способ изготовления разделяющей матрицы

Формула изобретения

1. Способ изготовления нерастворимой разделяющей матрицы, включающий солевую обработку, где анион добавляемой соли представляет собой сульфат, геля нативного полисахарида с последующим сшиванием полимеров полисахарида путем добавления сшивающего агента, такого как эпихлоргидрин, дивинилсульфон, диэпоксиды, диизоцианаты.

2. Способ изготовления разделяющей матрицы, включающий

а) получение водной суспензии частиц, состоящих из нативного полисахарида в гелеобразном состоянии;

б) солевую обработку суспендированных частиц путем добавления по меньшей мере одной соли, где анион добавляемой соли представляет собой сульфат, и

в) сшивание обработанных солью частиц путем добавления сшивающего агента, такого как эпихлоргидрин, дивинилсульфон, диэпоксиды, диизоцианаты.

3. Способ по п.1 или 2, где полисахарид представляет собой агарозу.

4. Способ по п.1 или 2, где соль (соли) добавляют до конечной концентрации соли в суспензии от 0,5 до 1,3 М.

5. Способ по п.1 или 2, где катион соли выбирают из группы, состоящей из Mg, Na, K, Li и Cu.

6. Способ по п.5, где катион соли выбирают из группы, состоящей из Mg и Na.

7. Способ по п.1 или 2, где соль представляет собой MgSO₄.

8. Способ по п.1 или 2, где температура при солевой обработке находится в диапазоне от 94 до 98°С.

9. Способ по п.8, где температура при солевой обработке составляет приблизительно 96°С.

10. Способ по п.2, где полисахаридные частицы стадии (а) получают путем эмульгирования в органическом растворителе.

11. Способ по п.10, где гранулы после эмульгирования подвергают промывке.

12. Способ по п.1 или 2, который включает последующую стадию присоединения хроматографических лигандов к гидроксильным группам преобразованного в гель полисахарида.

13. Сшитая полисахаридная разделяющая матрица, изготовленная, как определено в любом из пп.1-12.

14. Матрица по п.13, где доступный объем пор соответствует значению K_av для декстрана с молекулярной массой 110 кДа по меньшей мере 0,5.

15. Хроматографическая колонка, включающая разделяющую матрицу, как определено в любом из пп.13-14.

16. Способ изготовления разделяющей матрицы, включающий

1) получение водного раствора, способного к гелеобразованию нативного полисахарида;

2) снижение температуры раствора полисахарида до значения ниже его температуры гелеобразования;

3) солевую обработку путем добавления по меньшей мере одной соли, где анион добавляемой соли представляет собой сульфат, к полисахариду, полученному на стадии (2), и

4) сшивание обработанного солью полисахарида путем добавления сшивающего агента, такого как эпихлоргидрин, дивинилсульфон, диэпоксиды, диизоцианаты.

17. Способ по п.16, где соль (соли) добавляют до конечной концентрации соли от 0,5 до 1,3 М.

18. Сшитая полисахаридная разделяющая матрица, изготовленная, как было определено в пп.16-17.

19. Матрица по п.18, которая представлена мембраной или монолитным материалом.

20. Способ изготовления разделяющей матрицы, включающий

1) обеспечение пористого мембранного носителя и взаимодействие указанного носителя с водным раствором способного к гелеобразованию полисахарида;

2) снижение температуры раствора полисахарида до значения ниже его температуры гелеобразования;

3) солевую обработку путем добавления по меньшей мере одной соли, где анион добавляемой соли представляет собой сульфат, и

4) сшивание обработанного солью полисахарида путем добавления сшивающего агента, такого как эпихлоргидрин, дивинилсульфон, диэпоксиды, диизоцианаты.

21. Способ по п.20, где мембранный носитель имеет гидрофильную поверхность.

22. Способ по п.20, где мембранный носитель изготовлен из целлюлозы.

23. Способ по п.20, где полисахарид представлен нативным полисахаридом.

24. Способ по п.20, где соль (соли) добавляют до конечной концентрации соли в растворе от 0,5 до 1,3 М.

25. Способ по п.20, где температура на протяжении солевой обработки находится в диапазоне от 94 до 98°С.

26. Способ по п.20, который включает последующую стадию присоединения хроматографических лигандов к гидроксильным группам преобразованного в гель полисахаридного покрытия.

27. Способ по любому из пп.20-26, который включает стадию стерилизации сшитой разделяющей матрицы, полученной таким образом.

28. Применение разделяющей матрицы, полученной по любому из пп.1-12, или 16-17, или 20-27, или охарактеризованной в любом из пп.13-15 или 18-19, для очистки, выделения и/или удаления биомолекулы или органической молекулы из жидкости.

29. Применение по п.28, где расход подвижной фазы, подаваемой на разделяющую матрицу, составляет по меньшей мере приблизительно 300 см/ч.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к разделению и очистке молекул-мишеней, таких как биомолекулы, и более конкретно, к хроматографической матрице и новому способу ее изготовления. Изобретение также охватывает применение подобной матрицы в жидкостной хроматографии и хроматографическую колонку, включающую данную матрицу.

Недавние успехи в области биотехнологии потребовали более быстрых и более точных методов выделения, очистки и анализа биологических и биохимических веществ, таких как белки. Хроматография представляет собой широко используемый метод очистки в этой области. В хроматографии приводятся в контакт две взаимно несмешиваемые фазы. Точнее говоря, молекулу-мишень вводят в подвижную фазу, которая контактирует с неподвижной фазой. Затем по мере перемещения через систему при помощи подвижной фазы молекула-мишень вовлекается в ряд взаимодействий между неподвижной и подвижной фазами. Взаимодействия происходят за счет различия физических или химических свойств компонентов образца. В жидкостной хроматографии жидкий образец, возможно смешанный с приемлемым буфером, составляет подвижную фазу, которая контактирует с неподвижной фазой, известной как разделяющая матрица. Обычно матрица включает носитель, с которым связаны лиганды, представляющие собой группы, способные взаимодействовать с мишенью.

Разделяющие матрицы обычно имеют в своей основе носители, изготовленные из неорганических материалов, таких как диоксид кремния, или органических материалов, таких как синтетические или природные полимеры. Синтетические полимеры, такие как стирол и дивинилбензол, часто применяют для носителей, проявляющих некоторую гидрофобность, таких как носители в эксклюзивной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) и обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ). Кроме того, синтетические полимеры иногда предпочтительнее природных полимеров, так как их легко можно сделать более жесткими и стойкими к давлению, что дает в результате носители, обеспечивающие более предпочтительные характеристики прохождения потока.

Природные полимеры, которые обычно представляют собой полисахариды, такие как агароза, использовались в качестве носителей разделяющих матриц на протяжении десятилетий. За счет наличия гидроксильных групп поверхности природных полимеров обычно гидрофильны, что обеспечивает по существу отсутствие неспецифических взаимодействий с белками. Другое преимущество природных полимеров, которое имеет особое значение при очистке лекарственных препаратов или диагностических молекул для внутреннего употребления человеком, это их нетоксичные свойства. Агарозу можно растворять в воде при повышенной температуре, после чего она образует пористый гель при охлаждении до определенной температуры (температуры гелеобразования). При нагревании гель снова плавится при температуре (температура плавления), которая обычно значительно выше, чем температуры гелеобразования. Гелеобразование включает спираль-спиральную агрегацию полимеров полисахарида и иногда его относят физическому перекрестному сшиванию.

Как указано выше, природные полимеры обладают меньшей жесткостью и стойкостью к давлению, чем синтетические полимеры, поэтому разработаны способы усовершенствования этих характеристик. Например, изменяя концентрацию полисахарида, можно увеличить пористость носителя, что приводит к улучшению массопереноса мишени и увеличению области, с которой взаимодействует мишень в процессе хроматографии. Другой существенный параметр, который следует учитывать, это характеристики прохождения потока через носитель, например, в уплотненном слое частиц разделяющей матрицей. Когда подвижная фаза прогоняется через слой, противодавление будет в основном регулироваться поровыми каналами между частицами. При низких скоростях потока частицы можно считать несжимаемыми, и тогда противодавление возрастает линейно со скоростью потока, с наклоном, зависящим от размера частиц. При увеличении скорости потока частицы могут начать деформироваться под действием гидростатического давления, что приводит к уменьшению диаметров поровых каналов и быстрому увеличению противодавления. При определенной скорости потока, в зависимости от жесткости матрицы, слой схлопывается, и противодавление стремится к бесконечности.

Наиболее широко распространенным путем увеличения жесткости и, следовательно, улучшения характеристик прохождения потока для агарозы является ее сшивание. Подобное сшивание происходит между доступными гидроксильными группами и может быть получено общеизвестными способами при помощи, к примеру, эпихлоргидрина.

US 4973683 (Lindgren) относится к сшиванию пористых полисахаридных гелей и, более конкретно, к способу увеличения жесткости при минимизации неспецифического взаимодействия пористого полисахаридного геля. Способ включает обеспечение агарозного геля и реагента, называемого «монофункциональным», который включает реакционноспособную группу, такую как галоген или эпоксидная группа, и двойную связь. Реагент связывается с гелем через свою реакционноспособную группу, а двойная связь затем активируется с образованием эпоксида или галоидгидрина, который в конечном счете взаимодействует с гидроксильными группами на агарозе для обеспечения сшивания.

US 5135650 (Hjertén et al) относится к высокосжимаемым частицам хроматографической неподвижной фазы, таким как шарики из агарозы, которые, как установлено, обладают достаточной жесткостью для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и непористы до такой степени, что непроницаемы для растворов. В частности, шарики Hjertén производят из пористых агарозных шариков, которые приводят в контакт с органическим растворителем для схлопывания пористой структуры, после чего поверхности шариков внутри схлопнувшихся пор сшивают для закрепления пор в их закрытом состоянии. Альтернативно, шарики производят путем заполнения пор полимеризуемым веществом, которое соединяется с поверхностями пор и тем самым осуществляет привитую полимеризацию. Одно заявленное преимущество раскрытого изобретения заключается в том, что одна неподвижная фаза эффективна при высоких давлениях и, кроме того, может применяться при низких давлениях. Однако применения растворителей, особенно таких, как применяемые в данном патенте, в основном, избегают по соображениям здоровья и безопасности.

US 6602990 (Berg) касается способа производства пористого сшитого полисахаридного геля, где к раствору полисахарида добавляют бифункциональный сшивающий агент и дают ему связываться посредством своего активного центра с гидроксильными группами полисахарида. Затем из раствора образуют полисахаридный гель, после чего активируют неактивный центр сшивающего агента и осуществляют сшивание геля. Таким образом, сшивающий агент вводят в раствор полисахарида в противоположность вышеописанным способам, где его добавляли к полисахаридному гелю. Бифункциональный сшивающий агент включает один активный центр, т.е. центр, способный взаимодействовать с гидроксильными группами полисахарида, такой как галогениды и эпоксиды, и один неактивный центр, т.е. группу, которая не взаимодействует при условиях, когда активный центр взаимодействует, такой как аллильные группы. Таким образом, настоящий бифункциональный сшивающий агент соответствует «монофункциональным реагентам», применяемым по вышеописанному US 4973683 (Lindgren). Показано, что частицы, входящие в состав полученного в результате геля, обнаруживают повышенную способность выдерживать высокие скорости потока и высокое противодавление. Недостаток способа по US 6602990 заключается в том, что для активации сшивающего агента требуется бром.

US 5998606 (Grandics) касается способа синтеза хроматографических матриц, где сшивание и функционализация матрицы происходят одновременно. Более конкретно, двойные связи, имеющиеся на поверхности полимерной углеводной матрицы, активируют в присутствии металлического катализатора для сшивания матрицы и функционализируют ее галоидгидриновыми, карбоксильными или сульфонатными группами. Наличие двойных связей на поверхности матрицы обеспечивают приведением в контакт с активирующим реагентом, который содержит атом галогена или эпоксид и двойную связь. Таким образом, активирующий реагент по US 5998606 соответствует монофункциональному реагенту по US 4973683 и бифункциональному сшивающему агенту по US 6602990.

Qi et al (Journal of Functional Polymers, Vol. 13, March 2000: "Preparation of Two Types of Immobilized Metal-Chelated Complex Affinity Membrane Chromatography Media") описывают получение макропористых целлюлозных аффинных мембран с применением целлюлозной фильтровальной бумаги в качестве матрицы, подвергаемой щелочной обработке, активации эпоксидированию, ассоциированию с двунатриевым иминодиацетатом и иммобилизации Cu²⁺. Кроме того, для получения мембран со структурой, подобной сэндвичу, на мембраны после активирования ковалентно пришивали агарозу.

US 2005/0220982 (Moya et al) относится к способу получения полисахаридных структур, таких как шарики, гелевые пленки и пористые покрытия на пористых подложках путем приготовления раствора, в котором гелеобразование при комнатной температуре подавлено, полисахарида, одного или более гелеингибирующих агентов и растворителя, такого как вода; нагревания смеси до полного растворения всех компонентов, охлаждения смеси в виде раствора приблизительно до комнатной температуры, формирования трехмерной структуры из раствора и добавления структуры к гелеобразующему агенту для формирования полисахаридного геля. Гелеингибирующий агент, к примеру, может быть на основе солей цинка, лития или натрия. Утверждается, что покрытие из полисахарида имеет достаточную толщину, чтобы обеспечить возможность диффузионного потока в пределах самого слоя полисахарида. Заявленным преимуществом описанного способа является то, что структуры образуются при комнатной температуре и с регулируемым гелеобразованием полимера с полимерами полисахарида, которые обычно образуют гель при температуре значительно выше комнатной. Также утверждается, что нанесение покрытий на поверхности достигается без существенной блокировки пор полисахаридом. Однако подобная работа при комнатной температуре потребует тщательного регулирования раствора агарозы, что делает весь процесс относительно трудоемким.

Таким образом, даже несмотря на то, что способы изготовления сшитых полисахаридных разделяющих матриц доступны, разнообразные будущие прикладные задачи будут предъявлять различные требования к матрице, что имеет результатом непрерывную потребность в альтернативных способах.

Одним аспектом настоящего изобретения является предоставление способа изготовления полисахаридной разделяющей матрицы, которая обеспечивает характеристики прохождения потока, приемлемые для крупномасштабного технологического процесса. Этого можно достичь, изготавливая разделяющую матрицу, как описано в прилагаемой формуле изобретения.

Специфическим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа изготовления полисахаридной разделяющей матрицы в виде частиц, который предусматривает сшивание со сниженным риском агрегации. Этого можно достичь при помощи разделяющей матрицы, изготовленной, как описано в прилагаемой формуле изобретения, которая может быть сшита при более высоких температурах, чем применяемые традиционно.

Специфическим аспектом настоящего изобретения является предоставление способа, который дает возможность получать пористую разделяющую матрицу повышенной жесткости без схлопывания пористой структуры. Этого можно достичь при помощи способа, описанного в прилагаемой формуле изобретения, для изготовления разделяющей матрицы, размер пор которой позволяет молекулам-мишеням проникать в поры. Этот аспект предпочтителен для очистки и/или выделения относительно малых молекул-мишеней, таких как белки, при повышенных скоростях потока.

Прочие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут ясны из подробного описания, которое следует далее.

Определения

Термин разделяющая матрица «в виде частиц» здесь обозначает разделяющую матрицу, состоящую из частиц, таких как, по существу, сферические частицы или частицы менее правильной формы.

«Температура гелеобразования» обозначает температуру, при которой полимеры раствора взаимодействуют физически с образованием твердого геля.

Термин «способный к гелеобразованию» здесь обозначает вещество, способное образовывать физический гель.

Термин «нативный» полисахарид относится к полисахариду в немодифицированном состоянии, т.е. полисахариду, который не подвергнут замещению или дериватизации.

Термин разделяющая «матрица» здесь обозначает материал, состоящий из пористого или непористого твердого носителя, к которому присоединены лиганды. В области хроматографии разделяющая матрица иногда обозначается как смола или среда.

Термин «лиганды» применяется здесь в его традиционном значении, т.е. для химических объектов, которые способны взаимодействовать с молекулой-мишенью, таких как заряженные группы, способные взаимодействовать с противоположно заряженной молекулой-мишенью в ионно-обменном процессе.

K_av - это параметр гель-фильтрации (эксклюзивной хроматографии), определяемый как (V_e-V₀)/(V_t -V₀), где V_e - объем пика элюирования тест-молекулы, V₀ - свободный объем колонки и V_t - общий объем слоя. K_av - это показатель доли объема неподвижной фазы, доступной конкретной тест-молекуле.

K _avDX - это K_AV для молекул декстрана. В примерах применяли декстран молекулярной массы 110 кДа, 500 кДа и 1000 кДа соответственно.

Настоящее изобретение относится к способу изготовления нерастворимой разделяющей матрицы, такой как частицы, монолитный материал или мембрана, при помощи солевой обработки полисахаридного геля с последующим сшиванием полимеров полисахарида. Способ может включать предшествующую стадию получения полисахаридного геля из раствора соответствующего полисахарида предпочтительно путем снижения температуры раствора. Гель может предоставляться в виде покрытия на мембранном носителе в виде частиц полисахарида или в виде покрытия на частицах, изготовленных из иного материала. Гель преимущественно является пористым.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления разделяющей матрицы, включающему стадии:

а) обеспечения водной суспензии частиц, состоящих из нативного полисахарида в гелеобразном состоянии;

б) солевой обработки суспендированных частиц путем добавления по меньшей мере одной соли и

в) сшивания обработанных солью частиц.

Полисахарид может быть представлен любым полисахаридом, способным принимать форму геля, предпочтительно за счет изменения температуры, и его можно выбирать из группы, состоящей из агарозы, агара, целлюлозы, декстрана, крахмала, хитозана, конджака, курдлана, каррагинана, пектина, геллана и альгината. Как понятно специалистам, подобные полисахаридные частицы в гелеобразном состоянии преимущественно состоят из одного полисахарида, но настоящее изобретение также охватывает применение частиц, состоящих из смеси двух или более полисахаридов. В предпочтительном воплощении настоящего способа полисахарид представлен агарозой. В специфическом способе ядро частицы или носителя покрыто полисахаридом, как описано выше. Носитель может быть таким, как обсуждается далее в контексте мембранного носителя.

Как явствует из вышеизложенного, по настоящему изобретению полисахаридные частицы, полученные на стадии (а), состоят из нативного полисахарида, т.е. полисахарида, полимеры которого не подвергнуты какой-либо модификации или замещению, например, дериватизации или сшиванию. Таким образом, в настоящем изобретении соль добавляют к немодифицированному полисахариду.

В предпочтительном воплощении полисахаридные частицы представляют собой преимущественно сферические частицы (шарики). В области хроматографии размер частиц обычно представлен как средний размер частиц интегрального распределения по объему. В настоящем способе средний размер шариков может составлять от 10 до 300 мкм, предпочтительно от 30 до 200 мкм или более предпочтительно от 45 до 165 мкм, например, приблизительно 45 мкм, в диаметре.

Подобные полисахаридные шарики легко может приготовить специалист в данной области по стандартным методикам, таким как гелеобразование из инверсной суспензии (inversion suspension gelation) (S Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964). Например, при приготовлении агарозы агарозные капли получают путем растворения или диспергирования агарозы в водном растворителе, таком как вода, или в любом другом обычно используемом растворителе, при температуре выше ее температуры плавления. Растворенную агарозу затем эмульгируют в обычно используемом органическом растворителе, таком как толуол или гептан, при перемешивании, после чего температуру снижают до значений ниже температуры гелеобразования агарозы для удобства до комнатной температуры. В настоящем способе шарики, изготовленные таким образом, преимущественно промывают для удаления каких-либо следов растворителя, к примеру этанолом или водой, и суспендируют в воде или приемлемом водном растворе. Таким образом, в предпочтительном воплощении частицы промывают перед стадией сшивания.

Как понятно специалисту в данной области, имеются отличные от эмульгирования способы приготовления водной суспензии полисахаридных частиц. Так, в альтернативном воплощении полисахаридные частицы получают, распыляя композицию, которая состоит из полисахарида, образующего гель в условиях повышенной температуры в водной среде, в окружающую атмосферу, и предоставляя возможность распыленной композиции образовать гель в воздухе, как описано, к примеру, в US 6248268 (FMC Corporation), включенном здесь путем ссылки.

В альтернативном воплощении полисахаридные частицы имеют неправильную форму, такие как получаемые, например, просто путем приготовления крупного сегмента полисахарида и дробления его на частицы приемлемого среднего размера. В еще одном альтернативном воплощении полисахаридные частицы имеют продолговатую форму, например, эллипсоидные или нитевидные частицы.

Соль, добавляемая на стадии (б), в настоящем способе может быть любой солью, способной обеспечить требуемую жесткость при выбранной температуре и концентрации соли, но предпочтительно состоит из двух ионов, оба из которых стоят в возрастающем конце ряда липофильности Гофмейстера.

В одном воплощении анион соли, добавляемой на стадии (б), представляет собой сульфат или фосфат, предпочтительно сульфат. В другом воплощении катион соли выбирают из группы, состоящей из Mg; Li; Na; K и NH ₄. В предпочтительном воплощении катион соли выбирают из группы, состоящей из Mg и Na. Таким образом, соль, добавляемая на стадии (б), может, к примеру, быть MgSO₄ или Na ₂SO₄. В предпочтительном воплощении соль представляет собой MgSO₄.

Соль (соли), добавляемую на стадии (б), можно добавлять в водном растворе или в твердом виде. В одном воплощении количество соли (солей), добавляемой на стадии (б), достаточно для обеспечения конечной концентрации в суспензии, составляющей от 0,5 до 1,3 М. В специфическом воплощении концентрация соли в суспензии ниже 1,0 М, например, в диапазоне от 0,5 до 1,0 М, и предпочтительно от 0,5 до 0,8 или от 0,8 до 1,0 М. В альтернативном воплощении концентрация соли в суспензии выше 1,0 М, например, от 1,0 до 1,3 М, и предпочтительно от 1,0 до 1,2, к примеру, предпочтительно 1,1 М или от 1,2 до 1,3 М.

Суспензию, к которой добавляют соль, поддерживают при повышенной температуре в течение времени, достаточного для изменения свойств полисахарида в сторону улучшенных характеристик прохождения потока и повышенной жесткости, наблюдаемых авторами настоящего изобретения, предпочтительно с перемешиванием. Продолжительность солевой обработки легко определима для специалиста в данной области и может, к примеру, составлять до одного часа, например, от 20 до 40 минут, и преимущественно около 30 минут. Так, температуру во время солевой обработки можно поддерживать где-нибудь в диапазоне от 94 до 98°С и изменять в зависимости от требуемых характеристик матрицы. В одном воплощении температура находится в диапазоне от 94 до 96°С, например, от 94 до 95°С или от 95 до 96°С, например, приблизительно 94, приблизительно 95 или приблизительно 96°С. В другом воплощении температура находится в диапазоне от 96 до 98°С, например, от 96 до 97°С или от 97 до 98°С, например, приблизительно 97 или приблизительно 98°С.

В предпочтительном воплощении настоящий способ включает солевую обработку предпочтительно путем добавления сульфата, такого как Na₂SO₄ или MgSO ₄, при температуре приблизительно 96°С. В более предпочтительном воплощении способ включает солевую обработку путем добавления Na₂SC₄ или MgSO₄ до концентрации соли в суспензии выше 1,0 М, при том что обработка происходит при температуре приблизительно 96-97°С.

Как явствует из вышеизложенного, сшивание полисахаридных частиц происходит на стадии, следующей за солевой обработкой. В предпочтительном воплощении на стадии (в) стадия сшивания включает добавление сшивающего агента. Сшивающий агент может быть любым приемлемым мономером или бифункциональным реагентом, известным в полимеризации полисахаридов, таким как эпихлоргидрин, дивинилсульфон, диэпоксиды, диизоцианаты и т.д. Сшивание полисахаридов хорошо известно в данной области, см., например, обсуждавшиеся выше US 4973683 и US 6602990. Одним из преимуществ настоящего способа является то, что он позволяет производить полисахаридные частицы, характеризующиеся высокой жесткостью, путем сшивания при более высокой температуре, чем в распространенных способах, что, в свою очередь, снижает или даже исключает образование агрегатов. Не стремясь ограничиться какой-либо конкретной теорией, можно предположить, что эта особенность связана с добавлением соли перед сшиванием.

В одном воплощении настоящий способ включает последующую стадию присоединения хроматографических лигандов к гидроксильным группам сшитой полисахаридной матрицы. Присоединение хроматографических лигандов, также известное как функционализация или иногда дериватизация, к нерастворимой матрице может обеспечиваться за счет присоединения заряженных или заряжаемых групп для получения ионно-обменной матрицы; за счет присоединения групп, которые проявляют биологическое сродство для получения аффинной матрицы; за счет присоединения хелатообразующих групп для получения матрицы для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (АХИМ); или за счет присоединения гидрофобных групп для приготовления матрицы для хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ). Альтернативно, к матрице, изготовленной по изобретению, присоединяют группы, известные как мультимодальные, т.е. группы, которые содержат более чем одну группу, например, ионообменные группы в дополнение к гидрофобным группам. В специфическом воплощении функциональные группы представлены ионообменными лигандами, выбираемыми из группы, состоящей из четвертичной аммониевой (Ч), диэтиламиноэтильной (ДЭАЭ), диэтиламинопропильной, сульфопропильной (СП) и карбоксиметильной (КМ) групп. Способы присоединения функциональных групп к нерастворимому носителю, такому как разделяющая матрица, хорошо известны специалисту в данной области и могут включать предшествующую стадию аллилирования заместителя и применение стандартных реагентов и условий (см., например, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et at, Greg T.Hermanson, A.Krishna Mallia and Paul K.Smith. Academic Press. INC, 1992.) В специфическом воплощении сшитую разделяющую матрицу перед функционализацией снабжают наполнителями, также известными как гибкие ответвления, щупальца или пух. Широко известным наполнителем является декстран; см., например, US 6537793, где добавление наполнителей к полисахаридной матрице описано более подробно.

Настоящее изобретение также охватывает стерилизацию сшитой разделяющей матрицы, обработанной по изобретению. В другом воплощении способ касается упаковки или просто предоставления резервуара с разделяющей матрицей и последующей стерилизации резервуара с его содержимым. Так, специфическое воплощение способа включает предоставление сшитой разделяющей матрицы в хроматографической колонке до стерилизации. Стерилизация может проводиться путем тепловой обработки и/или обработки паром, например, в автоклаве; облучением; микроволнами; высоким давлением; химическими реагентами или любым другим общеизвестным способом стерилизации.

Другой аспект настоящего изобретения составляет сшитая разделяющая матрица, изготовленная, как описано выше. В предпочтительном воплощении полисахаридная разделяющая матрица по изобретению состоит из преимущественно сферических пористых частиц. В одном воплощении частицы имеют значение K_av для декстрана с молекулярной массой 110 кДа, по меньшей мере, приблизительно 0,4, предпочтительно >0,5. В предпочтительном воплощении частицы снабжены хроматографическими лигандами. В этом воплощении поры имеют размер, достаточный для того, чтобы обеспечить проникновение разделяемых молекул-мишеней, следовательно, улучшая связывающую способность частиц. Кроме того, способ изготовления, описанный выше, предоставляет достаточно жесткую матрицу для крупномасштабного технологического процесса. Это воплощение применимо для любых молекул-мишеней, представленных в качестве примеров ниже в контексте применения, но особенно предпочтительно для относительно небольших молекул-мишеней, таких как белки.

Несмотря на то что выше обсуждалась разделяющая матрица в форме частиц, как понятно специалисту в данной области, настоящий способ в равной мере пригоден для изготовления разделяющих матриц в другой форме. Так, разделяющая матрица по настоящему изобретению может быть изготовлена в виде любой другой широко используемой формы, такой как монолитный материал: фильтры или мембраны; дробленый материал; поверхности; капилляры; волокна и т.д.

В предпочтительном воплощении предлагаемый способ включает способ изготовления разделяющей матрицы, включающий стадии:

1) получения водного раствора способного к гелеобразованию нативного полисахарида;

2) снижения температуры раствора полисахарида до значения ниже его температуры гелеобразования;

3) солевой обработки путем добавления по меньшей мере одной соли к полисахариду, полученному по стадии(2) и

4) сшивания обработанного солью полисахарида.

В одном воплощении полисахарид представляет собой нативный полисахарид, т.е. полисахарид, полимеры которого не подвергнуты какой-либо модификации или замещению, таким как дериватизация или сшивание. В предпочтительном воплощении соль (соли) добавляют до концентрации в растворе в диапазоне от 0,5 М до 1,3 М.

Любая из вышеуказанных подробностей в контексте первого аспекта, таких как полисахарид, природа соли, температура и концентрации соли и т.д., могут быть применимы к вышеуказанному способу изготовления разделяющей матрицы в другой форме.

Как явствует из вышеизложенного, полисахарид может быть изготовлен в виде частиц. В одном воплощении разделяющая матрица представлена мембраной или фильтром. За исключением вышеуказанных подробностей, дающих в результате жесткую матрицу по изобретению, методика изготовления мембран общеизвестна и легко выполнима для специалиста в данной области.

В альтернативном воплощении разделяющая матрица представлена монолитным материалом. В этом воплощении для обеспечения требуемой пористости монолитного изделия преимущественно добавляют пороген (porogen). Приемлемые порогены хорошо известны в данной области и могут, к примеру, представлять собой полиэтиленгликоль. Другие детали в отношении изготовления монолитных материалов хорошо известны в данной области.

Другим аспектом изобретения является хроматографическая колонка, включающая разделяющую матрицу, как описано выше. Колонка может быть изготовлена из любого широко используемого материала, такого как биологически совместимая пластмасса, например полипропилен; стекло или нержавеющая сталь. Колонка может иметь размеры, приемлемые для лабораторной или крупномасштабной очистки. В специфическом воплощении колонку по изобретению сопровождают люэровскими адаптерами, переходниками и колпачковыми гайками.

В предпочтительном воплощении вышеуказанная стадия (1) включает также предоставление пористого мембранного носителя и взаимодействие указанного носителя с раствором полисахарида. Взаимодействие может, например, осуществляться путем погружения мембранного носителя в горячий раствор полисахарида, в случае чего пропитанную полисахаридом мембрану предпочтительно удаляют из раствора перед стадией охлаждения (2). Мембранный носитель может быть изготовлен из любого материала, совместимого с раствором полисахарида, и следовательно, преимущественно является по существу гидрофильным. Так, в одном воплощении мембранный носитель изготовлен из гидрофильного полимера, такого как полимер, выбранный из группы, состоящей из агарозы, агара, целлюлозы, декстрана, крахмала, хитозана, конджака, курдлана, каррагинана, пектина, геллана, альгината и любой смеси двух или более указанных полимеров. В предпочтительном воплощении настоящего способа мембранный носитель изготовлен из целлюлозы. В наиболее предпочтительном воплощении целлюлозный мембранный носитель приводят в контакт с раствором агарозы для получения гибридной целлюлозно-агарозной мембраны. В альтернативном воплощении мембранный носитель изготовлен из синтетического полимера или керамического материала, обработанного с целью получения в значительной степени гидрофильной поверхности, например, путем химической модификации поверхности. Таким образом, в одном воплощении мембранный носитель имеет гидрофильную поверхность.

Мембранный носитель, применяемый в настоящем способе, может быть представлен коммерчески доступной мембраной. Как вариант, его изготавливают, следуя способам, хорошо известным в данной области. Средний размер пор мембранного носителя будет зависеть от его предполагаемого применения и может находиться где-нибудь в диапазоне от 0,1 до 10 мкм, например от 0,2 до 5 мкм. В специфическом воплощении мембрану предоставляют в виде картриджа. В другом воплощении мембрана представляет собой уложенную слоями мембрану. В специфическом воплощении мембрана по изобретению предоставляют на вращающемся цилиндре. Как понятно специалисту, размер и геометрия мембранного носителя также будут зависеть от применения.

Солевую обработку на стадии (3) преимущественно проводят путем пропитывания мембранного носителя теплым водно-солевым раствором в течение приемлемого промежутка времени для получения требуемых характеристик прохождения потока через конечный продукт. В одном воплощении длительность солевой обработки составляет от 0,5 до 4 ч, например, от 1 до 3 ч, к примеру, 1 или 2 часа. Специалист в данной области может применить простой тест для определения наиболее приемлемого промежутка времени для данного сочетания мембранный носитель - полисахарид. Как указано далее в экспериментальной части, авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что при обработке покрытого полисахаридом мембранного носителя солью по изобретению пористость мембранного носителя, которая существенно снижалась после стадии нанесения покрытия, могла быть восстановлена.

Полисахаридную оболочку обработанной солью мембраны затем подвергают сшиванию по любому известному в данной области способу. В одном воплощении способ изготовления мембраны включает последующую стадию присоединения хроматографических лигандов к гидроксильным группам полисахаридной оболочки. Подобная функционализация путем присоединения лигандов может быть получена, как описано выше. В специфическом воплощении сшивание и функционализация происходят в основном одновременно.

В другом аспекте настоящее изобретение касается мембраны, изготавливаемой путем предоставления пористого мембранного носителя и обеспечения взаимодействия указанного носителя с водным раствором способного к гелеобразованию полисахарида; где полисахаридная оболочка, которая обнаруживает улучшенные характеристики прохождения потока, получена при помощи способа, описанного в US 6602990 (Berg) или SE 0402322-2 (Berg et al.). Оба указанных способа включают модификацию полисахарида, например, путем аллилирования или другой дериватизации полимеров полисахарида перед их огеливанием, которая будет увеличивать жесткость покрытия, получаемого после сшивания. Мембранный носитель может, к примеру, представлять собой целлюлозу или любой другой гидрофильный материал; а полисахарид покрытия преимущественно представляет собой агарозу.

В предпочтительном воплощении настоящий способ включает стадию стерилизации сшитой разделяющей матрицы, полученной таким образом. Стерилизация может проводиться, как обсуждалось выше. В специфическом воплощении мембрану по изобретению изготавливают для однократного применения, что также известно как одноразовое изделие. Однократное применение предпочтительно, например, в случаях, где мембрану применяют для адсорбции загрязняющих веществ, таких как загрязняющие вещества, с которыми по соображениям безопасности и здоровья следует обращаться с осторожностью. Однократное применение также предпочтительно в случаях, где чистота имеет самое большое значение, например, в фармацевтической промышленности. Дополнительное преимущество изделий одноразового использования заключается в том, что исключается необходимость аттестации очистки.

В альтернативном воплощении разделяющая матрица представлена монолитным материалом. В данном воплощении для обеспечения требуемой пористости продукта преимущественно добавляют пороген. Приемлемые порогены известны в данной области и могут, например, представлять собой полиэтиленгликоль. Прочие подробности в отношении изготовления монолитных материалов хорошо известны в данной области.

Наконец, настоящее изобретение касается применения разделяющей матрицы, изготовленной, как описано выше, для молекул-мишеней практически любого вида. Так, в одном воплощении настоящего применения выделяют, очищают и/или удаляют из жидкости биомолекулу или органическую молекулу. Так, данный аспект представляет собой метод жидкостной хроматографии, как обсуждалось выше, и включает адсорбцию молекулы-мишени на матрице и возможно последующую стадию избирательной десорбции мишени, обычно известную как градиентное элюирование. При необходимости между адсорбцией и элюированием обеспечивают одну или более стадий промывки. Как вариант настоящее применение служит для задерживания молекулы-мишени, в случае чего мишень избирательно задерживается на колонке по сравнению с другими компонентами. В этом случае в стадии элюирования нет необходимости.

В одном воплощении настоящая колонка включает преимущественно сферические пористые частицы. Хроматографическая колонка может быть заполнена разделяющей матрицей по изобретению для применения в ВЭЖХ. Альтернативно, разделяющей матрицей по изобретению просто наполняют колонку с тем, чтобы обеспечить применение в режиме псевдоожиженного слоя, также известного как адсорбция на слое разрыхленного адсорбента (АСРА). В еще одном варианте разделяющая матрица по изобретению представлена монолитным материалом, который полимеризуют в колонке. В предпочтительном воплощении изобретения колонку, включающую разделяющую матрицу по изобретению, подвергают стерилизации для обеспечения однократного применения. Такая колонка однократного применения, или одноразовая колонка, особенно предпочтительна в фармацевтической промышленности, а иногда также в области диагностики, когда стоит проблема стерильности.

Настоящее изобретение также охватывает комплект, включающий в отдельных ячейках хроматографическую колонку, включающую разделяющую матрицу, как описано выше; по меньшей мере, один буфер; и письменные инструкции в отношении очистки молекул-мишеней.

Наконец, настоящее изобретение касается применения разделяющей матрицы, изготовленной, как описано выше, для молекул-мишеней любого вида. Так, в одном воплощении настоящего применения биомолекулу или органическую молекулу выделяют, очищают и/или удаляют из жидкости. Так, этот аспект представляет собой метод жидкостной хроматографии, как обсуждалось выше, и включает адсорбцию молекулы-мишени на матрице и возможно последующую стадию избирательной десорбции мишени, общеизвестной как градиентное элюирование. При необходимости между адсорбцией и элюированием обеспечивают одну или более стадий промывки. Альтернативно, настоящее применение служит для задерживания молекулы-мишени, а случае чего мишень избирательно задерживается на колонке по сравнению с другими компонентами. В этом случае в стадии элюирования нет необходимости.

В одном воплощении настоящего применения для матрицы, состоящей из преимущественно сферических частиц, которые для декстрана с молекулярной массой 110 кДа дают K _av по меньшей мере около 0,4, используют расход жидкости по меньшей мере приблизительно 300 см/ч, а именно по меньшей мере 400, предпочтительно, по меньшей мере 500 и более предпочтительно по меньшей мере 700 см/ч.

Как явствует из вышеизложенного, молекулы-мишени могут быть любыми биологическими молекулами, такими как пептиды, белки, такие как рецепторы и моноклональные или поликлональные антитела, нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, РНК и олигонуклеотиды, к примеру, плазмиды, вирусы и прокариотические или эукариотические клетки; или органическими молекулами, такими как потенциальные лекарства и т.д. В одном воплощении потенциальное лекарство может быть применено в индивидуальной терапии. Разделяющая матрица, изготовленная по настоящему изобретению, также применима для разделения молекул-мишеней, используемых в пищевой промышленности и производстве напитков, например, для очистки функциональных продуктов питания и/или очистки напитков от загрязняющих молекул-мишеней. Широко известными молекулами-мишенями из пищевой промышленности являются продукты из молочной сыворотки, такие как различные белки молока.

Последним аспектом настоящего изобретения является применение разделяющей матрицы, изготовленной по настоящему изобретению, в качестве носителя для роста прикрепленных клеток в культуре. Такие клетки могут, к примеру, быть эмбриональными или зрелыми стволовыми клетками. Дополнительное применение матрицы является применением для иммобилизации ферментов для производства биокатализаторов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Настоящие примеры приведены лишь в иллюстративных целях и не должны интерпретироваться как ограничивающие настоящее изобретение, описанное в прилагаемой формуле изобретения. Все источники, приводимые ниже и где-либо в настоящем описании изобретения, тем самым включены сюда посредством ссылки.

Материалы и методы

Свойства частиц

Декстраны для определения Kd экспериментальных образцов

Сырьевой декстран	5 мг/мл
М=196300	10 мг/мл
М=123600	10 мг/мл
М=66700	10 мг/мл
М=43500	10 мг/мл
М=4440	0 мг/мл
М=1080	10 мг/мл

Все декстраны разбавляли 0,2 М раствором NaCl за исключением сырьевого декстрана, который разбавляли 0,25 М NaCl.

Испытание на эффективность

Испытание на эффективность проводили при помощи анализатора КТА (ID 494) (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) путем введения 1% раствора ацетона. Этот тест дает оценку качества заполнения колонки. Допустимая асимметрия лежит в диапазоне от 0,75 до 1,25, число теоретических тарелок >1000 шт.

Селективность

Определение Kd проводили при помощи анализатора КТА (ID 494), оборудованного автодозатором А-900. Рефрактометрический детектор Shimadzu (RID-10А) был подсоединен к системе КТА для детектирования образцов декстрана. Применяли следующие условия:

Расход: 0,2 мл/мин

Подвижная фаза: 0,2 М NaCl

Контур инжекции: 100 мкл

Оценка

Пики декстрана оценивали по широко известным методикам в данной области. Значения Kd затем рассчитывали как степень доступной поверхности пор следующим образом:

Kd=(V_e-V_o)/(V_с-V_o -гелевая матрица)=(V_e-V_o)/(V_t -V_o)

V_e = удерживаемый объем элюированного декстрана (мл)

V_o = свободный объем (удерживание сырьевого декстрана) (мл)

V _c = рассчитанный объем колонки (высота слоя колонки (см) x площадь поверхности колонки (см²)) (мл)

V_t = общий объем жидкости (объем удреживания NaCl) (мл)

Пример 1: Общий синтез полисахаридных частиц

Солевая обработка: Примерно 1,5 г несшитой Sepharose HP (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) промывали 10 объемами слоя колонки деоинизированной воды для получения 75% водной суспензии частиц геля. Затем в суспензию добавляли соли, как изложено ниже для каждого образца. Реакционную смесь нагревали до температуры, указанной ниже для каждого образца, в течение 30 минут с перемешиванием перед последующим охлаждением до температуры ниже 30°С на ледяной бане. Затем из суспензии удаляли соли путем промывания геля 10 объемами слоя колонки воды на воронке из агломерированного стекла.

Сшивание: Сшивание проводили с помощью эпихлоргидрина в качестве сшивающего агента и согласно Porath (Gel product for separation, 1982, EP 81850244) с 4-кратным избытком эпихлоргидрина и NaOH сверх указанных количеств.

Функционализация: Для получения анионообменника к сшитым гранулам присоединяли группы четвертичного аммония (Ч-группы) по общеизвестным методикам. После присоединения для определения количества функциональных Ч-групп проводили титрование Cl ^- с 0,1 М AgNO₃.

Заполнение колонки: Частицы, изготовленные, как описано выше, упаковывали в колонки HR 5/20 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) с деионизированной водой в качестве уплотняющей жидкости. Колонки сперва заполняли при расходе 306 см/ч в течение приблизительно 15 минут, а затем при расходе 764 см/ч в течение приблизительно 15 минут. Заполнение колонки тестировали путем определения пиковой асимметрии после введения 25 мкл 0,4% ацетона при расходе 76 см/ч. Колонки с пиковой асимметрией между 0,8 и 1,8 признавали приемлемыми в данной работе.

Примеры 2-4: Образцы частиц

Исходя из коммерчески доступных Sepharose матриц, образцы готовили, как описано выше, с различными солями, варьируя количество и продолжительность обработок. Результаты представлены в нижеприведенных Таблицах.

Примеры 5-6: Сравнительные примеры частиц

Два сравнительных примера были выполнены для тестирования двух Sepharose матриц, используемых в качестве исходных материалов в вышеприведенных Примерах 2-4, но опуская стадию солевой обработки.

Таблица 1
Расходы
Образец	Основная матрица	Солевая обработка М, моль/литр суспензии из частиц	Макс. темп., °С	Диаметр частиц (по Малверну, d50v), мкм	Расход (макс), мл/мин
Пр.2 U1262069	Sepharose 4В	0,35М MgSO4 + 0,5М Na2SO4	96,8	58	34,5
Пр.3 U1262073	Sepharose 6В	1,3M Na 2SO4	96.7	76	32,5
Пр.4 U1262074	Sepharose 6В	0,5М MgSO 4 + 0,5М Na2SO4	96,9	55	85
U1262066 Сравн. Пр.5	Sepharose 4В	-	-	83	6
U1262067 Сравн. Пр.6	Sepharose 6В	-	-	89	10

Таблица 2
Испытание на эффективность
Образец	Асимметрия	Число теоретических тарелок (шт.)
Пр.2, U1262069	1,00	1609
Пр.3, U1262073	0,77	2520
Пр.4. U1262074	1,26	1489
Сравн. Пр.5, U1262066	0.75	2281
Сравн. Пр.6, U1262067	0,49**	886**
* Приемлемая асимметрия для настоящей цели
** Даже после 4-кратного повторения данной набивки она, тем не менее, не удовлетворяла критерию, установленному в настоящем тесте.

Таблица 3
Доступная поверхность пор
Образец	Основная матрица	Расход (макс). мл/мин	Диаметр гранул, (по Малверну, d50v) 110000
Пр.2 U1262069	Sepharose 4B	34.5	0,67
Пр.3 U1262073	Sepharose 6B	32,5	0.59
Пр.4 U1262074	Sepnarose 6B	85	0,10
Сравн. пр.5, U1262066	Sepharose 4B	6	0,65
Сравн. пр.6, U1262067	Sepharose 6B	10	0.46

Примеры 7-10: Солевая обработка мембран

Пример 7: Пропитка мембраны в растворе агарозы - Мембрана А

1% раствор агарозы готовили, растворяя 0,3 г агарозы в 30 мл воды при температуре 95°С в течение 3 ч. Регенерированную целлюлозную мембрану (Sartorius, 0,45 мкм, продукт № 3S18406-047N) затем погружали в раствор агарозы на 1 ч при температуре 95°С. Затем мембрану вынимали из раствора агарозы и давали ей остыть до комнатной температуры, так чтобы агароза могла формировать гель внутри мембранной структуры.

Пример 8: Обработка мембраны в солевом растворе - Мембрана В

Гибридную мембрану А, изготовленную, как описано в Примере 7, погружали в сульфат аммония (NH ₄SO₄) (1 М раствор) (50 мл) при температуре 96°С на 1 ч, а затем вынимали из раствора и давали ей остыть. Мембрану тщательно промывали водой.

Пример 9: Определение пропускной способности мембраны

Фрагмент мембраны, изготовленной и обработанной, как описано выше, помещали в воронку с фильтром диаметром 15 мм и вакуумировали при давление 0,07 МПа (0,7 бар). 50 мл воды заливали в воронку и включали секундомер. Регистрировали время, за которое вся вода прошла через мембрану. Проводили трехкратный анализ.

Рассчитывали характеристики прохождения потока в мл на квадратный сантиметр за мин.

Пример 10: Результаты по пропускной способности мембраны

Таблица 4
Мембрана	Раствор агарозы (%)	Солевая обработка	«Текучесть» (мл/мин/см2)
Сравнительный пример	-	-	21,8
Мембрана А	1	нет	2.1
Мембрана В	1	есть	18,7