способ прогнозирования обострения хронического гепатита с у детей подросткового возраста

Формула изобретения

Способ прогнозирования обострения хронического гепатита С у детей подросткового возраста путем исследования крови, отличающийся тем, что с помощью биолюминесцентного метода определяют активности НАДФН- и НАДФ-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ лимфоцитов периферической крови больных хроническим гепатитом С, и о возможности возникновения обострения хронического гепатита С судят по величине коэффициента НАДФН/НАДФ⁺ в ферментативных реакциях глутаматдегидрогеназы: при величине коэффициента >25 прогнозируют развитие обострения, при величине коэффициента <25 - отсутствие обострения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть применено для определения обострения течения хронического гепатита С (ХГС) у детей подросткового возраста.

Известно, что лимфоциты, реализующие основные функции специфического иммунного ответа, являются главными клетками в системе иммунологического надзора и принимают активное участие в системе противоинфекционной защиты, в том числе, и при вирусном гепатите С (ВГС) [2, 8]. Доказано, что именно от уровня функциональной активности лимфоцитов зависит исход острого ВГС и характер течения ХГС [7]. В то же время установлено, что функциональная активность лимфоцитов в значительной степени определяется уровнем их метаболических процессов [6, 10]. К числу показателей, наиболее объективно отражающих основные параметры внутриклеточного метаболизма, можно отнести дегидрогеназы.

НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа (НАДФГДГ, КФ 1.4.1.4) осуществляет окислительное дезаминирование L-глутаминовой кислоты, используя в качестве кофактора НАДФ ⁺ [1]. Ферментативная реакция глутаматдегидрогеназы является обратимой, соответственно аммиак в присутствии НАДФН и -кетоглутаровой кислоты может участвовать в синтезе глутамата. Глутаматдегидрогеназа является олигомерным ферментом с молекулярной массой 312000, который состоит из 6 субъединиц. Фермент проявляет свою активность только в мультимерной форме. При диссоциации глутаматдегидрогеназы на субъединицы, которая происходит в присутствии НАДФН, ГТФ и ряда стероидных гормонов, фермент теряет способность осуществлять окислительное дезаминирование глутаминовой кислоты, но приобретает способность осуществлять дезаминирование ряда других аминокислот. Подобная особенность характеризует аллостерический механизм регуляции глутаматдегидрогеназы и определяет данный фермент как регуляторный в системе аминокислотного обмена.

Известен способ прогнозирования обострений вирусных гепатитов, заключающийся в исследовании билирубина в сыворотке крови, при этом одновременно на пике билирубинемии и через 7-10 дней после него дополнительно определяли уровень сывороточного железа и при его нарастании по сравнению с первотачальным уровнем прогнозировали обострение [3]. Недостатком способа является прогнозирование обострений только при затяжном течении острых гепатитов.

Известен способ прогноза быстрого прогрессирования заболевания у больных ХГС, заключающийся в изучении показателей индекса массы тела, количественного содержания в крови лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD3/CD25⁺, CD3/CD95⁺ и CD118 ⁺-лимфоцитов, концентрации в крови инсулиноподобного фактора роста и трансформирующего фактора роста, генотипа HCV и антигенов HLA-системы. На основании полученных данных рассчитывался суммарный показатель, исходя из значения которого прогнозировали течение заболевания (риск развития цирроза печени) [5]. Существенным недостатком данного способа является трудность его выполнения и сложность расчетов.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования течения хронического гепатита C путем определения микросомальных и митохондриальных аутоантител в сыворотке крови и при повышении их содержания на 25% и более прогнозируют течение хронического гепатита C с обострениями [4].

Недостатком способа является то, что он реализуется только у больных с биохимической и вирусологической активностью процесса и прогнозирует лишь затяжное течение ХГС. Однако течение ХГС складывается из периодов обострений и ремиссий, и данный способ не может быть использован при прогнозировании обострения заболевания у больных с клинико-биохимической ремиссией.

Кроме того, в литературных источниках не обнаружено прогнозов ХГС в детском возрасте, что обуславливает актуальность проблемы.

Задачей изобретения является раннее прогнозирование обострения ХГС у детей подросткового возраста.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что с помощью биолюминесцентного метода определяют активности НАДФН- и НАДФ ⁺-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ лимфоцитов периферической крови больных ХГС, и о возможности возникновения обострения судят по величине коэффициента НАДФН/НАДФ⁺ в ферментативных реакциях глутаматдегидрогеназы: при величине коэффициента 25 прогнозируют развитие обострения, при величине коэффициента <25 - отсутствие обострения.

Способ осуществляют следующим образом. У детей подросткового возраста, больных ХГС, забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Выделяют лимфоциты. Центрифугируют в градиенте плотности фиколл-верографина по стандартной методике A.Boyum (1968) [9]. Подсчитывают концентрацию лимфоцитов, например, в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода лимфоцитов, которая составляет не менее 97%. 1 млн. выделенных клеток используют для определения активности НАДФН-ГДГ и НАДФ-ГДГ лимфоцитов одним из известных способов, например, биолюминесцентным [6]. Для этого суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, разрушают путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. Затем непосредственно определяют активность НАДФН-ГДГ и НАДФ-ГДГ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов (для фермента НАДФ-ГДГ субстратом является глутамат - 0,5 мМ, кофактором НАДФ ⁺ - 1,65 мМ, рН буфера 9,8; для фермента НАДФН-ГДГ субстратом является 2-оксоглутарат - 100,0 мМ, кофактором НАДФН - 0,0025 мМ, рН буфера 7,4).

Необходимо отметить, что в инкубационную смесь для определения активности НАДФН-ГДГ и НАДН-ГДГ дополнительно вносят NH₄Cl в концентрации 5,0 мМ.

После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут для НАДФ-ГДГ или 5 минут для НАДФН-ГДГ к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5 M, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН:ФМН оксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М K⁺, Na⁺ фосфатном буфере с pH 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминометра, например марки "БЛМ-8803", измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определяют в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАД(Ф)Н: ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производили измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном pH-буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также pH-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строили для каждого pH буфера. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывают по формуле

A= [C]×V/T,

где A - активность дегидрогеназы, Е на 1×10⁴ лимфоцитов (1Е=1 мкмоль/мин [1]);

[C] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

T - время инкубации, мин.

Затем по соотношению уровней активности НАДФН-ГДГ и НАДФ-ГДГ находят величину коэффициента НАДФН/НАДФ⁺. Величина коэффициента, равная и выше 25, свидетельствует о развитие обострения ХГС, меньше 25 - об отсутствии обострения ХГС. Значение 25 получено опытным путем на основании сопоставления данных проведенного биолюминесцентного анализа, результатов медицинского обследования и последующего обострения ХГС. Величина коэффициента НАДФН/НАДФ ⁺, равная или больше 25, свидетельствует о выраженном превалировании восстановительного аминирования над окислительным дезаминированием, что снижает количество субстратов на энергетических процессах и, соответственно, понижает функциональную активность лимфоцитов.

Данный способ апробирован на 22 больных ХГС. Всем больным также проводились общепринятые лабораторные методы обследования при поступлении в стационар и в динамике через 6 месяцев: анализ периферической крови, биохимический анализ крови с определением концентрации общего билирубина и его фракций, тимоловой пробы, аминотрансфераз сыворотки крови (аланиновой аминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT). С помощью иммуноферментного анализа (ИФА) выявлялись антитела к core-протеину и к неструктурным белкам вируса (NS₃, NS₄, NS₅ ). Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяли РНК HCV. Совпадение прогноза оценивали по уровню АЛТ.

Таблица 1
Прогноз обострения ХГС по значению коэффициента НАДФН/НАДФ +
№	Развитие/отсутствие обострения	НАДФН/НАДФ +
1	не будет обострения	0,254
2	не будет обострения	12,835
3	не будет обострения	8,547
4	не будет обострения	0,120
5	не будет обострения	0,139
6	не будет обострения	1,203
7	не будет обострения	1,616
8	не будет обострения	12,269
9	не будет обострения	2,190
10	не будет обострения	7,853
11	не будет обострения	4,996
12	будет обострение	803.995
13	будет обострение	281.703
14	будет обострение	25,237
15	не будет обострения	12,369
16	будет обострение	25,237
17	не будет обострения	0,678
18	будет обострение	25,862
19	не будет обострения	0,139
20	не будет обострения	6,416
21	будет обострение	26,255
22	будет обострение	89,635

Активность НАДФН-ГДГ и НАДФ-ГДГ в лимфоцитах крови определяли с помощью биолюминесцентного метода у детей с ХГС.

По результатам биохимического анализа крови установлено, что у 15 детей и подростков в течение 6 месяцев не было обострения ХГС (активность АЛТ и ACT были в пределах нормы), у 7 - в диапазоне от 3 недель до 6 месяцев развилось обострение ХГС (при повторном обследовании обнаружено повышение активности аминотрансфераз в сыворотке крови).

У всех больных обнаружено совпадение прогноза, сделанного путем определения коэффициента НАДФН/НАДФ⁺.

Клинический пример 1

Больной Р., 14 лет ( № истории болезни 135) находился на плановом обследовании в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ № 20 им. И.С.Берзона г.Красноярска с диагнозом: Хронический вирусный гепатит С, неактивный. Соп. диагноз: хронический гастрит, дискинезия желчевыводящих путей. Ребенок состоит на диспансерном учете в течение 2 лет в диспансерном кабинете гепатоцентра МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска, когда был выставлен диагноз хронического вирусного гепатита C.

Из анамнеза известно, что ребенок получал переливание препаратов крови в возрасте 8 месяцев в связи с тяжелой пневмонией.

При поступлении в детское инфекционное отделение МУЗ ГКБ № 20 им. И.С.Берзона г.Красноярска мальчик жалоб не предъявлял.

Результаты биохимического исследования следующие: билирубин общий 14,6 мкмоль/л, АЛТ 0,6 ммоль*ч/л (в пределах нормы) ACT 0,24 (в пределах нормы) ммоль*ч/л.

При исследовании лимфоцитов периферической крови методом биолюминесценции с определением активности НАДФН- и НАДФ-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ было обнаружено, что НАДФН/НАДФ⁺ составил 1,203, что указывает на отсутствие обострения.

При обследовании в диспансерном кабинете гепатологического центра на базе инфекционного отделения МУЗ ГКБ № 20 им. И.С.Берзона через 6 месяцев активность аминотрансфераз также была в пределах нормы.

Клинический пример 2

Больная X., 17 лет ( № истории болезни 562) находилась на лечении в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ № 20 им. И.С.Берзона г.Красноярска с диагнозом: Хронический вирусный гепатит С, с умеренной степенью активности. Соп. диагноз: Синдром Жильбера.

Из анамнеза известно, что мать девочки также больна хроническим вирусным гепатитом С. Ребенок состоит на диспансерном учете в течение 9 лет (с 1999 г.) в диспансерном кабинете МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска, когда был выставлен диагноз хронического вирусного гепатита С. При плановом обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра выявлена гиперферментемия и ребенок был направлен в стационар для уточнения характера поражения печени и решения вопроса о тактике лечения.

При поступлении в стационар девочка предъявляла жалобы на боли в животе, слабость, утомляемость. Во время осмотра выявлены выраженная иктеричность кожи и склер, умеренное увеличение печени (1/3-2 см-2 см).

Результаты биохимического исследования следующие: билирубин общий 104,7 мкмоль/л (норма до 20 мкмоль/л), прямой 35,9 непрямой 71,5, АЛТ 2,15 ммоль*ч/л (выше нормы в 3,2 раза), ACT 1,045 ммоль*ч/л (выше нормы в 1,6 раза).

При исследовании лимфоцитов периферической крови методом биолюминесценции с определением активности НАДФН- и НАДФ-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ было обнаружено, что НАДФН/НАДФ⁺ составил 8,547, что указывает на отсутствие обострения.

В контрольном биохимическом анализе крови отмечалось снижение концентрации билирубина и нормализация показателей АЛТ и ACT. На 26 день пребывания в стационаре больная выписана.

При обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра на базе инфекционного отделения МУЗ ГКБ № 20 через 6 месяцев активность аминотрансфераз сохранялась на уровне нормальных показателей.

Клинический пример 3

Больной С., 10 лет ( № истории болезни 443), находился на плановом обследовании в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска с диагнозом: Хронический вирусный гепатит С, неактивный.

Из анамнеза известно, что ребенок получал переливание препаратов крови в возрасте 3 лет в связи с оперативным вмешательством. Больной наблюдается в течение 4 лет в диспансерном кабинете гепатоцентра МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит С. При плановом обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра выявлена гиперферментемия и ребенок был направлен в стационар для уточнения характера поражения печени и решении вопроса о тактике лечения.

Результаты биохимического исследования следующие: билирубин общий 16,3 мкмоль/л, реакция непрямая, АЛТ 0,6 ммоль*ч/л(в пределах нормы), ACT 0,25 ммоль*ч/л (в пределах нормы).

При исследовании лимфоцитов периферической крови методом биолюминесценции с определением активности НАДФН- и НАДФ-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ было обнаружено, что НАДФН/НАДФ⁺ составил 25,237, что указывает на развитие обострения.

На 10 день пребывания в стационаре больной выписан. Однако при амбулаторном обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра на базе инфекционного отделения МУЗ ГКБ № 20 им. И.С.Берзона через 6 месяцев вновь отмечено увеличение активности АЛТ и ACT в 1,3 раза.

Клинический пример 4

Больной Ч., 16 лет ( № истории болезни 546), находился на обследовании и лечении в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска с диагнозом: Хронический вирусный гепатит С, с минимальной степенью активности. Соп. диагноз: хр.гастрит, ДЖВП. Из анамнеза известно, что ребенок наблюдается с 2008 г. в диспансерном кабинете МУЗ ГКБ № 20 г.Красноярска с диагнозом: Хронический вирусный гепатит С. При плановом обследовании у ребенка регистрировалось повышение активности АЛТ и мальчик направлен в стационар.

Результаты биохимического исследования следующие: билирубин общий 18,7 мкмоль/л, реакция непрямая, АЛТ 1,05 ммоль*ч/л (выше нормы в 1,5 раз), ACT 0,44 ммоль*ч/л (в пределах нормы).

При исследовании лимфоцитов периферической крови методом биолюминесценции с определением активности НАДФН- и НАДФ-зависимых реакций глутаматдегидрогеназ было обнаружено, что НАДФН/НАДФ⁺ составил 281,703, что указывает на развитие обострения.

В контрольном биохимическом анализе крови отмечалась нормализация активности аминотрансфераз.

На 10 день пребывания в стационаре больной выписан. Однако при амбулаторном наблюдении в диспансерном кабинете через 6 месяцев вновь отмечено увеличение активности АЛТ и ACT в 1,6 раз.

Два последних примера указывают на необходимость ежемесячного мониторинга взятия биохимического анализа крови у больных ХГС с определением активности аминотрансфераз для более раннего выявления обострения.

Преимуществами предлагаемого способа являются:

1) возможность прогноза обострения ХГС у детей с клинико-биохимической ремиссией;

2) высокий уровень совпадения прогноза - 100%.

Предложенный способ может быть рекомендован для применения в клинической практике.

Используемые источники

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

2. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Моргунов К.В. Изменение показателей гуморального и клеточного иммунитета у пациентов с хроническим гепатитом С различной тяжести. // Вопр. вирусол. - 2003. - № 3. - С.15-18.

3. Патент РФ № 2188429 С2, G01N 33/68, G01N 33/84, БИПМ № 6, 27.02.2002.

4. Патент РФ № 2256925 C1, G01N 33/576, БИПМ № 20, 20.07.2005.

5. Патент РФ № 2354975 C1, G01N 33/53, G01N 33/68, C12Q 1/68, A61B 5/107 БИПМ № 13, 10.05.2009.

6. Савченко А.А. Биолюминесцентное определение активности НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ лимфоцитов. // Лаб. дело. - 1991. - № 11. - С.22-25.

7. Собчак Д.М., Корочкина О.В. Оценка показателей Т-клеточного иммунитета и медиаторов иммунного ответа у больных хроническим гепатитом С. // Журнал эпидемиол. и инфекц. бол. - 2007. - № 2. - С.37-42.

8. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. - М.: Медицина, 2000. - 432 с.

9. Boyum A. Isolation of lymphocytes from blood and bone marroow. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 1968. - Vol.21 (Suppl.97). - P.77-80.

10. Jacobs S.R., Rathmell J.C. Lymphocyte selection by starvation: glucose metabolism and cell death. // Trends Immunol. - 2006. - Vol.27, № 1. - P.4-7.