диссоциативный люминесцентный наносенсор

Формула изобретения

1. Диссоциативный люминесцентный наносенсор, представляющий собой комплекс, состоящий из люминесцирующих полупроводниковых нанокристаллов и связанных с ними молекул органического красителя, отличающийся тем, что молекулы органического красителя связаны с поверхностными ионами металла полупроводникового нанокристалла посредством координационной связи при непосредственном контакте молекулы органического красителя с поверхностью нанокристалла.

2. Диссоциативный люминесцентный наносенсор по п.1, отличающийся тем, что собственная люминесценция полупроводниковых нанокристаллов в комплексе отсутствует.

3. Диссоциативный люминесцентный наносенсор по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что в состав комплекса входят гидрофобные полупроводниковые нанокристаллы.

4. Диссоциативный люминесцентный наносенсор по п.3, отличающийся тем, что в состав комплекса входят молекулы гидрофобных органических красителей, способные образовывать комплекс с ионами металлов и(или) ионами водорода.

5. Диссоциативный люминесцентный наносенсор по п.4, отличающийся тем, что наносенсор помещен в тонкую гидрофобную полимерную пленку, не препятствующую проникновению определяемых ионов к наносенсору.

6. Диссоциативный люминесцентный наносенсор по п.4, отличающийся тем, что наносенсор находится в гидрофобной жидкой среде, имеющей фазовую границу с анализируемой пробой.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к устройствам, материалам и методам, предназначенным для качественного и количественного анализа ионов металлов или ионов водорода (определения изменения уровня кислотности, рН) в анализируемой пробе, и может быть использовано в медицине, биологии, экологии и различных отраслях промышленности.

Известен люминесцентный сенсор, состоящий из полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек, КТ), полимера и органических молекул, в котором отклик на наличие аналита в пробе состоит в изменении измеряемой интенсивности собственной люминесценции КТ, обусловленном вызванным наличием аналита сдвигом спектра поглощения органических молекул, которые частично поглощают люминесценцию полупроводниковых наночастиц ( Ion-selective quantum dots , авторы Clark Н.А., Harjes D.I., Dubach J.M. Патент США US/2008/0131909, кл. G01N 33/53, C12Q 1/20, C12M 1/34, заявка 11/888663, дата публикации 05.06.2008, приоритет 31.07.2007).

Известны диссоциативные люминесцентные сенсоры, в которых отклик на наличие аналита в пробе состоит в увеличении сигнала собственной люминесценции полупроводниковых нанокристаллов, вызванном диссоциацией их комплекса с органическим красителем в присутствии определяемого аналита, при этом стабильность комплекса в отсутствие аналита обеспечивается специальными связывающими молекулами - линковщиками :

1. Quantum dot nanoparticle-based universal neurotoxin biosensor , автор Bauer D. Патент США US/2007/212746, кл. C12Q 1/46, C12M 3/00, заявка 11/684109, дата публикации 13.09.2007, приоритет 09.03.2007, заявитель Bauer D.

2. Luminescent nanosensor , автор Mogul R. Мировой патент WO/2006/083269, кл. G01N 33/00, G01N 33/53, G01N 33/553, заявка PCT/US2005/016818, дата публикации 10.08.2006, приоритет 13.05.2005, заявитель Florida Atlantic University.

3. Detection method for specific biomolecular interactions using FRET between metal nanoparticle and quantum dot , авторы Kim H.-S., Oh E., Hong M.-Y., Lee D., Nam S. Патент США US/2006/0183247, кл. G01N 33/553, заявка 11/355069, дата публикации 17.08.2006, приоритет 16.02.2006.

Недостатками рассмотренных выше аналогов являются чувствительность, пониженная из-за наличия люминесценции КТ в отсутствие аналита, и достаточно сложная технология создания сенсора.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого технического решения является решение, защищенное патентом Colorimetric nanocrystal sensors, methods of making, and use thereof , авторы Miller B.L., Krauss T.D. Мировой патент WO/02/100805, кл. C07C, заявка PCT/US02/18760, дата публикации 19.12.2002, приоритет 13.06.2001, заявитель University of Rochester. Согласно прототипу сенсор представляет собой комплекс полупроводниковой наночастицы и органического люминофора или металлической наночастицы, связанных с помощью лиганда, также способного к образованию комплексов с молекулами анализируемого вещества, причем степень его связывания с молекулами аналита выше, чем степень связывания с полупроводниковым нанокристаллом. Собственная люминесценция полупроводниковой наночастицы в комплексе с органическим люминофором частично потушена в результате переноса энергии внутри комплекса. При добавлении в пробу аналита происходит диссоциация комплекса, приводящая к увеличению интенсивности люминесценции полупроводниковой наночастицы, которое регистрируется как признак наличия аналита и может служить для количественной оценки его концентрации.

Прототип имеет следующие недостатки:

1) принципиально ограниченные чувствительность и точность определения аналита, обусловленные тем, что КТ, входящие в состав сенсора, люминесцируют как в присутствии аналита в пробе, так и в его отсутствие, и наличие аналита в пробе определяется по изменению интенсивности люминесценции полупроводниковых нанокристаллов (разностный метод), а не по наличию или отсутствию люминесценции;

2) избыточная сложность композиции сенсора, включающей, помимо КТ и красителя, дополнительный связывающий агент, что усложняет и удорожает изготовление сенсоров.

Решается задача повышения чувствительности определения ионов металлов и водорода при упрощении композиции.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что КТ и органические молекулы, образующие диссоциативный люминесцентный сенсор, связываются в комплекс не с использованием дополнительного компонента, а посредством координационной связи молекул красителя с поверхностными ионами металла нанокристалла. При координационном типе связывания осуществляется непосредственный контакт молекулы с поверхностью нанокристалла, что обеспечивает максимальную эффективность переноса энергии. Собственная люминесценция КТ в таком комплексе полностью потушена за счет безызлучательного переноса энергии от КТ к молекуле органического красителя. Степень связывания молекул органического красителя с поверхностными ионами нанокристалла существенно ниже степени связывания данных молекул с детектируемыми свободными ионами, присутствующими в анализируемой пробе, поэтому при наличии аналита в пробе происходит диссоциация комплекса и появляется собственная люминесценция КТ, являющаяся индикатором наличия в пробе определяемого аналита. Интенсивность люминесценции служит количественной мерой концентрации ионов в анализируемой пробе. Тот факт, что люминесценция возникает только в присутствии аналита (нуль-метод), обеспечивает предлагаемому подходу принципиальное превосходство по чувствительности над аналогичными решениями, основанными на измерении разности сигналов (разностные методы).

Диссоциативный люминесцентный наносенсор, представляющий собой координационный комплекс полупроводникового нанокристалла и органических молекул, может быть расположен в полимерной пленке, не препятствующей проникновению определяемых ионов к наносенсору, либо в жидкой гидрофобной фазе, имеющей фазовую границу с исследуемой пробой. Это обеспечивает следующие дополнительные преимущества по сравнению с прототипом, предполагающим введение люминесцентных наносенсоров непосредственно в раствор:

1) удобство использования, упрощение пробоподготовки - заранее приготовленная пленка помещается в исследуемый раствор;

2) возможность проведения параллельного люминесцентного анализа большого числа пространственно разделенных микропроб, наносимых в виде двумерной матрицы на пленку с наносенсорами, - метода, аналогичного используемому для анализа «биочипов»;

3) возможность использования гидрофобных КТ, более дешевых и при этом обладающих значительно более высоким квантовым выходом люминесценции, чем гидрофильные КТ, используемые в большинстве аналогов.

Сущность предлагаемого изобретения поясняется фиг.1-6, где

на фиг.1 приведена структурная формула 1-(2-пиридилазо)-2-нафтола;

на фиг.2 представлены спектры люминесценции пленочного сенсора: 1 - до обработки раствором азотнокислого кобальта; 2 - после обработки раствором азотнокислого кобальта с концентрацией 3,8×10^-5 М; 3 - после обработки раствором азотнокислого кобальта с концентрацией 3,6×10^-4 М;

на фиг.3 приведена зависимость относительной интенсивности люминесценции пленочного сенсора от концентрации ионов кобальта в анализируемой пробе;

на фиг.4 представлены спектры люминесценции пленочного сенсора: 1 - до обработки раствором сернокислого никеля; 2 - после обработки раствором сернокислого никеля с концентрацией 7,0×10^-5 М; 3 - после обработки раствором сернокислого никеля с концентрацией 3,5×10^-4 М; 4 - после обработки раствором сернокислого никеля с концентрацией 7,0×10 ^-4 М;

на фиг.5 приведена зависимость относительной интенсивности люминесценции пленочного сенсора от концентрации ионов никеля в анализируемой пробе;

на фиг.6 приведена зависимость относительной интенсивности люминесценции пленочного сенсора от уровня кислотности.

В качестве примера нами были создан диссоциативный люминесцентный наносенсор, представляющий собой координационные комплексы полупроводниковых нанокристаллов и органических молекул, внедренные в полимерную пленку (пленочный сенсор). Были использованы КТ CdSe/ZnS диаметром 2.5 нм с максимумом люминесценции 530 нм, синтезированные в соответствии с известной процедурой (Sukhanova А., Baranov A.V., Perova T.S., Cohen J.H.M., and Nabiev I. Controlled Self-Assembly of Nanocrystals into Polycrystalline Fluorescent Dendrites with Energy-Transfer Properties. Angew. Chemie Int. Ed. 45(13), 2048-2052 (2006)).

В качестве органического красителя использовался 1-(2-пиридилазо)-2-нафтол (ПАН), который широко применяется в качестве металлоиндикатора. Структурная формула ПАН приведена на фиг.1. ПАН нерастворим в воде, но может экстрагировать из водной среды в хлороформ, бензол, четыреххлористый углерод и т.д. ионы многих металлов и образовывать с ними хелатные комплексы, в которых ионы металлов замещают водород оксигруппы и координационно связываются с атомами азота азогруппы.

Нами были приготовлены отдельно толуольные растворы КТ (концентрация 5,8×10^-4 М) и ПАН (концентрация 5,8×10^-3 М). Затем они смешивались с полиуретановым двухкомпонентным клеем Novacote NC-250-A+СА-350 фирмы NOVACOTE в следующих соотношениях: 1,5 мл раствора КТ+1,5 мл раствора ПАН+1 мл клея Novacote NC-250-A+СА-350. Полученную смесь наносили на лавсановую подложку, после нанесения пленки сушились около 15 минут при температуре воздуха 100°С, а затем в течение суток при комнатной температуре. При таком объемном соотношении полимерного клея и вводимых в него толуольных растворов нами были получены пленки толщиной от 1 до 3 мкм с молярным соотношением КТ и ПАН 1 к 10.

Полимерную пленку (способ приготовления см. выше) помещали в кювету с дистиллированной водой под 45° и проводили регистрацию спектров люминесценции с помощью спектрофлуориметра Флюорат-2-Панорама (Люмекс, Россия).

Для получения зависимости интенсивности люминесценции пленочного сенсора от концентрации ионов кобальта в анализируемой пробе одинаковые по площади образцы сенсора были выдержаны в растворах азотнокислого кобальта различной концентрации - от 3,8×10^-5 М до 9,9×10 ^-4 М. В случае анализа растворов на наличие ионов никеля использовались растворы сернокислого никеля с концентрациями от 7,0×10^-5 М до 1,0×10^-4 М. После этого образцы сенсора вынимались из растворов и проводилась регистрация их спектров люминесценции. На фиг.2 приведены спектры люминесценции образцов пленочного сенсора до и после воздействия на них раствором азотнокислого кобальта: 1 - до обработки раствором азотнокислого кобальта; 2 - после обработки раствором азотнокислого кобальта с концентрацией 3,8×10^-5 М; 3 - после обработки раствором азотнокислого кобальта с концентрацией 3,6×10 ^-4 М. Видно, что увеличение концентрации ионов кобальта в пробе приводит к существенному увеличению сигнала люминесценции сенсора.

Параллельно с появлением и ростом люминесценции наблюдалось изменение окраски пленочного сенсора с сиреневой на серо-зеленую, что свидетельствует о диссоциации комплексов КТ/ПАН и об образовании комплексов ПАН/ионы кобальта. На фиг.3 приведена зависимость относительной интенсивности люминесценции пленочного сенсора от концентрации ионов кобальта в анализируемой пробе.

Нами было исследовано воздействие ионов никеля на пленочный сенсор. На фиг.4 приведены спектры люминесценции образцов пленочного сенсора до и после обработки их раствором сернокислого никеля: 1) до обработки раствором сернокислого никеля; 2) после обработки раствором сернокислого никеля с концентрацией 7,0×10^-5 М; 3) после обработки раствором сернокислого никеля с концентрацией 3,5×10^-4 М; 4) после обработки раствором сернокислого никеля с концентрацией 7,0×10 ^-4 М.

Так же как и при воздействии на пленочный сенсор раствором азотнокислого кобальта, наличие в анализируемой пробе ионов никеля приводит к появлению отклика сенсора и его заметному увеличению с ростом концентрации ионов никеля в пробе. На фиг.5 представлена зависимость относительной интенсивности люминесценции пленочного сенсора от концентрации ионов никеля в анализируемой пробе.

Нами была получена зависимость интенсивности люминесценции пленочного сенсора с комплексами КТ/ПАН от уровня кислотности анализируемой пробы, приведенная на фиг.6. Пленочный сенсор помещался в кювету с дистиллированной водой, в которую затем было последовательно добавлено 0,5; 1,5; 4,0 и 4,5 мкл 100% уксусной кислоты, что соответствует рН раствора 5,72; 5,33; 4,99 и 4,75 соответственно, и через определенное время после каждой добавки (10 мин) регистрировалась люминесценция образца. Из чертежа видно, что образец реагировал на последовательное увеличение концентрации кислоты в кювете: после каждой добавки наблюдалось увеличение интенсивности люминесценции. При данных величинах добавок уксусной кислоты вымывания ПАНа из пленки не наблюдалось, после эксперимента цвет пленки не изменился. Это свидетельствует о том, что большая часть комплексов КТ/ПАН не диссоциировала.

Таким образом, предлагаемое изобретение обладает повышенной чувствительностью определения ионов металлов и водорода, простотой изготовления и отсутствием необходимости в специальной пробоподготовке.