ферментативная переэтерификация масла

Формула изобретения

1. Способ переэтерификации масла, содержащего одну или более из лимонной и/или фосфорной кислоты в качестве агентов, образующих хелаты с металлами, включающий стадии

а) приведения масла в контакт с основанием,

б) взаимодействия указанного масла с липазой,

при этом стадии а) и б) проводят последовательно или одновременно.

2. Способ по п.1, где масло представляет собой смесь двух или более масел.

3. Способ по п.1, где масло представляет собой пищевое масло, предпочтительно растительное масло.

4. Способ по п.3, где растительное масло (масла) выбирают из группы, состоящей из пальмового стеарина, пальмового олеина, пальмоядрового масла, кукурузного масла, масла канолы (рапсовых семян), соевого масла, хлопкового масла, пальмового масла, кокосового масла или подсолнечного масла, или их смеси.

5. Способ по п.1, где масло (масла) представляет(ют) собой неочищенное, рафинированное, отбеленное, дезодорированное масло или любую их комбинацию.

6. Способ по п.1, где агент, образующий хелаты с металлами, присутствует в масле в концентрации от 1 до 100 м.д., предпочтительно от 10 до 90 м.д., наиболее предпочтительно около 50 м.д.

7. Способ по п.1, где основание представляет собой гидроксид натрия (NaOH).

8. Способ по п.1, где основание представляет собой слабое основание, предпочтительно карбонат натрия (Na₂CO₃).

9. Способ по п.1, где липаза представляет собой липазу, специфичную для 1,3-положений.

10. Способ по п.1, где липаза представляет собой липазу грибов, предпочтительно рода Thermomyces, предпочтительно штамма вида Т.lanuginosus, или липазу В дрожжей вида Candida antactica.

11. Способ по п.1, где липаза иммобилизована.

12. Способ по п.1, где липаза представляет собой продукт LIPOZYME TL IM.

13. Способ по п.1, где основание используют в количестве от 0,001 до 100 ммоль на килограмм масла, предпочтительно от 0,01 до 10 ммоль основания на килограмм масла, наиболее предпочтительно 0,1-1 ммоль на килограмм масла.

14. Способ по п.1, где во время переэтерификации поддерживают температуру от 50 до 100°С, предпочтительно от 60 до 90°С, наиболее предпочтительно от 65 до 80°С.

15. Ферментная композиция для переэтерификации масла, содержащего один или более хелатообразующий агент, содержащая липазу с внедренным основанием.

16. Ферментная композиция по п.15, где основание представляет собой слабое основание, предпочтительно карбонат натрия.

17. Ферментная композиция по п.15, где основание представляет собой гидроксид натрия.

18. Ферментная композиция по п.15, где липаза представляет собой липазу грибов, предпочтительно рода Thermomyces, предпочтительно штамма вида Т.lanuginosus, или липазу В дрожжей вида Candida antactica.

19. Ферментная композиция по п.15, где липаза иммобилизована.

20. Ферментная композиция по п.15, где липаза представляет собой продукт LIPOZYME TL IM.

21. Ферментная композиция по п.15, где основание после растворения/диспергирования в воде с получением концентрации 1 М обеспечивает рН в интервале от 8 до 13.

22. Применение основания в способе переэтерификации масла, содержащего один или более хелатообразующий агент, с использованием липазы.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу ферментативной переэтерификации масла, содержащего один или более агентов, образующих хелаты с металлами. Изобретение также касается ферментной композиции, пригодной для переэтерификации с использованием липаз.

Уровень техники

Известно, что наличие металлов в маслах растительного и животного происхождения оказывает отрицательный эффект на стабильность этих масел. Поэтому масла часто обрабатывают агентами, образующими хелаты с металлами, такими как лимонная кислота или фосфорная кислота, для того чтобы удалить эти металлы.

Обычно растительные и животные масла и жиры используют в виде смесей, для того чтобы достичь требуемых для заданного применения физических и химических свойств. Более того, для получения подходящих свойств (например, профиля плавления, вкусового ощущения и т.д.) масла или смеси масел необходимо подвергать дальнейшей обработке. Профиль плавления обычно корректируют с помощью перегруппировки и перераспределения жирных кислот на глицериновом остове, что осуществляют как химическими, так и ферментативными способами. Этот способ обычно называется "переэтерификация". Ферментативную переэтерификацию проводят с использованием липазы.

Недостатком добавления в масло агента, образующего хелаты с металлами, является то, что он оказывает отрицательное воздействие на эффективность переэтерификации с использованием липазы.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является усовершенствование способа ферментативной переэтерификации масла, содержащего один или более агентов, образующих хелаты с металлами.

По настоящему изобретению переэтерификацию масла, содержащего один или более агентов, образующих хелаты с металлами, осуществляют путем 1) приведения в контакт масла с основанием, 2) взаимодействия масла с липазой.

Изобретение также относится к ферментной композиции, включающей в себя липазу и основание. Наконец, изобретение относится к применению основания для переэтерификации масла, содержащего один или более хелатообразующих агентов.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показано содержание твердого жира (SFC) при 40°C в смеси соевого масла, содержащей лимонную кислоту, до и после переэтерификации с добавлением и без добавления основания.

На фиг.2 представлена зависимость константы скорости (1/час) от количества масла, обработанного иммобилизованной липазой A (партия LA350005). Предварительная обработка: данные получены после предварительной обработки масла карбонатом натрия. Одновременная обработка: данные получены, когда масло одновременно подвергалось обработке карбонатом натрия и переэтерефикации. Контроль: данные получены при переэтерификации масла без предварительной обработки.

Подробное описание изобретения

Основным компонентом растительных и животных масел и жиров являются триацилглицерины, также называемые триглицеридами. Триглицерид состоит из трех остатков жирных кислот, связанных сложноэфирной связью с глицериновым остовом. Неполные глицериды также могут присутствовать в масле как его естественные составляющие. Они могут появляться при гидролизе одного или двух остатков жирных кислот на глицериновом остове. Растительные и животные масла и жиры часто требуют определенной модификации, чтобы их можно было использовать в качестве компонентов пищевых продуктов.

Часто требуется скорректировать профиль плавления, для того чтобы придать жиру требуемые физические свойства для заданного применения. Искомый профиль плавления зависит от ожидаемого применения. Подходящий профиль плавления обычно получают, комбинируя различное сырьевые вещества и его модификации. Содержание твердого жира (SFC) в растительных маслах обычно составляет около 10-30% при 40°C. "SFC" определяется как процентное содержание жира или масла в кристаллической форме при заданной температуре. Для использования в качестве компонента пищевого продукта в большинстве случаев желательно модифицировать масла так, чтобы величина SFC при 40°C находилась в диапазоне от 1 до 10%. Для продуктов, таких как маргарины, желаемая величина SFC составляет приблизительно 2-4%. Однако для других пищевых продуктов, например определенных видов шоколада, предпочтителен другой профиль SFC.

Способы модификации включают в себя смешивание с другими маслами, гидрирование, разделение на фракции и переэтерификацию. Переэтерификация перегруппировывает остатки жирных кислот на глицериновом остове таким образом, что меняется состав триглицерида. Во время переэтерификации могут также появиться неполные глицериды, но это обычно нежелательно. Как правило, количество образующихся неполных глицеридов мало.

Ионы металлов должны быть тщательно удалены из масла, поскольку они отрицательно влияют на его качество. Даже следовые количества железа, меди и марганца способны вызвать окисление. Для того чтобы удалить из масла ионы металлов, добавляют один или более агент, образующий хелаты с металлами. Агенты, образующие хелаты с металлами, предпочтительно такие как лимонная кислота и/или фосфорная кислота, добавляют в масло. После образования хелатного комплекса хелатообразующий агент остается растворенным в масле в концентрации 1-100 м.д., обычно 10-90 м.д., например, приблизительно 50 м.д. Пищевые масла обрабатывают агентами, образующими хелаты с металлами, пригодными для потребителя конечного продукта. В предпочтительном варианте осуществления агентом, образующим хелаты с металлами, является кислота, предпочтительно лимонная кислота и/или фосфорная кислота. По настоящему изобретению переэтерификацию проводят ферментативным способом с использованием липазы, и переэтерификации подвергают масло, обработанное хелатообразующим агентом, для того чтобы удалить ионы металлов.

Главным недостатком обработки масла хелатообразующим агентом является то, что даже незначительное количество хелатообразующего агента, оставшегося в масле, оказывает отрицательное воздействие на эффективность липазы при переэтерификации. Например, авторы изобретения обнаружили, что эффективность иммобилизованной липазы Thermomyces lanuginosa при переэтерификации соевого масла, содержащего 50 м.д. лимонной кислоты, оказывается до 65% ниже, чем при переэтерификации масла без лимонной кислоты.

Таким образом, требующая решения проблема заключается в том, чтобы предоставить усовершенствованный способ ферментативной переэтерификации масла, содержащего один или более агент, образующий хелаты с металлами, с использованием липазы. Усовершенствование включает повышенную производительность ферментной композиции и/или повышенный средний выход продукта ферментной композиции за один проход в единицу времени.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что добавление основания в масло оказывает значительное положительное влияние на эффективность липазы. Данное влияние иллюстрируется ниже в примере 1. Способ настоящего изобретения можно проводить в условиях, обычно используемых для переэтерификации с использованием липазы, за исключением того, что вводят эффективное количество основания. Например, способ переэтерификации настоящего изобретения можно проводить при температуре от 50 до 100°C, предпочтительно от 60 до 90°C, наиболее предпочтительно от 65 до 80°C.

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к способу переэтерификации масла, содержащего один или более агентов, образующих хелаты с металлами, включающими в себя стадии:

1) приведения указанного масла в контакт с основанием,

2) взаимодействия масла с липазой.

По настоящему изобретению стадии 1) и 2) можно проводить последовательно или одновременно. Последовательная обработка означает, что масло предварительно обрабатывают основанием до того, как добавляют липазу. По настоящему изобретению также предусмотрено первоначальное добавление основания и части, например, 10-90%, а именно 30-70%, липазы в масло, а затем через некоторое время добавление остатка липазы, например, 90-10%, а именно 70-30%.

Одновременная обработка означает, что масло подвергают воздействию основания и липазы в одно и то же время. Одновременное осуществление стадий 1) и 2) можно осуществить путем добавления в масло композиции настоящего изобретения, включающей основание и липазу, предпочтительно иммобилизованную липазу. Одновременный и последовательный способы проиллюстрированы в Примере 2.

В предпочтительном варианте осуществления основание добавляют в масло до липазы и, следовательно, до переэтерификации. Основание может быть добавлено в масло любым способом. В одном варианте осуществления основание вносят в масло с использованием мешалки с уменьшающимся сдвиговым усилием. Однако также можно использовать другие способы смешивания. После объединения основания с маслом можно добавить липазу.

В другом предпочтительном варианте осуществления основание добавляют в масло одновременно с липазой. Основание и липазу можно вносить в масло любым подходящим способом, таким как с помощью мешалки, как описано выше. Как будет описано ниже, основание также может быть успешно включено в состав ферментной композиции, например в виде физической смеси липазы, предпочтительно иммобилизованной липазы, и основания или в виде иммобилизованной липазы с внедренным основанием.

В третьем предпочтительном варианте осуществления масло обрабатывают основанием на отдельной стадии способа, и основание удаляют из масла до того, как масло и фермент вступят в контакт.

В четвертом предпочтительном варианте осуществления колонку заполняют основанием. Масло приводят в контакт с основанием, пропуская его через слой основания внутри колонки. Таким способом обработка основанием легко может быть проведена, например, на типовой установке непрерывной ферментативной переэтерификации, включающей один или несколько последовательно соединенных реакторов со слоем носителя, содержащих липазу.

Вне связи с конкретной теорией можно предположить, что причиной падения производительности липазы во время переэтерификации масла, содержащего агент, образующий хелаты с металлами, может являться то, что агент, образующий хелаты с металлами, например, лимонная кислота, в локальном окружении поблизости от активного центра фермента может оказывать влияние на заряды образом, не благоприятным для липазы, например, липазы Thermomyces lanuginose. Следовательно, присутствие основания в масле меняет заряд кислоты, например, лимонной кислоты, таким образом, что она уже не оказывает неблагоприятного влияния на липазу, благодаря чему производительность липазы возрастает.

Пищевые масла:

В способе настоящего изобретения может использоваться любое пищевое масло. Масло может быть любого качества, например неочищенное, рафинированное, отбеленное и дезодорированное или их комбинация.

Например, рафинированное масло может быть получено путем обработки 0,05-0,1% фосфорной кислотой для удаления смол при температуре 60-90°C в течение 10-30 минут. Отбеленное масло может быть получено путем обессмоливания 0,05-0,1% фосфорной кислотой, с последующим отбеливанием 1% отбельной глины при 105-110°C в течение 15-30 минут и фильтрацией для удаления отбельной глины. Активированную отбельную глину можно обработать серной или соляной кислотой. В другом предпочтительном варианте осуществления смесь масла представляет собой, например, 27% полностью гидрированного соевого масла («Соевые хлопья»), смешанного с соевым маслом.

В предпочтительном варианте осуществления масло является растительным маслом. Примеры растительных масел включают масла, выбранные из группы, состоящей из масла канолы (рапсовые семена), соевого масла, хлопкового масла, пальмового масла, пальмового стеарина, пальмового олеина, пальмоядрового масла, кокосового масла, кукурузного масла и подсолнечного масла.

По настоящему изобретению также допускается смесь масел. Например, смесь масел может содержать одно или более как полностью, так и частично отвержденных масел.

В варианте осуществления смесь представляет собой смесь полностью или частично отвержденного соевого и/или хлопкового масла с соевым маслом в весовом соотношении компонентов смеси от 10:90 до 50:50, предпочтительно от 25:75 до 30:70. В предпочтительном варианте осуществления изобретения смесь масел представляет собой смесь пальмового стеарина и кокосового масла, где кокосовое масло является или рафинированным, или рафинированным и отбеленным.

В одном варианте осуществления масло, которое подвергается переэтерификации, представляет собой пальмовый олеин без добавок, который становится тверже (а не мягче), когда подвергается переэтерификации.

Липазы

Липаза, используемая в способе настоящего изобретения и/или входящая в композицию настоящего изобретения, может быть получена из микроорганизмов, предпочтительно мицелиальных грибов, дрожжей или бактерий. В одном варианте осуществления липаза может быть получена в виде иммобилизованного продукта, как описано ниже.

В контексте настоящего изобретения термин «получен из», когда он используется в связи с конкретным микроорганизмом в качестве источника, обозначает, что фермент и, соответственно, последовательность ДНК, кодирующая указанный фермент, продуцируется соответствующим источником. Фермент в таком случае получают из указанного конкретного источника стандартными известными способами, позволяющими квалифицированному специалисту получить образец, содержащий фермент и подходящий для использования в способе настоящего изобретения. Указанные стандартные способы могут представлять собой непосредственное выделение из указанного конкретного источника или клонирование последовательности ДНК, кодирующей фермент, с последующей рекомбинантной экспрессией или в том же источнике (гомологичная рекомбинантная экспрессия), или в другом источнике (гетерологичная рекомбинантная экспрессия).

Липаза может представлять собой неспецифическую липазу, способную высвободить или присоединить любую жирнокислотную группу в любом положении глицерида. Такие липазы получают из Candida cylindracae, Corynebacterium acnes и Staphylococcus aureus (Macrae, J.A.O.C.S., 1983, 60:243A-246A; Патент США № 5128251). Липаза также может представлять собой фермент, который присоединяет или отщепляет только конкретную жирнокислотную группу в конкретном глицериде. Такие липазы пригодны для получения или модификации конкретных глицеридов. Такие липазы получают из Geotrichum candidium и Rhizopus, Aspergillus и Mucor genera (Macrae, 1983; Патент США № 5128251). Липаза также может представлять собой липазу, специфичную для 1,3-положений. Такие липазы получают из Thermomyces lanuginosa, Rhizomucor miehei, Aspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus delemar и Rhizopus arrhizus (Macrae, 1983).

Предпочтительные липазы, применяемые в способе настоящего изобретения, получают из видов мицелиальных грибов рода Thermomyces, таких как штамм вида Thermomyces lanuginosa, предпочтительно описанный в европейском патенте № 305216-B1, или рода Fusarium, такие как штаммы видов Fusarium culmorum, F. heterosporum, F. solani или F. oxysporum. В другом предпочтительном варианте осуществления липазу получают из дрожжей, таких как Candida, предпочтительно вида Candida antactica. В особенности предполагается применение липазы B (CaIB) Candida antactica.

Иммобилизованные липазы

В способе настоящего изобретения могут быть использованы липазы в твердой форме, такие как иммобилизованные липазы. Хорошо известны различные способы иммобилизации липаз. Обзор по иммобилизации липаз содержится в "Journal of American Oil Chemist's Society", Vol.67, pp. 890-910 (1990), где приведены примеры типичных носителей иммобилизованной липазы, в том числе неорганические носители, такие как кизельгур, диоксид кремния, пористое стекло и т.д.; различные искусственные смолы и искусственные ионообменные смолы и натуральные полисахаридные носители, такие как целлюлоза и поперечносшитый декстрин с введенными ионообменными группами.

Пригодные в качестве носителей материалы включают полипропилен, например ACCUREL (Accordis Membranes GmbH), и кремний или их смесь. Подходящие методы иммобилизации описаны в европейском патенте 140542, патенте США № 4818695, патенте США № 5128251, патенте США № 5508185 и патенте США № 6156548 (которые включены в данное описание в качестве ссылки).

Предпочтительная иммобилизованная липаза Humicola lanuginose (та же самая, что и липаза Thermomyces lanuginosa) описана в патенте США № 5776741 (который таким образом включен в данное описание в качестве ссылки). Другой предпочтительной липазой является липаза B Candida antactica (CaIB) (см., например, Uppeberg et al., 1994, Structure 2:293-308), иммобилизованная способом, описанным в патенте США № 5776741.

Наконец, примеры пригодных коммерчески доступных липаз включают липазы, продаваемые под торговыми наименованиями LIPOZYME TL IM , LIPOZYME RM IM (поставляются Novozymes, Дания).

Основания

В способе настоящего изобретения можно использовать любое основание. В предпочтительном варианте осуществления основание представляет собой «слабое основание». «Слабое основание» в контексте настоящего изобретения определяется как основание, которое после растворения/диспергирования в воде с получением концентрации 1 М обеспечивает pH в интервале от 8 до 13, предпочтительно основание, которое обеспечивает pH около 11, а именно pH от 10 до 12, или pH, соответствующий диапазону pH +/-1 около оптимума pH липазы, о которой идет речь.

Основание может представлять собой сильное основание, в том числе гидроксид лития (LiOH), гидроксид натрия (NaOH), гидроксид калия (KOH), гидроксид рубидия (RbOH), гидроксид цезия (CsOH), гидроксид кальция (Ca(OH)₂), гидроксид стронция (Sr(OH) ₂), гидроксид бария (Ba(OH)₂).

Основание предпочтительно является таким основанием, как амин или карбонат. Примеры слабых оснований могут быть выбраны из группы, состоящей из: аммиака (NH₃), аланина (C ₃H₅O₂NH₂), диметиламина ((CH₃)₂NH), этиламина (C₂H ₅NH₂), глицина (C₂H₃O ₂NH₂), гидразина (N₂H₄ ), метиламина (CH₃NH₂), триметиламина ((CH ₃)₃N) и карбоната натрия (Na₂CO ₃), гидрокарбоната натрия, (NaHCO₃), нитрита натрия (NaNO₂), ацетата натрия (CH₃COO Na).

В предпочтительном варианте осуществления основание представляет собой карбонат натрия (Na₂CO ₃). В предпочтительном варианте осуществления основание используют в количестве от 0,01 до 100 миллимоль на грамм фермента, предпочтительно от 0,1 до 60 ммоль основания на грамм фермента.

В варианте осуществления основание используют в количестве от 0,001 до 100 ммоль на килограмм масла, предпочтительно между 0,01 и 10 ммоль основания на килограмм масла, как правило, 0,1-1 ммоль на килограмм масла.

Ферментная композиция

В этом аспекте настоящее изобретение относится к ферментной композиции, включающей липазу и основание. Основание может быть любым из перечисленных и/или определенных выше в разделе "Основания". Ферментную композицию можно добавлять непосредственно в масло, содержащее хелатообразующий агент. Ферментная композиция настоящего изобретения обеспечивает более благоприятные условия для липазы во время переэтерификации масла, содержащего хелатообразующий агент, чем ферментная композиция, содержащая только липазу.

Композицию настоящего изобретения можно составить любым способом, подходящим для использования в переэтерификации масла. Композицию можно получить в виде иммобилизованного продукта. В предпочтительном варианте осуществления композиция представляет собой гранулят, содержащий липазу и основание. Ферментная композиция настоящего изобретения может представлять собой смесь иммобилизованной липазы и основания или иммобилизованную липазу с внедренным основанием.

Липаза может представлять собой любую липазу, такую как описанные выше в разделе «Липазы». В предпочтительном варианте осуществления липаза представляет собой липазу Thermomyces lanuginose или может представлять собой липазу B (CaIB) Candida antactica. В предпочтительном варианте осуществления ферментная композиция представляет собой гранулят, содержащий иммобилизованную липазу Thermomyces lanuginose или липазу B Candida antactica и основание, предпочтительно слабое основание, главным образом, карбонат натрия.

Применение оснований

Настоящее изобретение также относится к применению основания в способе переэтерификации масла, содержащего один или более хелатообразующий агент, с помощью липазы. Когда в таком способе переэтерификации используют основание, производительность повышается, как показано в примере 3. Основание и липаза, соответственно, могут представлять собой любые из указанных выше в разделах «Основания» и «Липазы».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ :

Фермент:

Иммобилизованная липаза А: иммобилизованную липазу Humicola lanuginosa/Thermomyces lanuginose получают рекомбинантным способом в Aspergillus oryzae, как описано в европейском патенте № 305216-B1. Способ иммобилизации описан в патенте США № 5776741.

Na₂CO₃: Sigma chemical Company, аналитической степени чистоты (пример 2).

Na₂CO₃: Карбонат натрия безводный, NF/EP мелкозернистый, поставляемый Jost Chemical (пример 3).

Масла:

- Полностью гидрированное соевое масло: («Соевые хлопья» Bunge Foods лот 345M4-T106R3) (пример 1).

- Соевое масло: "Master Chef Salad Oil" C&T Refinery, Charlotte, NC лот L3C27 1337 (пример 1).

- Смесь полностью гидрированного соевого масла и соевого масла (массовое соотношение компонентов в смеси 27:73 (мас./мас.)). Жидкое соевое масло представляет собой "raffinert soyaolje" (Denofa, Норвегия). Это масло представляет собой RBD (рафинированное, отбеленное, дезодорированное) масло, о котором известно, что оно содержит лимонную кислоту. Полностью гидрированные соевые хлопья получают от Loders Croklaan, США. Информация о содержании в хлопьях лимонной кислоты отсутствует (пример 2).

- Рафинированная смесь пальмового стеарина и кокосового масла (пример 3).

- Отбеленная смесь пальмового стеарина и кокосового масла (пример 3).

Методы:

Определение содержания твердого жира (SFC)

Способ, использованный для определения содержания твердого жира, основан на официальной методике AOCS Cd 16b-93 "Определение содержания твердого жира (SFC) с помощью ядерного магнитного резонанса низкого разрешения".

Единицы измерения: Содержание твердого жира определяют в процентах.

Аппаратура: Печь - поддерживается температура 100°C.

Охлаждающая ванна с температурой 0°C.

Водяная баня с постоянной температурой (от 10 до 60°C +/-0,1°C).

Металлические (алюминиевые) штативы для ампул для измерения SFC.

Ампулы для измерения SFC

ЯМР-спектрометр, Minispec mq-series 2001, Bruker Optics Inc, TX, США.

Секундомер

Определение SFC проводят следующим образом:

Стадия	Процедура
1	Смесь жиров плавят при 100°C в течение 30 минут (или используют микроволновую печь)
2	Смесь жиров (примерно 3 мл) перемещают в ампулы для ЯМР (с повторами)
3	Ампулы нагревают при 100°C примерно 5 минут (если в ампулах присутствует твердое вещество)
4	Ампулы для ЯМР перемещают в водяную баню с температурой 60°C на 5-15 минут
5	Ампулы для ЯМР перемещают в охлаждающую ванну с температурой 0°C на 60+/-1 мин
6	Ампулы для ЯМР последовательно помещают на 30 минут в водяную баню с выбранной температурой, например, в основном измерения проводят при температуре 10°C, 21,1°C, 33,3°C и 40°C.
7	Ампулы для ЯМР помещают в камеру ЯМР-спектрометра по одной и проводят измерения настолько быстро, насколько это возможно. Магнит ЯМР-спектрометра термостатируется при 40°C.

Образцы минерального масла для калибровки ЯМР-спектрометра поставляются Bruker Optics Inc, TX, США.

Вычисления: результат представляет собой процентное соотношение, например: «23,24% SFC».

Ссылка: официальная методика AOCS Cd 16b-93 "Определение содержания твердого жира (SFC) с помощью ядерного магнитного резонанса низкого разрешения" QMS 2003-22839.

АНАЛИЗ МНОГОКРАТНЫХ РЕАКЦИЙ В РЕАКТОРЕ ПЕРИОДИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

Данный способ использовали для определения эффективности иммобилизованной липазы для переэтерификации в многократных реакциях в реакторе периодического действия.

Методика: Смесь масла подвергают переэтерификации в реакторе периодического действия с использованием в качестве катализатора иммобилизованной липазы. В конце каждой из реакций масло декантируют с катализатора, который остается в реакторе. Затем к катализатору добавляют свежее масло и проводят следующую реакцию. В каждой из реакций определяют среднюю скорость ферментативной реакции.

На основе средней скорости ферментативной реакции в последовательно проводимых реакциях с повторным использованием фермента можно установить зависимость скорости дезактивации фермента от объема масла, которое подвергалось воздействию фермента.

Для того чтобы количественно определить изменение свойств жира благодаря переэтерификации, используют содержание твердого жира (SFC).

Результаты: Обычно эксперименты проводят для того, чтобы:

* Осуществить непосредственное сравнение эффективности двух и более иммобилизованных ферментных продуктов с помощью графиков зависимости или содержания твердого жира, или средней константы скорости реакции от порядкового номера реакции в реакторе периодического действия или количества обработанного масла на единицу массы иммобилизованного фермента.

* Установить среднюю скорость выработки для заданной производительности при постоянном превращении в соответствии с описанной ниже моделью. Единицей измерения результата является отношение массы переэтерифицированного масла к массе иммобилизованного фермента в единицу времени.

Реактор периодического действия	Флакон квадратного сечения Duran с противокапельным кольцом и винтовой крышкой. Емкость 250 мл
Печь с орбитальным встряхивателем	Печь, способная поддерживать постоянную температуру 70°C+/-2°C и которая может быть укомплектована орбитальным встряхивателем. Диаметр орбиты: 25 мм Скорость встряхивания: 300 об/мин

Для получения более подробной информации см. «Novozymes' Standard Method (346-SM-0010.01)», который может быть предоставлен по запросу Novozymes A/S, Дания.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Влияние основания на эффективность липазы при переэтерификации масла, содержащего хелатообразующий агент

Этот эксперимент был проведен, чтобы исследовать эффект добавления основания (Na₂CO ₃) в масло, содержащее лимонную кислоту.

Приготовление смеси масел, содержащей лимонную кислоту

Эксперимент был проведен с использованием 27% полностью гидрированного соевого масла ("Соевые хлопья", Bunge Foods лот 345M4-T106R3), смешанного с коммерческим соевым маслом ("Master Chef Salad Oil" C&T Refinery, Charlotte, NC Lot L3C27 1337).

Приготовление смеси масел: Нагревают 73 грамма полностью гидрированного соевого масла до 70-80°C и добавляют 27 граммов соевых хлопьев. Перемешивают и нагревают до тех пор, пока не расплавится все твердое вещество. Добавляют лимонную кислоту (10-30 м.д.) и перемешивают в течение примерно 30 минут. Разливают в пластиковые бутылки и хранят в низкотемпературном шкафу до использования.

Переэтерификация смеси масел

0,5 грамма карбоната натрия («карбонат натрия, безводный, чистый для анализа, гранулированный», позиция 7525 в каталоге Mallincrodt) вносят в 110 граммов смеси масел вместе с 0,5 грамма иммобилизованной липазы A. Основанию и ферменту дают осесть под действием силы тяжести. Смесь масел встряхивают в орбитальном термостате при 200 об/мин (орбита 25 мм) примерно 22-23 часа. Переэтерификацию проводят при 70°C и повторяют со смесью масел, в которую не добавляют основание.

Определение SFC переэтерифицированной смеси масел с основанием и без основания

100 г смеси масел декантируют из флакона, соблюдая осторожность, чтобы весь фермент и основание оставались во флаконе. SFC масла определяют с помощью способа определения SFC, описанного выше. SFC измеряют при 40°C. 100 г новой смеси масел добавляют во флакон, содержащий фермент и основание, и процедуру переэтерификации повторяют. В общей сложности переэтерификацию повторяют девять раз в течение двух недель с использованием тех же самых фермента и основания, тогда как масло заменяют каждые 22-23 часа. Массу каждой добавленной и декантированной порции масла фиксируют.

Экспериментальные данные представлены на фиг.1. Содержание твердого жира в масле после каждой реакции в реакторе периодического действия изображено в зависимости от количества масла, контактировавшего с ферментом. Содержание твердого жира масла понижается благодаря реакции переэтерификации. Следовательно, чем ниже SFC, полученное при одинаковых условиях реакции, тем выше активность фермента. Из фиг.1 видно, что присутствие основания (карбоната натрия) значительно увеличивает эффективность липазы при переэтерификации.

ПРИМЕР 2

Увеличение эффективности иммобилизованной липазы благодаря предварительной обработке масла карбонатом натрия

Эффективность иммобилизованной липазы A исследуют в экспериментах по проведению многократных реакций переэтерификации в реакторе периодического действия. При этом используют смесь полностью гидрированного соевого масла и соевого масла (массовое соотношение компонентов смеси 27:73 (мас./мас.)).

В многократных реакциях в реакторе периодического действия фермент повторно используют в серии реакций. Каждую реакцию проводят при практически постоянном соотношением количества масла и фермента, постоянном времени реакции и постоянной температуре 70°C. Уровень переэтерификации количественно определяют с помощью измерения содержания твердого жира (SFC) в жире при 40°C.

Реактор периодического действия представляет собой квадратный флакон емкостью 250 мл. Во время реакции флакон постоянно встряхивается в орбитальном встряхивателе. Диаметр орбиты встряхивателя 1 дюйм, и он работает на скорости 200 об/мин.

Партию иммобилизованной липазы A (партия LA350005) и карбоната натрия (Na₂ CO₃) исследуют в условиях 1) предварительной обработки масла с помощью Na₂CO₃ перед переэтерификацией, т.е. последовательной обработки, и 2) обработки масла Na ₂CO₃ во время переэтерификации, т.е. одновременной обработки. Контрольный эксперимент по переэтерификации с использованием иммобилизованной липазы A проводят, используя такую же смесь масел, но без предварительной обработки масла. Было исследовано три сочетания предварительной обработки и фермента.

Предварительная обработка

Предварительную обработку масла проводят по следующему способу. Герметизированную емкость, заполненную необработанным маслом, помещают на ночь в термошкаф при 70°C.

Затем масло разливают во флаконы емкостью 1 литр и добавляют 1% (мас./мас.) карбоната натрия. Флакон продувают азотом и тщательно закрывают. Флакон с маслом и карбонатом натрия ставят на водяную баню на ночь. Масло и карбонат натрия постоянно перемешивают с помощью магнитной мешалки. На следующий день перемешивание прекращают, чтобы дать карбонату натрия осесть. Для проведения серии экспериментов в реакторе периодического действия масло декантируют непосредственно из флакона, соблюдая осторожность, чтобы реагенты для предварительной обработки остались во флаконе.

Одновременная обработка

Для одновременной обработки фермент и карбонат натрия отвешивают непосредственно в реактор. Во флакон добавляют 1 грамм карбоната натрия и 0,5 грамма иммобилизованной липазы A. Твердые компоненты для предварительной обработки остаются во флаконе в течение всего эксперимента.

100 граммов масла приводят в контакт с 0,5 грамма липазы A.

Определение активности

Кинетику реакции переэтерификации с использованием липазы A рассчитывают по модели обратимой реакции первого порядка, где в качестве концентрации используют содержание твердого жира.

(1)

где

k - константа скорости,

SFC _in - содержание твердого жира в масле, поступающем в реактор,

SFC_out - содержание твердого жира в масле, выходящем из реактора,

SFC_eq - содержание твердого жира в масле в состоянии равновесия,

w - масса катализатора - иммобилизованной липазы A,

M_b - масса масла в реакторе и

t _b - время реакции в реакторе периодического действия.

Для определения константы скорости как функции производительности можно использовать экспоненциальную модель

(2)

где

k_model - модель константы скорости

k₀ - константа скорости для свежего фермента

V - количество субстрата, полуинактивирующее фермент - отношение количества масла к количеству фермента, которое необходимо, чтобы уменьшить k_model на 50%.

V - отношение количества масла, которое прошло через реактор, к количеству фермента.

На фиг.2 изображена зависимость константы скорости от отношения количества переэтерифицированного масла к количеству иммобилизованной липазы A для каждого типа обработки.

Из фиг.2 видно, что фермент сохраняет значительно более высокую активность в масле, которое было обработано карбонатом натрия или предварительно, или во время переэтерификации.

Константа скорости и количество субстрата, полуинактивирующее фермент, определяются с помощью расчета параметров инактивационной модели (2) по данным, показанным на фиг.2. Эти величины приведены ниже в таблице 1.

Таблица 1 Параметры модели - Lipozyme TL IM, партия LA350005
Образец	V (кг/кг)	k0 (мин-1)
Реагент	Порядок обработки
Na2CO3	Предварительная	596	0,293
Na2CO 3	Предварительная	594	0,301
Na2CO3	Предварительная	626	0,289
Na2CO 3	Одновременная	722	0,247
Na2CO3	Одновременная	788	0,235
Нет	Контроль	504	0,215
Нет	Контроль	418	0,237
Нет	Контроль	414	0,250

k ₀ - константа скорости для свежего фермента и V - количество субстрата, полуинактивирующее фермент.

Найденные для инактивационной модели величины параметров показывают, что обработка карбонатом натрия повышает главным образом стабильность фермента в масле, характеризующуюся количеством субстрата, полуинактивирующим фермент. Количество субстрата, полуинактивирующее фермент, благодаря обработке карбонатом натрия возрастает на 30-70%.

ПРИМЕР 3

Достигаемая производительность липазы A, измеренная с помощью анализа комбинации масла с ферментом с помощью многократных реакций в реакторе периодического действия

В этом эксперименте эффективность переэтерификации исследуют с помощью описанного выше в разделе «Материалы и методы» анализа многократных реакций в реакторе периодического действия.

Смеси масел представляют собой смеси пальмового стеарина и кокосового масла, причем кокосовое масло является или рафинированным, или рафинированным и отбеленным. Эти смеси предварительно обрабатывают Na₂CO₃ и переэтерифицируют с использованием иммобилизованной липазы A, и производительность фермента в масле сравнивают с контрольными образцами, которые не подвергают предварительной обработке Na₂CO₃.

ТАБЛИЦА Результаты определения производительности
Образец			Производительность кг масла/кг фермента После исследования производительности, сохранилось 10% относительной активности липазы
Рафинированное масло	-	Контроль	1650
	Na2 CO3	Предварительная обработка	3620
Отбеленное масло	-	Контроль	210
	Na2 CO3	Предварительная обработка	3250

Производительность на образце рафинированного масла оказывается равной 1650 кг масла/кг фермента. При использовании предварительной обработки Na ₂CO₃ производительность повышается до 3620 кг масла/кг фермента.

На отбеленном масле производительность составляет 210 кг масла/кг фермента. Когда отбеленное масло подвергают предварительной обработке Na₂CO₃, производительность вырастает до 3250 кг масла/кг фермента, тогда как производительность на рафинированном масле вырастает от 1650 до 3620 кг масла/кг фермента.