способ восстановления эпителия тощей кишки лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения

Формула изобретения

Способ восстановления эпителия тощей кишки старых лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения, который осуществляют через 25-30 мин после облучения путем внутривенной трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, в количестве 6·10⁶ клеток/кг.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к способам лечения лучевой болезни, и может быть использовано для восстановления эпителия тощей кишки лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения.

Природа радиационного поражения организма животного и человека интенсивно изучается уже несколько десятилетий. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) относится к критическим системам клеточного обновления млекопитающих при облучении. Под действием излучения в слизистой оболочке ЖКТ происходят резкие нарушения динамического равновесия между отдельными пулами, приводящие к тяжелым функциональным расстройствам в самой системе. В зависимости от выраженности расстройств это может иметь существенное значение для жизнедеятельности всего организма. Восполнение клеточной убыли составляет первостепенную задачу проводимой функциональной терапии, способствующей ослаблению первичных нарушений, угрожающих жизни. Первичным нарушением в тонком кишечнике является клеточное опустошение ворсинок и крипт.

Восстановление регенерации криптального эпителия после острого лучевого поражения можно свести к пролиферации клеток, сохранивших жизнеспособность, благодаря чему восполняется убыль популяции клеток, а следовательно, восстанавливается их функциональная полноценность (О.И.Василенко. Радиационная экология [Текст] /Василенко О.И., М.: Медицина, 2004. - 88 с.).

Следующим направлением в патогенетической терапии лучевых поражений эпителия кишечника является использование метаболических средств (Г.Л.Вышковский. Регистр лекарственных средств России (Текст)/ Г.Л.Вышковский. - М.: РЛС, 2005. - С.195).

Препарат - бутилированный гидрокситолуол может использоваться при лучевых поражениях слизистой оболочки кишечника, так как оказывает выраженное антиоксидантное, антигипоксическое, противовоспалительное, регенерирующее действие.

Недостатками применения этих препаратов (метаболических средств и, в частности, бутилированного гидрокситолуола) являются побочные эффекты: аллергические реакции, уретрит, простатит.

Восстановление регенерации эпителия тощей кишки обеспечивается применением препаратов, повышающих регенераторный потенциал эпителиоцитов крипт. Типичным представителем препаратов, оказывающих стимулирующее действие на процессы регенерации, является дезоксинат (деринат). Деринат представляет собой натриевую соль ДНК, полученную из молок осетровых рыб. Данный препарат применяют не позднее 24 ч после облучения. Его вводят однократно внутримышечно или подкожно в объеме 15 мл (75 г активного вещества) (Куценко С.А. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита [Текст]: учеб. пособие для студентов мед. Вузов / С.А.Куценко, Н.В.Бутомо, А.Н.Гребенюк. - СПб.: Фолиант, 2004. - 527 с.).

Однако применение препаратов данной группы сопряжено с побочными эффектами и противопоказаниями. Так, после инъекций водного раствора дезоксината через 1,5-3 ч возникает выраженная гипогликемия (Вышковский Г.Л. Регистр лекарственных средств России [Текст] / Г.Л.Вышковский. - М.: РЛС, 2005. - С. 303-304).

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к восстановлению регенераторного потенциала ткани - эпителия тощей кишки старых лабораторных животных, угнетенных воздействием ионизирующего излучения, а также отсутствие их осложнений.

Технический результат достигается за счет внутривенной аллогенной трансплантации через 25-30 мин после облучения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты в количестве 6×10⁶ клеток на 1 кг веса животного.

Сущность изобретения заключается в применении впервые для восстановления регенераторного потенциала эпителия тощей кишки ММСК, выделенных из плаценты.

Известно, что ММСК продуцируют весь спектр противовоспалительных цитокинов (IL - 4, 10, TGF - ). ММСК способны оказывать цитопротективное действие, выделяя белки теплового шока (HSP70), а также вырабатывая цитокин HIF-1 , могут приводить к снижению выраженности апоптоза. Указанный цитокиновый профиль может приводить к изменению клеточной популяции, к снижению степени выраженности воспалительной реакции и уменьшению зоны повреждения. Плюрипотентность ММСК, специфическая миграция в область повреждения и адгезионные свойства - все это обуславливает восстановительную функцию ММСК. ММСК способны мигрировать к месту повреждения, закрепляться, дифференцироваться и осуществлять функцию замещенных клеток. При внутривенной трансплантации аллогенных совместимых ММСК, выделенных из плаценты, в количестве 6×10 ⁶ через 25-30 мин после ионизирующего излучения не возникает реакции отторжения трансплантата, так как ММСК обладают слабыми иммуногенными свойствами, а также не возникает реакции «трансплантат против хозяина» за счет иммуносупрессивных свойств ММСК. Именно эти свойства ММСК дают возможность их использовать для восстановления регенерации эпителиоцитов тощей кишки.

Из анализа научно-технической и патентной информации, использование ММСК, выделенных из плаценты, для восстановления регенерации эпителиоцитов тощей кишки нами не обнаружено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты по получению культуры ММСК проведены на 8 крысах линии Wistar, массой 150-170 гр. Возраст животных к началу эксперимента составлял 3-4 мес. Производилось выделение плаценты в сроке гестации 18 дней. Образец ткани массой 2 г трижды промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатами (PBS) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺, дополненным антибиотиками (пенициллин 50 ед./мл, стрептомицин 50 мкг/мл), после чего осуществлялось механическое измельчение ткани и энзиматическая обработка (0,25% трипсин - ЭДТА 15 мин при 37°С). Полученная суспензия клеток была дважды профильтрована через 100 мкм нейлоновую мембрану для очистки от крупных не измельченных кусочков ткани. Суспензию разбавляли средой -MEM (ICN, США), содержащей антибиотики, затем клетки осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 1000 g. Полученный клеточный осадок суспендировали в среде -МЕМ (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия), однократным раствором незаменимых аминокислот (Sigma, США) и однократным раствором антибиотиков (Chemicon). Суспензию клеток высевали в концентрации 150000-160000 кл/см ² на чашки Петри 60 мм (Nunc, Дания). Культивирование производилось при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% CO₂. Подсчет клеток производили в гемоцитометре. Расчет количества клеток в 1 мл суспензии производили по формуле: Х=а*10000, где Х - число клеток в 1 мл суспензии; а - сумма клеток в малых квадратах.

Субкультивирование клеток осуществляли по достижении ими 80% монослоя. Клетки промывали смесью 0,25% трипсин - ЭДТА в соотношении 1:1, в которой клетки инкубировали около 5 мин при 37°С. Трипсин инактивировали добавлением ростовой среды с фетальной бычьей сывороткой (10%) и центрифугировали суспензию при 200 g в течение 5 мин. Удалив супернатант, клетки суспендировали, производили подсчет и высевали в концентрации 10000 кл/ см ².

Характеристику культуры проводили с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit Rat) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated).

Моделирование экстремального воздействия.

Эксперименты выполнены на 28 белых лабораторных крысах-самцах возраста 6-8 месяцев, массой 200-220 г. Изучалось воздействие ионизирующего излучения (ИИ) дозой 3 Гр (мощность поглощенной дозы 15 сГр/мин). Тотальное облучение крыс осуществлялось однократно -излучением. В качестве источника -квантов был использован ⁶⁰Со. Контрольную группу составили животные, не подвергшиеся облучению. В каждой группе насчитывалось 14 крыс. Внутри группы было выделено 2 подгруппы по 7 животных в каждой. Крысам парентерально производилось введение: животным первой подгруппы внутривенно вводилась суспензия ММСК 6×10⁶ клеток на 1 кг веса, вторая подгруппа крыс являлась контролем в каждой из групп, животным вводили физиологический раствор 0,5 мл внутривенно.

Внутривенные введения осуществлялись через 25-30 мин после облучения однократно в указанных выше дозах (таблица 1).

Таблица 1
Доза ИИ	Препарат	Путь введения	Доза препарата	Время проведения аутопсии органов
24 часа	7 суток
3 Гр	ММСК	в/в	2 млн. кл. в 0,5 мл физ. раствора.	7 шт.	7 шт.
NaCl	в/в	0,5 мл	7 шт.	7 шт.

Для осуществления морфометрического анализа во всех сериях экспериментов производилась аутопсия тощей кишки. Заливку проводили в парафин и готовили срезы с соблюдением строгой ориентации ворсин и крипт толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

- Оценивали пролиферативную активность кишечного эпителия с помощью определения митотического индекса (МИ) на гистологических срезах продольной ориентации. Подсчитывали эпителиоциты в состоянии митоза, встречаемые на 3000-3500 клеток, полученный результат выражали в процентах.

Морфологическая верификация и количественная оценка апоптоза осуществлялись при флуоресцентной микроскопии с использованием двух флуорохромов: акридин оранжевым (производство Финляндия) и Annexin V - FITC fluorescence microscopy (производство США). Анализ осуществлялся с помощью флуоресцентного микроскопа Micmed - 2 вариант 12 (увеличение 40*10) при длине возбуждающего света 495 нм.

- Оценивали уровень запрограммированной гибели эпителиоцитов с помощью определения апоптотического индекса (АИ) на гистологических срезах продольной ориентации. Подсчитывали эпителиоциты с выявляемой картиной апоптоза, встречаемые на 3000 клеток, полученный результат выражали в процентах

- Среднюю клеточность в одной крипте (СКК) определяли как отношение общего числа подсчитанных криптальных клеток к

- количеству анализированных крипт, выраженному в процентах (Труфакин В.А. и др., 1990).

Гистологические препараты тощей кишки анализировались с помощью микроскопа Micros МС - 50 (Австрия) при увеличении 100·15. Полученные данные обрабатывали методами математической статистики с использованием t критерия Стьюдента.

В контрольной и опытной подгруппах на первые сутки после воздействия ИИ установлено выраженное угнетение митотической активности эпителиоцитов крипт, снижение средней клеточности в 1 крипте. Анализируя количество эпителиоцитов в состоянии апоптоза, установлено существенное повышение уровня запрограммированной клеточной гибели (таблица 2).

Таблица 2
Показатели регенераторной активности эпителия тощей кишки зрелых лабораторных животных на 1 сутки, М±m, n=7
Параметры	Содержание клеток после воздействия ИИ
После введения NaCl	После введения ММСК
Митотический индекс, %	5,73±0,86	4,82±1,16
Апоптотический индекс, %	12,77±1,71	13,85±1,32*
Средняя клеточность 1 крипты	55,82±3,74	49,20±4,80
Примечание: * отличие от подгруппы зрелых интактных животных (контрольная подгруппа), подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, достоверно с p<0,05.

В контрольной подгруппе на 7 сутки после воздействия ИИ при подсчете числа митозов в криптах, подсчете средней клеточности в 1 крипте, отмечено восстановление перечисленных показателей до значений нормы. В то же время уровень содержания клеток в состоянии апоптоза оставался существенно выше значений нормы (АИ: 6,60±0,63%, p<0,05).

В подгруппе лабораторных животных, которым была произведена внутривенная трансплантация аллогенных ММСК, на 7 сутки после воздействия ИИ при подсчете числа митозов в эпителиоцитах крипт, установлено существенное повышение числа митотически делящихся клеток. Митотический индекс был на 36% выше, чем в контроле. При подсчете эпителиоцитов в состоянии апоптоза отмечено снижение выраженности апоптоза по сравнению с контрольной подгруппой (АИ: 4,75±0,72%, p<0,05), и показатель, характеризующий запрограммированную гибель клеток, существенно не отличался от значений нормы. Анализируя среднюю клеточность в 1 крипте, выявлено восстановление и повышение содержания криптального эпителия по сравнению с контрольной подгруппой на 21% (таблица 3).

Таблица 3
Показатели регенераторной активности эпителия тощей кишки зрелых лабораторных животных на 7 сутки, М±m, n=7
Параметры	Содержание клеток после воздействия ИИ
После введения NaCl	После введения ММСК
Митотический индекс, %	8,92±0,92	12,08±0,92*
Апоптотический индекс, %	6,60±0,63	4,75±0,72*
Средняя клеточность 1 крипты	72,82±4,02	88,15±4,42*
Примечание: * отличие от подгруппы зрелых интактных животных (контрольная подгруппа), подвергшихся воздействию ИИ дозой 3 Гр, достоверно с p<0,05.

Таким образом, полученные данные позволяют считать ММСК цитопротективными в отношении эпителиоцитов слизистой оболочки тощей кишки.

На основании проведенных исследований можно сформулировать следующие выводы:

1. В условиях воздействия ионизирующего излучения трансплантированные аллогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки вызывают увеличение скорости клеточного обновления криптального эпителия тощей кишки.

2. В условиях воздействия ионизирующего излучения аллогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки оказывают антиапоптогенное действие.