очищенный компонент цианобактерий и способ применения

Формула изобретения

1. Композиция для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток, содержащая терапевтически эффективное количество водного или буферного солевого экстракта Aphanizomenon flos aquae или Spirulina, где экстракт обогащен лигандом L-селектина, и этанолового экстракта Aphanizomenon flos aquae.

2. Композиция по п.1, содержащаяся в фармакологически приемлемом носителе.

3. Композиция по п.2, где экстракт этанола получают суспендированием высушенного Aphanizomenon flos aquae в 10-20% этанола при температуре от 50 до 60°С.

4. Композиция по п.3, содержащая 1-2 г высушенного водного или буферного экстракта Aphanizomenon flos aquae, где экстракт обогащен лигандом L-селектина, и 100-500 мг высушенного этанолового экстракта Aphanizomenon flos aquae.

5. Композиция по п.4, содержащая примерно 1 г высушенного водного или буферного солевого экстракта Aphanizomenon flos aquae, где экстракт обогащен лигандом L-селектина, и 150 мг высушенного этанолового экстракта Aphanizomenon flos aquae.

6. Композиция по п.3, полученная способом

контактирования первого количества Aphanizomenon flos aquae в 0,1 молярного соляного раствора с фосфатным буфером или воды в течение 0,5-12 ч для получения буферного соляного или водного экстракта;

удаления твердого материала из буферного соляного или водного экстракта;

высушивания буферного соляного или водного экстракта для получения твердой композиции, содержащей лиганд L-селектина;

инкубации второго количества Aphamzomenon flos aquae в 10% этанола при 50°С в течение 1 ч для получения этанолового экстракта;

удаления твердого материала из этанолового экстракта;

высушивания твердого материала из этанолового экстракта для получения твердой формы этанолового экстракта; и

смешивания терапевтически эффективного количества твердой композиции, содержащей лиганд L-селектина и терапевтически эффективного количества твердой формы этанолового экстракта.

7. Очищенный лиганд селектина, выделенный из Aphanizomenon flos aquae или Spirulina, для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток в пациенте, содержащий белок или гликопротеин с молекулярной массой примерно 54 kDa, примерно 55 kDa или примерно 57 kDa в условиях восстановления.

8. Очищенный лиганд селектина по п.7, где лиганд селектина имеет молекулярную массу примерно 54 kDa, 57 kDa, 162 kDa, 171 kDa, 233 kDa или примерно 111 kDa в условиях невосстановления.

9. Очищенный лиганд селектина по п.7, где лиганд связывает L-селектин, Р-селектин, Е-селектин или любую их комбинацию.

10. Фармацевтическая композиция для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток, содержащая терапевтически эффективное количество очищенного лиганда селектина по п.7 в фармацевтически приемлемом носителе.

11. Применение для лечения объекта, нуждающегося в мобилизации гемопоэтических стволовых клеток путем введения терапевтически эффективного количества очищенного лиганда селектина по п.7.

12. Применение по п.11, где гемопоэтические стволовые клетки экспрессируют CD34(CD34+), CD133 (CD133+) или и то, и другое.

13. Применение по п.11, где объект является человеком.

14. Применение по п.11, где объект является животным (ветеринарный объект).

15. Применение по п.11, где очищенный лиганд селектина связывает L-селектин, Р-селектин, Е-селектин или любую их комбинацию.

16. Применение по п.11, дополнительно предполагающее измерение количества стволовых клеток CD34+у объекта.

17 Применение по п.11, где объект здоров.

18. Применение по п.11, где объект имеет, снижение иммунитета (иммуносупрессию) или имеет хроническую болезнь, травму или запущенное заболевание.

19. Применение по п.11, где объект имеет нарушение пищеварительной системы, нервной системы, лимфатической системы, сердечно-сосудистой системы или эндокринной системы.

20. Применение по п.19, где объект имеет остеопороз, болезнь Альцгеймера, инфаркт миокарда, болезнь Паркинсона, черепно-мозговую травму, рассеянный склероз или цирроз печени.

21. Применение для лечения объекта, нуждающегося в мобилизации гемопоэтических стволовых клеток путем введения терапевтически эффективного количества композиции по п.1.

22. Применение по п.21, где гемопоэтические стволовые клетки экспрессируют CD34(CD34+), CD 133 (CD133+) или и то, и другое.

23. Применение по п.21, где объект это человек.

24. Применение по п.21, где объект это животное (ветеринарный объект).

25. Применение по п.21, кроме того, предполагающий измерение количества стволовых клеток CD34+у объекта.

26. Применение по п.21, где объект здоров.

27. Применение по п.21, где объект имеет снижение иммунитета (иммуносупрессию) или имеет хроническую болезнь, травму или запущенное заболевание.

28. Применение по п.21, где объект имеет нарушение пищеварительной системы, нервной системы, лимфатической системы, сердечно-сосудистой системы или эндокринной системы.

29. Применение по п.28, где объект имеет остеопороз, болезнь Альцгеймера, инфаркт миокарда, болезнь Паркинсона, черепно-мозговую травму, рассеянный склероз или цирроз печени.

30. Способ выделения лиганда селектина для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток, предполагающий экстрагирование клеток Aphanizomenon flos aquae или Spirulina в водном растворе, отделение вещества в частицах и выделение полученного всплывшего вещества; контактирование всплывшего вещества с селектином, связанным с твердым субстратом; и высвобождение лиганда, специфически связанного с селектином, тем самым выделяя лиганд селектина.

31. Способ по п.30, где высвобождение лиганда предполагает обработку кислотой, щелочью, теплом (нагреванием) или их сочетанием.

32. Способ по п.30, где селектин содержит внеклеточный домен L-селектина человека, слитый с доменом иммуноглобулина Fc, или внеклеточный домен Р-селектина человека, слитый с доменом иммуноглобулина Fc.

33. Способ по п.30, где твердый субстрат содержит магнитные гранулы.

34. Лиганд селектина для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток в объекте, выделенный способом по п.30.

35. Лиганд селектина для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток в объекте, выделенный способом по п.30, где клетки цианобактерии это Aphanizomenon flos aquae.

36. Лиганд селектина для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток, выделенный способом по п.30, где клетки цианобактерии это Spirulina.

Описание изобретения к патенту

Область

Эта заявка относится к водному экстракту, взятому из цианобактерий, такому как водный экстракт водорослей, включающий лиганд селектина.

Предыстория

Стволовые клетки представляют собой плюрипотентные клетки, полученные из соматической ткани и способные дифференцироваться в более специализированные клетки. Например, гемопоэтические стволовые клетки могут дифференцироваться во множество разных типов клеток крови, включая эритроциты, тромбоциты и лейкоциты.

Гемопоэтические стволовые клетки играют роль в непрерывном пожизненном физиологическом пополнении клеток крови. Стволовые клетки развиваются как в гемопоэтические клетки линии (дифференцировки), так и в не гемопоэтические клетки, специфичные к тканям. В последнее время было обнаружено, что стволовые клетки дифференцируются в разные типы клеток, специфичных к тканям, таких как миоциты, гепатоциты, остеоциты, глиоциты и нейроны. Например, было показано, что стволовые клетки пересекают гематоэнцефалический барьер (Williams and Hickey, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 202-221-245, 1995) и дифференцируются в нейроны (Mezey, Science 290: 1779-82, 2000). Таким образом, возможно, что стволовые клетки можно было бы использовать для лечения болезни Паркинсона (Polli, Haematologica 85:1009-10, 2000), болезни Альцгеймера (Mattson, Exp.Gerontol. 35:489-502, 2000) и черепно-мозговых травм (Magavi, Nature 405:892-3, 895, 2000). Также было показано, что стволовые клетки дифференцируются в фибробласты или подобные фибробластам клетки и экспрессируют коллаген (Periera at al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1142-7, 1998). Таким образом, возможно, что стволовые клетки можно использовать для лечения несовершенного остеогенеза и переломов костей. Peterson и др. (Science 284:1168-70, 1999) также показали, что клетки печени могут возникнуть из стволовых клеток. Таким образом, стволовые клетки могут быть пригодными при лечении разнообразных патологий печени, включая цирроз, но не ограничиваясь им. Кроме того, было показано, что стволовые клети, полученные из костного мозга, мигрируют к месту инфаркта миокарда и образуют миокард (Orlic, Nature 410:701-5, 2000). Таким образом, стволовые клетки можно использовать для лечения инфаркта миокарда.

Поскольку стволовые клетки способны дифференцироваться в самые разнообразные типы клеток, они играют важную роль в процессах заживления и регенерации различных тканей и органов (см. Kос et al., Bone Marrow Transplant, 27(3):235-39, 2001). Лиганды селектина стимулируют высвобождение стволовых клеток из костного мозга (Frenette et al., Blood 96:2460-68, 2000).

Многие исследования говорят о том, что мобилизация, миграция и дифференциация стволовых клеток костного мозга в целевой ткани составляют природное явление заживления в теле человека (Spencer et al., Thorax 60(1):60-2, 2005; Ishikawa et al., FASEB J. 18(15): 1958-60, 2004; Mattsson et al., Transplantation 15;78(1): 154-7, 2004; Thiele Jet al., Transplantation 77(12): 1902-5, 2004; Cogle et al., The Lancet 363(9419): 1432-7, 2004; Deb et al., Circulation 107(9): 1247-9, 2005; Korbling et al., N EngI J Med 346(10):738-46, 2002; Adams et al., Blood 102(10):3845-7, 2002; Krause et al., Cell 105(3):369-77, 2001). Мобилизованные стволовые клетки следуют градиентам концентрации цитокинов, высвобождаемых пораженными тканями, и мигрируют сами по себе в ткани, следуя таким градиентам. Действительно, было показано, что мобилизация стволовых клеток костного мозга, вызванная инъекцией цитокинов, ускоряет заживление сердечной ткани после острого инфаркта миокарда. Поэтому простой запуск мобилизации стволовых клеток костного мозга с помощью эффективного и безопасного потребляемого вещества может улучшить этот естественный физиологический процесс и обеспечить потенциальную терапию различных патологий. Таким образом, существует необходимость в композициях, которые увеличивают мобилизацию и направленную миграцию стволовых клеток.

Краткое изложение сущности изобретения

Раскрыта примерная процедура получения водного экстракта цианобактерий, содержащих лиганд селектина. В этой процедуре лиганд селектина выделяется из цианобактерий с использованием твердого субстрата, ковалентно связанного с селектином, таким как L-селектин, Р-селектин или/и Е-селектин. Лиганд селектина может специфически связывать L-селектин, Р-селектин или/и Е-селектин.

Описаны очищенные лиганды селектина, которые выделены из цианобактерий. Эти лиганды выделены из цианобактерий, которые являются белком или гликопротеином с молекулярной массой приблизительно 55 kDa в условиях восстановления. В нескольких примерах лиганд селектина имеет молекулярную массу приблизительно 54 kDa - 57 kDa в условиях восстановления. В дополнительных примерах лиганд селектина имеет молекулярную массу примерно 54 kDa, примерно 57 kDa, примерно 162 kDa, примерно 171 kDa, примерно 233 kDa или примерно 111 kDa в условиях невосстановления.

Здесь раскрыт экстракт Aphanizomenon flos aquae (AFA), содержащий лиганд L-селектина. Этот лиганд может быть приготовлен как лекарственное средство для введения пациенту. Композиции, включающие только экстракт или включающие другие экстракты AFA, могут вводиться пациенту, нуждающемуся в мобилизации стволовых клеток или/и в увеличенном количестве циркулирующих стволовых клеток. В одном примере экстракт, содержащий лиганд L-селектина, вводится с экстрактом AFA, содержащим полисахариды. Композиции, включающие лиганд L-селектина AFA или состоящие из него, пригодны для мобилизации стволовых клеток и увеличения количества циркулирующих стволовых клеток.

Здесь раскрывается способ запуска мобилизации стволовых клеток путем введения терапевтически эффективного количества специфического экстракта цианобактерий пациенту. Экстракты, пригодные для вызывания мобилизации стволовых клеток, включают в себя экстракты цианобактерий, содержащие лиганд селектина, такой как лиганд L-селектина, Р-селектина или/и Е-селектина. В одном примере цианобактерий это AFA. Экстракты могут вводиться одни или в сочетании с другими экстрактами AFA. В одном примере вводится также экстракт, содержащий полисахариды.

Введение терапевтически эффективного количества экстракта цианобактерий, такого как экстракт, содержащий лиганд селектина, вызывает временное увеличение популяции некоторых стволовых клеток, таких как стволовые клетки CD34+ или/и стволовые клетки CD133+, в сердечно-сосудистой системе пациента.

Вышеуказанные и другие признаки и преимущества станут более очевидными из следующего подробного описания нескольких вариантов осуществления со ссылками на сопроводительные чертежи.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой линейный график течения времени для увеличения количества стволовых клеток, циркулирующих в крови здоровых людей после приема внутрь AFA. Проточная цитометрия проводилась на человеческих лимфоцитах и моноцитах, где моноклональное антитело CD34 со специфичностью к стволовым клеткам человека использовалось, чтобы показать, что экстракт А AFA содержит соединение, которое мобилизует стволовые клетки путем увеличения их количества в кровообращении.

Фиг.2 представляет собой гистограмму, показывающую проточную цитометрию, проводимую на лимфоцитах, моноцитах и полиморфных ядросодержащих клетках человека, где моноклональное антитело TQ1, специфичное к связывающей лиганд области L-селектина человека, использовалось, чтобы показать, что экстракт A AFA содержит соединение, конкурирующее в связывании на участке связывания лиганда L-селектина. Эффект конкуренции между антителом TQ1 и соединением из экстракта А AFA зависит от концентрации.

Фиг.3 представляет собой схематическое изображение способа очистки лиганда селектина из экстракта A AFA. Магнитные гранулы покрывались белком G, который связывает часть Fc иммуноглобулина. Эти гранулы использовались для захвата химерического рекомбинантного белка, состоящего из внеклеточной части L-селектина человека, соединенной вместе с частью Fc иммуноглобулина IgG1 человека. Химическая реакция проводилась для образования ковалентных связей между частью Fc химеры и белком G на магнитных гранулах. Эти гранулы, теперь покрытые химерой, причем внеклеточная часть L-селектина человека реагировала из гранул, использовались для захвата лиганда для L-селектина в экстрактах AFA.

Фиг.4 А-4 В представляют собой цифровые изображения, показывающие электрофорез геля, что иллюстрирует приблизительную молекулярную массу соединения, которое было очищено по сродству из экстракта А AFA при использовании способа сродства, описанного на фиг.3. Изображения представляют собой цифровые изображения гелей, когда электрофорез геля проводился на материале, элюированном с магнитных гранул после того, как эти гранулы захватили лиганд селектина из экстракта А AFA. Фиг.4А - это цифровое изображение, показывающее соединение, элюированное из гранул, которые покрывались рекомбинантным L-селектином человека, а фиг.4 В - это цифровое изображение, показывающее соединение, элюированное из гранул, покрытых рекомбинантным Р-селектином человека. Гели исследовались в условиях восстановления. Показаны две отчетливые полосы при приблизительно 54 и 57 kDa. Тождественные рисунки полос были видны по L- и Р-селектину, что указывает на то, что лиганд селектина является лигандом как для L-селектина, так и для Р-селектина.

Фиг.5 является цифровым изображением геля, когда электрофорез геля проводился на материале, элюированном с магнитных гранул, после того, как эти гранулы использовались на захвата потенциальных лигандов селектина в экстракте А AFA в сравнении с экстрактом В. Лиганд селектина из AFA был обнаружен в экстракте А. В экстракте В не было обнаружено в лиганде селектина из AFA. Полоса 1 представляет собой отрицательную контрольную группу, полоса 2 показывает лиганд, очищенный из экстракта А (стрелка), и полоса 3 показывает, что соответствующая полоса не была видна в экстракте В.

Фиг.6 представляет собой линейный график, показывающий результаты анализа методом проточной цитометрии экспрессии рецептора CXCR4 хемокина, как она вызывается известным лигандом L-селектина, фукоиданом. Данные указывают на то, что известный лиганд L-селектина фукоидан конкурирует с соединением из АРА в связывании с L-селектином на периферических лимфоцитах крови человека.

Фиг.7 - это линейный график, показывающий результаты анализа методом проточной цитометрии экспрессии рецептора CXCR4 хемокина, как она указывается известным лигандом L-селектина, фукоиданом. Данные указывают, что известный лиганд L-селектина фукоидан конкурирует с соединением из AFA в связывании с L-селектином на CD34+ клеточной линии KG-1a человека.

Фиг.8 представляет собой таблицу. Представленные результаты показывают, что экстракт А (AFA-W) блокирует связывание TQ1 MoAb с L-селектином на лейкоцитах человека. Фиг.9 - это линейный график, показывающий время действия ряда CD34+ клеток в периферической крови человека после потребления (стрелка) лиганда L-селектина (LSL), мигратозы (MGT), комбинации с улучшенными стволами (SE) или плацебо (помеченный Ctrl). Лиганд L-селектина (LSL) - это экстракт AFA, обогащенный лигандом L-селектина. Для пациентов, которых лечили LSL, один грамм экстракта, концентрированного в лиганде L-селектина (см. раздел примеров), смешивался с 40 мл воды и принимался пациентом. Мигратоза (MGT) - это экстракт, в котором жидкое AFA экстрагировалось с 10% этанола при 85 градусах С в течение трех часов. Раствор центрифугировался, и всплывшее вещество сушилось с помощью RW. Для приема 150 мг высушенного продукта тонко перемешивалось с 250 мг носителя, заключенного в растительную капсулу и принимаемого пациентами. Комбинация с улучшенными стволами (SE) представляла собой смесь LSL и MGT, как описано выше. Один грамм SE перемешивался в 40 мл воды и принимался пациентами. Контрольная группа представляла собой 400 мг тонко перемолотых картофельных хлопьев, заключенных в растительные капсулы.

Подробное описание

I. Сокращения

AFA: Aphanizomenon flos aquae

Ctrl: контрольная группа

LSL: лиганд L-селектина

мг: миллиграмм

мл: миллилитр

MGT: мигратоза

SE: комбинация с улучшенными стволами, включает LSL и MGT

г: грамм

кг: килограмм

II. Термины

Если они не отмечены иначе, технические термины используются согласно традиционному употреблению. Определения обычных терминов в молекулярной биологии можно найти у Benjamin Lewin, Genes V, опубликовано Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al., (ред.) The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликовано Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-92182-9); и Robert A. Meyers (ред.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликовано VCN Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Чтобы облегчить просмотр разных вариантов осуществления этого изобретения, даны следующие объяснения конкретных терминов:

Введение пациенту. Предоставление пациенту цианобактерий включает в себя введение целых клеток цианобактерий или/и экстрактов (фракций) клеток цианобактерий. Пути введения включают в себя, но не ограничиваясь этим, пероральный и парентеральный пути, такие как внутривенный (IV), внутрибрюшинный (IP), ректальный, местный, офтальмический, через нос и трансдермальный. Пероральное введение включает как целые цианобактерии, так и экстракты цианобактерий. Можно вводить более одного экстракта. При пероральном введении целые клетки или экстракты можно давать или вводить в виде стандартной дозы в твердой, полутвердой, либо жидкой формах, таких как таблетки, пилюли, порошки, жидкие растворы или жидкие взвеси. Однако экстракты цианобактерий могут также вводиться внутривенно в любой традиционной среде для внутривенной инъекции, такой как водная солевая среда, или в среде плазмы крови. Среда может также содержать традиционные фармацевтические вспомогательные материалы, такие как фармацевтически приемлемые соли для регулировки осмотического давления, носители липидов (например, циклодекстрины), белки (например, сывороточный альбумин), гидрофильные агенты (например, метил целлюлоза), детергенты, буферы, консерванты и т.п. Более полное объяснение приемлемых фармацевтических носителей можно найти у Remington: Science and Practice of Pharmacy (19 издание, 1995) в главе 95.

Агент, влияющий на гемопоэз. Соединение, антитело, молекула нуклеиновой кислоты, белок, гликопротеин или клетка, меняющая образование клеток крови, таких как лейкоциты.

Молекулярный агент может быть естественной молекулой или синтетической молекулой. В некоторых вариантах осуществления агент влияет на мобилизацию, рост, пролиферацию, созревание, дифференциацию или высвобождение кроветворных клеток. В оном примере осуществления агентом является лиганд селектина, выделенный из клетки цианобактерии.

Агент, влияющий на циркуляцию стволовых клеток. Соединение, антитело, молекула нуклеиновой кислоты, белок, гликопротеин или клетка, включая нейропептиды и другие сигнальные молекулы, что влияет на высвобождение стволовых клеток в сердечно-сосудистую систему, а также на направление из сердечно-сосудистой системы в ткань. Молекулярный агент может быть естественной молекулой или синтетической молекулой. В одном конкретном варианте осуществления агент является лигандом селектина из цианобактерий.

Агент, влияющий на циркуляцию стволовых клеток, может влиять на отношение стволовых клеток в неактивной популяции по сравнению с активной популяцией. В некоторых вариантах осуществления агент влияет на баланс между недифференцированными стволовыми клетками и стволовыми клетками, дифференцирующимися в CD34-отрицательную (CD34-) и CD34-положительную (CD+) клетку и/или CD133-отрицательные (CD133-) и CD133-положительные (CD133+) клетки. В других вариантах осуществления агент влияет на высвобождение стволовых клеток из участков ткани, например высвобождение клеток CD34+ или/и клеток CD133+ или/и клеток, обнаруживаемых способами, основанными на ферментных действиях дегидрогеназы альдегида, из среды костного мозга.

Животное. Живой, многоклеточный позвоночный организм, включая, например, млекопитающих, рыб, рептилий и птиц.

Цианобактерии. Общее название грамотрицательных фотосинтезирующих бактерий, относящихся к типу Cyanophyta, которые могут существовать в одноклеточном, колониальном или нитеобразном видах. Представители цианобактерии включают, не ограничиваясь этим, вид Spirulina и вид Aphanizomenon. Aphanizomenon flos aquae (AFA) - это один конкретный не ограничивающий тип цианобактерии.

Термин «водоросли» - это множественное число от «водоросль», которая представляет собой вид микроводорослей. Например (и без ограничения), «цианобактерии» означают множество клеток одного вида Aphanizomenon, множество клеток одного вида Spirulina или смесь клеток из множественных видов Aphanizomenon или/и Spirulina.

Сердечно-сосудистая система. У животных сердечно-сосудистая система образована структурами, которые перемещают кровь и компоненты крови по всему телу, включая сердечно-сосудистую систему и лимфатическую систему. Компоненты сердечно-сосудистой системы включают в себя сердце, кровеносные сосуды (артерии, вены и капилляры) и лимфатические сосуды.

Циркулирующая стволовая клетка. Стволовая клетка, присутствующая в сердечно-сосудистой системе.

Компонент цианобактерий. Любая фракция, экстракт или выделенная или очищенная молекула из клетки цианобактерий. В одном варианте осуществления компонент является белком или гликопротеином, или нуклеиновой кислотой. В другом варианте компонент является фитохимикатом. В другом варианте компонент представляет собой водный экстракт цианобактерий, включая лиганд селектина. Таким образом, цианобактерии разрываются, добавляется неорганический или органический растворитель, и экстракты собираются. Конкретные не ограничивающие примеры - это экстракты, выделенные с использованием эффективной жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии, аффинной колонки, магнитных гранул или дистилляции. В одном варианте фракционирование основано на молекулярной массе или гидрофобности компонентов цианобактерий.

Дифференциация. Процесс, посредством которого клетки становятся более специализированными для выполнения биологических функций. Дифференциация - это свойство, которое часто полностью или частично теряется клетками, которые подверглись злокачественному перерождению.

Эффективное количество. Количество, например количество содержащего селектин экстракта цианобактерий, способное запустить или увеличить мобилизацию стволовых клеток, что может определяться различными методами, используемыми в биологии. Эти способы включают, но не ограничиваясь этим, генерирование эмпирической кривой реакции на дозу. В одном варианте осуществления «терапевтически эффективное количество» - это количество, эффективное для повышения мобилизации стволовых клеток, которые снова наполняют, восстанавливают или омолаживают ткань. В другом варианте «терапевтически эффективное количество» - это количество, эффективное для улучшения направленной миграции стволовых клеток. Еще в другом варианте «терапевтически эффективное количество» - это количество, эффективное для улучшения целевого направления стволовых клеток из сердечно-сосудистой системы к различным тканям или органам.

Терапевтически эффективным количеством также может быть количество, достаточное для лечения состояния или заболевания, например количество, достаточное для ослабления симптомов, связанных с нарушениями нервной системы (например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз), внутричерепной травмы или повреждения спинного мозга, заболевания печени или нарушения в костях или хрящах. Терапевтически эффективным количеством может также быть количество, достаточное для ускорения или улучшения восстановления острого инфаркта миокарда.

В одном отдельно взятом, не ограничивающем примере терапевтически эффективное количество экстракта, такого как содержащий селектин экстракт цианобактерий, составляет примерно 0,01-1,0 г на 1 кг массы тела, например примерно 0,05-0,5 г на 1 кг массы тела или примерно 0,1-0,5 г на 1 кг массы тела. В другом конкретном, не ограничивающем примере эффективное количество содержащего селектин экстракта цианобактерий составляет примерно 0,25-5 г, или примерно 0,5-5 г, или примерно 1-2 г. В одном конкретном, не ограничивающем примере эффективное количество содержащего селектин экстракта цианобактерий составляет 1 г. Это эффективное количество может вводиться с данной частотой, например, примерно раз в неделю, примерно два раза в неделю, примерно три раза в неделю, раз в день, примерно два раза в день, примерно три раза в день, или чаще. Терапевтически эффективное количество экстракта цианобактерий, такого как содержащий селектин водный экстракт цианобактерий, и частота введения могут зависеть от различных факторов, таких как род или вид применяемых водорослей, общего состояния здоровья больного и физиологических характеристик (например, высоты, веса, процентного содержания жира в теле, обмен веществ) больного. Здесь приведены конкретные анализы для определения терапевтически эффективного количества водного экстракта, например, содержащего лиганд селектина экстракта цианобактерий. В одном конкретном, не ограничивающем примере разные количества содержащего лиганд селектина экстракта цианобактерий, таких как АРА, принимаются людьми, и обнаруживается или/и анализируется наличие или/и количество стволовых клеток (что может включать подтипы таких клеток), присутствующих в сердечно-сосудистой системе. В другом варианте осуществления используется модель животного (например, мыши), и популяция вновь интегрированных стволовых клеток отслеживается в различных тканях (см. примеры ниже). Раскрытые способы имеют одинаковое применение в медицинской и ветеринарной обстановке. Поэтому общий термин «больной» включает все позвоночные (например, но не ограничиваясь этим, людей, обезьян, собак, кошек, мышей, крыс, кроликов, овец, лошадей, свиней и коров).

Усиление (усиливающий). Повышение конкретного параметра клетки или организма. В одном варианте осуществления усиление относится к 25%, 50%, 100% или большему, чем 100% увеличению параметра. В одном конкретном, не ограничивающем примере усиление циркуляции стволовых клеток подразумевает увеличение конкретной популяции клеток, такой как 25%, 50%, 100%, 200%, 400%, 500% или большее повышение конкретной популяции клеток или реакции популяции клеток. В одном варианте параметр является мобилизацией клеток. В другом примере параметр является дифференцировкой стволовых клеток. Еще в одном варианте параметр является целевым направлением стволовых клеток.

Эритроциты. Эритроциты, которые переносят кислород к тканям тела.

Экстракт. Концентрированный препарат композиции, например цианобактерий, получаемый удалением активных составляющих композиции пригодными растворителями, выпариванием всего или почти всего растворителя и регулированием остаточной массы или порошка до определенного стандартного количества. Экстракт «обогащен» продуктом, таким как лиганд селектина, если активность или количество интересующего компонента в экстракте существенно увеличены по сравнению с другими экстрактами или с тем же количеством экстрагированной первоначальной композиции.

Гликопротеин. Комплексная молекула, образованная составляющей белка и составляющей гликана или полисахарида.

Гемопоэз. Образование и развитие клеток крови. Гемопоэз предполагает пролиферацию и терминальную дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток. Известно, что у взрослых млекопитающих гемопоэз происходит в костном мозгу. Гемопоэз - это производство гемопоэтических клеток, включая В-клетки, Т-клетки, клетки линии дифференцировки макрофагов моноцитов и красных кровяных клеток.

Целевое направление (хоминг). Процесс миграции клеток из сердечно-сосудистой системы в ткань или орган. В некоторых случаях хоминг совершается посредством специфических к тканям адгезионных молекул или процессов адгезии.

Иммунологически нормальный. «Иммунологически нормальный» означает объект, который проявляет характеристики иммунной системы, типичные для вида, к которому принадлежит индивид. К числу этих типичных относятся кроме прочего функционирующие В-клетки и Т-клетки, а также структурные компоненты клетки, называемые поверхностными антигенами клетки, которые действуют как иммунологическая отличительная черта для конкретного организма.

Использование таких иммунологически нормальных реципиентов означает, что иммунная система иммунологически нормального реципиента через свою В (гуморальная реакция) и Т (клеточная реакция) клетки будет идентифицировать поверхностные антигены клетки посторонней клетки или приживленной ткани как посторонние. Это опознание приводит в конце концов к иммунной реакции против клетки или ткани, что имеет результатом разрушение клетки или отторжение трансплантата. Иммунная реакция против аллогенной ткани известна как отторжение хозяин-трансплантат.

Подверженный иммунологическому риску. Объект, «подверженный иммунологическому риску», имеет генотипический или фенотипический иммунодефицит. Объект с генотипическим иммунодефицитом имеет генетический дефект, приводящий к неспособности генерировать ни гуморальную, ни опосредованную клетками реакцию. Конкретный, не ограничивающий пример объекта с генотипическим иммунодефицитом - это мышь с генотипическим иммунодефицитом, такая как мышь SCID или мышь bg/nu/xid (Andriole et al., J. Immunol. 135:2911, 1985; McCune et al., Science 241:1632, 1988) или человек XSCID. «Объект с фенотипическим иммунодефицитом» - это объект, который генетически способен генерировать иммунную реакцию, но был фенотипически изменен, так что реакции не видно. В одном конкретном, не ограничивающем примере реципиент с фенотипическим иммунодефицитом облучен. В другом конкретном, не ограничивающем примере объект с фенотипическим иммунодефицитом подвергался лечению химиотерапией. Еще в одном конкретном, не ограничивающем примере объект с фенотипическим иммунодефицитом страдал от бактериальной или вирусной инфекции, такой как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) или вакуолизирующий вирус иммунодефицита обезьяны (ВВИО).

Увеличиваться (Увеличение). Значительное увеличение конкретной активности или интересующего компонента. В одном варианте осуществления ингибирование означает, по меньшей мере, увеличение активности или концентрации на 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100%.

Ингибировать. Уменьшение конкретного параметра клетки или организма. В одном варианте осуществления ингибирование означает уменьшение параметра на 25%, 50% или 100%.

Выделенный. «Выделенный» биологический компонент (например, молекула нуклеиновой кислоты, полипептид, полисахарид, селектин, лиганд селектина или другая биологическая молекула) был в принципе отделен или очищен от других биологических компонентов клеток, в которых компонент естественно встречается. «Выделенная» клетка была в принципе отделена или очищена от других клеток разных видов (в случае микроорганизмов) или клеток организма (в случае многоклеточных организмов). Нуклеиновые кислоты и белки могут выделяться стандартными способами очищения, рекомбинантной экспрессией в клетке-хозяине или химически синтезироваться. Клетки могут выделяться стандартными методами культивирования. В одном варианте осуществления цианобактерии собираются из природного источника (например, озеро Кламат (Klamath Lake)) и приготовляются сушкой (см. ниже).

Лейкоциты. Белые клетки крови. Сферические, бесцветные и образовавшие ядро форменные элементы крови, задействованные в защите хозяина, включая иммунологические реакции. К конкретным типам лейкоцитов относятся базофильные клетки, целомоциты, эозинофилы, гемоциты, лимфоциты, нейтрофилы и моноциты, циркулирующие дендритные клетки и циркулирующие гемопоэтические стволовые клетки.

L-селектин. Член семейства селектинов зависящих от кальция лектинов, также известный как CD62L. Адгезионная молекула, используемая стволовыми клетками для прилипания к среде костного мозга. L-селектин, самый малый из сосудистых селектинов представляет собой молекулу 74-100 kDa, которая конститутивно экспрессируется на верхушках микроскладок гранутоцитов, моноцитов и обширного ряда циркулирующих лимфоцитов. L-селектин известен также как LECAM-1, LAM-1, Mel-14 антиген, gp90^mel и Leu8/TQ-1 антиген. Известно, что L-селектин важен для связывания лейкоцитов с эндотелием в различных физиологических ситуациях, включая связывание фагоцитов с эндотелием, связывание лейкоцитов с воспаленным эндотелием и хоминг и адгезию лимфоцитов к высоким клеткам эндотелия пост-капиллярных венул периферических лимфатических узлов. Более того, это адгезионная молекула вносит большой вклад в захват циркулирующих лейкоцитов во время ранних фаз системы адгезии. Известны аминокислотные последовательности многих L-селектинов.

«Лиганд L-селектина» специфически связывает L-селектин. В некоторых вариантах осуществления лиганд может блокировать активацию другими лигандами, например пространственной интерференцией со связывающей областью лиганда. Лиганд также может активировать клетку посредством лигирования с L-селектином, например, запуская перенос кальция, цитоскелетную реаранжировку или другие активирующие события. Кроме того, лиганд может менять пути трансдукции сигналов, так что последующее связывание либо с другим лигандом L-селектина, либо с независимым от L-селектина стимулом приводит к измененной физиологической реакции. В некоторых примерах, когда лимфоциты человека активируются посредством некоторых лигандов L-селектина, L-селектин запускает экспрессию CXCR4, рецептор для стромального фактора 1 (SDF1), цитокина, влияющего на пребывание стволовых клеток в костном мозге. В одном варианте осуществления экстракт, содержащий L-селектин цианобактерий, ингибировал экспрессию CXCR4, запущенную активацией L-селектина флукоиданом. Последовательности аминокислот для примерных лигандов L-селектина известны. Например, Mus musculus GlyCam-1 показан в GENBANK, номер доступа NM_008134, а изоляты мРНК человека для GlyCam-1 показаны в GENBANK, номера доступа AJ_489 590, AJ 489 591, AJ 489 592, AJ 489 593 и AJ 489 589, как все они были в наличии 24 июня 2005 г. Эти последовательности аминокислот не должны ограничивать, а даны в качестве примеров. Рекомбинантные и модифицированные формы включены в данное описание.

Лимфоциты. Вид лейкоцитов (белых клеток крови), влияющий на иммунную защиту тела. Имеются два основных типа лимфоцитов: В-клетки и Т-клетки.

Лимфопролиферация. Увеличение производства или/и разделения лимфоцитов.

Млекопитающее. Этот термин включает млекопитающих как людей, так и не людей. Аналогично, термин «объект» включает как человеческие, так и ветеринарные объекты.

Моноцит. Крупный лейкоцит в крови, который проглатывает микробы или другие клетки и посторонние частицы. Когда моноцит выходит из кровотока и входит в ткани, он развивается в макрофаг.

Мускульная клетка. Клетка слоистой, сердечной ткани или ткани гладкой мышцы. В слоистой (скелетной) мышце клетка мышцы состоит из соклетия, образованного слиянием эмбриональных миобластов. В гладкой мышце клетка мышцы представляет собой одну клетку, характеризующуюся большими количествами актина и миозина и способную сокращаться до малой доли своей полной длины. В сердечной мышце клетка мышцы связана соседними клетками специализированными соединениями, называемыми вставочными дисками.

Фармацевтически приемлемые носители. Пригодные фармацевтически приемлемые носители традиционны. Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W.Martin, Mack publoshing Co., Истон, Пенсильвания, 15 издание (1975), описывает композиции и средства, пригодные для фармацевтической доставки цианобактерий и экстрактов, описанных здесь.

В основном, характер носителя будет зависеть от конкретного режима применяемого введения. Например, парентеральные формы обычно содержат инъецируемые жидкости, включающие фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные соляные растворы, водная декстроза, глицерин и т.п. в качестве носителя. Для твердых композиций (например, в форме порошка, пилюли, таблетки или капсулы) обычные не токсичные твердые носители могут включать в себя, например, фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала или стеарат магния.

Вдобавок к биологически нейтральным носителям подлежащие вводу фармацевтические композиции могут содержать незначительные количества не токсичных вспомогательных веществ, например смачивающих или эмульгирующих агентов, консервантов и буферных агентов для рН и т.п., например ацетат натрия или монолаурат сорбитана.

Пластичность. Способность формоваться, которую часто используют, говоря о гибкости и обратимости спецификации ткани и линии дифференцировки.

Тромбоциты. Маленькие фрагменты клеток в крови, происходящие из мегакариоцитов. Тромбоциты участвуют в заживлении ран, свертывании крови, восстановлении поврежденных кровеносных сосудов и патологических воспалительных процессах.

Клетка-предшественник. Клетка, дающая потомство в определенной линии дифференцировки клеток. «Гемопоэтическая клетка-предшественник» является клеткой, порождающей клетки гемопоэтической линии дифференцировки.

Р-селектин. Член семейства зависящих от кальция лектинов, также известный как CD62P. Р-селектин экспрессируется на поверхности клеток эндотелия, тромбоцитов (увеличенные количества при активации) и мегакариоцитов. Р-селектин может посредничать в связывании активированных тромбоцитов с лейкоцитами и может далее вносить вклад в последующее связывание этих лейкоцитов с эндотелием. Экспрессия Р-селектина на эндотелии костного мозга играет роль в расположении стволовых клеток in vivo, включая ретенцию костного мозга, мобилизацию и хоминг (Frenette и Weiss, Blood 96(7):2460, 2000).

Рекрутмент стволовой клетки. Процесс, посредством которого стволовая клетка с сердечно-сосудистой системы мигрирует в ткань или орган. Рекрутмент может быть облегчен соединением или молекулой, например сигналом-хемоатрактантом или рецептором клеток. Например, и CXCR4, и SDF-1 имеют идентифицированные роли в хоминге стволовых клеток. Hidalgo et at., Exp. Hematol. 29(3):345-55, 2001; Kollet et al., Blood 97 (10)3283-91, 2001.

Клетка-сателлит. Специфическая к мускулам стволовая клетка, часто находящаяся на периферии мышечной ткани и способная мигрировать в мышцу, чтобы помочь восстановиться и реконструироваться ткани.

Селектин. Семейство зависящих от кальция пектинов, также известное как CD62. К трем членам этого семейства относятся L-селектин (CD62L), Р-селектин (CD62P) и Е-селектин (CD62E). Эти адгезионные молекулы участвуют в замедлении циркулирующих лейкоцитов во время их прохождения в венулах и также участвуют во взаимодействиях с хозяином или других адгезионных взаимодействиях, включая, но не ограничиваясь, взаимодействия тромбоцит-лейкоцит, ретенцию клеток в некоторых тканях, включая костный мозг, и адгезию лейкоцитов к воспаленному эндотелию.

Стволовая клетка. Плюрипотентная клетка, порождающая потомство многих типов ткани, включая (но не ограничиваясь) все линии дифференцировки гемопоэтических и стромальных клеток костного мозга. Типичная стволовая клетка пребывает в костном мозге либо как прилипшая клетка стромального типа, либо как более дифференцированная клетка, экспрессирующая CD34, либо на поверхности клетки, либо таким образом, что клетка является негативной для поверхности CD34. Стволовые клетки могут также экспрессировать CD133. Так, стволовая клетка может быть клеткой CD34+, клеткой CD133+ или может наглядно экспрессировать как CD34, так и СВ133 (см. Не et al., Stem Cells and Development 14(2): 188-198, 2005). В качестве альтернативы, стволовая клетка может быть клеткой, которую можно измерить флуоресцентно меченным аминоацетальдегидом, образованным, когда фермент в цитоплазме стволовой клетки преобразует флуоресцентный субстрат в флуоресцентное соединение, которое удерживается внутри стволовой клетки и позволяет обнаружить ее на основании ферментной функции.

Субпопуляция клеток CD34+ в костном мозге, продукты лейкафереза и пуповинная кровь с примитивными фенотипическими характеристиками экспрессируют CD133, 5-трансмембранную молекулу с неизвестной функцией. Антитела, специфичные для штамма CD133 35-75% популяции CD34+ в зависимости от источника стволовых клеток (De Wynter et al., Stem Cells 16:387-396, 1998). Трансплантация выделенной не прилипающей фракции стволовых клеток CD133+ CD34+ в мыши NOD/SCID с иммунодефицитом вызывала высокое миелоидное и лимфоидное многолинейное приживание, что говорит о том, что эти клетки в высшей степени обогащены SCID-репопулирующими клетками (Kuci et al. Blood 101:869-876, 2003).

«Тотипотентные» стволовые клетки, такие как гемопоэтические стволовые клетки или нейронные стволовые клетки, в основном порождают потомство ограниченного количества типов ткани. Гемопоэтические стволовые клетки, мышечные стволовые клетки и нейронные клетки-предшественники - это некоторые примеры тотипотентных стволовых клеток.

Объект. Животное, имеющее сердечно-сосудистую систему, включая позвоночных, например людей и других объектов ветеринарии, таких как, но не ограничиваясь этим, приматов, собак, кошек, коров и грызунов.

Направленная миграция (Trafficking). Процесс перемещения клетки из исходной ткани и продвижения по сердечно-сосудистой системе. В одном варианте осуществления направленная миграция включает в себя движение клетки из исходной ткани, хоминг посредством адгезии к эндотелию, трансмиграцию и конечную миграцию внутри целевого органа. В одном варианте осуществления направленная миграция представляет собой процесс перемещения клетки иммунной системы. В другом варианте направленная миграция включает в себя мобилизацию стволовых клеток. Один конкретный, не ограничивающий пример направленной миграции - это перемещение стволовой клетки к целевому органу. Другой конкретный, не ограничивающий пример направленной миграции - это перемещение В-клетки или пре-В-клетки, покидающей костный мозг и двигающейся к целевому органу.

Трансдифференциация. Изменение клетки или ткани из одного дифференцированного состояния к другому или дифференцировка специфичной к ткани стволовой клетки в другой тип клетки, например в стволовую клетку костного мозга, дифференцирующуюся в нейрон.

Трансплантация. Перенос популяции клеток, ткани или органа или их части из одного тела или части тела в другое тело или часть тела. «Аллогенная трансплантация» или «гетерологичная трансплантация» представляет собой трансплантацию от одного индивида к другому, причем индивиды имеют гены в одном или нескольких локусах, которые не идентичны в последовательности у двух индивидов. Аллогенная трансплантация может произойти между двумя индивидами того же самого вида, которые разнятся генетически, или между индивидами двух разных видов. «Аутологическая трансплантация» - это трансплантация ткани или ее части из одного места в другое у того же индивида или трансплантация ткани или ее части от одного индивида к другому, причем два индивида генетически идентичны.

Если не объяснено иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют то же самое значение, которое обычно понятно для простого специалиста, к которому относится это описание. Слово «или» предназначено включать «и», если контекст явно не указывает на иное. Нужно далее понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, данные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и представлены для описания. Хотя на практике или при тестировании этого описания можно применять способы или материалы, сходные с описанными здесь или эквивалентные им, пригодные способы и материалы описаны ниже. Термин «содержит» означает «включает в себя». Все публикации, патентные заявки и другие ссылки, упомянутые здесь, включены во всей своей полноте. В случае противоречия, будет главенствовать настоящая заявка, включая объяснения терминов. Кроме того, материалы, способы и примеры даются только для иллюстрации и не должны быть ограничивающими.

Лиганд селектина, выделенный из клеток цианобактерий.

Здесь раскрывается водный экстракт цианобактерий, такой как Aphanizomenon flos aquae (АРА), обогащенный лигандом селектина, например лигандом L-селектина. В одном варианте осуществления экстракт представляет собой «Экстракт А», водный экстракт, включающий полярные соединения, быстро растворяющиеся в воде или физиологическом растворе, который обогащен лигандом селектина, таким как лиганд L-селектина. В другом варианте этот экстракт высушивается с использованием известного процесса и повторно взвешивается в водном растворе.

Цианобактерии, такие как AFA или Spirulina, можно фракционировать. Процесс выращивания, сбора и концентрации клеток цианобактерий был описан. Цианобактерии, такие как АРА или Spirulina, можно выделять из любого источника. Источник может быть естественным источником цианобактерий, таким как озеро (например, озеро Кламат). Источник может также быть искусственным источником цианобактерий, таким как искусственное озеро или источник воды. Источник может представлять собой окружающую среду, созданную, чтобы коммерчески выращивать и собирать цианобактерии.

Цианобактерии можно использовать непосредственно или хранить в жидком, замороженном жидком, высушенном на морозе или просто высушенном виде, используя описанный ниже способ. В одном варианте осуществления цианобактерии собираются и сушатся с использованием технологии REFRACTANCE WINDOW . Термин «Технология REFRACTANCE WINDOW » означает систему, в которой сушилка использует те самые свойства воды, которые позволяют вытеснить воду из продукта. Коротко говоря, когда вода помещается над источником тепла, теплота рассеивается в воде посредством конвекции, Поглощая тепло, вода передает энергию инфракрасного света во вне тремя способами: испарением, теплопроводностью и излучением. Если поверхность воды покрыта прозрачной средой, такой как пластик, испарение и связанная с ним потеря тепла блокируются, и происходит только теплопроводность. Пластиковая мембрана действует как зеркало, отражающее энергию инфракрасного света. Когда влажный материал, такой как цианобактерии, помещен на пластиковую поверхность, вода в материале создает «окно», позволяющее проходить энергии инфракрасного света. Считается, что в этой системе вода в материале позволяет происходить излучению, теплопроводности и испарению, создавая исключительно эффективную теплопередачу. Однако после нескольких минут, пока материал высыхает, инфракрасное «окно» закрывается, и теплопроводность остается единственным средством теплопередачи. Поскольку пластик является плохим проводником тепла, мало тепла теряется и переносится к продукту. Поэтому при сушке по технологии REFRACTANCE WINDOW водоросли только на небольшое время подвергаются воздействию тепла.

В этой системе сушки жидкие водоросли (клетки, взвешенные в растворе) помещаются на поверхность конвейерной ленты сушки. Лента выполнена из милара пищевого качества (прозрачной пленки сложного полиэфира), поставленного на поверхность горячей воды. Тепло от циркулирующей воды проводится к ленте и затем в воду в подлежащем сушке продукте, умеренно ускоряя естественный процесс испарения, одновременно защищая естественные питательные вещества. По мере того как продукт высыхает и вода испаряется, тепло перестает передаваться в продукт. Не связывая себя теорией, можно сказать, что это предотвращает деградацию полипептидов, нуклеиновых кислот, питательных веществ и пигментов. Таким образом, процесс сушки поддерживает температуру водорослей намного ниже температуры циркулирующей воды под конвейерной лентой.

Для получения высушенных водорослей можно использовать другие системы сушки. В основном, два фактора играют роль в деградации водорослей: степень нагрева и время воздействия тепла. Приложение сильного нагрева в короткий период времени приводит к меньшей деградации компонентов цианобактерий. В одном примере тепло, например применяется температура примерно от 65 градусов С до 80 градусов, такая как температура примерно от 70 градусов С до 75 градусов С, или примерно 72 градуса С. Тепло может прикладываться на значительное время для сушки водорослей, например примерно 1-15 минут или примерно 2-10 минут, или в течение примерно 3-7 минут. В одном примере тепло прикладывается к водорослям при 72 градусах С в течение всего 3-5 минут. Этот процесс известен специалисту и полностью описан на сайте Rossha Enterprises и описан у Abonyi et al., «Evaluation of Energy Efficiency and Quality Retention for the REFRACTANCE WINDOW Drying System: Research Report», университет штата Вашингтон, Пуллман, Вашингтон, 30 декабря 30, 1999). Однако можно также использовать клетки, высушенные на морозе.

Как здесь описано, водный экстракт можно приготовить из свежих, обезвоженных или консервированных клеток цианобактерий, таких как AFA. Водоросли можно экстрагировать водой или пригодным соляным раствором с буферной добавкой. Например, используется вода или раствор с буферной добавкой, в основном с нейтральным рН (примерно рН 7,0-рН 7,8, например, примерно рН 7,2-рН7,6 или примерно рН 7,4). Пригодные соляные растворы с буферной добавкой хорошо известны в технике, включают в себя соляной раствор с фосфатным буфером (такой как солевой раствор с фосфатным буфером примерно 0,1 М), коммерчески доступные культурные среды. Водное экстрагирование обычно производят при температуре ниже комнатной (обычно 25 градусов С), таких как температуры примерно 3-15 градусов С, таких как примерно 4-10 градусов С или примерно 4 градуса С, но экстрагировать можно также при комнатной температуре (примерно 25 градусов С).

В одном примере 1 грамм высушенного водорослевого материала, например, AFA взвешивается в примерно 10-50 мл, например примерно 40 мл солевого раствора с фосфатной буферной добавкой (например, солевого раствора с фосфатной буферной добавкой 0,1 М, рН 7,4) и выращивается при 4 градусах С. Инкубация может длиться 5 минут, полчаса, несколько часов или в течение ночи. В нескольких примерах водоросли инкубируют в водном растворе в течение примерно получаса до примерно 2-х часов, примерно получаса до примерно 3-х часов или примерно получаса до примерно 12 часов. Водоросли, взвешенные в соляном растворе с буферной добавкой, можно защитить от света для снижения деградации. После инкубации в водном растворе твердый материал отделяют от водного экстракта. Смесь водорослей в водном растворе, таком как соляной раствор, можно перемешать неоднократным опрокидыванием сосуда и центрифугировать для удаления твердого материала. Например, взвесь можно центрифугировать при 400 г в течение 10 минут.

После отделения твердого материала всплывший материал, который обычно имеет синий цвет, выделяется. Этот экстракт называется «Экстракт А». По желанию, этот всплывший материал можно стерилизовать, например, фильтрацией. В одном примере ярко-синий всплывший материал сцеживается после центрифугирования и стерильно фильтруется с использованием фильтра 0,22 мм. Этот фильтрат можно хранить, например, при примерно 4 градусах С в темноте.

Экстракт, содержащий лиганд селектина, такой как лиганд L-селектина, можно высушить, как описано выше. В одном примере тепло, например температура примерно 65 градусов С-80 градусов С, прилагается к водному экстракту, например температуры примерно 70 градусов С - 75 градусов С, или примерно 72 градуса С. Тепло можно прилагать достаточно долго, чтобы высушить экстракт, например примерно 1-15 минут, или примерно 2-10 минут, или примерно 3-7 минут. В одном примере тепло прилагается к экстракту при 72 градусах С только 3-5 минут. Этот процесс аналогичен процессу сушки водорослей (см. Abonyi et al., «Evaluation of Energy Efficiency and Quality Retention for the REFRACTANCE WINDOW Drying System: Research Report). Специалист может легко получить высушенный продукт из водного экстракта, используя известные методологии.

В нескольких конкретных, не ограничивающих примерах эффективное количество содержащего селектин экстракта цианобактерий, такого как водный экстрагированный обогащенный L-селектином лиганд, составляет примерно 0,25-5 граммов, или примерно 0,5-5 г, или примерно 1-2 г высушенного водного экстракта, такого как экстракт А.

Лиганд селектина может быть далее очищен водным экстрактом А. Например, лиганд селектина выделяют с использованием аффинного очищения. В одном примере экстракт А приводят в контакт с твердым субстратом, включающим L-селектин, Р-селектин или Е-селектин. Магнитные гранулы, ковалентно связанные с селектином, такие как L-селектин человека, также можно использовать. Примерная последовательность аминокислот L-селектина человека изложена как GENBANK номер доступа NP_000646; примерная аминокислотная последовательность L-селектина мыши изложена как САВ55488 и примерная последовательность L-селектина мыши изложена как GENBANK номер доступа ААН52681. Все эти последовательности были доступны в Интернете 24 июня 2005 г. Дополнительные примерные последовательности L-, Р- и Е-селектинов можно найти в базе данных GENBANK.

Селектин может быть природной молекулой, например L-селектин человека, Р-селектин человека, L-селектин мыши или Р-селектин мыши. Селектин можно также быть генетически создать формой, такой как рекомбинантная молекула, которая является стабильной формой L-селектина или/и молекулой, которая содержит фрагмент селектина, такой как внеклеточная часть молекулы L-селектина человека. В одном примере селектин - это слитый белок, в котором внеклеточная часть L-селектина человека и часть Fc иммуноглобулина. Такие рекомбинантные слитие белки доступны на рынке, например у фирмы R&D Systems, и их можно заказывать по Интернету. Твердый субстрат, ковалентно связанный с селектином, такой как, но не ограничиваясь этим, L-селектин, инкубируется с всплывшим веществом «Экстракт А» (растворимый в воде экстракт цианобактерий).

Материал из водорослей, который специфически связывается с селектином, затем выделяется. Например, лиганд селектина можно оторвать от рекомбинантной молекулы селектина, используя кислотную обработку. Лиганд селектина можно также оторвать от молекулы рекомбинантного селектина, используя щелочную обработку или/используя термическую обработку.

Как здесь описано, выделенный лиганд селектина имеет молекулярную массу примерно 50-60 kDa, например 55 kDa при условиях восстановления. В одном примере выделенный лиганд селектина имеет молекулярную массу примерно 54-57 kDa в условиях восстановления. В одном варианте осуществления лиганд селектина не образует комплекса. Например, лиганд селектина не может образовывать комплекс с самим собой или с другим лигандом селектина.

В некоторых примерах в условиях невосстановления лиганд селектина может объединяться в комплекс. Так, если комплекс из трех субъединиц 54 kDa образуется в условиях невосстановления, молекулярная масса составляет примерно 162 kDa, а если образуется комплекс из трех субъединиц 57 kDa, средняя молекулярная масса в условиях не восстановления составляет примерно 171 kDa. Если комплекс из трех субъединиц 54 kDa и трех субъединиц 57 kDa образуется в условиях не восстановления, молекулярная масса комплекса составляет примерно 233 kDa. Так, очищенный лиганд селектина может иметь молекулярную массу примерно 200 kDa в условиях невосстановления. При образовании комплекса одного из каждого лиганда, средняя молекулярная масса комплекса составляет приблизительно 111 kDa. Как альтернатива, две субъединицы не могут быть в комплексе, и средний молекулярный вес в условиях невосстановления будет тем же самым, что и в условиях восстановления. Лиганд селектина может быть белком или гликопротеином. Раскрытые здесь экстракты и композиции можно вводить в любой форме, включая в качестве твердых тел, таких как таблетки или порошки, или как жидкой препарат. В одном примере композиции формулируются для введения в тонкую кишку. Пример формы для использования в фармацевтическом препарате (таком как таблетка, жидкость для введения в тонкую кишку, парентеральная жидкость, капсула, жидкость для введения в нос или другая форма). В конкретном раскрытом примере композиция является фармацевтическим препаратом, в частности таблеткой или капсулой. Как известно в технике, композиции, пригодные для перорального введения, могут быть представлены как дискретные единицы, такие как капсулы, крахмальные капсулы или таблетки, каждая из которых содержит терапевтически эффективное количество композиции, в виде порошка или гранул или в виде раствора или взвеси в водной жидкости. Так, лекарственные формы включают в себя таблетки, капсулы, дисперсии, взвеси, растворы, капсулы и т.п. Из-за своей легкости введения, таблетки и капсулы представляют собой удобную единичную лекарственную форму, и в этом случае используются твердые фармацевтические носители, описанные выше. Однако соединения можно также вводить с помощью контролируемых высвобождающих средств или могут формулироваться для других средств доставки, например, но не ограничиваясь этим, доставка через нос или через кожу.

Композиции могут включать в себя неактивные ингредиенты, такие как связывающие агенты (например, предварительно желированный кукурузный крахмал, поливинил пирролидон или гидроксипропил метил целлюлоза; связующие вещества или наполнители (например, лактоза, пентосан, микрокристаллическая целлюлоза или кальций водород фосфат); смазки (например, стеарат магния, тальк или кремнезем); дезинтегранты (например, картофельный крахмал или гликолат крахмала натрия); или смачивающие агенты (такие как лаурил сульфат натрия).

В одном примере таблетку, содержащую раскрытую здесь композицию, такую как, но не ограничиваясь этим, экстракт, обогащенный лигандом L-селектина, или его твердая форма, или очищенный лиганд селектина, можно приготовить путем сжатия или формовки, при желании, с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Сжатые таблетки можно приготовить путем сжатия в подходящей машине сыпучей формы, такой как порошок или гранулы высушенного экстракта или/и лиганд селектина, при желании смешанный со связующим веществом, смазкой, инертным разбавителем, поверхностно-активным или диспергирующим веществом. Композиция, такая как таблетка, может включать в себя фармацевтически приемлемые компоненты, такие как лактоза, глюкоза, сахароза, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, сложные эфиры целлюлозы, например ацетат целлюлозы, этил целлюлоза, стеарат магния, силикат кальция, осажденный кремнезем, тальк, жирные кислоты, такие как стеариновая кислота, микрокристаллическая целлюлоза, воск карнобы и т.п. Таблетки или капсулы можно покрыть способами, хорошо известными в технике.

Жидкие препараты для перорального введения могут иметь вид, например, растворов, сиропов или взвесей, или же они представлены в виде сухого продукта для составления с водой или другим пригодным носителем до использования (см. раздел Примеры). Такие жидкие препараты можно приготовлять посредством традиционных средств с фармацевтически приемлемыми добавками, которые являются активными агентами, например суспендирующими агентеми (такие как сироп сорбитола, производные целлюлозы или гидрированные пищевые жиры), эмульсификаторами (такие как лецитин или акация) или консервантами (такие как метил или пропил-р-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Композиции можно также сделать приятными на вкус и потому могут содержать буферные соли, ароматизаторы, красители и сахаристые вещества по соответствию.

Можно использовать разбавители и другие не активные ингредиенты, такие как один или несколько фармацевтически приемлемых связывающих веществ, наполнителей, носителей, загустителей, агентов, улучшающих вкус, красителей, консервантов, стабилизаторов, регуляторов, эмульсификаторов, текущих агентов, абсорбентов и т.п. или их смеси в зависимости от вида применяемой композиции. Композиция может также включать сахаристое вещество, например натуральное (например, сахар или мед), или искусственное сахаристое вещество (например, сахарин) при желании. В основном, носители, сахара, разбавители, стабилизаторы, буферы, ароматизаторы и тестурирующие ингредиенты рассматриваются как не активные ингредиенты, поскольку они не привносят сами по себе терапевтического действия.

В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать один или несколько дополнительных экстрактов AFA, которые вызывают миграцию стволовых клеток. Этот экстракт можно получить путем экстрагирования жидкого AFA в спирте, таком как, но не ограничиваясь этим, этанол или метанол. В одном примере композицию получают экстрагированием AFA в примерно 10%-20% этанола. В одном примере композиция содержит экстракт, приготовленный экстрагированием жидкого AFA в примерно 10% этанола.

В одном примере дополнительный экстракт получают инкубированием жидкого AFA в примерно 10% этанола при температуре примерно 65-85ºС, приложенной к водному экстракту, такой как температура примерно 70-90,5ºС или примерно 85ºС. Затем раствор центрифугируется, и всплывшее вещество высушивается (см. выше). В одном варианте примерно 50-500 мг, например примерно 100-250 мг, так 150 мг высушенного продукта вводится объекту.

В одном примере используемая композиция включает примерно 0,25-5 г, примерно 0,5-5 г, примерно 1-2 г высушенного содержащего селектин экстракта, такого как твердая форма водного экстракта, обогащенного лигандом L-селектина, такого как экстракт А. В одном конкретном, не ограничивающем примере композиция включает примерно 1 г высушенного содержащего селектин экстракта цианобактерий (напр., AFA), такого как твердая форма водного экстракта, обогащенного лигандом L-селектина, такого как экстракт А. Композиция включает также примерно 150 мг второго высушенного экстракта AFA, где второй высушенный экстракт получается инкубацией AFA в примерно 10-20% этанола при примерно 70-90ºС в течение примерно 1-3 часов, например, инкубацией AFA в примерно 10% этанола при примерно 850ºС в течение примерно 1-3 часов.

Усиление мобилизации стволовых клеток.

Описан способ усиления мобилизации стволовых клеток путем введения объекту терапевтически эффективного количества водного экстракта цианобактерий, таких как AFA, обогащенных лигандом селектина, такого как L-селектин, или/и терапевтически эффективного количества очищенного лиганда селектина. Лиганд селектина может быть лигандом L-селектина, Р-селектина или/и Е-селектина. Лиганды селектина стимулируют высвобождение стволовых клеток (Frenette, Weiss, 196(7):2460, 2000). Объект может быть любым объектом, например человеком или животным.

Водный экстракт цианобактерий, обогащенный лигандом селектина, таким как L-селектин, или очищенный лиганд селектина из цианобактерий можно вводить в одиночку или в сочетании с другими агентами. В некоторых вариантах осуществления очищенный лиганд селектина или/и водный экстракт, обогащенный лигандом селектина (или его твердая форма), включается в фармацевтическую композицию вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Терапевтически приемлемые количества дополнительных компонентов, таких как твердые формы дополнительных экстрактов, также могут вводится объекту. В одном варианте терапевтически эффективное количество твердой формы водного экстракта цианобактерий, обогащенных лигандом селектина, вводится объекту. Таким образом, здесь имеется способ повышения мобилизации стволовых клеток у объекта, предполагающий введение терапевтически эффективного количества водного экстракта цианобактерий, обогащенных лигандом селектина, такого как L-селектин, тем самым увеличивая мобилизацию стволовых клеток у объекта.

В одном конкретном, не ограничивающем примере водный экстракт высушивается с получением твердой формы, и терапевтически эффективное количество твердой формы вводится данному объекту. Терапевтически эффективное количество экстракта, такого как водный экстракт цианобактерий, обогащенных лигандом селектина, составляет примерно 0,01-1,0 г на кг массы тела, примерно 0,05-0,5 г на кг массы тела или примерно 0,1-0,5 г на кг массы тела. В другом конкретном, не ограничивающем примере эффективное количество твердой формы водного экстракта цианобактерий, обогащенных лигандом селектина, составляет примерно 0,25-5 г, 0,5-5 г или примерно 1-2 г. В одном конкретном, не ограничивающем примере эффективное количество твердой формы водного экстракта цианобактерий, обогащенных лигандом селектина, составляет примерно 1 г.

Активные агенты раскрытой здесь композиции можно примешивать к носителю. В основном характер носителя будет зависеть от конкретного применяемого режима введения. Например, парентеральные формы обычно содержат инъецируемые жидкости, которые включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные соляные растворы, водная декстроза, глицерин и т.п. в качестве носителя. Для твердых композиций (например, порошка, пилюли, таблетки или капсулы) традиционные не токсичные носители могут включать, например, фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала или стеарата магния. В дополнение к биологически нейтральным носителям вводимые фармацевтические композиции могут содержать малые количества не токсичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты и эмульгаторы, консерванты и рН-буферные агенты и т.п., например ацетат натрия или монолаурат сорбитана.

Это эффективное количество может вводиться с данной частотой, такой как примерно раз в неделю, примерно 2 раза в неделю, примерно 3 раза в неделю, раз в день, примерно 2 раза в день, примерно 3 раза в день или чаще. Специалист может легко определить терапевтически эффективное количество очищенного лиганда селектина или водного экстракта, обогащенного лигандом селектина. В одном конкретном, не ограничивающем примере оценивается количество циркулирующих стволовых клеток, таких как количество клетки, экспрессирующей CD3.

Терапевтически эффективное количество водного экстракта цианобактерий, обогащенных лигандом селектина и частота введения этих композиций могут зависеть от самых разных факторов, таких как род или вид используемых водорослей, общего состояния здоровья лечащегося и физиологических характеристик (например, роста, веса, процентного отношения жира в теле, метаболизм и т.д.) лечащегося. Водный экстракт можно вводить непосредственно, не изменяя физических параметров, или можно вводить в другой физической форме. Так, в одном варианте осуществления экстракт высушивается и вводится в виде твердого тела. В другом варианте водный экстракт высушивается и затем конкретное количество растворяется в носителе и потом вводится объекту.

Конкретные анализы для определения терапевтически эффективного количества водного экстракта, такого как водного лиганда, обогащенного селектином, представлены здесь. В одном конкретном, не ограничивающем примере разные количества содержащего лиганд селектина экстракта цианобактерий, такого как AFA, принимаются людьми, и присутствие или/и количество стволовых клеток (которые могут включать подтипы таких клеток), присутствующих в сердечно-сосудистой системе, обнаруживается или/и анализируется. В другом варианте используется модель животного (такого как мышь, крыса или другого животного), и популяцию вновь интегрированных стволовых клеток отслеживают в разных тканях (см. примеры ниже). Следует отметить, что раскрытые способы имеют равное применение в медицинской и ветеринарной обстановке.

Независимо от того, как он получен или введен, экстракт цианобактерий или/и очищенный лиганд селектина вызывает переходное увеличение популяции циркулирующих стволовых клеток, таких как CD34+ стволовые клетки или/и клетки CD133+. Экстракт цианобактерий может также вызывать переходное увеличение стволовых клеток, которое можно измерить флуоресцентно меченным аминоацетальдегидом. Эта процедура описана на сайте стволовых клеток (см. http:/www.Stemcell. com/technical/aldedfluor.asp, см. также http:/www.stemcell.com/technical/12_aldefluor.pdf).

Вкратце, флуоресцентно меченный аминоацетальдегид может легко диффундировать в клетки. Внутриклеточный фермент ALDH (альдегид дегидрогеназа) превращает это в флуоресцентно меченый аминоацетат, который не может диффундировать из клеток. Таким образом, клетки, имеющие фермент ALDH (такие как стволовые клетки), становятся флуоресцентными. Другие клетки (такие как клетки, не являющиеся стволовыми, включая дифференцированные клетки) кажутся не флуоресцентными после промывки.

Усиление мобилизации стволовых клеток можно измерить путем анализа реакции стволовых клеток на конкретную дозу экстракта цианобактерий. В одном варианте введение очищенного лиганда селектина или цианобактерий объекту усилит мобилизацию стволовых клеток этого объекта в течение определенного периода времени, такого как менее примерно 5 часов, менее примерно 4 часа, менее примерно 2 часа, менее примерно 1 часа, менее примерно 30 минут, или менее примерно 10 минут после введения.

В одном варианте осуществления введение водного экстракта цианобактерий, обогащенных лигандом селектина или/и очищенным лигандом селектина, приводит к мобилизации стволовых клеток в циркуляцию примерно 10-30 минут после введения. Мобилизованные стволовые клетки поступят в сердечно-сосудистую систему, таким образом увеличивая количество циркулирующих стволовых клеток в теле объекта. Процентное повышение количества циркулирующих стволовых клеток в сравнении с нормальной опорной линией может составлять примерно 25%, примерно 50%, примерно 100% или более примерно 100% увеличение по сравнению с контрольной группой. В другом варианте контрольная группа - это число циркулирующих стволовых клеток в проходившем лечение объекте или в объекте, лечимом плацебо или фармакологическим носителем.

В некоторых вариантах объект здоров. В других вариантах объект страдает от заболевания или физиологического состояния, такого как подавление иммунитета, хронической болезни, травмы или дегенеративного заболевания. В определенных примерах объект страдает от заболевания или состояния кожи, пищеварительного аппарата, нервной системы, лимфатической системы, сердечно-сосудистой системы или эндокринной системы. В конкретных вариантах объект страдает от остеопороза, болезни Альцгеймера, инфаркта миокарда, болезни Паркинсона, черепно-мозговой травмы, рассеянного склероза, цирроза печени или от любых заболеваний или состояний, описанных в примерах ниже.

ПРИМЕРЫ

Приводятся следующие примеры для иллюстрации конкретных признаков различных описанных примеров осуществления. Объем настоящего изобретения не должен ограничиваться приведенными в примерах признаками.

Пример 1

Получение AFA и экстрагирование

Цианобактерии AFA выделялись из озера Кламат. Цианобактерии высушиваются с использованием технологии REFRACTANCE WINDOW.

Один грамм высушенного водорослевого материала взвешивался в 10 мл в солевом растворе с фосфатным буфером или в воде и инкубировался 1 час при 4ºС и защищался от света. Вязкая масса перемешивалась неоднократным опрокидыванием в сосуде и центрифугировалась при 400 г в течение 10 минут. Ярко-синее всплывшее вещество сцеживалось и стерильно фильтровалось, используя 0,22 мм фильтра. Этот фильтрат хранился в холоде и темноте и использовался в день приготовления. Этот экстракт назывался Экстрактом А.

Пример 2

Лиганд селектина, экстрагированный из AFA-W: материалы и способы.

Буферы и среда: Для культур клеток клетки повторно взвешивались и культивировались в RPMI-1640c 10% с сывороткой зародыша теленка, 1% пенициллина и стрептомицина и L-глутамина. Для иммунного окрашивания клетки промывались, повторно взвешивались и окрашивались в соляном растворе с фосфатным буфером, содержащим 0,02% Azide и 1% сыворотки зародыша теленка или сыворотки альбумина быка. Для анализов пролиферации и для стимуляции для блоттинг-анализов фосфотиросина клетки приготовлялись в RPMI 1640 с фенолом красным, 10% сыворотки зародыша теленка (Gibco, Грэнд Айленд, Нью-Йорк), 1% глутамина, 1% пенициллина и 1% стрептомицина.

Экстракты цианобактерий: Высушенный порошок цианобактерий из пресной воды АРА получался из озера Верхний Кламат в Орегоне, США. Для начальных экспериментов использовался высушенный при морозе порошок. Для более поздних экспериментов порошок получался из Desert Lake Technologvies LLC, Кино, Орегон, который высушивался с использованием технологии сушки REFRACTANCE WINDOW. Высушенный порошок Spirulina platensis получался у Healthforce Nutritionals Inc, Эскондидо, Калифорния. Один грамм высушенного водорослевого материала вторично взвешивался в 10 мл соляного раствора с фосфатным буфером и инкубировался за ночь при 4ºС и защищался от света. Вязкая масса перемешивалась повторным опрокидыванием сосуда и центрифугировалась при 400 г в течение 10 минут. Ярко-синее всплывшее вещество сцеживалось и стерильно фильтровалось, используя 0,22 мм фильтр. Фильтрат хранился в холоде и темноте и использовался в течение дня приготовления.

Моноклональные антитела: CD62L моноклинальное антитело TQ1 (специфическое для связывающей лиганд области молекулы L-селекетина), соединенное с фикоэритрином (РЕ), закупалось у Coulter (Хайали, Флорида). Антитела CD45-PerCP, CD11b-PE, CD14-PE и контроля изотипа получались из Beckton-Dickinson.

Захват лиганда с использованием Dynabeads и химерных белков: Для того чтобы идентифицировать молекулярную массу связывающего селектин соединения, использовался способ без клеток, в котором Dynabeads (Dynal Biotech Inc., озеро Суксесс, Нью-Йорк), покрытые протеином G, инкубировались с химерным белком селектина (R&D Systems Inc., Миннеаполис, Мичиган). Химерный белок - это слияние внеклеточного домена L-селектина, Р-селектина или Е-селектина человека с частью Fc иммуноглобулина G человека. Химерный белок был ковалентно соединен с G-покрытым протеином Dynabeads с использованием протокола, рекомендованного производителем, в котором гранулы инкубировались в течение 1 часа в заново созданном растворе 5,4 мг/мл диметил пимелимидата ×2 HCl (Sigma Aldrich) в буфере 0,2 М триэтаноламина рН 8,0 (Sigma Aldrich). Сшивка прекращалась путем удаления гранул из сшивающего раствора и повторного взвешивания в 50 мМ буфера TRIS (Sigma Aldrich) в течение 15 минут. Несвязанная химера элюировалась с гранул двумя промывками в буфере цитрат/лимонная кислота рН 2,8. Гранулы затем промывались несколько раз в PBS рН 7,4 и добавлялись к заново созданному водному экстракту AFA. Связанный материал из водного экстракта AFA элюировался одним из трех способов: 1) кипением в буфере Laemmli, содержащем бета-меркаптоэтанол, 2) элюированием с рН 12,5 и 3) конкуренцией за место связывания лиганда селектина с использованием известных лигандов селектина. Было обнаружено, что соединение очевидно тождественной молекулярной массы было аффинно очищен L-селектином и Р-селектином.

В параллельных экспериментах гранулы, покрытые рекомбинантным L-селектином/lgG1 слитым белком человека, использовались, чтобы посмотреть, содержал ли сходный водный экстракт из других цианобактерий, Spirulina platensis, сходное связывающее селектин соединение.

Электрофорез: Образцы элюэнта из способа Dynabead на с родство приготовлялись для электрофореза геля смешиванием в 1:1v/v образце буфера Laemmli (Biorad cat #161-0737) с меркаптоэтанолом. Электрофорез SDS геля проводился на 4-15% гелях (BioRad) в буфере TRIS/глицин/SDS (Biorad cat #16100732) в течение 1 часа при 120 В.

Электрофорез нативного белка проводился с реагентами, не содержащими SDS, с использованием Native Sample Buffer (Biorad cat #161-0738) для загрузки и буфера TRIS/глицин (Biorad cat #161-0734) для электрофореза.

Объекты-люди: Здоровые добровольцы набирались после согласия с информацией из штата лаборатории и студентов в возрасте 20-45 лет. Брались образцы крови венепункцией в асептических условиях и немедленно обрабатывались.

Выделение периферических мононуклеарных клеток крови (РВМС): Периферическая венозная кровь налагалась слоем на Ficoll-Hypaque (Amersham) и центрифугировалась в течение 25 минут при 400 г. Богатая РВМС поверхность раздела собиралась, и клетка промывались дважды в RPMI.

Выделение полиморфных ядросодержащих клеток (PMN): Периферическая венозная кровь смешивалась с декстраном 70 в 0,9% соляном растворе до конечной концентрации 1% декстрана при комнатной температуре. Осаждение происходило 1 час. Богатое лейкоцитами всплывшее вещество собиралось и лейкоциты гранулировались центрифугированием. Гранула повторно взвешивалась в 2 мл соляного раствора с фосфатным буфером, который затем накладывался слоем сверху 3 мл Ficoll-Hypaque, и центрифугирование в градиенте плотности проводилось для отделения мононуклеарных клеток (лимфоцитов и моноцитов) от нейтрофилов. Гранула, содержащая нейтрофилы, повторно взвешивалась в соляном растворе. Клетки промывались, повторно взвешивались в богатой питательными веществами среде (RPMI1640) и хранились на льду до использования.

Иммунное окрашивание для L-селектина: Лейкоциты из свежей и смешанной с формалином периферической крови распределялись по лункам в микротитрационном планшете с дном в форме V и с 96 лунками при приблизительной концентрации 10 ⁵ клеток на лунку. Вновь приготовленный водный экстракт цианобактерий AFA готовился в физиологическом растворе, и проводились последовательные разбавления. Клетки повторно взвешивались в любом из PBS, PBS-AFA-W, PBS-AFA-W-азиде или PBS-PC при разных разбавлениях. Клетки инкубировались при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин. Не фиксированная фракция не была в контакте с азидом натрия во время обработки экстрактом AFA, а повторно взвешивалась в буфере, содержащем азид натрия для последующего иммунного окрашивания. Позволялись свободные цитоскелетальные перемещения и выделение в среду L-селектина. Фракцию хранили в 0,02 азида натрия и приводили в контакт с азидом натрия в течение всей процедуры обработки экстрактом AFA и последующего иммунного окрашивания. Это блокировало бы цитоскелетальное перемещение и уменьшило или блокировало выделение в среду L-селектина. После инкубации с AFA-W или без него добавлялся буфер, и клетки центрифугировались. Всплывшее вещество удалялось, и клетки повторно взвешивались в объеме 50 мкл соляного раствора с фосфатным буфером, содержащим 1% зародышевой сыворотки теленка и 0,05% азида. Добавлялись оптимальные количества моноклональных антител, определенные при предыдущих титрованиях. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, добавлялся буфер и планшеты центрифугировались. Всплывшие вещества удалялись, клетки повторно взвешивались в 50 мл буфера и фиксировались в 1% формалина. Образцы держались холодными и в темноте до сбора проточной цитометрией. Сбор проводился в течение суток после фиксации.

Иммунное окрашивание для экспрессии CXCR4, вызванной лигандами L-селектина:

Связывание флукоидана с L-селектином приводит к экстернализации заранее полученных CXCR4 на поверхность клеток, за чем следует интернализация, создающая временное окно для реактивности хемотаксических факторов. Эту систему использовали для изучения того, будет ли AFA-W конкурировать с флукоиданом в связывании с L-селектином на поверхности клеток лейкоцитов, и для оценки того, будет ли это блокировать этот функциональный эффект от другого лиганда L-селектина. Чтобы выполнить это, вновь очищенный РВМС человека повторно взвешивался в RPMI и распределялся в ряде микролунок с круглым дном. Фукоидан добавляли в одному ляду лунок, AFA-W к другому ряду, и смесь фукоидана и AFA-W добавлялась к третьему ряду лунок. В разные моменты времени (1, 10, 20, 30, 40, 60 мин) PBS, содержащий азид натрия, добавляли в лунки, чтобы прекратить цитоскелетальные перемещения и тем самым прекратить рециклинг CXCR4, позволяя окрашивание CXCR4, экспрессированных у поверхности клеток в каждый момент времени. Клетки промывались в соляном растворе с фосфатным буфером, содержащим азид, окрашивались CXCR4-PE с использованием описанного выше протокола окрашивания, фиксировались в формалине и анализировались проточной цитометрией.

Оценка молекулярной массы нативных по сравнению с денатурированными компонентами лиганда селектина из АFА: Измерялись расстояния на геле для известных маркеров молекулярной массы. Положение лиганда селектина, полученного из AFA (двойная полоса), наносилось на график.

Пример 3

Стволовые клетки мобилизуются водным экстрактом из АFА

Этот эксперимент, описанный ниже, показывает, что водный экстракт AFA (Экстракт А, также называемый "AFA-W") обогащен лигандом селектина и может использоваться для усиления мобилизации стволовых клеток CD34+.

Идентифицировались здоровые люди-добровольцы, и доля клеток CD34+ оценивалась в периферической крови (циркулирующие клетки CD34+) каждого человека до приема содержащего селектин экстракта цианобактерий, а также через 10, мин, 30 мин, 60 мин и 120 мин после приема. Добровольцев попросили ограничить физическую и умственную активность на некоторое время до и после приема экстракта AFA.

В одном варианте осуществления 5 граммов высушенного AFA экстрагировались в 40 мл воды, и участник выпивал воду. В другом варианте участники принимали 750 мг высушенного экстракта AFA, содержащего лиганд селектина. Эритроциты в полных образцах крови, полученные от каждого добровольца, лизировались с использованием лизирующего раствора FACS (Beckton-Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния). Остальные клетки промывали и окрашивались моноклональным антителом НРСА-2, конъюгированным с флуоресцеин изотиоцианатом. Образцы фиксировались в 1% формалина и анализировались посредством проточной цитометрии с использованием проточного цитометра (Beckton-Dickinson, Сан-Хосе) и CellQuest программы (та же фирма).

Фиг.1 показывает, что прием экстракта AFA, содержащего лиганд селектина, запускал переходное увеличение циркулирующих стволовых клеток. Конкретно, ось Х показывает течение времени типичного эксперимента на момент 0, 10, 30 и 60 мин после приема внутрь экстракта AFA, содержащего лиганд L-селектина, выраженного как процентное отношение от контрольного уровня. В момент приема внутрь доля циркулирующих клеток CD34+ такая же, как контрольный уровень. Пиковое увеличение циркулирующих клеток CD34+ наблюдалось примерно 10-30 мин после приема. В этот момент времени количество циркулирующих клеток CD34+ увеличивалось в 2 раза (более чем на 200%) выше контрольного уровня. Спустя 1 час после приема внутрь экстракта AFA, содержащего лиганд селектина, циркулирующие клетки CD34+ вернулись к опорному значению. Поэтому водный экстракт AFA может усилить высвобождение эндогенных стволовых клеток (например, клеток CD34+) из костного мозга и других анатомических мест в циркуляцию. Прием экстракта AFA, содержащего лиганд селектина, мобилизует стволовые клетки CD34+.

Пример 4

Водный раствор AFA содержит лиганд селектина

Эксперименты, описанные ниже, документально показывают, что AFA содержит растворимое в воде соединение, которое специфически уменьшает TQ1 иммунное окрашивание L-селектина на лимфоцитах, моноцитах и нейтрофилах человека.

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделялись путем наложения слоя периферической венозной крови на Ficoll-Hypaque и центрифугировались в течение 25 минут при 400 г. Богатая РВМС поверхность раздела собиралась, и клетки дважды промывались в RPMI. Полиморфонуклеарные клетки (PMN) выделялись путем смешивания периферической венозной крови с декстраном 70 в 0,9 соляного раствора до конечной концентрации 1% декстрана при комнатной температуре. Осаждение продолжалось 1 час. Богатое лейкоцитами всплывшее вещество собиралось, и лейкоциты гранулировались центрифугированием. Гранула повторно взвешивалась в 2 мл солевого раствора с фосфатным буфером, который затем наносился слоем сверху 3 мл Ficoll-Hypaque, и центрифугирование в градиенте плотности проводилось для отделения мононуклеарных клеток (лимфоцитов, моноцитов) от нейтрофилов. Гранула, содержащая нейтрофилы, повторно взвешивалась в соляном растворе. Клетки промывались, повторно взвешивались в богатой питательными веществами среде (RPMI 1640) и хранились на льду до использования.

Свежие и фиксированные в формалине лейкоциты периферической крови распределялись по лункам титрационного микропланшета с дном в форме V на 96 лунок при приблизительной концентрации 10⁵ клеток на лунку. Вновь приготовленный водный экстракт цианобактерий АFА готовился в физиологическом растворе и проводились последовательные разбавления. Клетки повторно взвешивались в одном из PBS, PBS-AFA-W, PBS-AFA-W-азид или PBS-PC при разных разбавлениях. Клетки инкубировались при комнатной температуре и в темноте 20 мин. Нефиксированная фракция не была в контакте с азидом натрия во время обработки экстрактом AFA, но повторно взвешивалась в содержащем азид натрия буфере для последующего иммунного окрашивания. Это нужно было для свободных цитоскелетальных перемещений и выделения L-селектина в среду. Фракция, которая держалась в 0,02% азида натрия, находилась в контакте с азидом натрия в течение всей процедуры, как обработки экстрактом AFA, так и последующей иммунной окраски. Азид натрия блокирует цитоскелетальное перемещение и уменьшает или блокирует выделение L-селектина в среду. Поэтому любое уменьшение окрашивания для L-селектина моноклональным антителом вызвано непосредственной конкуренцией с соединением в экстракте AFA.

После инкубации с экстрактом A (AFA-W) или без него добавлялся буфер, и клетки центрифугировали. Всплывшее вещество снимали и клетки повторно взвешивали в объеме 50 мкл солевого раствора с фосфатным буфером, содержащим 1% сыворотки зародыша теленка и 0,05% азида. Оптимальные количества моноклональных антител, определенные предыдущими титрованиями, добавлялись. Планшеты инкубировались при комнатной температуре 10 мин, добавлялся буфер, и планшеты центрифугировали. Всплывшие вещества удалялись, клетки повторно взвешивались в 50 мкл буфера и фиксировались в 1% формалина. Образцы хранились в холоде и темноте до сбора проточной цитометрией. Сбор производился в течение суток после фиксации. Моноклональное антигело CD62L TQ1 (специфическое для связывающей лиганд области молекулы L-селектина), соединенное с фикоэритрином (РЕ), закупалось у Coulter (Hialeah FL).

Инкубация РВМС и PMN с водным экстрактом из AFA (AFA-W) приводила к уменьшению иммунного окрашивания с TQ1 моноклональным антителом анти-человеческого L-селектина, который, как известно, специфичен для связывающей лиганд области L-селектина (Spertini et al., J. Immunol. 147(3):942-9, 1991). Опосредованное AFA-W уменьшение TQ1 окрашивания было самым сильным на лимфоцитах и: PMN, но также наблюдалось на моноцитах (фиг.2А). На лимфоцитах и PMN снижение примерно в 40-70 раз окрашивания TQ1 было видно, когда клетки предварительно инкубировались с AFA-W в отличие от снижения в 15 раз для моноцитов.

Экспрессия CD11b была слегка позитивно отрегулирована, хотя не наблюдалось значительных изменений для других маркеров адгезии (CD11a, CD18, CD29, CD49d, CD 48e, CD44). Фиксированный формалином лимфоциты периферической крови инкубировались в отсутствие или в присутствии последовательных разбавлений AFA-W. Окрашивание лимфоцитов антителом TQ1 показало зависимое от дозы снижение в TQ1 связывания с L-селектином при увеличении концентрации Экстракта А. Поскольку эффект также наблюдался на фиксированных формалином лимфоцитах, уменьшенное окрашивание не могло быть вызвано высвобождением L-селектина в среду (фиг.2).

Пример 5

Лиганд селектина AFA блокирует экспрессию рецепторов хемокинов, запущенную фукоиданом в линии клеток KG-1a CD^bright

Примитивная линия клеток KG-1a ярко позитивна для CD34 и для L-селектина, как оценивалось путем окрашивания моноклонапьным антителом TQ1. KG-1a также содержит внутриклеточные резервуары для рецептора хемокина CXCR4, которые экстернализуются после лигирования L-селектина. Инкубация KG-1 с фукоиданом, агонистом L-селектина, запускает экспрессию рецептора хемокина CXCR4. Экстракт A AFA блокирует опосредованное фукоиданом воздействие на экспрессию CXCR4 (фиг.3).

Пример 6

Очистка лиганда L-селектина от AFA

Лиганд селектина выделялся из AFA с использованием магнитных гранул, ковалентно связанных с генетически созданным слитым белком, в котором внеклеточная часть рекомбинантного L-селектина или Р-селектина человека соединена с участком Fc иммуноглобулина. Гранилу инкубируют с растворимой в воде фракцией AFA и лиганд селектина выделяется (см. фиг.4А: L-селектин, фиг.4В: Р-селектин). Гранулы собирали с использованием магнита и многократно промывались. Затем гранулы подвергали кислотной обработке или кипячению или щелочной обработке для разрыва связи между лигандом и рекомбинантным селектином. Лиганд селектина также выделялся с использованием аффинной колонки.

Когда лиганд селектина восстановлен в условиях восстановления, он представляет собой димер, составленный из двух субъединиц примерно 54 RDa и 57 kDa (фиг.4В). Композитная молекула на основе этих субъединиц могла бы иметь молекулярные массы приблизительно 108, 111 или 114 kDa и их более высокие кратные. Используя методы исключения размеров, когда фракция экстракта А пропускалась через фильтр 100 kDa, лиганд обнаруживался в более высоких концентрациях во фракции выше 100 kDa. Поэтому лиганд можно выделить как димер с массой, по меньшей мере, 100 kDa.

Пример 7

Лиганд селектина, экстрагированный из АFА не найден в Экстракте В

Экстракт В получался в несколько этапов, вначале экстрагированием соединений в этанол, затем обратно в полярный буфер (вода, соляной раствор). Первый этап состоял в получении желтого/коричневого порошка из высушенного AFA, первично в течение 3 часов при 50ºС с водным раствором, содержащим 20% этанола. Всплывшее вещество сцеживалось, и твердые вещества осаждались добавлением этанола к конечной концентрации 80%. Осадок высушивался с использованием способа сушки REFRACTANCE WINDOW. Когда этот желтый порошок помещали обратно в водный раствор (вода или соляной раствор), получался оранжевый экстракт. Твердые вещества удалялись центрифугированием, а всплывшее вещество стерильно фильтровали. Жидкой экстракт - это Экстракт В. Этот экстракт инкубировали с покрытыми магнитными гранулами, описанными выше. Экстракт В не содержал лиганда селектина (фиг.5).

Пример 8

Лиганд селектина из экспрессии модулятов CXCR4 цианобактерий

Стволовые клетки поддерживаются в костном мозге, по меньшей мере, частично посредством адгезионных молекул селектина. Когда селектин зацепляется соответствующим лигандом, он запускает экспрессию рецептора цитокина CXCR4. CXCR4 является специфическим рецептором для стромального фактора 1 (SDF-1) и связывание SDF-1 с CXCR4 помогает поддерживать стволовые клетки, связанные с костным мозгом. Ингибирование связывания лиганда селектина уменьшает экспрессию CXCR4, что приводит к отсоединению стволовых клеток от костного мозга и к их высвобождению в кровоток.

Для демонстрации физиологического эффекта лиганда селектина из AFA в одном примере осуществления лиганд селектина тестировался на экспрессии CXCR4, запущенной флукоиданом, известным лигандом L-селектина, стимулирующим экспрессию CXCR4. Экспрессия рецепторов CXCR4 после воздействия флукоидана оценивалась на лимфоцитах с использованием проточной цитометрии. Инкубация с лигандом селектина AFA значительно ингибировала экспрессию CXCR4 на лимфоцитах человека (фиг.6) и на его CD34+линии клеток-предшественников KG-1a (фиг.7), указывая на то, что это механизм, которым лиганд селектина AFA может запустить мобилизацию стволовых клеток.

Пример 9

Стволовые клетки из костного мозга заселяют множество дальних тканей

Модель мыши может использоваться для оценки способности стволовых клеток, мобилизованных приемом цианобактерий, заселять отдаленные ткани тела.

Самцы мышей отбираются в качестве доноров костного мозга, тогда как все мыши-реципиенты - самки. Самки-реципиенты сублетально облучаются до инъекции клеток костного мозга самцов из вены хвоста. Оцениваются 2 группы мышей. Первая группа из 20 животных сублетально облучается, ей делают инъекцию костного мозга и нормально кормят. Вторая группа из 20 животных также сублетально облучается, принимает костный мозг самцов и ее кормят диетой нормального корма плюс 0,5-15% массы к объему фракции AFA, содержащей лиганд селектина.

Примерно 6×10 ⁶ ядросодержащих клеток собираются у мышей-самцов в возрасте 8-10 недель и инъецируются в хвостовые вены сублетально облученных изогенных взрослых реципиентов-самок также в возрасте 8-10 недель. Мышей из каждой группы убивают в каждый из следующих моментов времени: время 0,1 неделя, 2 недели, 3 недели, 4 недели и 8 недель. В моменты времени 2 и 8 недель убивается 6 мышей из каждой группы. Во все другие моменты времени из каждой группы убивают 2 мыши.

В течение первых двух недель после инъекции 15 микролитров цельной крови берется из уха, хвоста или лапы и немедленно разбавляется в 200 микролитрах буфера (соляной раствор с фосфатным буфером, рН 72,2% сыворотки, 0,02% азида) для разбавления факторов свертывания и предотвращения коагуляции. Образцы крови анализировались для отслеживания репопуляции тромбоцитов, эритроцитов и лейкоцитов в крови. Часть образца крови используется для получения подсчета клеток и для дифференциальной оценки эритроцитов относительно лейкоцитов. Образец анализируется с использованием проточного цитометра, и доля нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов будет оцениваться, используя устройство переднего и бокового рассеяния. Лейкоциты крови будут исследоваться на происхождение от самца с использованием проточной цитометрии.

В момент убийства разные типы клеток и тканей будут исследованы на Ну-антиген, что показывает, что клетка или ткань происходили из самца. Мозг собирается и исследуется весь мозг, включая обонятельную луковицу, гиппокамп, корковые зоны и мозжечок. Костный мозг, сердечная мышца, задняя лапа, печень, поджелудочная железа, части тонкой кишки и легочная ткань исследуются на присутствие клеток с Y хромосомой, либо обнаружением поверхностного Ну-антигена путем иммунофлуоресценции, либо флуоресценцией in situ гибридизацией, используя зонды для Y хромосомы. Эти данные документально покажут, до какой степени диета, содержащая цианобактерии, способствует «хомингу», имплантации и дифференцировке инъецированных стволовых клеток костного мозга.

Пример 10

Стволовые клетки из костного мозга заселяют множество отдаленных тканей

Исследование, сходное с описанным выше, проводится с использованием трансгенных мышей-самцов с геном GFP (Green Fluorescent Protein) и изогенных самок мышей, как реципиентов. Животные обрабатываются, кормятся и убиваются, как описано выше, и образцы крови также анализируются сходным образом.

Лейкоциты крови исследуются на экспрессию GFP с использованием проточной цитометрии и на момент убийства разные клетки и типы тканей будут изучены на GFP антиген, который показывает происхождение донора. Ткани и органы собираются, как описано выше, и обнаруживается присутствие клеток, несущих GFP, путем проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии.

Пример 11

Увеличенная репопуляция стволовых клеток травмированной ткани

Модель мыши используется для оценки «хоминга» и интеграции стволовых клеток, полученных из костного мозга, в травмированную ткань.

Все доноры костного мозга - это взрослые мыши-самцы (возраст 8-10 недель) и все мыши реципиенты - это взрослые самки (возраст 8-10 недель). Оцениваются 2 группы мышей. Одна группа сублетально облученных реципиентов получает 6×10⁶ ядросодержащих донорских клеток посредством инъекции в хвостовую вену с 2 неделями восстановления. Затем животные слегка травмируются путем инъекции иглы в мышцу задней лапы, сердце и мозг. Все животные получают нормальный корм в ходе всего исследования. Во второй группе самки обрабатываются идентично с первой группой, но их кормят диетой, включающей 0,5-15% массы к объему фракции АFА, содержащей лиганд селектина.

Двух мышей убивают до травмы для оценки опорных уровней клеток, полученных от самцов. Затем мышей убивают в следующие моменты времени: 1 неделя, 2 недели, 3 недели и 4 недели. Двух мышей убивают в каждый момент времени, кроме момента 2 недели, причем 6 мышей убивают из каждой группы. Мышца задней лапы, сердце и ткань мозга выделяются из убитых животных. Разрезы прорезаются через травмированные участки и окрашиваются для клеток, полученных у самцов, с использованием либо анализ маркера поверхности клетки на экспрессию Ну-антигена или флуоресцентной in situ гибридизацией с использованием зондов для Y хромосомы. Как альтернатива, будет использован экспрессирующая GFP трансгенная мышь донор (как в примере 4).

Полученные данные показывают эффект приема фракции AFA, содержащей лиганд селектина, на скорость рекрутмента стволовых клеток после травмы.

Пример 12

История болезни по восстановлению ткани

Объектом была культурист, у которой была транспортная авария 3 года назад. Машина ударила ее машину в дверцу на стороне водителя, и несколько мышц были порваны в ее бедре. Она прошла несколько операций для повторного прикрепления разделенных мышц. Несмотря на успешные хирургические операции, повреждение мышцы было настолько сильным, что она оставалась с постоянной болью и не могла возобновить свои тренировки по поднятию тяжестей, поскольку даже слабая тренировка закончилась бы распуханием и болью, которая не позволила бы ходить несколько дней.

Она испробовала много противовоспалительных лекарств, но после 18 месяцев она все еще не могла тренироваться. Она начала принимать фракцию цианобактерий, содержащих лиганд селектина. Через 2 недели она сообщила, что способна вернуться в гимнастический зал, а спустя 2 месяца приема она возобновила нормальные тренировки, что указывает на существенное восстановление мышечной ткани.

Пример 13

История болезни по восстановлению ткани

Пациент 55 лет пошел на 6-ю замену (протезирование) бедра - 4-ю слева. В основном, был очень плохой прогноз и встречались огромные трудности.

Хирург-ортопед перестроил таз и вертлужную впадину. Однако до операции пациенту сообщили врачи, что для тела нет способа произвести новую кость, необходимую для долгосрочного успеха процедуры. Было представлено, что если пациент должен получить рост кости, он скорее всего будет меньше, чем требуется для излечения.

Пациенту дали фракцию цианобактерий, содержащую L-селектин, вскоре после операции. Новый сильный рост кости появился быстро, и восстановление было скорым. Пациент сообщил, что он более не нуждался в костылях и был способен на статус переноса полного веса через 6 недель - в сравнении с 6 месяцами с предыдущей операцией пациента. Пациент сообщил, что ускоренное заживление было подтверждено каждым обследованием. Пациент сообщил также, что кость, окружающая его правое бедро, которое подверглось ревизии в начале 1980 гг., оказалась очень сильной (крепкой). Это посчитали исключительным.

Пример 14

История болезни

Молодая девушка диагносцировалась в возрасте 3 лет с детской мышечной дистрофией. Она не могла ходить. Она была очень слаба и часто переносила воспаление легких, что каждый раз приводило в постельному режиму в течение 8-10 дней. Она проходила традиционную терапию для мышечной дистрофии 6 месяцев, но это не привело к изменению. Она начала принимать Spirulina, которая до некоторой степени усилила ее иммунную функцию, поскольку она реже болела воспалением легких и в более легкой форме. Затем она начала принимать фракцию цианобактерий, содержащую лиганд селектина (Экстракт А). Спустя 2 недели она начала делать свои первые шаги. Спустя 3 месяца она уже ходила. Воспаления легких у нее больше не было. Эта болезнь является наследственной, и несколько членов семьи с этой же болезнью - но в более запущенной форме - также начали принимать фракцию цианобактерий (Экстракт А). Эти люди сообщили, что прием этой фракции принес им пользу.

Пример 15

Исследования людей

Втройне слепое, рандомизированное, контролируемое плацебо исследование людей проводилось по поводу воздействия разных экстрактов AFA на ряд циркулирующих стволовых клеток. В этих исследованиях использовались следующие методы:

Принимаемые вещества: Испытывалось 4 принимаемые вещества. Два были в жидком виде и два были в капсулах. Ни добровольцы, ни лицо, вводившее вещества, ни лаборанты, проводившие анализ данных, не знали, какое вещество вводилось в данный день исследования.

1. LSL. Экстракт А. Экстракт А, фракция AFA, обогащенная лигандом L-селектина. Один грамм фракции, концентрированной в лиганде L-селектина, перемешивался в 40 мл воды и давался исследуемым в бумажной чашке.

2. Migratose (MGT). Известно, что эта фракция содержит биоактивное соединение, ответственное за миграцию иммунных и стволовых клеток, и она была получена экстрагированием жидкого AFA с 10% этанола при 50ºС в течение 1 часа. Раствор центрифугировался и всплывшее вещество высушивалось, используя RW. Этот продукт назвали между своими Migratose (MGT). Migratose (150 мг) тонко смешивалась с 250 мг плацебо и вводилась в растительной капсуле.

3. StemEnhance (SE): StemEnhance представляет собой смесь LSL и Migratose. Один грамм StemEnhance смешивался в 40 мл воды и подавался исследуемым в бумажной чашке.

4. Плацебо: Плацебо состояло из 400 мг высушенных в зеленом виде, мелко перемолотых картофельных хлопьев, помещенных в растительные капсулы.

Внешний вид был тождественен капсулам, содержащим Migratose.

Объекты: Всего 19 человек были проинтервьюированы из числа здоровых доноров крови. Из исследования пациенты исключались по следующим критериям:

- Моложе 20 или старше 65 лет

- Беременность

- Тяжелая астма и аллергия, требующие ежедневной лекарственной терапии

- Любая известная хроническая болезнь или предыдущая/текущая венерическая болезнь

- Частое использование лекарств для отдыха

- Нарушенная функция пищеварения (включая предыдущие желудочно-кишечные операции).

Из проинтервьюированных людей 14 соответствовали критериям исследования и хотели принять участие. Из 14 три затем были исключены в ходе исследования из-за несоответствия. Из оставшихся 11 добровольцев каждый из шести прошли 4 дня исследования, так что данные получались для всех 4 принимаемых веществ для одного и того же лица. Остальные 5 добровольцев могли участвовать в трех днях исследования. Приход объектов регистрировался в тот же самый день недели в течение 4-х последующих недель в течение 2-х месяцев. Объекты регистрировались в тот же день недели для большей согласованности данных. Им посоветовали хорошо поспать ночью перед каждым днем исследования и тот же вид легкого завтрака в каждый день исследования.

По прибытии добровольцы усаживались в спокойных местах вдали друг от друга, чтобы не дать им возможность беседовать и создать спокойную среду (не было отвлекающих моментов, таких как телефоны, звонки в дверь, разговоров между лаборантами). Добровольцам посоветовали помолчать, удобно сидя в кресле в течение часа. Движения ограничивались медленным хождением в туалет при необходимости. Спустя час брался опорный образец крови. Непосредственно после взятия опорного образца давалось принимаемое вещество. Добровольцам давали инструкцию помолчать на протяжение всего эксперимента. Затем брались образцы крови 30, 60 и 120 минут после приема внутрь принимаемого вещества.

Каждый день по приходе в лабораторию добровольцы заполняли анкету, давая ежедневную оценку их общего состояния. Предполагалось, что эта анкета установит каждый случай, для которого данные могли бы быть уничтожены из-за чрезвычайных обстоятельств. Для уничтожения конкретных данных исследовались следующие критерии:

- Потеря сна

- Стимуляторы в течение 2 часов после прибытия

- Стресс

Оценка циркулирующих стволовых клеток: В каждый момент времени 5 мл крови брались в гепарин и 2 мл крови брались в EDTA. Колбы с кровью помещались на качающуюся пластину до использования. Кровь, взятая в EDTA, использовалась для получения полного анализа крови (СВС) с использованием счетчика Coulter (Mixcro Diff II, Beckman Coulter). Все CBC проводились в течение часа после взятия образца. Гепаринизированная кровь использовалась для очищения фракции мононуклеарных клеток периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности и обрабатывалась для иммунного окрашивания и проточной цитометрии. Маркеры стволовых клеток CD34-FITC (клон 8G12) и CD133-PE использовались для двуцветной иммунофлуоресценции. Окрашивание всех образцов CD34-FITC/CD133-PEW проводилось троекратно (in triplicate). Соответствующие контрольные группы изотипов использовались в параллельных образцах. Положительные контрольные группы для каждого донора включали CD45 и CD14. Окрашенные клетки фиксировали в 1% формалина и собирались проточной цитометрией немедленно. Файлы 200.000 событий собирались на каждом образце.

Поскольку клетки, использованные в иммунном окрашивании, не содержали популяции гранулоцитов, сбор 200.000 событий включал в себя больше стволовых клеток, чем если бы использовалась цельная кровь. Таким образом, использование фракции мононуклеарных клеток периферической крови позволяет собирать данные с большим количеством стволовых клеток, давая лучший статистический вес наблюдаемым различиям количества стволовых клеток.

Окрашивание для CD14 проводилось в параллельных образцах, чтобы не мешать анализу CD34 и CD 133. Анализ проточной цитометрией проводился, используя программу CellQuest Pro (Becton Dickinson).

Были получены следующие результаты:

Прием внутрь SE и LSL приводил к увеличению количества циркулирующих клеток CD34+ (см. фиг.9), тогда как MGT приводил к уменьшению количества циркулирующих клеток CD34+. После приема плацебо были небольшие изменения, статистически незначительные.

При SE и LSL ряд добровольцев показывал тенденцию к начальному переходному уменьшению количества клеток CD34+. Это наблюдалось больше для LSL, хотя не достигало значительной меры. Спустя 60 минут после приема SE (р<0,003) и LSL (р<0,02) запускали значительное увеличение количества клеток CD34+. Однако MGT запускал значительное уменьшение (р<0,03).

В последующей части анализа данных реакции каждого добровольца на экстракты AFA нормализовались к реакции того же лица к плацебо. Это делалось вычитанием процентного изменения, полученного с плацебо, из процентного изменения, полученного с экстрактом. Это делалось для всех 3-х принимаемых веществ. Эта процедура не увеличивала величину или значимость реакций; полученный рисунок был сходен с фиг.9.

Другая часть анализа данных концентрировалась на максимальном процентном изменении для каждого принимаемого вещества в сравнении с плацебо. Оснований для этого анализа состоит в том, что поглощение биоактивных соединений, доставка к целевым органам и время для генерирования количественной физиологической реакции могут быть разными в зависимости от общего состояния физиологии каждого добровольца. Этот метод анализа минимизирует различия времени индивидуальной реакции и позволяет сравнивать степень изменения независимо от того, наблюдалось ли максимальное изменение при 30 или 60 мин. На основе этого метода обнаруживалось увеличение 24+-5% количества циркулирующих стволовых клеток с SE и уменьшение 24+-2% с MGT. Средняя реакция 27% и 77% соответственно для SE и MGT была обнаружена.

Временные рамки для достижения максимальной реакции, как кажется, были не более нескольких недель. Во избежание потенциального путающего фактора в данных, большинство исследований проводилось на образцах у объектов, которые регулярно принимали AFA. В данном исследовании только один объект не принимал AFA регулярно. Этот один объект не проявил заметного увеличения мобилизации клеток CD34+. Следует заметить, что этот доброволец был удален из анализа. Поскольку это был только один объект, не принимавший регулярно AFA, образцы, полученные от этого объекта, нельзя было использовать в релевантном статистическом анализе. Кроме того, одно усложнение протокола этого типа - это то, что не все люди мобилизовались согласно сходным временным рамкам, и потому может быть недооценка реального пика мобилизации. Реакция на плацебо показывала вариации, хотя такие флуктуации не достигали статистической значимости. Тем не менее, эти флуктуации кажутся реальными и говорят о том, что может потребоваться лучшее понимание ежедневного цикла циркулирующих CD34+ при планировании будущих исследований.

Это исследование подтвердило, что SE и LSL, оба из которых содержат высушенный водный экстракт, обогащенный лигандом селектина, эффективны при мобилизации стволовых клеток костного мозга путем увеличения количества циркулирующих клеток CD34+. Данные, собранные в этом исследовании, показывают, что SE увеличивает количество циркулирующих стволовых клеток до 35%.

Понятно, что точные подробности описанных способов или композиций могут меняться или модифицироваться не отходя от сущности описанного изобретения. Мы притязаем на все такие модификации и вариации, которые подпадают под объем и сущность представленной ниже формулы изобретения.