способ предотвращения десульфатирования и повышения биодоступности биологически активных сульфатированных полисахаридов при их пероральном применении

Формула изобретения

1. Способ предотвращения десульфатирования и повышения пероральной биодоступности биологически активных сульфатированных полисахаридов (БАСП), выбранных из группы: нефракционированный гепарин, низкомолекулярный гепарин и фукоидан, характеризующийся тем, что БАСП смешивают с блок-сополимером полиэтиленоксида и полипропиленоксида (блок-сополимер ПЭО/ППО).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор блок-сополимера ПЭО/ППО предварительно облучают ионизирующим излучением.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве ионизирующего излучения используют тормозное -излучение.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что ионизирующим излучением облучают раствор, содержащий БАСП и блок-сополимер ПЭО/ППО.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что раствор, содержащий БАСП и блок-сополимер ПЭО/ППО, облучают -излучением.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что раствор, содержащий БАСП и блок-сополимер ПЭО/ППО, облучают потоком ускоренных электронов.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что раствор, содержащий БАСП и блок-сополимер ПЭО/ППО, облучают ультрафиолетовым излучением.

9. Способ по п.5, отличающийся тем, что раствор, содержащий БАСП и блок-сополимер ПЭО/ППО, облучают лазерным излучением.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве БАСП используют фукоидан с молекулярной массой (ММ) 3000-25000 Да.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют фукоидан, полученный из водорослей Laminaria japonica.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве БАСП используют нефракционированный гепарин.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве БАСП используют низкомолекулярный гепарин с ММ до 10000 Да.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют смесь различных БАСП, выбранных из группы: нефракционированный гепарин, низкомолекулярный гепарин и фукоидан.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве блок-сополимера ПЭО/ППО используют блок-сополимер с ММ 1100 Да и гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ), равным 1-7.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве блок-сополимера ПЭО/ППО используют блок-сополимер с ММ 8400 Да и ГЛБ>24.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве блок-сополимера ПЭО/ППО используют блок-сополимер с ММ 9840-14600 Да и ГЛБ 18-23.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве блок-сополимера ПЭО/ППО используют блок-сополимер с ММ 1400 Да и ГЛБ 5,7.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве блок-сополимера ПЭО/ППО используют смесь различных блок-сополимеров ПЭО/ППО.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, биологии, фармакологии.

В настоящее время в клинической практике, экспериментальных биологических и медицинских исследованиях широко применяются антикоагулянты прямого действия. К ним относятся сульфатированные полисахариды животного и растительного происхождения. Антикоагулянтное действие сульфатированных полисахаридов связано с их взаимодействием с антитромбином III. При этом образуются комплексы, инактивирующие фактор II (тромбин). Другим механизмом антикоагуляционного эффекта сульфатированных полисахаридов является инактивация Ха фактора свертывания крови (фактора Стюарта).

Сульфатированные полисахариды животного и растительного происхождения, кроме антикоагуляционного, обладают также и другими важными свойствами. Для сульфатированных полисахаридов показано их холестеролснижающее действие (РФ № 2048475). Известно, что фукоидан, декстран-сульфат, гепарин, каппа- и лямбда- каррагинаны обладают способностью ингибировать рост ВИЧ-1 (заявка на патент Японии № 1313433(A). Известна противоопухолевая активность лямбда-каррагинанов и фукоиданов (Hirayasu Н, Yoshikawa Y, Tsuzuki S, Fushiki Т. Sulfated polysaccharides derived from dietary seaweeds increase the esterase activity of a lymphocyte tryptase, granzyme A. / J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2005 Dec; 51(6):475-7; Yang C, Chung D, Shin IS, Lee H, Kim J, Lee Y, You S. Effects of molecular weight and hydrolysis conditions on anticancer activity of fucoidans from sporophyll of Undaria pinnatifida / Int J Biol Macromol. 2008 Dec; 43(5):433-7. Epub 2008 Aug 27). Известны и другие свойства фукоиданов: противовирусное (РФ № 2304443), иммунотропное свойства (РФ № 2247574; Choi Е.М., Kim A.J., Kim Y.O., Hwang J.K. Immunomodulating activity of arabinogalactan and fucoidan in vitro. // J Med Food. 2005 Winter; 8(4):446-53) J Med Food. 2005 Winter; 8(4):446-453).

Сульфатированные полисахариды, как правило, вводятся инъекционно, так как их биодоступность при пероральном применении низка. Это препятствует их более широкому применению при различных патологиях.

Известен препарат для перорального применения, содержащий гепаринопобные фракции и дерматан сульфат, выпускающийся под коммерческим названием «Сулодексид». Однако другие сульфатированные полисахариды, например, такие как фукоидан и гепарин, при пероральном применении подвергаются десульфатированию в кишечнике и теряют свою биологическую активность (Сидоренко Б.А., Преображенский Д.В. Клиническое применение антитромботических препаратов. Москва 1997. 175 стр.). Поэтому их вводят инъекционным путем, но длительное применение инъекционных форм препаратов затрудняет их использование в амбулаторных условиях и снижает качество жизни пациентов.

Поэтому сохраняет актуальность поиск способов повышения биодоступности сульфатированных полисахаридов при их пероральном приеме.

С целью повышения биодоступности сульфатированных полисахаридов предложено создание многослойных структур - микрочастиц (нанокапсул) диаметром от десятков нанометров до десятков микрон (Маууа К. S., Schoeler В., Caruso F. Preparation and organization of nanoscale polyalactrolyte-coated gold nanoparticles // Adv. Funct. Mater. 2003, 13(3):183-188; Qiu X.P., Leporatti S., Donath E., Mohwald H. Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles // Langmuir. 2001, 17(17): 5375-5380), обеспечивающих защиту молекул сульфатированных полисахаридов от десульфатирования и одновременно обеспечивающих адгезию сульфатированных полисахаридов на гликокаликсе энтероцитов. В частности, подобный подход описан в источниках, где использован плюроник: Choi S.H., Lee J.H., Choi S.M., Park T.G. Thermally Reversible Pluronic/Heparin Nanocapsules Exhibiting 1000-Fold Volume Transition // Langmuir. 2006, 22(4): 1758-1762; Park H.Y., Oh K.S., Koo H.M., Cho S.H., Chung S.J., Lim Y.T., Kim D., Yuk S.H. Heparin-immobilized pluronic/PVA composite microparticles for the sustained delivery of ionic drug // J Microencapsul. 2008, 25(2): 106-110; A facile method to prepare heparin-functionalized nanoparticles for controlled release of growth factors. Chung YI, Tae G, Hong Yuk S. Biomaterials. 2006 Apr; 27(12):2621-6. Epub 2005 Dec 19.

Однако процесс создания микрочастиц является трудозатратным, включает в себя много стадий, разделение промежуточных продуктов, что, соответственно, значительно удорожает конечный продукт.

Имеются сведения об успешных попытках увеличить биодоступность сульфатированных полисахаридов при пероральном приеме путем их конъюгации с желчными кислотами. В частности, в литературе описана биодоступность таких конъюгатов, составляющая от 9 до 16% (Guarini S., Fano R.A., Rompianesi Е., Martinelli A.M., Ferrari W. The effect of sodium deoxycholate given by gavage with heparin on the histology of the intestinal mucosa of the rat // J Pharm Pharmacol. 1986 Dec; 38(12): 922-924; Kim S.K., Lee D.Y., Lee E., Lee Y.K., Kim C.Y., Moon H.T., Byun Y. J. Absorption study of deoxycholic acid-heparin conjugate as a new form of oral anti-coagulant // Control Release. 2007 Jul 16; 120(1-2): 4-10; Kim S.K., Lee D.Y., Kim C.Y., Nam J.H., Moon H.T., Byun Y. J. A newly developed oral heparin derivative for deep vein thrombosis: Non-human primate study // Control Release. 2007 Nov 6; 123(2):155-163), где для обеспечения всасывания гепарина в кишечнике предложено ковалентное связывание гепарина с желчными кислотами, стеринами и алкановыми кислотами.

Известна рецептура для орального применения, содержащая: низкомолекулярный гепарин и основу рецептуры, состоящую из ненасыщенной жирной кислоты, полимерного компонента, выбранного из группы, включающей поливинилпирролидоны, сополимеры винилпирролидона или производные целлюлозы, и дополнительных фармацевтически приемлемых вспомогательных средств (РФ № 2278658).

В описанной рецептуре используется, как минимум, три вещества (гепарин, липидный компонент и полимерный компонент) и применяются специальные режимы приготовления смеси, например высокая температура.

Известна твердодисперсная фармацевтическая композиция, включающая нерастворимое в воде терапевтически активное вещество, которое является трициклическим соединением указанной в источнике формулы и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество, выбранное из группы, включающей, в частности, плюроник (РФ № 2197226).

Однако функции блок-сополимеров этиленоксида и полипропиленоксида в описанных составах сводятся лишь к стабилизации эмульсии и дисперсии тонкоизмельченного плохо растворимого в воде активного соединения.

Известно использование полимерных мицелл для повышения пероральной доступности лекарств (Bromberg L. Polymeric micelles in oral chemotherapyJ Control Release. 2008 Jim 4; 128(2):99-112. Epub 2008 Feb 11). Однако для создания полимерных мицелл используется сополимер плюроника и полиакриловой кислоты.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является «Способ повышения биодоступности лекарственных средств» (РФ № 2328309), включающий смешивание последних с предварительно аэрированным и облученным потоком ускоренных электронов или импульсным УФ-лазерным облучением раствором полиэтиленоксида с молекулярной массой 0,4-20 кДа в присутствии 0,01-0,1 М фосфатного буфера, pH 6,0-8,0 и содержащим 0,05-0,3 М хлорида натрия. В примерах, приведенных в данном способе, показано значительное (в три раза) повышение энтеральной биодоступности сульфатированного полисахарида (гепарина) у мышей.

Однако, как будет показано ниже, в прототипе указанное повышение биодоступности гепарина у мышей достигалось с помощью дозы гепарина, которая в 24 раз превышала использованную в предлагаемом способе.

Кроме того, и состав предлагаемого в патенте РФ № 2328309 лекарственного средства, и способ его приготовления более сложный.

Известно, что блок-сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленоксида (плюроники, проксанолы, полоксамеры) нашли широкое применение в различных областях науки и технологии. В частности, было обнаружено, что плюроники увеличивают проницаемость клеточных мембран по отношению к антрациклиновым антибиотикам и способствуют накоплению лекарств в опухолевых клетках, обладающих множественной лекарственной устойчивостью. Показано, что плюроник в наибольшей степени ускоряет транспорт крупных соединений, содержащих протонодонорные группы (Бугрин В.С. Связь между структурой низкомолекулярных соединений и их взаимодействием с плюрониками. Автореф. к.х.н., М., 2007).

Однако в литературе не описаны примеры проникновения через кишечную стенку в кровоток с помощью плюроников сульфатированных полисахаридов.

Раскрытие изобретения

Сущность предлагаемого способа предотвращения десульфатирования биологически активных сульфатированных полисахаридов (БАСП) и повышения их биодоступности при пероральном применении заключается в том, что БАСП смешивают с блок-сополимером полиэтиленоксида (ПЭО) и полипропиленоксида (ППО).

В качестве БАСП могут быть использованы различные биологически активные сульфатированные полисахариды, в частности, такие как гепарин (в частности, нефракционированный гепарин, низкомолекулярный гепарин (НМГ), в частности, с молекулярной массой (ММ) до 10000 Да, и фукоидан, в частности, с ММ 3000-25000 Да, в частности фукоидан, полученный из Laminaria japonica.

В качестве блок-сополимера полиэтиленоксида и полипропиленоксида (блок-сополимер ПЭО/ППО) могут быть использованы блок-сополимеры с различной ММ и гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ), в частности следующие: с ММ 1100 Да и ГЛБ, равным 1-7; с ММ 8400 Да и ГЛБ >24; с ММ 9840-14600 Да и ГЛБ 18-23; с ММ 1400 Да и ГЛБ 5,7. В качестве блок-сополимера ПЭО/ППО может быть также использована смесь различных блок-сополимеров ПЭО/ППО с разной ММ и разным ГЛБ.

В одних воплощениях изобретения БАСП смешивают с необлученным блок-сополимером ПЭО/ППО. В других воплощениях предлагаемого изобретения блок-сополимер ПЭО/ППО вначале облучают ионизирующим излучением, а затем смешивают с БАСП. В следующих воплощениях изобретения облучают раствор, содержащий БАСП и блок-сополимер ПЭО/ППО.

В качестве ионизирующего излучения могут быть использованы -излучение, поток ускоренных электронов. Для облучения смеси БАСП и блок-сополимера ПЭО/ППО могут быть использованы также ультрафиолетовое или лазерное излучение.

Как уже указывалось выше, сульфатированные полисахариды, к которым относятся гепарин и низкомолекулярный фукоидан, при их пероральном применении подвергаются десульфатированию в кишечнике, что приводит к потере ими биологической активности (Сидоренко Б.А., Преображенский Д.В. Клиническое применение антитромботических препаратов. Москва 1997. 175 стр.).

Техническим результатом предлагаемого способа является предотвращение десульфатирования сульфатированного полисахарида в желудочно-кишечном тракте, повышение его пероральной биодоступности и упрощение способа получения перорально биодоступного сульфатированного полисахарида.

Нами проводились многочисленные эксперименты по изучению пероральной биодоступности сульфатированных полисахаридов.

Испытывали пероральную биодоступность композиций, состоящих из двух компонентов, где одним компонентом был сульфатированный полисахарид (фукоидан, или нефракционированный гепарин, или низкомолекулярный гепарин), а второй компонент выбирали из группы, содержащей: соли желчных кислот, хитозан, полиэтиленоксид различной молекулярной массы, поливинилпирролидон, микрокристаллическую целлюлозу, декстран, блок-сополимер ПЭО/ППО и др.

Наилучшие результаты были достигнуты при использовании блок-сополимеров ПЭО/ППО (плюроников).

Осуществление изобретения

В данном разделе описано получение проб БАСП, а также их смесей с растворами ПЭО и сополимеров ПЭО/ППО различной ММ, с различными значениями ГЛБ и различной концентрацией, без облучения проб и с облучением; описано испытание полученных проб в отношении пероральной биодоступности БАСП.

Фукоидан получали следующим образом. После измельчения Laminaria Japonica до гомогенного состояния полученная масса лиофильно высушивалась. Экстракцию фукоидана производили 2,5%-ным раствором хлорида кальция при температуре 60°С в течение трех часов, далее раствор фильтровали, фукоидан осаждали спиртовым раствором. Деполимеризацию фукоидана осуществляли 10%-ным раствором соляной кислоты при температуре 60°С в течение трех часов, с последующим выделением с помощью гель-фильтрации фракции фукоидана с молекулярной массой 3000-25000 Да.

В экспериментах использовали исходные вещества следующих производителей:

ООО «Завод Синтанолов», РФ: полиэтиленоксид с ММ 1500 Да;

Dimethicone, Xiameter: блок-сополимер ПЭО/ППО с MM1400 Да и ГЛБ 5,7 (PEG/PPG-18/18)

http://www.xiameter.com/content/bxmeet/bxmeetproducts/Personal_Care_Selector _Guide.pdf);

Sigma-Aldrich:

блок-сополимер ПЭО/ППО с ММ9840-14600 Да и ГЛБ 18-23 (Pluronic^® F127,

http://www. sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=All&N3=mode+matchpartia lmax&N4=Pluronic&D7=0&D10=Pluronic&N25=0&N1=S_ID&ST=RS&F=PR),

блок-сополимер ПЭО/ППО с MM8400 Да и ГЛБ>24 (Pluronic ^® F68, http://worldaccount.basf.com/wa/NAFTA~en_US/Catalog/ChemicalsNAFTA/doc4/BASF/PRD/30089194/.pdf?title=&asset_type=pi/pdf&language=EN&urn=urn:documentum:eCommerce_sol_EU:09007bb28001f73c.pdf),

блок-сополимер ПЭО/ППОс ММ1100 Да и ГЛБ 1-7 (Pluronic ^® L31, http://worldaccount.basf.com/wa/NAETA~en_US/Catalog/ChemicalsNAFTA/doc4/BASF/PRD/30085851/.pdf?title=&asset_type=pi/pdf&language=EN&urn=urn:documentum:eCommerce_sol_EU:09007bb28001f6f6.pdf),

низкомолекулярный гепарин с ММ~4500 Да,

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=All&N3=mode+matc hpartialmax&N4=heparin&D7=0&D10=heparin&N25=0&N1=S_ID&ST=RS&F=PR;

Хебей Чангшин Биокемикал Фармасьютикал Ко. Л.Т.Д., (Китай): нефракционированного гепарина натриевая соль (Гепарин сухой) с активностью 130 ЕД/мг.

Приготовление проб с фукоиданом

1. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 0,9 г хлорида натрия. В полученный раствор вносили 0,1 г фукоидана, полученного из Laminaria Japonica, с ММ от 3000 до 25000 Да. Получали пробу № 1.

2. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 2 г полиэтиленоксида с ММ 1500 Да. В полученный раствор вносили 0,25 г фукоидана. Получали пробу № 2.

3. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 9840-14600 Да и ГЛБ 18-23. В полученный раствор вносили 0,25 г фукоидана. Получали пробу № 3.

4. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 2 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 8400 Да и ГЛБ>24. В полученный раствор вносили 0,25 г фукоидана. Получали пробу № 4.

5. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1100 Да и ГЛБ 1-7. В полученный раствор вносили 0,25 г фукоидана. Получали пробу № 5.

Приготовление проб с нефракционированным гепарином

6. Для приготовления пробы № 6 в 10 мл дистиллированной воды растворяли 0,9 г хлорида натрия. В полученный раствор вносили 0,385 г нефракционированного гепарина натриевой соли с активностью 130 ЕД/мг.

7. В 10 мл 3,85% раствора нефракционированного гепарина натриевой соли с активностью 5000 ЕД/мл растворяли 2 г полиэтиленоксида с ММ 1500 Да. Получали пробу № 7.

8. В 10 мл 3,85% раствора нефракционированного гепарина натриевой соли с активностью 5000 ЕД/мл растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 9840-14600 Да и ГЛБ 18-23. Получали пробу № 8.

9. В 10 мл 3,85% раствора нефракционированного гепарина натриевой соли с активностью 5000 ЕД/мл растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 8400 Да и ГЛБ>24. Получали пробу № 9.

10. В 10 мл 3,85% раствора нефракционированного гепарина натриевой соли с активностью 5000 ЕД/мл растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1100 Да и ГЛБ 1-7. Получали пробу № 10.

Приготовление проб с низкомолекулярным гепарином

11. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 0,9 г хлорида натрия. В полученный раствор вносили 95 мг гепарина с ММ ~ 4500 Да. Получали пробу № 11.

12. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 2 г полиэтиленоксида с ММ ~ 1500 Да. В полученный раствор вносили 95 мг гепарина4500 Да. Получали пробу № 12.

13. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 9840-14600 Да и ГЛБ 18-23. В полученный раствор вносили 95 мг гепарина с ММ ~ 4500 Да. Получали пробу № 13.

14. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 2 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 8400 Да и ГЛБ>24. В полученный раствор вносили 95 мг гепарина с ММ ~ 4500 Да. Получали пробу № 14.

15. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1100 Да и ГЛБ 1-7. В полученный раствор вносили 95 мг гепарина ММ ~ 4500 Да. Получали пробу № 15.

Приготовление проб смесей фукоидана или гепарина с облученным раствором полимера (блок-сополимера ПЭО/ППО или ПЭО)

16. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 9840-14600 Да и ГЛБ 18-23. Полученный раствор облучали потоком ускоренных электронов на ускорителе ИЛУ-6 дозой облучения 3,5 Мрад. В облученный раствор вносили 0,25 г фукоидана с ММ от 3000 до 25000 Да, полученного из Laminaria japonica (проба № 16).

17. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 9840-14600 Да и ГЛБ 18-23. Полученный раствор облучали потоком ускоренных электронов на ускорителе ИЛУ-6 дозой облучения 3,5 Мрад. В облученный раствор вносили 95 мг гепарина с ММ ~ 4500 Да. Получали пробу № 17.

18. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1100 Да и ГЛБ 1-7. Полученный раствор облучали тормозным -излучением дозой облучения 0,5 Мрад. В облученный раствор вносили 0,25 г фукоидана с ММ от 3000 до 25000 Да из Laminaria japonica. Получали пробу № 18.

19. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 1 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1100 Да и ГЛБ 1-7. Полученный раствор облучали -излучением дозой облучения 0,5 Мрад. В облученный раствор вносили 95 мг гепарина с ММ ~ 4500 Да. Получали пробу № 19.

20. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 2 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1400 Да и ГЛБ 5,7. Полученный раствор облучали -излучением дозой облучения 2 Мрад. В облученный раствор вносили 0,25 г фукоидана, полученного из Laminaria japonica, с ММ от 3000 до 25000 Да. Получали пробу № 20.

21. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 2 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1400 Да и ГЛБ 5,7. Полученный раствор облучали тормозным -излучением дозой облучения 2 Мрад. В облученный раствор вносили 95 мг гепарина ММ ~ 4500 Да. Получали пробу № 21.

22. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 2 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1400 Да и ГЛБ 5,7. В полученный раствор вносили 0,25 г фукоидана, полученного в лабораторных условиях из Laminaria japonica, молекулярной массой, ММ от 3000 до 25000 Да. Получали пробу № 22.

23. В 10 мл дистиллированной воды растворяли 2 г блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1400 Да и ГЛБ 5,7. В полученный раствор вносили 95 мг гепарина ММ~4500 Да. Получали пробу № 23.

24. В 10 мл фосфатного буфера с pH 8,0 растворяли 2 г полиэтиленоксида с ММ 1500 Да. Раствор аэрировали барботажем кислорода в течение 30 минут и затем облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 2,0 Мрад. В облученный раствор вносили 385 мг нефракционированного гепарина. Получали пробу № 24.

Пример 1. Оценка биодоступности сульфатированных полисахаридов при их подкожном и внутрижелудочном введении

Использовали пробы № 1, № 6 и № 11. Опыты проводили на крысах Вистар весом 220-280 г.

Пробу № 1 вводили подкожно в дозировке 8 мг/кг фукоидана (8 мг на 1 кг массы тела животного) и внутрижелудочно в дозировке 40 мг/кг фукоидана.

Пробу № 6 вводили подкожно в дозировке 4 мг/кг нефракционированного гепарина и внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг нефракционированного гепарина.

Пробу № 11 вводили подкожно в дозировке 4 мг/кг низкомолекулярного гепарина (НМГ) и внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг НМГ.

Контролем служили интактные животные.

Оценка биодоступности осуществлялась с помощью показателей активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и анти Ха-активности. У крыс, которым введение препаратов производилось подкожно, забор крови для определения АЧТВ и анти Ха-активности проводился через 1 час после введения препарата. У крыс, которым введение препаратов производилось внутрижелудочно, забор крови для определения АЧТВ и анти Ха-активности проводился через 4 часа после введения препарата.

АЧТВ определялось как время свертывания плазмы крови в условиях стандартизированной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса в присутствии ионов кальция. Использовались наборы «АПТВ/АЧТВ-тест» производства «Технология-Стандарт». Метод определения анти Ха-активности и гепарина основан на способности комплекса АТIII-гепарин нейтрализовать активированный фактор Ха. Использовались наборы «Реахром-Гепарин тест» производства НПО «Ренам».

Результаты измерения АЧТВ и анти Ха-активности представлены в таблице 1.

Как видно из представленных данных, достоверно изменяется по отношению к контролю (интактным животным) АЧТВ при подкожном введении нефракционированного гепарина. Анти Ха-активность достоверно изменяется при подкожном введении фукоидана, нефракционированного и низкомолекулярного гепаринов.

При внутрижелудочном введении сульфатированных полисахаридов изменение АЧТВ и анти Ха-активности статистически недостоверны.

Подобные результаты общеизвестны и важны для нас в контексте дальнейшего представления примеров реализации изобретения.

Пример 2. Оценка пероральной биодоступности сульфатированных полисахаридов в смеси с полиэтиленоксидом или блок-сополимером ПЭО/ППО

Использовались пробы № 2, № 5, № 7, № 10, № 12 и № 15. Опыты проводились на крысах Вистар весом 220-280 г.

Пробы № 2 и № 5 вводились внутрижелудочно в дозировке 40 мг/кг фукоидана.

Пробы № 7 и № 10 вводились внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг нефракционированного гепарина.

Пробы № 12 и № 15 вводились внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг низкомолекулярного гепарина.

Контролем служили интактные животные.

Забор крови для определения АЧТВ и анти Ха-активности проводился через 4 часа после введения препарата. АЧТВ и анти Ха-активность оценивались аналогично тому, как описано в примере 1.

Результаты измерений АЧТВ и анти Ха-активности представлены в таблице 2.

Из полученных данных видно, что достоверно повышается (в 3,5 раза) АЧТВ при внутрижелудочном введении нефракционированного гепарина в растворе 10%-ного блок-сополимера ПЭО/ППО с ММ 1,1 кДа. Анти Ха-активность достоверно повышается (в среднем, в 3 раза) при внутрижелудочном введении всех испытываемых сульфатированных полисахаридов (фукоидана, нефракционированного гепарина, низкомолекулярного гепарина).

Пример 3. Оценка пероральной биодоступности сульфатированных полисахаридов, растворенных в предварительно облученном ионизирующим излучением растворе полимера

Опыты проводились на крысах Вистар весом 220-280 г. Пробы № 16, № 18 и № 20 вводились внутрижелудочно в дозировке 40 мг/кг фукоидана.

Пробы № 17, № 19 и № 21 вводились внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг низкомолекулярного гепарина.

Проба № 24 вводилась внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг нефракционированного гепарина.

Вид облучения и доза указаны при характеристике использованных в данном примере проб.

Контролем служили интактные животные.

Забор крови для определения АЧТВ и анти Ха-активности проводился через 4 часа после введения препарата. АЧТВ и анти Ха-активность оценивались аналогично примеру 1.

Результаты измерения АЧТВ и анти Ха-активности представлены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что АЧТВ достоверно повышается при внутрижелудочном введении гепарина нефракционированного в предварительно облученном 20%-ном растворе ПЭО с ММ 1,5 кДа (проба 24).

При внутрижелудочном введении фукоидана и НМГ в предварительно облученном растворе блок-сополимера анти Ха-активность достоверно повышается (в 3,4-4,1 раза) для всех исследуемых сульфатированных полисахаридов.

В прототипе модифицированный и немодифицированный гепарин вводят мышам внутрижелудочно в дозе 1250 ЕД на мышь, что составляет 62500 ЕД/кг при условии, что средний вес мыши равен 20 г. В предлагаемом способе нефракционированный гепарин, приготовленный аналогично способу-прототипу (проба 24), вводят крысам внутрижелудочно в дозе 2600 ЕД/кг.

При введении мышам модифицированного гепарина АПТВ в прототипе увеличилось в три раза. При введении крысам пробы 24 в предлагаемом способе АПТВ увеличилось достоверно, но незначительно, что, по-видимому, объясняется более низкой дозой вводимого гепарина.

Пример 4. Оценка пероральной биодоступности растворов сульфатированных полисахаридов и сополимеров ПЭО/ППО, облученных ультрафиолетовым излучением (УФ-излучением)

Использовались пробы № 3, № 4, № 8, № 9, № 13 и № 14. Пробы после их получения облучались УФ-излучением с длиной волны 290 нм, мощностью облучения 4000 мкВт/см² в открытой кювете площадью 12 см², продолжительность облучения 15 минут. Опыты проводились на крысах Вистар весом 220-280 г.

Пробы № 3 и № 4 вводились внутрижелудочно в дозировке 40 мг/кг фукоидана.

Пробы № 8 и № 9 вводились внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг нефракционированного гепарина.

Пробы № 13 и № 14 вводились внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг низкомолекулярного гепарина.

Контролем служили интактные животные.

Забор крови для определения АЧТВ и анти Ха-активности проводился через 4 часа после введения препарата. АЧТВ и анти Ха-активность оценивались аналогично примеру 1.

Результаты измерения АЧТВ и анти Ха-активности представлены в таблице 4.

Данные, представленные в таблице 4, показывают существенное возрастание АЧТВ (в 3,8 раз) при внутрижелудочном введении смеси гепарина нефракционированного и блок-сополимера ПЭО/ППО, облученной УФ-излучением. Анти Ха-активность достоверно возрастает (в 3,2-4,6 раз) при внутрижелудочном введении смесей всех видов исследуемых сульфатированных полисахаридов с блок-сополимерами ПЭО/ППО, облученных УФ-излучением.

Пример 5. Оценка пероральной биодоступности облученных ионизирующим излучением растворов сульфатированных полисахаридов и сополимеров ПЭО/ППО

Использовались пробы № 3, № 4, № 5, № 8, № 9, № 10, № 13, № 14, № 15, № 22 и № 23. Пробы № 4, № 9 и № 14, № 22 и № 23 после их получения облучались тормозным -излучением дозой облучения 1,5 Мрад. Пробы № 3, № 5, № 8, № 10, № 13 и № 15 облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 2,0 Мрад.

Опыты проводились на крысах Вистар весом 220-280 г.

Пробы № 3, № 4, № 5 и № 22 вводились внутрижелудочно в дозировке 40 мг/кг фукоидана.

Пробы № 8, № 9 и № 10 вводились внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг нефракционированного гепарина.

Пробы № 13, № 14, № 15 и № 23 вводились внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг низкомолекулярного гепарина.

Контролем служили интактные животные.

Забор крови для определения АЧТВ и анти Ха-активности проводился через 4 часа после введения препарата. АЧТВ и анти Ха-активность оценивались аналогично примеру 1.

Результаты измерений АЧТВ и анти Ха-активности представлены в таблице 5.

Данные, представленные в таблице 5, показывают достоверное возрастание (в 3,8-4,4 раза) пероральной биодоступности нефракционированного гепарина (данные по АЧТВ и анти-Ха-активности для проб 8, 9,10), а также достоверное повышение (в 3,8-4,6 раз) значений анти-Ха активности для проб всех исследованных сульфатированных полисахаридов при их введении в составе облученной ионизирующим излучением смеси с блок-сополимером ПЭО/ППО.

Пример 6. Оценка пероральной биодоступности растворов сульфатированных полисахаридов с сополимерами ПЭО/ППО, облученных лазерным излучением

Использовались пробы № 4, № 9 и № 14. Пробы после их получения обрабатывались излучением аргонового лазера ЛГН-502, мощность излучения 600 мВт, время воздействия - 5 минут. Опыты проводились на крысах Вистар весом 220-280 г.

Проба № 4 вводилась внутрижелудочно в дозировке 40 мг/кг фукоидана.

Проба № 9 вводилась внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг нефракционированного гепарина.

Пробы № 14 вводилась внутрижелудочно в дозировке 20 мг/кг низкомолекулярного гепарина.

Контролем служили интактные животные.

Забор крови для определения АЧТВ и анти Ха-активности проводился через 4 часа после введения препарата. АЧТВ и анти Ха-активность оценивались аналогично примеру 1.

Результаты измерений АЧТВ и анти Ха-активности представлены в таблице 6.

Данные, представленные в таблице 6, показывают достоверное возрастание (в 4,2 раза) АЧТВ при внутрижелудочном введении смеси нефракционированного гепарина и блок-сополимера, облученной лазерным излучением, а также достоверное возрастание (в 3,3-4,6 раза) анти Ха-активности при внутрижелудочном введении облученной лазерным излучением смеси с блок-сополимером всех исследуемых сульфатированных полисахаридов.

В предлагаемом способе достоверное повышение в 3,5-4,4 раза АЧТВ в пробах с нефракционированным гепарином (см. пробу 10, табл.2; пробы 8 и 9 в табл.4, пробы 8, 9, 10 в табл.5, пробу 9 в табл.6) и анти-Ха-активности (см. пробу 10 в табл.2, пробы 8, 9 в табл.4, пробы 8, 9, 10 в табл.5, пробу 9 в табл.6) наблюдается при использовании доз нефракционированного гепарина, которые в 24 раз меньше (62500 ЕД/кг / 2600 ЕД/кг=24), чем в прототипе, что свидетельствует о том, что предлагаемый способ по сравнению с прототипом обеспечивает более высокую пероральную биодоступность сульфатированного полисахарида на единицу введенной дозы.

Таким образом, предлагаемый способ предотвращает десульфатирование сульфатированных полисахаридов в желудочно-кишечном тракте и обеспечивает их пероральную биодоступность, которая значительно превышает пероральную биодоступность, показанную для сульфатированного полисахарида (гепарина) в прототипе.

Таблица 1
Результаты оценки биодоступности сульфатированных полисахаридов у крыс при их подкожном (п/к) и внутрижелудочном (в/ж) введении
№ пр.	Активное вещество	Растворитель	Введение	АЧТВ (сек)	Анти Ха-активность (ЕД/мл)
1	Фукоидан	NaCl, 0,9%	п/к	25,33±6,41	0,74±0,02*
в/ж	17,13±2,94	0,21±0,05
6	Гепарин нефракц.	NaCl, 0,9%	п/к	73,51±16,59*	0,70±0,03*
в/ж	20,59±7,21	0,22±0,05
11	НМГ	NaCl, 0,9%	п/к	21,29±6,18	0,77±0,02*
в/ж	17,53±3,12	0,21±0,03
Интактные животные	16,13±2,87	0,16±0,04
* - достоверное отличие от интактных животных

Таблица 2
Результаты измерения АЧТВ и анти Ха-активности у крыс при внутрижелудочном введении смесей сульфатированных полисахаридов с полиэтиленоксидом и блок-сополимером ПЭО/ППО
№ пр.	Акт. в-во	Полимер	АЧТВ (сек)	Анти Ха-активность (ЕД/мл)
2	фукоид.	ПЭО, 20%, 1,5 кДа	16,11±2,70	0,21±0,05
5	фукоид.	Бл.-сопол., 10%, 1,1 кДа, ГЛБ 1-7	20,35±5,48	0,48±0,03*
7	Гепар. нефракц.	ПЭО, 20%, 1,5 кДа	18,32±4,31	0,21±0,04
10	Гепар. нефракц.	Бл.-сопол., 10%, 1,1 кДа, ГЛБ 1-7	57,51±18,27*	0,44±0,04*
12	НМГ	ПЭО, 20%, 1,5 кДа	17,11±2,46	0,20±0,04
15	НМГ	Бл.-сопол., 10%, 1,1 кДа, ГЛБ 1-7	19,86±5,21	0,51±0,04*
Интактные животные	16,13±2,87	0,16±0,04
* - достоверное отличие от интактных животных

Таблица 3
Результаты измерения АЧТВ и анти Ха-активности у крыс при внутрижелудочном введении сульфатированных полисахаридов в растворах полимеров, предварительно облученных ионизирующим излучением
№ пр.	Акт. в-во	Полимер	АЧТВ (время, сек)	Анти Ха-активность (ЕД/мл)
16	Фукоидан	Блок-сопол., 10%, 9,84-14,6 кДа, ГЛБ 18-23	22,33±6,41	0,58±0,06*
17	НМГ	Блок-сопол., 10%, 9,84-14,6 кДа, ГЛБ 18-23	21,02±3,72	0,62±0,05*
18	Фукоидан	Блок-сопол., 10%, 1,1 кДа, ГЛБ 1-7	24,11±4,22	0,55±0,05*
19	НМГ	Блок-сопол., 10%, 1,1 кДа, ГЛБ 1-7	20,96±4,82	0,66±0,05*
20	Фукоидан	Блок-сопол., 20%, 1,4 кДа, ГЛБ 5,7	19,48±3,41	0,64±0,04*
21	НМГ	Блок-сопол., 20%, 1,4 кДа, ГЛБ 5,7	18,62±3,87	0,65±0,05*
24	Гепар. нефракц.	ПЭО, 1,5 кДа	28,71±9,32*	0,24±0,05
Интактные животные	16,13±2,87	0,16±0,04

Таблица 4
Результаты измерения АЧТВ и анти Ха-активности у крыс при внутрижелудочном введении смесей сульфатированных полисахарида и блок-сополимера, облученных ультрафиолетовым излучением
№ пр.	Активное в-во	Полимер	АЧТВ (время, сек)	Анти Ха-активность (ЕД/мл)
3	Фукоидан	Блок-сопол., 10%, 9,84-14,6 кДа, ГЛБ 18-23	23,14±5,31	0,60±0,04*
4	Фукоидан	Блок-сопол., 20%, 8,4 кДа, ГЛБ>24	22,62±5,02	0,59±0,04*
8	Гепарин нефрак.	Блок-сопол., 10%, 9,84-14,6 кДа, ГЛБ 18-23	61,42±9,16*	0,52±0,05*
9	Гепарин нефрак.	Блок-сопол., 10%, 8,4 кДа, ГЛБ>24	65,07±8,12*	0,51±0,04*
13	НМГ	Блок-сопол., 10%, 9,84-14,6 кДа, ГЛБ 18-23	21,18±2,93	0,74±0,05*
14	НМГ	Блок-сопол., 20%, 8,4 кДа, ГЛБ>24	21,83±3,64	0,71±0,04*
Интактные животные	16,13±2,87	0,16±0,04
* - достоверное отличие от интактных животных

Таблица 5
Результаты измерения АЧТВ и анти Ха-активности у крыс при внутрижелудочном введении облученных ионизирующим излучением смесей сульфатированных полисахаридов и блок-сополимеров
№ пр.	Вид облучения	Активное в-во	Полимер	АЧТВ (сек)	Анти Ха-активность (ЕД/мл)
3	ПЭ	Фукидан	Блок-сопол., 10%, 9,84-14,6 кДа, ГЛБ 18-23	23,84±5,83	0,67±0,05*
4	-изл	Фукоидан	Блок-сопол., 20%, 8,4 кДа, ГЛБ>24	24,32±6,11	0,69±0,04*
5	ПЭ	Фукоидан	Блок-сопол., 10%, 1,1 кДа, ГЛБ 1-7	25,84±5,17	0,73±0,03*
8	ПЭ	Гепарин нефр.	Блок-сопол., 10%, 9,84-14,6 кДа, ГЛБ 18-23	63,07±11,08*	0,62±0,05*
9	-изл	Гепарин нефр.	Блок-сопол., 10%, 8,4 кДа, ГЛБ>24	65,07±8,12*	0,65±0,04*
10	ПЭ	Гепарин нефр.	Блок-сопол., 10%, 1,1 кДа, ГЛБ 1-7	70,41±14,71*	0,66±0,03*
13	ПЭ	НМГ	Блок-сопол., 10%, 9,84-14,6 кДа, ГЛБ 18-23	21,37±6,48	0,69±0,04*
14	-изл	НМГ	Блок-сопол., 20%, 8,4 кДа, ГЛБ>24	20,68±4,12	0,71±0,04*
15	ПЭ	НМГ	Блок-сопол., 10%, 1,1 кДа, ГЛБ 1-7	20,14±5,15	0,74±0,03*
22	-изл	Фукоидан	Блок-сопол., 20%, 1,4 кДа, ГЛБ 5,7	22,36±5,83	0,64±0,05*
23	-изл	НМГ	Блок-сопол., 20%, 1,4 кДа, ГЛБ 5,7	24,73±6,77	0,66±0,04*
Интактные животные	16,13±2,87	0,16±0,04
* - достоверное отличие от интактных животных, ПЭ - облучение потоком электронов

Таблица 6
Результаты измерения АЧТВ и анти Ха-активности у крыс при внутрижелудочном введении смесей сульфатированных полисахаридов и блок-сополимеров, облученных лазерным излучением
№ пр.	Акт. в-во	Полимер	АЧТВ (сек)	Анти Ха-акт-сть (ЕД/мл)
4	Фукоидан	Блок-сопол., 20%, 8,4 кДа, ГЛБ>24	23,81±6,43	0,62±0,04*
9	Гепарин нефракц.	Блок-сопол., 10%, 8,4 кДа, ГЛБ>24	68,24±9,28*	0,53±0,05*
14	НМГ	Блок-сопол., 20%, 8,4 кДа, ГЛБ>24	22,15±4,45	0,73±0,03*
Интактные животные	16,13±2,87	0,16±0,04
* - достоверное отличие от интактных животных