рекомбинантная плазмидная днк, содержащая последовательность зрелой стафилокиназы staphylococcus aureus с заменами кодонов k74, e75 и r77 на триплеты, кодирующие ala, штамм escherichia coli mz09 и способ получения рекомбинантного белка, содержащего последовательность гена зрелой стафилокиназы с заменами кодонов k74, e75 и r77 на триплеты, кодирующие ala

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК, содержащая последовательность гена зрелой стафилокиназы Staphylococcus aureus с заменами кодонов K74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие А1а, и имеющая нуклеотидную последовательность, приведенную на фигуре 1.

2. Штамм Escherichia coli MZ09 - продуцент рекомбинантного белка, содержащего последовательность гена зрелой стафилокиназы Staphylococcus aureus с заменами кодонов K74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие А1а, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 1, включая аминокислоты метионин (ATG) и глицин (GGA).

3. Способ получения рекомбинантного белка, содержащего последовательность гена зрелой стафилокиназы Staphylococcus aureus с заменами кодонов K74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие Ala, характеризующегося аминокислотной последовательностью по п.2, которая приведена на фигуре 1, и содержит метионин (ATG) и глицин (GGA), включающий синтез рекомбинантной плазмидной ДНК, клонирование синтезированной последовательности с использованием вектора pQE30, трансформацию рекомбинантной плазмиды в клетки Escherichia coli M15Rep4, содержащие плазмиду с геном репрессора лактозного оперона, культивирование в условиях экспрессии ДНК, отбор клонов, обладающих оптимальной стафилокиназной активностью, выделение зрелой стафилокиназы с заменами кодонов K74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие Ala.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области микробиологической фармацевтической промышленности.

Стафилокиназа (Sak) - белок, секретируемый некоторыми штаммами Staphylococcus aureus, состоящий из 136 аминокислотных остатков. Клинический интерес к этому бактериальному белку вызван благодаря его способности превращать плазминоген (неактивный профермент системы фибринолиза) в плазмин. Sak представляет собой эффективный и специфический тромболитический агент.

Рекомбинантные стафилокиназы разрабатываются несколькими фирмами мира, однако они отличаются друг от друга структурой генов (см., например, US 6010897, 01.04.2000; US 5801037, 01.09.1998; US 6902733, 07.06.2005; US 6383483, 05.07.2002; US 5951980, 14.09.1999; US 5695754, 09.12.1997 и др.).

Исследования рекомбинантной стафилокиназы показали, что некоторые структуры стафилокиназы склонны к образованию димеров и полимеров. Образование полимеров повышает иммуногенность стафилокиназы.

Предложены производные стафилокиназы, не склонные к образованию димеров и обладающие бифункциональностью тромболитического и антикоагулирующего агента. Эти производные отличаются от стафилокиназы дикого типа тем, что один или более аминокислотных остатков между аминокислотными остатками 104 и 113 стафилокиназы дикого типа замещены другими аминокислотами с образованием последовательности RGD или последовательности KGD. Разработан способ их получения (RU 2283863, 20.09.2006).

Недостатком указанного технического решения является невозможность применения лекарственного препарата на этой основе на этапе догоспитального тромболизиса в связи с увеличением опасности кровотечений. Это обусловлено тем, что последовательности RGD и KGD обладают дополнительным антикоагулянтным действием.

Наиболее близким к предложенному решению является изобретение по RU 2156299, 20.09.2000, в котором описана рекомбинантная ДНК, содержащая полную последовательность стафилокиназы и лидерный пептид с блоком из 6 гистидиновых остатков, штамм Е.coli SA 9325, являющийся продуцентом рекомбинантного белка, содержащего полную последовательность стафилокиназы из S.aureus.

Изобретение по RU 2156299 позволяет получить высокоактивный белок, обладающий фибринолитической активностью, с выходом рекомбинантного белка 20-26% от общего количества белков.

Однако известное решение обладает недостатком, так как вышеназванный штамм-продуцент кодирует белок, состоящий из 163 аминокислот (т.н. незрелая форма) и который только в активной форме превращается в белок, состоящий из 136 аминокислот (т.н. зрелая форма).

В связи с этим задачей настоящего изобретения является создание рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей последовательность стафилокиназы из 136 аминокислот и лидерного пептида, которые обладают повышенной активностью, а также создание нового эффективного штамма-продуцента на базе Е.coli и разработка процесса выделения и очистки целевого продукта с высоким выходом и чистотой.

Поставленная задача решается группой изобретений.

Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК, которая содержит последовательность гена зрелой стафилокиназы Staphylococcus aureus с заменами кодонов К74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие Ala, и имеющая нуклеотидную последовательность, приведенную на фигуре 1.

Предложен также штамм Escherichia coli MZ09 - продуцент рекомбинантного белка, содержащего последовательность гена зрелой стафилокиназы Staphylococcus aureus с заменами кодонов K74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие Ala, и имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на фигуре 1.

Кроме того, предложен способ получения рекомбинантного белка, содержащего последовательность гена зрелой стафилокиназы Staphylococcus aureus с заменами кодонов K74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие Ala, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, приведенной на фигуре 1, который включает синтез рекомбинантной плазмидной ДНК, клонирование синтезированной последовательности с использованием вектора pQE30, трансформацию рекомбинантной плазмиды в клетки Escherichia coli M15Rep4, содержащие плазмиду с геном репрессора лактозного оперона, культивирование в условиях экспрессии ДНК, отбор клонов, обладающих оптимальной стафилокиназной активностью, выделение зрелой стафилокиназы с заменами кодонов K74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие Ala.

На фигуре 1 представлена нуклеотидная последовательность гена рекомбинантной стафилокиназы и соответствующая этому гену аминокислотная последовательность белка рекомбинантной стафилокиназы, включающая аминокислоты метионин (ATG) и глицин (GGA). На фигуре 2 представлена схема получения плазмиды с геном рекомбинантной стафилокиназы, состоящей из зрелого белка стафилокиназы и лидерного пептида с заменами кодонов K74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие Ala (а), и последовательность праймеров, использующихся для амплификации фрагмента ДНК, содержащего ген зрелой стафилокиназы.

Особенностью настоящей последовательности Sak является наличие дипептида на N конце белка MG. Также изменены аминокислоты в положениях 74, 75 и 77. В качестве экспрессионного вектора используется промотор фага Т5, использование которого обеспечивает максимальные показатели качества и количества (выхода) заявленного продукта. При этом, вносимые в последовательность белка замены имеют целью снизить его свойство полимеризоваться, т.е. образовывать димеры и другие полимерные формы, которые могут приводить к снижению растворимости белка и увеличению иммуногенности.

Подробное описание получения целевого продукта описано ниже и пояснено с помощью представленных фигур.

Для получения рекомбинантной ДНК была использована векторная плазмида pQE30, которая поставляется в наборе «High-level expression and purification of 6XHis-tagged proteins» и имеет репликатор плазмиды ColEl, промотор бактериофага Т5, два оператора оперона lac E.coli, терминаторы Т1 оперона rrnB E.coli и t₀ бактериофага лямбда. Штамм, содержащий плазмиду pQE30 устойчив к ампициллину в концентрации 100 мкг/мл. Фрагмент ДНК EcoRI-BamHI размером 57 н.п. плазмиды pQE30, кодирующий последовательность аминокислот 6 His, был заменен на фрагмент размером 30 н.п.

WHF 5' ttcgaattcattaaagaggagaaattaact 3'

WHR 5' gttggatcccatagttaatttctcctct 3'

В полученную плазмиду был клонирован фрагмент ДНК размером 426 п.н. с геном стафилокиназы Staphylococcus aureus с заменами кодонов K74, Е75 и R77 на триплеты, кодирующие Ala. Полученная плазмида была названа pZT11. Затем ДНК рекомбинантной плазмиды была трансформирована в клетки E.coli M15Rep4, содержащие плазмиду (pRep4) с геном репрессора лактозного оперена, обеспечивающую индуцибельность синтеза клонированного белка. Из полученных трансформантов был отобран клон, обладающий оптимальной стафилокиназной активностью.

Нуклеотидная последовательность гена стафилокиназы Staphylococcus aureus и соответствующая аминокислотная последовательность стафилокиназы, включающая аминокислоты метионин (ATG) и глицин (GGA), приведены на фигуре 1. Других рамок считывания клонированный фрагмент ДНК не содержит.

Полимеразную цепную реакцию проводили в стандартном буфере: 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl, pH 9,0, 2,5 мМ MgCl₂

ПЦР проводили с использованием в качестве матрицы гена sak ДНК плазмиды с полным геном sak из штамма S. aureus. В качестве отрицательного контроля использовали хромосомную ДНК E.coli. Плазмидную ДНК выделяли, используя набор для выделения ДНК фирмы Promega, в соответствие с прилагаемым протоколом.

Фрагмент ДНК ожидаемой длины обнаружен во всех пробах, кроме контрольной, содержавшей ДНК E.coli.

Далее в работе использовали все полученные ампликоны гена sak.

Клонирование sak-гена в мультикопийном векторе под сильным промотором бактериофага Т5.

Рестрикцию и лигирование ДНК ампликонов и ДНК вектора проводили стандартными методами. Схема конструирования рекомбинатной плазмиды представлена на фигуре 2.

Полученными дотированными смесями, содержащими ДНК рекомбинантной плазмиды, трансформировали клетки штамма хозяина E.coli M15REP4. Штамм M15REP4 поставляется фирмой QIAGEN в наборе «High-level expression and purification of 6XHis-tagged proteins» для наработки больших количеств рекомбинантных белков. Используемая система предусматривает, что реципиентный штамм F^-, lac^-, mtl ^-, thi^-, nal^s, str^s, rif ^s, Km^R, Amp^R должен содержать плазмиду, несущую ген лактозного оперона laci и маркер устойчивости к канамицину (ген - каn). Продукт этого гена подавляет работу промотора, под контролем которого в составе мультикопийного вектора pQE30 будет находиться клонированный ген. Эффект репрессии обусловлен тем, что промоторная область pQE30 помимо промотора фага Т5 несет две lac-операторные последовательности, являющиеся объектом действия белка-репрессора Lacl. Действие репрессора в индуцибельных системах снимается работой индуктора, которым, в данном случае, может быть лактоза или ИПТГ.

Используемая система обеспечивает высокий уровень синтеза белков. Кроме того, нуклеотидная последовательность плазмиды pQE30 содержит кодирующие Ala триплеты, заменяющие кодоны К74, Е75 и R77. Вектор pQE30 содержит в своем составе маркер для селекции - ген bla, кодирующий устойчивость к ампициллину (Apr).

Получение штамма-продуцента.

Трансформацию проводили следующим методом:

А) Приготовление компетентных клеток: клетки штамма хозяина M15[REP4] выращивали до ранней логарифмической фазы (OD=0,4) в 200 мл LB-бульона в качалочной колбе, затем осаждали центрифугированием при 3 тыс.оборотов (центрифуга К-23) в течение 10 минут при 4°С, ресуспендировали в 2/3 от исходного объема охлажденного 0,1М CaCl₂ и инкубировали 40 минут во льду при 4°С, затем центрифугировали при 3 тыс.оборотов (центрифуга К-23) в течение 10 минут при 4°С. Супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в 10 мл 0,1М CaCl ₂. К полученной суспензии добавляли 1,5 мл охлажденного глицерина и расфасовывали в эппендорфы по 100 мкл и хранили при -70°С.

По мере необходимости компетентную культуру использовали следующим образом. К 0,1 мл компетентных клеток M15Rep4 добавляли необходимое количество лигированной смеси или плазмид.

ДНК и смесь инкубировали на ледяной бане при 4°С 40 мин. Далее проинкубированную смесь подвергали термальному шоку на водяной бане 60 сек при температуре 42°С. Добавляли 0,25 мл среды LB и инкубировали при 37°С в течение часа, затем высевали на чашки с селективной средой: LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Через сутки инкубации выросшие АрКт (ампициллин-канамицин) резистентные клоны были однократно расчищены на селективной среде и подвергнуты дальнейшему анализу.

Б) Анализ трансформантов.

Полученные трансформанты наращивали в 5 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл канамицина до оптической плотности 0,4 и добавляли ИПТГ. После 3-4 часов дополнительного инкубирования полученную культуральную жидкость центрифугировали, полученный осадок ресуспендировали в 100 мкл Н₂О и разрушали ультразвуком. Полученный лизат наносили на питательный агар, содержащий 30% плазмы крови человека (плазму перед добавлением в агар выдерживали 20 минут при 56°С) клеток. После 4 часов инкубации было установлено, что часть лизатов исследуемых клонов образовывали вокруг капельного рассева зоны лизиса. Этот положительный сигнал свидетельствовал о том, что трансформанты унаследовали интактную копию гена sak, кодирующую активную форму стафилокиназы (белка активатора плазминогена).

По результатам анализа для дальнейшей работы были отобраны 2 клона, которые показали максимальную зону лизиса.

В) Электрофоретический контроль содержания белка стафилокиназы.

150 мкл культуральной жидкости кипятили на водяной бане 5 минут с последующим центрифугированием в течение 5 минут при 15000 об/мин на центрифуге Eppendorf. 5 мкл супернатанта наносили в присутствии белкового красителя на 12% акриламидный гель. В качестве контроля молекулярного веса был использован маркер молекулярного веса белка фирмы "Fermentas." Было установлено, что количество определяемого белка составляет 15-20% от общего количества белков в клетках.

Г) Ферментация.

Ферментацию рекомбинантного штамма проводили в 10-литровом ферментере.

Состав питательной среды, г/дм³: триптон - 15,0; дрожжевой экстракт - 7,5; калий фосфорнокислый (K₂HPO₄) - 1,0; натрий хлористый (NaCl) - 10,0; глюкоза - 3,0; ампициллина натриевая соль - 0,075; канамицин - 0,025; вода дистиллированная - до 1 литра, рН до стерилизации составляет - 7,0-7,1.

Стерилизацию осуществляли при 116°С в течение 40 мин. Контроль процесса культивирования проводили по показаниям оптической плотности среды. При достижении плотности 2,0-2,5 ед. в ферментер вносили спиртовой раствор индуктора: изопропил-бета-D-тиогалактозида (ИПТГ) из расчета 48 мг/дм³. При достижении оптической плотности 4,5-5,0 осуществляли сепарацию. Полученные клетки промывали, суспендировали в буфере, разрушали в гомогенизаторе и центрифугировали.

Микробиологическая характеристика полученного рекомбинанта.

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. На агаре «Дифко» клетки образуют круглые гладкие колонии с ровными краями. При росте в жидкой питательной среде образуют интенсивную ровную муть.

Физико-химические свойства. Клетки растут в температурном диапазоне от 8 до 40°С, оптимум рН 7,4. В качестве источников азота, углерода и других необходимых компонентов используются минеральные соли, казеин, пептон, дрожжевой автолизат и т.д.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к канамицину и ампициллину.

Хранение рекомбинантного штамма. По требованиям генной инженерии материнский штамм микроорганизма и рекомбинантная плазмида хранятся отдельно друг от друга для избегания спонтанных мутаций. Наработанный объем плазмиды хранят при 20°С в буфере ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Материнский штамм хранят согласно общепринятым методам хранения микробиологических штаммов.

Как видно из представленного описания, получен штамм-продуцент гибридного белка, обладающего стафилокиназной активностью, названный нами E.coli MZ09.

В соответствии с вышеизложенным, предложенное изобретение решило задачу создания рекомбинантной ДНК, кодирующей белок, обладающий стафилокиназной активностью, который может быть выделен с использованием аффинной хроматографии. Кодирующая последовательность стафилокиназы приведена на фигуре 1.

Изобретение позволило создать штамм-продуцент стафилокиназы E.coli MZ09, обладающий высокой фибринолитической активностью и обеспечивающий выход рекомбинантного белка - до 20% по отношению к общему количеству белков.