новые циклогексеноновые соединения из антродии камфорной (antrodia camphorata) и их применение

Формула изобретения

1. Соединение, имеющее формулу (1):



в которой Х и Y могут быть кислородом или серой, R₁, R₂ и R₃ являются каждый атомом водорода, метилом или (CH₂)_m -СН₃, а m=1-12; n=1-12.

2. Соединение по п.1, в котором соединение выделяют из Antrodia camphorata.

3. Соединение по п.2, в котором соединение выделяют из экстрактов Antrodia camphorata, полученных с помощью органических растворителей.

4. Соединение по п.3, в котором органические растворители выбраны из группы, состоящей из спиртов, сложных эфиров, алканов и алкил галоидов.

5. Соединение по п.4, в котором спиртом является этанол.

6. Соединение по п.2, в котором соединение выделено из водных экстрактов Antrodia camphorata.

7. Соединение по п.1, представляющее собой 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон.

8. Соединение по п.1 или 7, проявляющее антиоксидантную активность.

9. Способ подавления роста клеток рака молочной железы, включающий применение соединения по п.1 или 7.

10. Способ по п.9, в котором соединение выделено из Antrodia camphorata.

11. Способ по п.10, в котором соединение выделено из экстрактов Antrodia camphorata, полученных с помощью органических растворителей.

12. Способ по п.11, в котором органические растворители выбраны из группы, состоящей из спиртов, сложных эфиров, алканов и алкил галоидов.

13. Способ по п.12, в котором органический растворитель является этанолом.

14. Способ по п.10, в котором соединение выделено из водных экстрактов Antrodia camphorata.

15. Способ по п.9, в котором клетки рака молочной железы относятся к клеточной линии MCF-7 или MDA-MB-231.

16. Способ подавления роста клеток рака печени, включающий применение соединения по п.1 или 7.

17. Способ по п.16, в котором соединение выделено из Antrodia camphorata.

18. Способ по п.17, в котором соединение выделено из экстрактов Antrodia camphorata, полученных с помощью органических растворителей.

19. Способ по п.18, в котором органические растворители выбраны из группы, состоящей из спиртов, сложных эфиров, алканов и алкил галоидов.

20. Способ по п.19, в котором органический растворитель является этанолом.

21. Способ по п.17, в котором соединение выделяют из водных экстрактов Antrodia camphorata.

22. Способ по п.16, в котором клетки рака печени относятся к клеточной линии Нер 3 В или Нер G2.

23. Способ подавления роста клеток рака простаты, включающий применение соединения по п.1 или 7.

24. Способ по п.23, в котором соединение выделяют из Antrodia camphorata.

25. Способ по п.24, в котором соединение выделено из экстрактов Antrodia camphorata, полученных с помощью органических растворителей.

26. Способ по п.25, в котором органические растворители выбраны из группы, состоящей из спиртов, сложных эфиров, алканов и алкил галоидов.

27. Способ по п.26, в котором органическим растворителем является этанол.

28. Способ по п.24, в котором соединение выделяют из водных экстрактов Antrodia camphorata.

29. Способ по п.23, в котором клетки рака простаты относятся к клеточной линии LNCaP или DU145.

30. Фармацевтическая композиция для подавления роста опухолевых клеток, включающая активную дозу соединения по п.1 и фармацевтически пригодный носитель, в котором опухолевые клетки выбраны из группы, состоящей из рака молочной железы, рака печени и рака простаты.

31. Фармацевтическая композиция для подавления роста опухолевых клеток, включающая активную дозу соединения по п.7 и фармацевтически пригодный носитель, в котором опухолевые клетки выбраны из группы, состоящей из рака молочной железы, рака печени и рака простаты.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому соединению, в частности к экстракту, выделенному и очищенному из Antrodia camphorata, и к его применению в подавлении роста опухоли.

Уровень техники

Antrodia camphorata (Ниу Чанг-Жи), также называемая «Чанг-Жи», «Ниу Чанг-Ку», «Ред-Чанг», «Ред Чанг-Чи», «Чанг-Ку», камфорный камерный гриб и так далее, является эндемичным видом на Тайване, растущим на внутренней гнилой сердцевине древесной стенки коричника Cinnamomum kanehirae Хей на высоте над уровнем моря от 450 м до 2000 м в горах Тайваня. Плодовое тело Antrodia camphorata растет внутри ствола дерева. Cinnamomum kanehirae Хей распространен главным образом в горных областях Тао-Юань, Нан-Тоу и внесен в перечень редких и ценных пород благодаря малой численности, и его чрезмерная вырубка является противозаконной. Таким образом, Antrodia camphorata в природе становится также редкой. Поскольку скорость роста природной Antrodia camphorata является крайне низкой, а сезон роста проходит с июня по октябрь, то цена Antrodia camphorata является очень высокой.

Плодовые тела Antrodia camphorata являются многолетними, бесчерешковыми, пробковыми или древесными, с различными внешними формами, наподобие тарелки, колокола, копыта или башни. Они являются плоскими на поверхности дерева в начале роста. Затем края на передней границе поднимаются, заворачиваясь в форму тарелок или сталактитов. Верхние поверхности Antrodia camphorate являются блестящими, коричневого или темно-коричневого цвета, с незаметными складками, плоскими и тупыми краями. Нижние стороны являются оранжево-красными или частично желтыми с порами на всей поверхности.

В дополнение, Antrodia camphorata издает сильный запах сассафраса (камфорный аромат), становится бледным желто-коричневым после высушивания на солнце, и имеет сильный горький вкус. В традиционной Тайваньской медицине Antrodia camphorata обычно применяется для детоксикации, защиты печени, в качестве противоракового средства. Antrodia camphorata, как и обычные съедобные и медицинские грибы, богата многочисленными питательными веществами, включая полисахариды (такие как р-глюкозан), тритерпеноиды, супероксид-дисмутазу (СОД), аденозин, белки (иммуноглобулины), витамины (такие как витамин В, никотиновая кислота), микроэлементы (такие как кальций, фосфор и германий и прочее), нуклеиновую кислоту, агглютинин, аминокислоты, стероиды, лигнины и стабилизаторы кровяного давления (такие как антродиевая кислота) и тому подобное. Полагают, что эти биоактивные ингредиенты проявляют благоприятные эффекты, такие как: противоопухолевый, усиление иммунитета, протвоаллергический, подавление агглютинации тромбоцитов, противовирусный, противобактериальный, антигипертензивный, снижение уровня глюкозы в крови, снижение холестерина, защита печени и тому подобное.

Тритерпеноиды являются наиболее изученным компонентом среди многочисленных композиций Antrodia camphorate. Тритерпеноиды являются общим наименованием для природных соединений, содержащих 30 атомов углерода с пентациклическими или гексациклическими структурами. Горький вкус Antrodia camphorata обусловлен компонентом из тритерпеноидов. Три новых тритерпеноидов эргостанового типа (антцин А, антцин В, антцин С) были выделены Chemg et al. из плодовых тел Antrodia camphorata (Chemg, I. H., and Chiang, H. C. 1995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58:365-371). Три новых соединения, названных жанкуевой кислотой А, жанкуевой кислотой В и жанкуевой кислотой С, были экстрагированы из плодовых тел Antrodia camphorata этанолом Chen et al. (Chen, С.H., and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from Antrodia cinnamomea, - a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. J. Nat. Prod. 58:1655-1661). В дополнение, Chemg et al. также нашли в плодовых телах Antrodia camphorata три других новых тритерпеноида, являющихся сесквитерпена лактоном и двумя соединениями, полученными из бифенила, 4,7-диметокси-5-метил-1,3-бензодиоксолом и 2,2',5,5'-тетраметокси-3,4,3',4'-би-метилендиокси-6,6'-диметилбифенилом (Chiang, H. С., Wu, D. Р., Chemg, I. W., and Ueng, С.H. 1995. А sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 39:613-616). В 1996 четыре новых тритерпеноида эргостанового типа (антцины Е и F и метил антцинаты G и H) были выделены Chemg et al. с помощью тех же самых аналитических методов (Chemg, I. H., Wu, D. P., and Chiang, H. С.1996. Triteroenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 41:263-267). Два родственных к эргостану стероида, жанкуевые кислоты D и Е вместе с тремя ланоста-связанными тритерпенами, 15 альфа-ацетил-дегидросульфуреновой кислотой, дегидроебурикоевой кислотой и дегидросульфуреновой кислотой были выделены Yang et al. (Yang, S. W., Shen, Y. С., and Chen, С.H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea-a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. Phytochemistry. 41:1389-1392). Поиски точных активных ингредиентов с противоопухолевым эффектом все еще остаются на экспериментальной стадии, и нуждаются в разъяснении, хотя сообщалось о противоопухолевых эффектах Antrodia camphorata (таких, как в вышеупомянутых ссылках). Если будет найдена точная противоопухолевая композиция, это внесет большой вклад в благоприятные эффекты лечения рака.

Раскрытие изобретения

Чтобы идентифицировать противоопухолевые соединения из экстрактов Antrodia camphorata, в данном изобретении было выделено и очищено соединение формулы (1),

в котором Х и Y могут быть кислородом или серой, R₁, R₂ и R₃ каждый являются атомом водорода, метилом или (СН₂)_m -СН₃, а m=1-12; n=1-12.

Предпочтительным соединением общей формулы (1) является 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон, как показано в формуле (2), с молекулярной формулой С₂₄ Н₃₈O₄, в виде бледно-желтого порошка, с молекулярной массой 390.

Соединения со структурой формулы (1) и формулы (2) очищены путем водной экстракции или экстракции органическим растворителем Antrodia camphorata. Органические растворители включают без ограничения спирты, такие как метанол, этанол или пропанол, сложные эфиры, такие как этилацетат, алканы, такие как гексан, или алкил галоиды, такие как хлорметан, хлорэтан. Среди них предпочтительным является спирт, особо предпочтительным является этанол.

Соединениями, которые можно применять в соответствии с изобретением, может быть подавлен рост опухолевых клеток, что можно далее применять для медицинской композиции для лечения рака и усиления лечебных эффектов. Соединения изобретения можно применять для ряда раковых клеток, включая рак молочной железы, рак печени и рак простаты, что приводит к замедлению роста раковых клеток, с последующим подавлением пролиферации раковых клеток и снижением риска развития опухоли. Таким образом, их можно применять в лечении рака, такого как рак молочной железы, рак печени, рак простаты и тому подобного.

С другой стороны, соединения формулы (1) и/или формулы (2) в изобретении могут быть включены в медицинские композиции для лечения рака молочной железы, рака печени и рака простаты, для подавления роста опухолевых клеток. Медицинские композиции включают не только соединения формулы (1) и/или формулы (2), но также и фармацевтически пригодные носители. Носители включают без ограничения наполнители, такие как вода, уплотнители, такие как сахароза или крахмал, связующие агенты, такие как производные целлюлозы, разбавители, дезинтегранты, усилители абсорбции или подсластители. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть произведена путем смешивания соединений формулы (1) и/или (2) по крайней мере с одним из носителей с помощью обычных способов, известных в фармацевтической области техники, и может быть сформулирована без ограничения в виде порошка, таблетки, капсулы, пилюль, гранул или другой жидкой формулы.

В дополнение, поскольку соединения настоящего изобретения в то же время обладают антиоксидантной активностью, они могут быть идеальными добавками к здоровому питанию, диетам и напиткам, медицинским продуктам и косметике, и являются благоприятными для здоровья человека благодаря способностям к профилактике сердечно-сосудистых заболеваний или мутации клеток.

Настоящее изобретение далее разъясняется в следующих примерах и иллюстрациях воплощений. Эти примеры, однако, нельзя рассматривать как ограничивающие объем изобретения, и предполагается, что специалистами в данной области техники легко могут быть сделаны модификации, находящиеся в пределах сущности изобретения и объема приложенной формулы.

Осуществление изобретения

Мицелий, плодовые тела или их смесь из Antrodia camphorata вначале экстрагировали водой или органическими растворителями до получения водного экстракта или органического экстракта Antrodia camphorata с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Органические растворители включали без ограничения спирты, такие как метанол, этанол или пропанол, сложные эфиры, такие как этилацетат, алканы, такие как гексан, или алкил галоиды, такие как хлорметан, хлорэтан. Среди них предпочтительным является спирт, особо предпочтительным является этанол.

Водные или органические экстракты из Antrodia camphorata подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для выделения и очистки. Каждую фракцию отбирали и анализировали на противораковый эффект. В активных фракциях с противораковым эффектами анализировали состав и впоследствии исследовали активность против различных опухолевых клеток. Вышеуказанный подход привел к идентификации новых соединений формулы (1) и формулы (2), ингибирующих рост некоторых опухолевых клеток, не обнаруженных ранее в Antrodia camphorata, и о которых не сообщалось в каких-либо предыдущих публикациях.

Соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон формулы (2) разъясняется ниже в качестве примера настоящего изобретения. Противоопухолевые эффекты 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,б,10-триенил)-циклогекс-2-енона оценивали путем анализа с 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, S-дифенил тетразолия бромидом (МТТ) тестом в соответствии с моделью скрининга противоопухолевых лекарств Национального института рака (NCI) по уровню выживания клеток с применением клеточных линий, таких как клетки рака молочной железы, рака печени, рака простаты и тому подобных. Вышеуказанные тесты доказали, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон снижает уровни выживания клеточных линий рака молочной железы (MCF-7 и MDA-MB-231), клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы (Нер 3В и Нер G2) и клеточных линий рака простаты (LNCaP и DU-145), в то же время показывая относительно низкие значения концентрации полуингибирования (IC₅₀). Рост клеток рака молочной железы, рака печени и рака простаты подавлялся 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-еноном, который таким образом можно применять для лечения рака, такого как рак молочной железы, рак печени, рак простаты и тому подобное. Подробности примеров описаны далее.

Пример 1

Выделение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона

100 г мицелия, плодовых тел или их смеси из Antrodia camphorata помещали в колбу. В колбу добавляли подходящее количество воды и спирта (70-100% спиртовой раствор) и перемешивали при 20-25°С в течение по крайней мере 1 часа. Раствор фильтровали через фильтр и 0,45 мкм мембрану, и собирали фильтрат в качестве экстракта.

Фильтрат из Antrodia camphorata подвергали анализу посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Разделение проводили на колонке RP18, мобильная фаза состояла из метанола (А) и 0,1-0,5% уксусной кислоты (В), с условиями градиента 0-10 мин в 95%~20% В, 10-20 мин в 20%~10% В, 20-35 мин в 10%~10% В, 35-40 мин в 10%~95% В, при скорости потока 1 мл/мин. Поток, вытекающий из колонки, контролировали детектором в УФ/видимой области.

Фракции, собранные на 25-30 мин, отбирали и концентрировали до получения 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона, продукта в виде бледно-желтого порошка. Анализ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона показал молекулярную формулу C₂₄H₃₈O₄, молекулярную массу 390, точку плавления 48°С~52°С. Исследование ЯМР спектра показало, что ¹Н-NMK(CDC1₃) (м.д.)=1.51, 1.67, 1.71, 1.75, 1.94, 2.03, 2.07, 2.22, 2.25, 3.68, 4.05, 5.07, и 5.14; ¹³C-NMK(CDC1₃ ) (м.д.)=12.31, 16.1, 16.12, 17.67, 25.67, 26.44, 26.74, 27.00, 39.71, 39.81, 4.027, 43.34, 59.22, 60.59, 120.97, 123.84, 124.30, 131.32, 135.35, 135.92, 138.05, 160.45, и 197.12.

Химическую структуру 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона сравнивали с базой данных химических соединений, и не было найдено подобной структуры. Эти данные подтвердили, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон является новым соединением, о котором не сообщалось ранее.

Пример 2

Анализ выживания in vitro для эффектов против рака молочной железы

Модель скрининга противораковых лекарств NCI выбрали для тестирования противоракового эффекта соединения из примера 1 изобретения. Выделенное соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из примера 1 добавляли в среду для культивирования клеток рака молочной железы человека, MCF-7 или MDA-MB-231, для анализа выживания опухолевых клеток. Этот анализ проводили с применением теста с 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, S-дифенил тетразолия бромидом (МТТ), обычно применяемого для определения клеточной пролиферации, процента жизнеспособных клеток и цитотоксичности. МТТ является желтым красителем, который абсорбируется живыми клетками и восстанавливается до багряно-синих кристаллов формазана редуктазой сукцинат-тетразолия в митохондриях. Образование формазана, таким образом, применяют для оценки и определения уровня выживания клеток.

Клетки рака молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB-231 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет. Этанольные экстракты Antrodia camphorata (контрольная группа, общие экстракты Antrodia camphorata без очистки) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно, в то время как 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон (экспериментальная группа) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% CO ₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 1.

Таблица 1
Результаты анализа выживания in vitro для подавления клеток рака молочной железы
Образцы	IC 50 (мкг/мл)
Контрольная группа (экстракт из Antrodia группа camphorata)
MCF-7	11,132
MDA-MB-231	25,812
Экспериментальная (формула 2)
MCF-7	0,852
MDA-MB-231	1,031

Из результатов таблицы 1 видно, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон является мощным ингибитором роста клеточной линии рака молочной железы человека. Значения IC50 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для MCF-7 и MDA-MB-231 составляют 0,852 мкг/мл и 1,031 мкг/мл, соответственно, что значительно ниже, чем у общих экстрактов из Antrodia camphorata. Таким образом, 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из Antrodia camphorata можно применять для подавления роста клеток рака молочной железы.

Пример 3

Дополнительное исследование in vitro по адъювантной терапии клеток рака молочной железы

Эксперимент также проводили в соответствии с in vitro моделью скрининга противораковых лекарств NCI. Клетки рака молочной железы человека MCF-7 и MDA-МВ-231 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет после добавления 0,0017 мг/мл Таксола, и обрабатывали в течение 72 часов. 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 - триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон, полученный в примере 1, добавляли в каждую из 96 лунок в следующих концентрациях: 0 мкг/мл (контрольная группа); 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл (экспериментальная группа), соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 2.

Таблица 2
Результаты дополнительной терапии Таксолом in vitro клеток рака молочной железы
Образцы	Результаты
Контрольная группа	Уровень выживания клеток (%)
MCF-7 (0,0017 мкг/мл Таксола)	65±1
MDA-MB-231 (0,0017 мкг/мл Таксола)	76±3
Экспериментальная группа	IC50 (мкг/мл)
MCF-7 (0,0017 мкг/мл Таксола+формула 2)	0,009
MDA-MB-231 (0,0017 мкг/мл Таксола+формула 2)	0,011

Из результатов таблицы 2 видно, что значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для MCF-7 и MDA-MB-231 снизились до 0,009 мкг/мл и 0,011 мкг/мл, соответственно, после добавления Таксола. Таким образом, эти результаты подтверждают ингибиторную активность 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона из Antrodia camphorate, который можно применять для подавления роста клеток рака молочной железы, и показывают лучшую противоопухолевую синергетическую активность при комбинации с Таксолом.

Пример 4

Анализ выживания in vitro для эффектов против рака печени

Модель скрининга противораковых лекарств NCI также применяли для анализа противораковых эффектов соединения, выделенного в примере 1 настоящего изобретения. Выделенное соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из примера 1 добавляли в среду для культивирования клеток рака печени человека, Нер 3В или Нер G2, для анализа выживания опухолевых клеток.

Клетки рака печени человека Нер 3В и Нер G2 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут.

Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет. Этанольные экстракты Antrodia camphorata (контрольная группа, общие экстракты Antrodia camphorata без очистки) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно, в то время как 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон (экспериментальная группа) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО ₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 3.

Из результатов таблицы 3 видно, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон является мощным ингибитором роста клеточной линии рака печени человека. Значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для Нер 3В и Нер G2 составляют 0,005 мкг/мл и 1,679 мкг/мл, соответственно, что значительно ниже, чем у общих экстрактов из Antrodia camphorata. Таким образом, 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из Antrodia camphorata можно применять для подавления роста клеток рака печени.

Пример 5

Дополнительное исследование in vitro по адъювантной терапии клеток рака печени

Эксперимент также проводили в соответствии с in vitro моделью скрининга противораковых лекарств NCI. Клетки рака печени человека Нер 3В и Нер G2 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки Нер 3В обрабатывали 0,0043 мг/мл Ловастатина в течение 72 часов, а Нер G2 обрабатывали 0,0017 мг/мл Таксола в течение 72 часов, перед помещением в 96-луночный планшет. 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон, полученный в примере 1, добавляли в каждую из 96 лунок в следующих концентрациях: 0 мкг/мл (контрольная группа); 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл (экспериментальная группа), соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 4.

Таблица 4
Результаты дополнительной терапии in vitro клеток рака печени
Образцы	Результаты
Контрольная группа	Уровень выживания клеток (%)
Нер 3В (0,0043 мкг/мл Ловастатина)	61±3
Нер G2 (0,0017 мкг/мл Таксола)	81±2
Экспериментальная группа	IC50 (мкг/мл)
Нер 3В (0,0043 мкг/мл Ловастатина+формула 2)	0,002
Нер G2 (0,0017 мкг/мл Таксола+формула 2)	0,008

Из результатов таблицы 4 видно, что значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для Нер 3В и Нер G2 снизились до 0,002 мкг/мл и 0,008 мкг/мл, соответственно, после добавления синергетических активностей Ловастатина и Таксола. Таким образом, эти результаты подтверждают ингибиторную активность 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона из Antrodia camphorata, который можно применять для подавления роста клеток рака печени, и показывают лучшую противоопухолевую синергетическую активность при комбинации с Таксолом.

Пример 6

Анализ выживания in vitro для эффектов против рака простаты

Модель скрининга противораковых лекарств NCI также применяли для анализа противораковых эффектов соединения, выделенного в примере 1 настоящего изобретения. Выделенное соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-пиклогекс-2-енон из примера 1 добавляли в среду для культивирования клеток рака простаты человека, LNCaP или DU-145, для анализа выживания опухолевых клеток.

Клетки рака простаты человека LNCaP или DU-145 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет. Этанольные экстракты Antrodia camphorata (контрольная группа, общие экстракты Antrodia camphorata без очистки) или 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,б,10-триенил)-циклогекс-2-енон (экспериментальная группа) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл, соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% CO ₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 5.

Таблица 5
Результаты анализа выживания in vitro для подавления клеток рака простаты
Образцы	IC 50 (мкг/мл)
Контрольная группа (экстракт из Antrodia camphorata)
LNCaP	11,491
DU-145	41,392
Экспериментальная группа (формула 2)
LNCaP	2,378
DU-145	1,812

Из результатов таблицы 5 видно, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон является мощным ингибитором роста клеточной линии рака простаты человека. Значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для LNCaP и DU-145 составляют 2,378 мкг/мл и 1,812 мкг/мл, соответственно, что значительно ниже, чем у общих экстрактов из Antrodia camphorata. Таким образом, 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон из Antrodia camphorata можно применять для подавления роста клеток рака простаты.

Пример 7

Дополнительное исследование in vitro по адъювантной терапии клеток рака простаты

Эксперимент также проводили в соответствии с in vitro моделью скрининга противораковых лекарств NCI. Клетки рака простаты человека LNCaP и DU-145 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 × трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки LNCaP обрабатывали 0,0017 мг/мл Таксола в течение 72 часов, а DU-145 обрабатывали 0,0043 мг/мл Таксола в течение 72 часов, перед помещением в 96-луночный планшет. 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енон, полученный в примере 1, добавляли в каждую из 96 лунок в следующих концентрациях: 0 мкг/мл (контрольная группа); 30, 10, 3, 1, 0.3, 0.1 и 0.03 мкг/мл (экспериментальная группа), соответственно. Клетки инкубировали при 37°С в 5% CO₂ инкубаторе в течение 48 часов. МТТ добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте, и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полу-ингибирования (IC₅₀) подсчитывали и указывали в таблице 6.

Таблица 6
Результаты дополнительной терапии Таксолом in vitro клеток рака простаты
Образцы	Результаты
Контрольная группа	Уровень выживания клеток (%)
LNCaP (0,0017 мкг/мл Таксола)	56±3
DU-145 (0,0043 мкг/мл Таксола)	70±2
Экспериментальная группа	IC50 (мкг/мл)
LNCaP 3В (0,0017 мкг/мл Ловастатина+формула 2)	0,961
DU-145 (0,0043 мкг/мл Таксола+формула 2)	0,515

Из результатов таблицы 6 видно, что значения IC₅₀ 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона для клеток рака простаты человека LNCaP и DU-145 снизились до 0,961 мкг/мл и 0,5158 мкг/мл, соответственно, после комбинации с Таксолом. Таким образом, эти результаты подтверждают ингибиторную активность 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона из Antrodia camphorate, который можно применять для подавления роста клеток рака простаты, и показывают лучшую противоопухолевую синергетическую активность при комбинации с Таксолом.

Пример 8

Исследование антиоксидантной активности in vitro

Человеческий липопротеин низкой плотности (LDL), окисленный ионом меди

(Cu²⁺), широко применяют для оценки антиоксидантной активности анализируемых образцов. Антиоксидантную активность образца определяют по содержанию диенов в LDL после окисления, и выражают в эквивалентах Тролокса с применением стандартной кривой, рассчитанной по водорастворимому стандарту витамина Е Тролоксу (значение 1 антиоксидантной активности соответствует 2 мкМ Тролокса).

Вначале готовили следующие растворы: бидистиллированную воду (отрицательная контрольная группа), 5 мМ натрий-фосфатный буфер (НФБ), 1 мкМ и 2 мкМ раствор Тролокса (положительная контрольная группа), и 40 мкг/мл 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона, выщеленного в примере 1. Концентрацию холестерина LDL (LDL-C) определяли с применением метода ферментативной реакции, готовя разведения до 0,1-0,25 мг/мл с помощью 5 мМ НФБ. Одну сотую мкл LDL добавляли в каждую лунку 96-луночного кварцевого планшета, с последующим добавлением вышеупомянутого Тролокса и соединения, выделенного в примере 1. Чтобы индуцировать окисление, добавляли стандартизированный окисляющий агент CuSO₄, до конечной концентрации 5 мкМ в каждую 250 мкл лунку. Планшет анализировали на ИФА-ридере при длине волны 232 нм при 37°С в течение 12 часов. Время отбора пробы составило 15 минут. Результаты показаны в таблице 7.

Таблица 7
Результаты исследования антиоксидантной активности in vitro
Образцы	Tlag (мин)	Tlag (мин)	Значения активности
Отрицательный контроль
H2O (Tlag0)	185
Положительный контроль
1 мкМ Тролокс
2 мкМ Тролокс	266	81	0,48
Экспериментальная группа
40 мкг/мл формулы 2	344	159	1,00
	439	208	1,30

Замечание 1: Время лаг-фазы (Tlag, мин) определяли как пересечение лаг-фазы с фазой распространения поглощения при 234 нм. Tlag(мин) определяли как разницу во времени между Tlag и Tlag₀ для каждого образца.

Замечание 2: Считается, что соединение обладает антиоксидантной способностью, когда значение антиоксидантной активности больше 0,5.

Из результатов таблицы 7 видно, что значение антиоксидантной активности 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11 -триметил-додека-2,6,10-триенил)-циклогекс-2-енона составляет 1,3, что гораздо больше стандартного значения 0,5. Таким образом, соединения изобретения обладают антиоксидантной активностью, что может быть использовано для здорового питания, диет и напитков, медицинских продуктов и косметики, и оказывать значительные благоприятные эффекты в отношении здоровья человека благодаря способности к профилактике сердечно-сосудистых заболеваний или мутации клеток.