вакцинный штамм вируса гриппа в/60/флорида/04/181 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Формула изобретения

Штамм вируса гриппа В/60/Флорида/04/181, депонированный в ФГУН «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора) под № 722, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в практическом здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа типа B, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus B, B/60/Флорида/04/181.

В результате появления в циркуляции принадлежащего к антигенной линии Ямагата нового штамма вируса гриппа - B/Флорида/07/04 известный вакцинный штамм B/60/Джилин/03/1 антигенной линии Ямагата - прототип [Патент РФ № 2307161 от 27.09.2007 - Опубл. 2007. - БИ № 27] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной B/Флорида/07/04 - подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма для производства живой гриппозной вакцины для взрослых и детей актуальной антигенной разновидности на основе современного эпидемического вируса B/Флорида/07/04.

Цель изобретения - получение промышленно значимого и антигенно актуального реассортантного вакцинного штамма. Для его получения выбраны два родительских штамма вируса гриппа: эпидемический штамм вируса гриппа B/Флорида/07/04 и безвредный для человека холодоадаптированный донор аттенуации B/СССР/60/69.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол - 1977 - № 4 - С.387-395].

Донор аттенуации B/СССР/60/69 - холодоадаптированный (ca) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968 - С.66-83]. Донор аттенуации B/СССР/60/69, характеризующийся устаревшей антигенной структурой, был ранее получен из эпидемического вируса гриппа B/СССР/69 методом холодовой адаптации [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука - 1994 - 151 с.], в результате чего он стал безвредным для человека, т.е. приобрел способность бессимптомно размножаться в верхних дыхательных путях привитых лиц, вызывая выработку противовирусного иммунитета.

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) - от безвредного донора аттенуации. На основе донора аттенуации B/СССР/60/69 был создан вакцинный штамм B/60/Джилин/03/1 - прототип.

Получение вакцинного штамма.

Вакцинный штамм B/60/Флорида/04/181 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса B/Флорида/07/04 с донором аттенуации B/СССР/60/69 путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 25°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены трехкратным клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (25°C) и оптимальной (32°C) температурах инкубации. Чистые клоны проверены по фенотипическим характеристикам (ts-, ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали следующие методы.

а) Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), позволяющую определить принадлежность поверхностного антигена-гемагглютинина (НА) одному из родительских вирусов [Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУК 3.3.2.1758-03].

б) Метод ПЦР-рестрикционного анализа ДНК копий генов, основанный на амплификации относительно коротких участков РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации, но не для эпидемических вирусов гриппа. Метод впервые был создан для анализа состава генома реассортантов эпидемических вирусов гриппа A и донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J.Virol. Methods - 1995 - Vol.52. - № 1-2 - P.41-49]. Для вирусов гриппа типа В полноценный метод анализа состава генома с помощью метода ПЦР-рестрикционного анализа ДНК копий генов отсутствует. Мы разработали метод ПЦР-рестрикционного анализа реассортантов современных вирусов гриппа В, принадлежащих к антигенной линии Ямагата, и донора аттенуации B/СССР/60/69. Перечень сконструированных праймеров и использованных ферментов (рестриктаз) приведен в табл.1. Обработку амплифицированных фрагментов ДНК производили соответствующими рестриктазами с их последующим электрофорезом в 1,7%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида. Это позволило четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к любому современному эпидемическому вирусу гриппа B линии Ямагата или донору аттенуации B/СССР/60/69.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Гемагглютинин (HA) полученного нами вакцинного штамма B/Флоридa/04/181 в РТГА идентичен эпидемическому вирусу B/Флорида/07/04, антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. ПЦР-рестрикционным методом установлено, что вакцинный штамм B/Флорида/04/181 унаследовал нейраминидазу (NA) - от эпидемического вируса B/Флорида/07/04.

Формула генома.

Формула генома 6:2 вакцинного штамма B/Флорида/04/181 подтверждена ПЦР-рестрикционным методом с помощью специфических праймеров и соответствующих рестриктаз. Вакцинный штамм B/Флорида/04/181 унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (PB1, PB2, PA, NP, M, NS), от донора аттенуации B/СССР/60/69.

Результаты анализа всех генов вакцинного штамма B/Флорида/04/181 представлены в табл.2.

Таблица 2
Состав генома реассортантного вакцинного штамма В/Флорида/04/181, полученного на основе эпидемического вируса В/Флорида/07/04 и донора аттенуации B/СССР/60/69
Принадлежность гена одному из родительских вирусов
Ген	Донор аттенуации	Эпидемический вирус	Вакцинный штамм 60
PB2	60	ЭВ	60
PB1	60	ЭВ	60
PA	60	ЭВ	60
HA	60	ЭВ	ЭВ
NP	60	ЭВ	60
NA	60	ЭВ	ЭВ
M	60	ЭВ	60
NS	60	ЭВ	60
ОБОЗНАЧЕНИЯ: 60 - донор аттенуации В/СССР/60/69;
ЭВ - эпидемический вирус гриппа В/Флорида/07/04.

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма B/60/Флорида/04/181 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Было показано, что вакцинный вирус является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°C и 38°C составляет 8,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 32°C и 25°C равна 4.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл), что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации B/СССР/60/69.

Оценку токсичности вакцинного штамма B/60/Флорида/07/181 определяли путем подкожного и внутрибрюшинного введения вирусного материала мышам. Для этого группе из 12 мышей (самцов линии СВА весом 18-20 г вводили соответствующим способом 0,5 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости с титром 8.0 lg ЭИД₅₀/0.2 мл и оценивали патогенность вируса по проценту выживших мышей в течение 7 дней после введения вируса. Вакцинный штамм B/60/Флорида/04/181 в эксперименте на мышах оказался полностью безвредным - 100% мышей выжили в течение всего периода наблюдения.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины B/60/Флорида/04/181 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса B/Флорида/07/04, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека. Штамм аттенуирован и безвреден для мышей.

Морфология штамма полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Штамм B/60/Флорида/04/181 ареактогенен для взрослых и для детей при интраназальном введении.

Таким образом, вакцинный штамм B/60/Флорида/04/181 по биологическим свойствам и показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения.

Полученный штамм B/60/Флорида/04/181 депонирован в коллекции вирусов ФГУН «Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Роспотребнадзора (ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Россия RU, 119002, город Москва, Сивцев-Вражек, дом 41) под № 72. Штамм B/60/Флорида/04/181 имеет характеристики, представленные в паспорте (прилагается - стр.7).

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма B/60/Флорида/04/181 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 72 часов - 9,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл. Гемагглютинирующая активность - 1:2048.

Штамм проявляет генетическую стабильность аттенуирующих мутаций и биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм B/60/Флорида/04/181 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа B/60/Флорида/04/181 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма: B/60/Флорида/04/181

2. Серия: № 1

3. Метод получения: генетическая реассортация; характеристика родительских вирусов:

а) эпидемический вирус - B/Флорида/07/04;

б) донор аттенуации - B/СССР/60/69.

4. Количество пассажей: 6 в процессе реассортации.

5. Характеристика штамма до лиофилизации:

а) оптимальные условия репродукции: 32°C, 72 часов;

б) гемагглютинирующая активность: 1:2048;

в) инфекционная активность: 9.5 lg ЭИД₅₀ /0,2 мл;

г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной (неиммунной) сывороткой крови лошади;

д) разность в показателях инфекционной активности при 32°C и 38°C (температурочувствительный фенотип): 8.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

е) разность в показателях инфекционной активности при 32°C и 25°C (холодоустойчивый фенотип): 4.0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

ж) структура генома реассортанта пол данным рестрикционного анализа амплифицированных в RT-PCR фрагментов вирусных РНК:

гены от эпидемического вируса - HA, NA;

гены от донора аттенуации - PB2, PB1, PA, NP, M, NS.

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а) объем материала в ампуле: 1.0 мл;

б) инфекционная активность: 8,0 lg ЭИД₅₀/0.2 мл;

в) гемагглютинирующая активность: 1:512.

7. Антигенная специфичность

а) гемагглютинина - идентична эпидемическому вирусу B/Флорида/07/04 по данным РТГА с крысиной антисывороткой;

б) нейраминидазы - идентична эпидемическому вирусу B/Флорида/07/04 по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.

8. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении: безвреден.

9. Бактериологический контроль: стерилен.

10. Контроль на посторонние вирусы: посторонние вирусы отсутствуют.

ШТАММ B/60/ФЛОРИДА/04/181 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ

Пример 1. При вакцинации 52 взрослых человек интраназально реассортантным вакцинным штаммом B/60/Флорида/07/181 с инфекционной активностью 8,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл слабые температурные реакции (37,1°C-37,2°C) наблюдались у двух привитых (3.8%), сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°C и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°C не наблюдалось. Легкие катаральные явления (насморк) продолжительностью не более двух дней были отмечены у одного человека (1.9%). Результаты обследования приведены в табл.3.

В получившей плацебо группе из 43 лиц сильных и средних температурных реакций не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°C) отмечены у 2 человек (2,3%). Катаральные явления (насморк) продолжительностью не более двух дней были отмечены также у одного человека (2.3% случаев).

Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.

Таким образом, вакцинный штамм B/60/Флорида/04/181 по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

ШТАММ B/60/ФЛОРИДА/04/181 АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ

Пример 2. Группу из 53 детей в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназально в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом B/60/Флорида/04/181 с инфекционной активностью 8,0 lg ЭИД₅₀/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 31 человека получила плацебо. Результаты исследований приведены в табл.4.

В группе привитых детей слабых температурных реакций (до 37,5°С), сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Катаральные симптомы не отмечены.

В получившей плацебо группе слабых, сильных и средних температурных реакций также не наблюдалось. Катаральные симптомы отсутствовали.