рекомбинантная плазмида, штамм escherichia coli, химерный белок и их применение

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмида pESAT6-CBD, представленная нуклеотидной последовательностью № 1, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка ESAT6-CBD, состоящего из полноразмерного белка ESAT6 M.tuberculosis, Gly-Ser спейсера, целлюлозосвязывающего домена гена эндоглюканазы CelD из A.thermophilum, размером 4282 п.н., состоящая из следующих структурных элементов:

искусственный бактериальный оперон рекомбинантного белка ESAT6-CBD, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), ген рекомбинантного белка ESAT6-CBD (117-1007 п.н.), нетранслируемую область терминации транскрипции (1047-1141 п.н.);

бактериальный оперон бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (3217-4067 п.н.);

бактериальный участок инициации репликации типа ColEl (2474-2485 п.н.), обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli.

2. Рекомбинантный штамм E.coli M15 [pREP4, pESAT6-CBD], полученный трансформацией штамма E.coli M15 [pREP4] плазмидой по п.1, продуцент белка ESAT6-CBD.

3. Способ получения, иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантного белка ESAT6-CBD на целлюлозе, включающий:

выращивание клеток штамма E.coli Ml5 [pREP4, pESAT6-CBD] no п.2;

иммобилизацию белка ESAT6-CBD в составе клеточных экстрактов штамма E.coli M15 [pREP4, pESAT6-CBD] на целлюлозном сорбенте за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации с последующей отмывкой от несвязавшихся бактериальных белков, при этом происходит концентрирование целевого продукта и его очистка; выделение целевого продукта.

4. Рекомбинантный белок ESAT6-CBD с молекулярной массой 32,0 кДа (pI 5,05), включающий полноразмерный белок ESAT6 с последовательностью № 2, Gly-Ser спейсер с последовательностью № 3, целлюлозосвязывающий домен гена эндоглюканазы CelD из A.thermophilum с последовательностью № 4.

5. Иммуногенная композиция, содержащая белок по п.4 ESAT6-CBD, иммобилизованный на целлюлозе, в эффективном количестве, специфически активирующая Т-лимфоциты, синтезирующие ИФН-гамма при стимуляции антигенами микобактерий.

6. Способ проверки протективных свойств иммуногенной композиции по п.5 в отношении туберкулезной инфекции в модели туберкулеза у мышей, включающий

а) вакцинацию мышей инбредной линии C57BL/6 дважды, подкожно, с интервалом 2 недели препаратами: иммуногенная композиция по п.5 из расчета 10 мкг на мышь по содержанию действующего вещества; CBD-целлюлоза из расчета 10 мкг на мышь по содержанию CBD - отрицательный контроль 1; физиологическим раствором - отрицательный контроль 2;

в) заражение через 5 нед. после второй вакцинации мышей внутривенно в дозе 5·10⁶ КОЕ вирулентным штаммом M.tuberculosis H37Rv;

c) умерщвление через 4 нед. после заражения из каждой группы по 4 мыши и проведение оценки размножения микобактерий в легких и селезенке методом посева гомогенатов органов на агар Дюбо с последующим подсчетом колоний;

d) построение кривых выживания при проведении наблюдений за оставшимися мышами (8 в каждой группе), при этом о протективных свойствах иммуногенной композиции по п.5 судят по результатам стадий с) и d).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии.

В настоящее время единственной применяемой в мире вакциной против туберкулеза является БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette-Guerin, 1921 г.), которая представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Она безопасна, недорога и достаточно эффективно защищает детей как от заражения туберкулезом, так и от милиарного туберкулеза и туберкулезного менингита. Однако BCG не защищает взрослых от легочного туберкулеза, а именно эта форма болезни приводит к распространению инфекции и тяжелой эпидемической ситуации. Отсюда следует высокая актуальность разработки новых вакцин против туберкулеза.

Существует несколько направлений разработки новых противотуберкулезных вакцин, альтернативных БЦЖ: субъединичные вакцины, ДНК-вакцины и живые вакцины с улучшенными свойствами. Наиболее полно в экспериментальных моделях на животных охарактеризованы субъединичные вакцины, в том числе препараты, состоящие из нескольких секретируемых белков/пептидов Mycobacterium tuberculosis (Doherty Т.М., Olsen A.W., Weischenfeldt I J. et al. Comparative Analysis of Different Vaccine Constructs Expressing Defined Antigens from Mycobacterium tuberculosis. The Journal of Infectious Diseases, 2004, Vol.190, pp.2146-2153). Идентифицировано много антигенов М. tuberculosis, потенциально важных в качестве компонентов новых вакцин. К ним относятся, в частности, иммунодоминантные секретируемые антигены, присутствующие в культуральном фильтрате М. tuberculosis. Среди секретируемых антигенов М. tuberculosis лучше всего изучены антигены ESAT-6 (Early Secret Antigen Target-6), CFP-10 (culture-filtrate protein-10) и белки комплекса 85 (Ag85A, В, С).

Белки ESAT-6 и CFP-10 транслируются в составе одной рамки считывания, RD1, присутствующей в разных штаммах вирулентных микобактерий, но утраченной вакцинным штаммом BCG. Как нативные, так и рекомбинантные белки ESAT-6 и CFP-10 индуцируют синтез интерферона-гамма (ИФН-гамма, ИФН- ) Т-лимфоцитами периферической крови инфицированных М. tuberculosis лиц (Johnson P.D., Stuart R.L., Grayson M.L. et al. Tuberculin-purified protein derivative-, MPT-64, and ESAT-6-stimulated gamma interferon responses in medical students before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination and in patients with tuberculosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol, 1999, Vol.6, No. 6, pp.934-937; Berthet F.X., Rasmussen P.В., Rosenkrands I. et al. Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrate protein (CFP-10). Microbiology, 1998, Vol.144, No.11, pp.3195-3203), поэтому оба белка используются для разработки различных тестов серологической диагностики туберкулеза (Arend S.M., Andersen P., van Meijgaarden K.E. et al. Detection of active tuberculosis infection by Т cell responses to early-secreted antigenic target 6-kDa protein and culture filtrate protein 10. J. Infect. Dis., 2000, Vol.181, No. 5, pp.1850-1854; van Pinxteren L.A., Ravn P., Agger EM. et al. Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT-6 and CFP10. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2000, Vol.7, No.2, pp.155-160).

Задачей изобретения является разработка вакцинного препарата на основе отдельных белковых компонентов с высоким уровнем экспрессии и стабильности этих белков в бактериальной системе, эффективная система очистки и простота тестирования иммуногенности.

Для решения этой задачи используется конструирование химерного белка за счет соединения в одной рамке трансляции двух генов - гена для вакцинирующего белка и гена для белка-носителя, что приводит к синтезу в бактериальной системе химерного белка. Был создан рекомбинантный белок, состоящий из двух компонентов: антигена М. tuberculosis и целлюлозосвязывающего домена CelD из термофильного микроорганизма Anaerocellum thermophilum (CBD). Рекомбинантный белок, имеющий в своем составе CBD, можно в одну стадию иммобилизовать на целлюлозном носителе. В результате происходит одновременная очистка, концентрирование и стабилизация, а также обеспечивается защита от протеаз бактерий-продуцентов. При этом исходные антигенные свойства функционально активного белкового домена не нарушаются.

При использовании этого подхода был получен двухкомпонентный рекомбинантный белок. Последовательность гена М. tuberculosis esat6 кодирует полноразмерный белок, который формирует первый белковый домен, определяющий функциональные иммунологические свойства комплексной молекулы. Далее следует соединяющая (спейсерная) аминокислотная последовательность из нескольких чередующихся остатков глицина и серина (Gly-Ser). Второй белковый домен кодируется последовательностью гена эндоглюконазы CelD A. thermophilum; он определяет способность продукта взаимодействовать с целлюлозным сорбентом. Белковые продукты нарабатываются в непатогенных лабораторных штаммах Escherichia coli. Иммобилизированный на целлюлозе антиген представляет собой суспензию сорбента с адсорбированным на нем белке. Целлюлозный носитель выступает в роли адъюванта при иммунизации, обеспечивающего укрупнение, полимеризацию антигена, без которого развивается более слабый иммунный ответ на белковый моноантиген. Антигены в свободном состоянии представляют собой растворы с определенной ионной силой, свободные от примесей липополисахаридов и ДНК штамма-продуцента.

Очистка конечных продуктов от высокотоксичных для организма липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов является важной проблемой.

Таким образом, заявляемая группа изобретений позволяет создавать штамм Е. coli, обеспечивающий высокий уровень продукции рекомбинантного белка, содержащего белок М. tuberculosis ESAT6; получить простую и эффективную схему очистки рекомбинантного белка, специфически и эффективно индуцирующего иммунный ответ на антигены микобактерий, в том числе синтез ИФН-гамма, необходимый для противотуберкулезной защиты; создавать иммуногенную композицию на основе рекомбинантных белка на целлюлозном носителе (адъювант).

Указанный результат достигается за счет синтеза рекомбинантного белка ESAT6-CBD в клетках рекомбинантного штамма Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-CBD], несущего рекомбинантную плазмиду pESAT6-CBD. Также за счет создания комплексного препарата ESAT6-CBD-целлюлоза, в котором рекомбинантный белок рекомбинантный белок ESAT6-CBD (концентрация 2,1 мг/мл) иммобилизован на целлюлозе (по массе 2,8% в препарате) и ресуспендирован в 1x PBS буфере рН 7,2-7,4.

Сущность изобретения состоит в том, что включенная в заявку плазмида содержит следующие существенные для функционирования структурные элементы:

а) искусственный бактериальный оперон химерных белков, состоящий из:

- промоторной области раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающий эффективную транскрипцию мРНК;

- рекомбинантный ген, кодирующий химерный белок «последовательность белка ESAT6 М. tuberculosis - спейсер - целлюлозосвязывающий домен А. thermophilum» - ESAT6-CBD (117-1007 п.н.);

- нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции pESAT6-CBD (1041-1147 п.н.);

б) бактериальный оперон bla, кодирующий белок бета-лактамазу, селективный маркер для трансформации штамма Е. coli pESAT6-CBD (3217-4067 п.н.) комплементарной цепи.

в) бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штамме Е. coli pESAT6-CBD (2474-2485 п.н.).

Таким образом, создана рекомбинантная плазмида pESAT6-CBD (4282 п.н.), кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок ESAT6-CBD, обладающий способностью самопроизвольно связываться с целлюлозосодержащим сорбентом. Плазмида содержит следующие структурные элементы: искусственный бактериальный оперон химерного белка, включающий промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (80 п.н.), ген химерного белка ESAT6-CBD (890 п.н.) и терминатор транскрипции (94 п.н.); бактериальный оперон бета-лактамазы (860 п.н.) и бактериальный участок инициации репликации типа ColE1 (11 п.н.). Штамм-продуцент рекомбинантного белка ESAT6-CBD получают трансформацией клеток Е. coli штамма M15 [pREP4] плазмидой pESAT6-CBD. Штамм обеспечивает продукцию рекомбинантного белка ESAT6-CBD после проведения процедуры индукции (изопропил- -D-тио-галактопиранозидом) (ИПТГ) до 12-15% от тотального белка клетки.

Штамм Е. coli M15 [pREP4], несущий плазмиду pESAT6-CBD - продуцент бифункционального рекомбинантного белка ESAT6-CBD характеризуются следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 2,0% агаризованной средой LB рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-агар, МПА, МПБ).

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре от +4°С до +42°С, при оптимуме рН=6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагают сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживают мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенным при использовании данных штамма является чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляет устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pESAT6-CBD и к канамицину (до 50 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4.

По созданию комплексного препарата рекомбинантного белка и аморфной целлюлозы технический результат достигается за счет создания двухкомпонентного рекомбинантного белка, состоящего из белка ESAT6 М. tuberculosis и гена эндоглюконазы CelD A. thermophilum. А также за счет получения комплексного препарата (иммунологической композиции), в которой рекомбинантный белок (Ag-CBD), иммоблизован на аморфной целлюлозе (Ag-CBD-целлюлоза).

Рекомбинантный белок ESAT6-CBD имеет в своем составе домен, определяющий его способность связываться с целлюлозой, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на целлюлозе. Иммобилизация на целлюлозе обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке целлюлозосвязывающего домена эндоглюконазы CelD из термофильного микроорганизма A. thermophilum, который обладает высоким сродством к кристаллической и аморфной целлюлозам и обеспечивает необратимое связывание с носителем в широком диапазоне значений рН=4-11, температуры: от 0 до +75°С и концентраций NaCl: от 0 до 5 М.

Поскольку в Е. coli отсутствуют белки, связывающиеся с целлюлозой, то синтезируемый в клетках Е. coli, трансформированных плазмидой pESAT6-CBD, рекомбинантный белок ESAT6-CBD является единственным белком штамма-продуцента, прочно связывающимся с целлюлозой. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата белка, иммобилизованного на сорбенте. На чертеже приведена схема плазмиды pESAT6-CBD.

Была исследована иммуногенность комплексного препарата ESAT6-CBD - целлюлоза на мышах двумя методами. Во-первых, мышей иммунизировали в подушечки задних лап и через 18 дней сравнивали пролиферативный ответ Т-клеток с ответом мышей, которых иммунизировали только CBD-целлюлоза. Был выявлен выраженный специфический иммунный ответ на все три антигена, с индексами пролиферации опыт: контроль = 5-7. В другой схеме мышей иммунизировали под кожу спины 2-кратно с 2-недельным интервалом иммуногенным и контрольным препаратом. Через 5 недель был исследован пролиферативный ответ Т-клеток и количество Т-клеток, продуцирующих ИФН-гамма. Был выявлен 2-3-кратный прирост ИФН-гамма-положительных Т-клеток и 4-6-кратное усиление пролиферации в присутствии соответствующих антигенов в культуре клеток по сравнению с контрольными животными.

Для проверки протективной активности исследуемых препаратов иммунные к антигену ESAT-6 (иммунизация препаратом ESAT-6-CBD-целлюлоза), а также контрольные животные (иммунизация CBD-целлюлоза и физиологический раствор) были заражены внутривенно вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv в дозе 5×10⁶ КОЕ/мышь. Через 3 недели после заражения по 4 мыши из каждой группы были забиты и гомогенаты органов были посеяны на чашки Петри с агаром Дюбо. В легких и селезенках мышей, иммунных к ESAT-6, наблюдалось 7-кратное уменьшение бактериальной нагрузки по сравнению с контрольными животными.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является получение штамма-продуцента, обеспечивающего высокий уровень продукции устойчивого иммуногенного белка, который может быть получен, иммобилизован и очищен в одну стадию. Получена эффективная иммуногенная композиция против туберкулеза.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами, приведенными ниже. Генно-инженерные и микробиологические манипуляции, амплификацию и секвенирование ДНК проводили по стандартным методикам (Т.Parish, N.G.Stoker. Mycobacterium tuberculosis protocols., Humana Press Inc., 2001, Methods in molecular Medicine, 54; Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, Vol.239, No. 4839, pp.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNAsequencing with chain-terminating inhibitors (DNA polymerase/nucleotide sequences/bacteriophage 4Х174). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, Vol.74, No.12, pp.5463-5467).

Пример 1. Получение плазмиды.

а) Получение фрагмента гена белка М. tuberculosis с последующим их клонированием.

Фрагмент гена белка ESAT-6 получали методом ПЦР. В качестве матрицы для амплификации использовали хромосомную ДНК М. tuberculosis. Для синтеза целевого фрагмента гена был сконструированы специфические праймеры (ЗАО «Синтол», РФ), в последовательность которых для клонирования были введены сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI, BspMII (Kpn2I) и NcoI (полужирный, подчеркнутый), а также кодоны инициации и терминации трансляции (курсив).

Название праймера	Последовательность
EF	5' - ctt ccg gga tcc atg gca gag cag cag tgg aat ttc - 3'
	BamHI NcoI
ER	5' - cga ttc tcc gga tta aga tct gaa cat ccc agt gac gtt gcc ttc - 3' Kpn2I BglII

В рабочую смесь для ПЦР добавляли по 2,5 мМ каждого праймера, реакцию проводили при следующих условиях: а) 95°С 10 мин; б) 94°С 4,5 мин, 60°С 5 мин, 72°С 40 с; в) 94°С 2 мин, 65°С 1 мин, 72°С 40 с, 94°С 1 мин - 30 циклов; г) 65°С 5 мин; д) 72°С 10 мин; е) 10°С - хранение. Для клонирования двуцепочечных фрагментов ДНК, плазмидный вектор pQE6 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции NcoI и Kpn2I при 37°С в буфере, содержащем 33 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия и 0,1 мг/мл BSA в течение 1 ч. В 1,2% агарозном геле проводили разделение продуктов рестрикции. Выделенный из агарозного геля фрагмент вектора pQE6 (размером 3016 п.н.) объединяли с фрагментами cfp10 (293 п.н.), esat6 (305 п.н.). Лигировали при 25°С в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ DTT, 0,5 мМ АТФ (рН 7,8 при 37°С) с помощью ДНК лигазы бактериофага Т4 в течение 1 ч. Продукты реакции переосаждали при -20°С 96% C₂H₅OH с добавлением ацетата аммония в течение 1,5 ч. После переосаждения смесь растворяли в деионизированной воде (mQ H₂O). Методом электропорации полученными лигазными смесями трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма M15 [pREP4] (Nal^S, Str^S, rif^S, lac^-, ara^-, gal^- , mtl^-, F^-, recA⁺, uvr⁺ ). После трансформации клоны отбирали на агаризованной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин (50 мг/мл) и канамицин (25 мг/мл). Плазмидную ДНК из колоний выделяли методом щелочного лизиса; анализировали методом рестрикционного картирования эндонуклеазами рестрикции BglI, BglII, BspMII, NcoI. Отбирали клоны плазмидной ДНК pESAT6 (3309 п.н.), содержащие в своем составе последовательность туберкулезного белка. Первичную структуру полученных конструкций подтверждали секвенированием.

б) Получение плазмиды, содержащей последовательность гена микобактериального белка, Gly-Ser спейсера и целлюлозосвязывающего домена CBD.

Для получения конструкции, кодирующей последовательность гена белка М. tuberculosis ESAT6, Gly-Ser спейсера, и целлюлозосвязывающего домена CBD, плазмиду pESAT6 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BglII, PvuI, XbaI при 37°С в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ хлорида магния, 100 мМ хлорида натрия и 0,1 мг/мл BSA, в течение 1 часа. Плазмиду pspCBD (ptt10), кодирующую последовательность Gly-Ser и целлюлозосвязывающего домена, гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BamHI и BglI при 37°С в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетата (рН 7,9 при 37°С), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1 часа. В 1,2% агарозном геле проводили разделение продуктов рестрикции. Выделенные из агарозного геля фрагменты рестрикции плазмидной ДНК pESAT6 (2696 п.н.) и pspCBD (2414 п.н.) лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Методом электропорации полученными лигазными смесями трансформировали компетентные клетки Е. coli M15 [pREP4]. После трансформации клоны отбирали на агаризованнной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин и канамицин. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, анализировали методом рестрикционного картирования эндонуклеазами рестрикции BamHI, BglI, BgLII, NcoI, PvuI. Отбирали клоны плазмидной ДНК pESAT6-CBD (4282 п.н.), содержащей в своем составе последовательность туберкулезного белка, Gly-Ser спейсера, и целлюлозосвязывающего домена CBD. Первичную структуру полученных конструкций подтверждали секвенированием.

Пример 2. Конструирование штамма Е. coli - продуцента антигена М. tuberculosis, соединенного с целлюлозосвязывающим доменом.

Для получения штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка ESAT6-CBD, клетки штамма E. coli M15 [pREP4] трансформировали плазмидой pESAT6-CBD. Трансформированные клетки выращивали в 3,5 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм (около 2,5 ч). В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ, IPTG) и выращивали в течение 3 ч. Для контроля продукции рекомбинантных белков в штаммах Е. coli M15 [pREP4, pCFP10-CBD], Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-CBD] применяли метод электрофореза по Лэммли в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Разделение белков проводили в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Tris-HCl, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте.

При сравнении спектра белков в штаммах Е. coli M15 [pREP4] и Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-CBD] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы 32,0 кДа, соответствовала расчетной для белка ESAT6-CBD. Уровень синтеза белков в Е.coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка-стандарта Unstained Protein Molecular Weight Marker («Fermentas», Литва).

Для проверки растворимости синтезируемого белка биомассу выращенного штамма (Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-CBD]) подвергали разрушению в 1% TES буфере (25 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 1% Тритон Х-100, 5 мг/мл лизоцим) в соотношение биомасса-буфер 1:2 и гомогенизировали до однородной массы. После центрифугирования пробы разделяли на 2 фракции: растворимых клеточных белков (над осад очная жидкость) и нерастворимых (осадок). Обе фракции подвергали разрушению в лизирующем буфере (0,05 М Трис-HCl, рН 6.8, 0,5% Triton X-100, 0,5 М NaCl, 0,25 М MgCl₂, 5 мг/мл лизоцим, 10 мг/мл PMSF, 20 мг/мл ДНКаза) в соотношении 1:1; гомогенизировали до однородной массы; прогревали при +95°С 15 мин. Результаты контролировали с помощью электрофореза по Лэммли. Было показано, что рекомбинантный белок ESAT6-CBD синтезируется в клетках Е. coli как в растворимой фракции, так и виде телец-включений.

Пример 3. Получение рекомбинантного белка ESAT6-CBD в свободном состоянии и иммобилизованном на целлюлозе.

Для получения рекомбинантного белка культуру штамма Е. coli M15 [pREP4, pESAT6-CBD] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 100 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 об/мин в течение 15 мин.

Осадок ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,25 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂, 0,15 мМ PMSF, 0,1% Тритон-Х100, 0,5 мг/ мл лизоцима, 20 мг/мл ДНКазы; из расчета 1 г биомассы на 4 мл буфера. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком 3 раза по 20 с. После центрифугирования при 16000 об/мин в течение 30 мин фракция нерастворимых клеточных белков оставалась в осадке, растворимых - в надосадочной жидкости.

Осадок (нерастворимая фракция) суспендировали в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 0,002 объема -меркаптанола) и добавляли равный (по массе) объем мочевины. После перемешивания выдерживали на водяной бане при +37°С до полного растворения мочевины. Центрифугировали при 12000 об/мин 30 мин и отбирали надосадочную жидкость. Для очистки рекомбинантного белка надосадочную жидкость переносили на колонку с микрокристаллической целлюлозой (Perloza MT-200, «lontosorb», Czech Republic). Элюцию белков с целлюлозы проводили раствором 8-2 М мочевины и 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0). Для удаления мочевины образцы диализовали против PBS буфера при 25°С в течение ночи.

Растворимую фракцию белков использовали для иммобилизации на инъекционной (аморфной) целлюлозе. К надосадочной жидкости добавляли 1/3 объема 30% суспензии целлюлозы и буфер, содержащий 0,5% Тритона Х-100, 0,5 М NaCl; инкубировали при 25°С 1 ч. Центрифугировали в течение 10 мин при 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в том же буфере; отмывку целлюлозы повторили 2 раза. Осадок ресуспендировали в PBS буфере. В иммобилизованном на сорбенте состоянии белки представляют собой суспензию.

Концентрацию белков в свободной и иммобилизованной форме определяли по Бредфорду при длине волны 595 нм. Для определения % содержания целлюлозы в пробах, где белки были иммобилизованы на сорбенте, образцы подвергали лиофилизации в течение двух дней с последующим пересчетом полученных масс. Таким образом, были получены следующие комплексные препараты (иммуногенные композиции) (Ag-CBD, Ag-CBD-целлюлоза), степень чистоты которых составила не менее 95%:

№ п/п	Название образца	Концентрация белка в образце, мг/мл	% целлюлозы в образце
1	ESAT6-CBD	3,33	нет
2	CBD	1,36	нет
3	ESAT6-CBD-целлюлоза	2,1	2,8
4	CBD-целлюлоза	5,6	2,8
5	целлюлоза	нет	2,8

Пример 4. Способ проверки иммуногенности комплексных препаратов Ag-CBD-целлюлоза на мышах.

Самкам мышей инбредной линии мышей I/St, генетически чувствительных к туберкулезу (Nikonenko BV, Averbakh MM, Lavebratt С, Schurr E, Apt AS. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice. Tubercle Lung Dis, 2000, 80:15-25), вводили подкожно с двухнедельным интервалом следующие препараты: 1) ESAT-6-CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию ESAT-6); 2) CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию CBD) - отрицательный контроль; 3) однократно вакцина BCG (10 ⁶ КОЕ на мышь) - положительный контроль. Через 5 недель оценивали содержание в селезенках Т-лимфоцитов, продуцирующих ИФН-гамма в присутствии соответствующих антигенов в культуральной жидкости методом ELISPOT, с подсчетом клеток, реагирующих с антителами анти-ИФН-гамма, через 60 часов после начала культивирования. Результаты приведены в таблице:

Вакцинация	Количество продуцентов ИФН-гамма на 1 млн. клеток селезенки
Без антигена в культуре	10 мкг/мл антигена в культуре*
ESAT-6-CBD-целлюлоза	20±5	82±13
BCG	31±3	70±7
CBD-целлюлоза	4±2	17±3
*В контрольных группах (вакцинация BCG и CBD-целлюлозой) в качестве антигена использовался ультразвуковой дезинтеграт микобактерий, т.е. смесь многих антигенов, поскольку стимуляция BCG поликлональна.

Результаты показывают, что вакцинация моноантигенами, связанными с целлюлозой через CBD-домен, приводит к специфической активации продуцентов ИФН-гамма. Вакцинация теми же антигенами, в тех же количествах, но без адсорбции на целлюлозе, не вызывает иммунного ответа (данные не приводятся).

Пример 5. Способ проверки защитного эффекта против туберкулеза комплексных препаратов Ag-CBD-целлюлоза на мышах.

Мышей инбредной линии C57BL/6 вакцинировали препаратом ESAT-6-CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию ESAT-6); CBD-целлюлоза (10 мкг на мышь по содержанию CBD - отрицательный контроль; 1) физиологическим раствором (отрицательный контроль 2) дважды, подкожно, с интервалом 2 недели. Через 5 недель после второй вакцинации мышей заражали внутривенно в дозе 5×10⁶ КОЕ вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv. Через 4 недели после заражения из каждой группы забивали по 4 мыши и проводили оценку размножения микобактерий в легких и селезенке методом посева гомогенатов органов на агар Дюбо с последующим подсчетом колоний. Оставшиеся мыши (8 в каждой группе) наблюдались для определения кривых выживания. Результаты приведены на фиг.3. Установлено, что вакцинация специфическими антигенами на целлюлозном сорбенте достоверно снижает число микобактерий в органах (Фиг.3А, Р<0,01, непарный тест Стьюдента) и продлевает срок жизни зараженных животных (Фиг.3Б, Р<0,01, критерий Гохана для кривых выживания).

Оценка параметров иммунного ответа у мышей:

- Пролиферативная активность Т-лимфоцитов CD4⁺ в тестах in vitro;

- Увеличение в результате иммунизации количества клеток иммунной системы, продуцирующих ИФН-гамма;

- Снижение количества вирулентных микобактерий в легких и селезенке зараженных мышей;

- Увеличение сроков выживания мышей после заражения.