способ количественного определения уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот в крови методом газохроматографического анализа

Формула изобретения

1. Способ количественного определения уксусной, пропионовой, изо-масляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот в крови методом газохроматографического анализа, характеризующийся тем, что пробу крови подкисляют 1%-ным раствором серной кислоты до рН 2-3, осуществляют экстракцию определяемых кислот изобутиловым спиртом, объем которого соотносится с объемом пробы крови как 1:1, проводят центрифугирование для отделения белков, добавляют 2-3 капли 0,4%-ного раствора щелочи и экстракт выпаривают досуха, далее к сухому осадку последовательно добавляют 1%-ный раствор серной кислоты и изобутиловый спирт и осуществляют газохроматографическое разделение смеси кислот на капиллярной колонке с пламенно-ионизационным детектором, а количество каждой кислоты устанавливают по калибровочному графику.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что добавление к сухому остатку 1%-ного раствора серной кислоты производят в объеме 1:40, а изобутилового спирта - 1:20 к объему пробы крови соответственно.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что экстракцию определяемых кислот изобутиловым спиртом производят в течение 5-10 мин.

4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что центрифугирование производят при 6000 об/мин в течение 10 мин.

5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что газохроматографическое разделение смеси кислот на капиллярной колонке с пламенно-ионизационным детектором осуществляют с использованием аппаратно-программного комплекса на базе газового хроматографа "Кристалл-2000" с детектором ионизации в пламени на капиллярной колонке HP-FFAP - 50м×0,32мм×0,5мкм при температурном режиме: колонка - от 70°С-160°С-180°С-280°С; испаритель - 250°С; детектор - 280°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 40 см³/мин; расход газа-носителя 2 (азот) - 14-30 см³/мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения уксусной, пропионовой, изо-масляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот в крови для целей диагностики гастродуоденита.

Известен способ определения летучих жирных кислот (уксусной, пропионовой, масляной, изо-масляной, изо-валериановой, валериановой, капроновой и изо-капроновой) и малонового диальдегида в биологических средах на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором с программированием температурного режима от 60 до 220°С со скоростью 10°С в 1 мин. Время анализа 45 мин (авт. св-во СССР № 1725095 от 29.06.89). Согласно известному способу производят отбор проб экссудата в количестве 1-2 мл, пробу помещают в специальный герметично закрытый флакон, заполненный бескислородным газом (смесью азота 85%, водорода 10% и углекислого газа 5%). Затем проводят анализ равновесной паровой фазы. Для этого во флакон с исследуемой пробой добавляют кристаллический бисульфат калия, закрывают флакон резиновой пробкой с фторопластовой прокладкой и помещают его в специальный патрон для герметизации. Проводят термостатирование при 90°С в течение 10 мин. Затем через дозирующую иглу пневматического дозатора проба вводится в колонку хроматографа. Пики на хроматограммах исследуемых образцов экссудата идентифицируются путем сравнения времени их выхода со временем выхода пиков исследуемых кислот и малонового диальдегида при аналогичном исследовании стандартного образца.

Также известен способ количественного определения органических кислот и ангидридов при их совместном присутствии с применением метода газовой хроматографии (авт. св-во СССР № 347656 от 11.03.1969 г.), заключающийся в том, что анализируемую пробу перед хроматографированием последовательно обрабатывают эфирным раствором диазометана, а затем смесью этилового спирта, диэтилсульфата и серной кислоты при нагревании. При этом из кислот под действием диазометана образуются метиловые эфиры, а из ангидридов под действием этилового спирта и диэтилсульфата - этиловые эфиры. Полученную смесь хроматографируют.

Известен способ определения уксусной, пропионовой и масляной кислот в слюне для диагностики хронического гастродуоденита и функциональной диспепсии у детей (патент РФ № 2270610 от 04.08.2004 г.). Согласно этому способу производят подготовку пробы слюны путем подкисления 1 мл слюны одной каплей 10% серной кислоты. Газохроматографическое разделение анализируемых кислот проводят на стеклянной колонке длиной 1 м, диаметром 3 мм, заполненной Порапак Q (США) с нанесенной на него ортофосфорной кислотой, в изотермическом режиме при температуре в колонке 200°С, хроматограф МОЗХ - модель 3700. Детектор пламенно-ионизационный, газ-носитель - гелий. В результате анализа слюны у обследованных детей авторы установили, что у здоровых детей концентрация уксусной кислоты в слюне составила 0,60 мг/дм³, пропионовой кислоты - 0,296 мг/дм³, масляной кислоты - 0,528 мг/дм ³. У детей с функциональной диспепсией содержание уксусной кислоты в слюне составило 54,64 мг/дм³, пропионовой кислоты - 11,11 мг/дм³, масляной кислоты - 1,14 мг/дм ³. У детей с хроническим гастродуоденитом уксусная кислота в слюне обнаружена в концентрации 474,3 мг/дм³, пропионовой кислоты - 49,6 мг/дм³, масляной кислоты - 50,2 мг/дм ³.

В автореферате на соиск. уч. степени д-ра мед. наук Быкова И.Л. Молекулярные механизмы и патогенетическая роль нарушений обмена L-карнитина. Новосибирск, 2006 г. предлагается определять концентрацию короткоцепочечных жирных кислот в тканях и физиологических жидкостях методом газовой хроматографии после экстракции диэтиловым эфиром с н-валериановой кислотой в качестве внутреннего стандарта. Диапазон обнаруживаемых концентраций пропионовой кислоты в тканях и плазме крови составляет 5,03-6,07 мг/дм ³, изо-масляной кислоты - 1,41-2,03 мг/дм³.

В источнике информации: Досон Р., Эллиот Д., Джонс К. Бумажная и тонкослойная хроматография в биохимии. Методики разделения. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991 г., с.379 используют бумажную хроматографию для разделения муравьиной, уксусной, пропионовой, масляной, валериановой и капроновой кислот. Хроматографию проводят в растворителе, содержащем летучее основание, например МН ₃, этиламин. В случае смешанного растворителя этанол: 3 М NH₃=95:6 коэффициент удерживания составляет 0,31 для муравьиной кислоты, 0,33 - для уксусной кислоты, 0,44 - для пропионовой кислоты, 0,54 - для масляной кислоты, 0,60 - для валериановой кислоты и 0,68 - для капроновой кислоты. Детекцию кислот осуществляют рН-индикаторными методами с использованием 0,04%-ного раствора бромкрезолового зеленого в этиловом спирте или воде, или 0,04%-ного раствора бромкрезолового пурпурного в смеси формалин: этанол = 1:5 с рН 5, или 0,1%-ного водного раствора тимолового синего. Чувствительность определения 5 мкг. Недостатком указанного метода является полуколичественное определение кислот и невысокая чувствительность определения.

Также известна методика определения летучих жирных кислот (ЛЖК) методом газожидкостной хроматографии, описанная в книге авторов Мазанковой Л.Н., Ильиной Н.И., Кондраковой О.А., Затевалова A.M. «Оценка нарушений микробиоценоза при острых кишечных инфекциях у детей и их коррекция. Трудн. Пациент.» 2004; 2(9): 11-6. Для определения ЛЖК предлагается использовать инфильтрат пробы. Получение инфильтрата проходит по следующей схеме: в одноразовой пластиковой пробирке взвешивают 2-3 грамма содержимого пробы на аналитических весах с точностью до 3-го знака, к пробе приливают 1 мл 0,02 N соляной кислоты, 1 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного вещества. Пробирку закрывают притертой пробкой и гомогенизируют смесь путем энергичного встряхивания. Если необходимо определить концентрацию ЛЖК в крови, в смесь добавляют так же 0,5 мл 0,01 N перхлоратной кислоты. Пробирку с гомогенной смесью центрифугируют 10 минут при 6000 об/мин. Полученный инфильтрат должен быть прозрачным, иметь кислую реакцию. Хроматографирование проводится при температуре термостата 140°С, испарителя 240°С. Одноразовым стеклянным капилляром отбирается микроколичество надосадочной жидкости пробы. Капилляр запаивается с одной стороны и прикрепляется к специальному устройству ввода пробы, с помощью которого капилляр помещают в испаритель и запускают программу считывания хроматограммы.

Также известен способ газожидкостной хроматографии количественного определения уксусной, пропионовой и масляной кислот в крови детей с вирусным гепатитом (Акайзин Э.С., Золотарев Д.В., Акайзина М.А., Баликин В.Ф. «Короткоцепочечные жирные кислоты в крови у детей с вирусным гепатитом», Ивановская гос. мед. Академия Минздравсоцразвития России, г.Иваново, 2005 г.). Согласно известному способу исследования проводились на хроматографе МОЗХ модель 3700 с пламенно-ионизационным детектором. Хроматографическое разделение кислот проводили на стеклянной колонке длиной 1 м, диаметром 3 мм, заполненной Порапаком Q (США) с нанесенной на него ортофосфорной кислотой. Температура колонки 200°С, испарителя - 250°С. Скорость газа-носителя (гелия) 25 мл/мин. У здоровых детей уксусная кислота в крови обнаруживалась в концентрациях 0,040-0,222 мг/дм³, пропионовая - 0,0148-0,362, масляная - 0,024-0,077 мг/дм³. У пациентов с вирусным гепатитом содержание кислот в крови увеличивалось.

Недостатком указанного способа является невысокая чувствительность уксусной кислоты в крови 0,04 мг/дм³ , пропионовой - 0,015 мг/дм³, масляной - 0,024 мг/дм ³. Определению масляной кислоты мешает изо-масляная кислота.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в повышении чувствительности и точности способа определения уксусной, пропионовой, изо-масляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот при их совместном присутствии в крови.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения уксусной, пропионовой, изо-масляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот в крови методом газохроматографического анализа, согласно которому пробу крови подкисляют 1%-ным раствором серной кислоты до рН 2-3, осуществляют экстракцию определяемых кислот изобутиловым спиртом, объем которого соотносится с объемом пробы крови как 1:1, проводят центрифурирование для отделения белков, добавляют 2-3 капли 0,4%-ного раствора щелочи и экстракт выпаривают досуха, далее к сухому осадку последовательно добавляют 1%-ный раствор серной кислоты и изобутиловый спирт и осуществляют газохроматографическое разделение смеси кислот на капиллярной колонке с пламенно-ионизационным детектором, а количество каждой кислоты устанавливают по калибровочному графику.

Добавление к сухому остатку 1%-ного раствора серной кислоты производят в объеме 1:40, а изобутилового спирта - 1:20 к объему пробы крови соответственно.

Экстракцию определяемых кислот изобутиловым спиртом производят в течение 5-10 мин.

Центрифугирование производят при 6000 об/мин в течение 10 мин.

Газохроматографическое разделение смеси кислот на капиллярной колонке с пламенно-ионизационным детектором осуществляют с использованием аппаратно-программного комплекса на базе газового хроматографа "Кристалл-2000" с детектором ионизации в пламени на капиллярной колонке HP-FFAP - 50 m*0,32 mm*0,5 µm при температурном режиме: колонка - от 70°С-160°С-180°С-280°С; испаритель - 250°С; детектор - 280°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 40 см³/мин; расход газа-носителя 2 (азот) - 14-30 см³/мин.

Экспериментальным путем обнаружено, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, при реализации которых и достигается высокая чувствительность и точность определения указанных короткоцепочечных жирных кислот при их совместном присутствии.

В лабораторных условиях был проведен ряд опытов для установления существенности признаков, положенных в основу предлагаемого способа.

Пример. Согласно заявляемому способу брали 2 см ³ крови, содержащей уксусную, пропионовую, изо-масляную, масляную, валериановую, изо-капроновую и капроновую кислоты, подкисляли ее 1%-ным раствором серной кислоты до рН 2-3, экстрагировали 2 см³ изобутилового спирта в течение 5-10 мин. Для денатурации белков экстракт центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин, затем прибавляли 2-3 капли (0,1 см³ ) 0,4%-ного раствора щелочи (натриевой или калиевой), упаривали досуха, сухой остаток подкисляли 0,05 см³ 1%-ным раствором серной кислоты и прибавляли 0,1 см³ изо-бутилового спирта. Далее проводили количественное определение кислот в подготовленных пробах газохроматографическим методом по калибровочному графику с использованием аппаратно-программного комплекса на базе газового хроматографа "Кристалл-2000" с детектором ионизации в пламени. Полнота разделения уксусной, пропионовой, изо-масляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот достигнута на капиллярной колонке HP-FFAP - 50 m*0,32 mm*0,5 µm при температурном режиме: колонка - от 70°С-160°С-180°С-280°С; испаритель - 250°С; детектор - 280°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 40 см³/мин; расход газа-носителя 2 (азот) - 14-30 см³/мин.

Для построения калибровочного графика использовали следующую методику. В мерную пробирку объемом 10 см³, содержащую изо-бутиловый спирт в объеме 5 см³, вводят 15 мм³ (мкл-микролитр) уксусной, по 10 мм пропионовой, изо-масляной и масляной кислот и по 5 мм ³ валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот. Содержание в исходном аттестованном растворе составляет для уксусной кислоты - 3120 мкг/см³, пропионовой - 1996 мкг/см³ , изо-масляной кислоты - 1916 мкг/см³, масляной кислоты - 1918 мкг/см³, валериановой кислоты - 930 мкг/см ³, изо-капроновой кислоты - 923 мкг/см³, капроновой кислоты - 923 мкг/см³. Срок хранения аттестованного раствора составлял 12 час.

Градуировочную характеристику устанавливали методом абсолютной калибровки. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (мм²) от массы (мкг) и строится по 5 сериям рабочих стандартных растворов. Каждую серию, состоящую из 5 стандартных растворов, готовят в мерных пробирках объемом 10 см³. Для этого в каждую пробирку вносят уксусной кислоты, пропионовой кислоты, изо-масляной кислоты, масляной кислоты, изо-капроновой кислоты, капроновой кислоты, валериановой кислоты в соответствии с таблицей 1 и доводят изо-бутиловым спиртом до 2 см³. Полученные экстракты - стандартные растворы хроматографируют на хроматографе с детектором ионизации в пламени. Отработка оптимальных газохроматографических параметров для определения указанных кислот в крови осуществлялась с использованием аппаратно-программного комплекса на базе газового хроматографа "Кристалл-2000" с детектором ионизации в пламени. Полнота разделения уксусной, пропионовой, изо-масляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот достигнута на капиллярной колонке HP-FFAP - 50 m*0,32 mm*0,5 µm при температурном режиме: колонка - от 70°С-160°С-180°С-280°С; испаритель - 250°С; детектор - 280°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 40 см³/мин; расход газа-носителя 2 (азот) - 14-30 см³/мин.

В процессе исследований по выбору экстрагента (органического растворителя) для извлечения летучих жирных кислот из крови были апробированы следующие растворители: бензол, этиловый спирт, диэтиловый эфир, гексан, изо-бутиловый спирт и неорганические кислоты: соляная, фосфорная, серная.

Максимальная степень экстракции изучаемых кислот из проб крови была достигнута при использовании серной кислоты, которую применяли в дальнейших исследованиях.

В ходе экспериментальных работ по выбору экстрагента использовали ряд органических растворителей и изучали зависимость степени экстракции от типа неорганических кислот и природы органических растворителей результаты приведены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что только при использовании изо-бутилового спирта наряду с серной кислотой при совокупности всех заявленных операциях предлагаемого способа обеспечивается максимальное извлечение (наибольшая степень экстракции) указанных кислот из пробы крови при подобранных оптимальных условиях газохроматографического анализа.

Предлагаемым способом было исследовано ряд проб крови с различным содержанием в них уксусной, пропионовой, изо-масляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот.

В результате проведенного эксперимента установлено, что наибольшее извлечение изучаемых кислот из крови происходит при экстракции изо-бутиловым спиртом в кислой среде (рН 2-3), при добавлении 0,4%-ного раствора щелочи (для перевода кислот в соли), центрифугирования, упаривании досуха, подкислении упаренного экстракта 1%-ным раствором серной кислоты, причем в объемном соотношении к пробе крови как 1:40 и введении изо-бутилового спирта в объемном соотношении к пробе крови как 1:20. Причем отступление от указанных объемных соотношений в меньшую или большую стороны приводило к увеличению погрешности определения.

Методика выполнения измерений с помощью предлагаемого способа обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в таблицах 3 и 4. Данные, приведенные в таблицах 3 и 4, показывают, что чувствительность определения в анализируемом объеме пробы крови при совместном присутствии составила для: уксусной кислоты - 0,003 мкг; пропионовой кислоты - 0,002 мкг; изо-масляной кислоты - 0,001 мкг; масляной кислоты - 0,001 мкг; валериановой кислоты - 0,0005 мкг; изо-капроновой кислоты - 0,0005 мкг; капроновой кислоты - 0,0005 мкг.

Погрешность определения составила для уксусной кислоты - 17,66%; пропионовой кислоты - 13,93; изо-масляной кислоты - 19,06%; масляной кислоты - 11,21%; валериановой кислоты - 15,64%; изо-капроновой кислоты - 17,56%; капроновой кислоты - 20,76%, даже при их совместном присутствии.

Применение предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения по уксусной, пропионовой кислоте и масляной кислот в 2 раз (по сравнению с известным методом). Также следует отметить, что из уровня техники неизвестна методика определения такого круга кислот в крови при их совместном присутствии.

Предлагаемый способ доступен в исполнении и может быть рекомендован при клинических исследованиях в лабораторных условиях.

Таблица 1
Стандартные растворы для установления калибровочного графика
Номер смеси	1	2	3	4	5
Уксусная кислота Объем исходного станд. Раствора, см3	2	3	5	7	10
Концентрация уксусной кислоты, мкг/см3	3,12	4,68	7,8	10,92	15,6
Пропионовая кислота Объем исходного станд. Раствора, см3	2	3	5	7	10
Концентрация пропионовой кислоты, мкг/см3	1,996	2,99	4,99	6,99	9,98
Изо-масляная кислота Объем исходного станд. Раствора, см3	2	3	5	7	10
Концентрация Изо-масляной кислоты, мкг/см3	0,96	2,87	4,79	6,71	9,58
Маслянная кислота Объем исходного станд. раствора, см3	2	3	5	7	10
Концентрация Масляной кислоты, мкг/см3	0,959	2,88	4,79	6,71	9,59
Валериановая кислота Объем исходного станд. раствора, см3	2	3	5	7	10
Концентрация Валериановой кислоты, мкг/см3	0,47	1,39	2,33	3,26	4,65
Изо-капроновая кислота Объем исходного станд. раствора, см3	2	3	5	7	10
Концентрация Изо-капроновой кислоты, мкг/см3	0,46	1,39	2,31	3,23	4,62
Капроновая кислота Объем исходного станд. раствора, см3	2	3	5	7	10
Концентрация Капроновой кислоты, мкг/см3	0,46	1,39	2,31	3,23	4,62

Таблица 2
Средние значения полноты экстракции уксусной, изо-масляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот из пробы крови от природы органических растворителей и типа неорганических кислот
Компонент	Органический растворитель
Гексан	Изо-бутиловый спирт
Тип неорганической кислоты
2% H2SO4	1% H2SO4	0,5% H2SO4	2% H2SO4	1% H2SO4	0,5% H2SO4
Степень экстракции, %
1. Уксусная кислота	25±2,050	25±2,00	20±2,717	59±4,052	60±4,905	55±3,312
2. Пропионовая кислота	39±2,134	35±2,35	30±2,13	50±4,23	65±5,99	45±3,391
3. Изо-масляная кислота	32±2,25	29±1,95	35±2,99	80±2,756	88±6,82	75±6,73
4. Масляная кислота	30±1,299	30±2,052	25±2,120	75±7,42	82±7,5	70±2,251
5. Валериановая кислота	35±2,92	33±2,82	39±3,00	82±6,85	91,3±8,13	89±8,1
6. Изо-капроновая кислота	28±2,12	29±1,95	40±2,95	80±7,21	95,5±8,65	90±8,32
7. Капроновая кислота	27±1,99	30±2,05	35±2,33	85±7,09	88±7,54	84±7,23

Таблица 3
Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, воспроизводимости при реализации предлагаемого способа
Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/см3	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), r, %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости) %	Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности Р=0,95), ± , %
Уксусная кислота, от 3 до 16 вкл.	19,11	4,71	17,66
Пропионовая кислота, от 2 до 10 вкл.	4,48	5,99	13,93
Изо-масляная кислота, от 1 до 10 вкл.	6,18	4,46	19,06
Масляная кислота, от 1 до 10 вкл.	5,61	4,83	11,21
Валериановая кислота, от 0,5 до 5,0 вкл.	4,47	5,02	15,64
Изо-капроновая кислота, от 0,5 до 5,0 вкл.	3,53	3,93	17,56
Капроновая кислота, от 0,5 до 5,0 вкл.	3,39	4,27	20,76

Таблица 4
Значения пределов повторяемости и воспроизводимости при реализации предлагаемого способа (при доверительной вероятности Р=0,95)
Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/см3	Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами параллельных определений), rn, %	Предел внутрилабораторной воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории, но в разных условиях), %
Уксусная кислота, от 3 до 16 вкл	12,94	1,31
Пропионовая кислота, от 2 до 10 вкл.	12,41	1,66
Изо-масляная кислота, от 1 до 10 вкл. от	17,12	1,24
Масляная кислота, от 1 до 10 вкл.	15,53	1,34
Валериановая кислота, от 0,5 до 5,0 вкл.	12,39	1,39
Изо-капроновая кислота, от 0,5 до 5,0 вкл.	9,77	1,09
Капроновая кислота, от 0,5 до 5,0 вкл	9,38	1,18