способ получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума

Формула изобретения

1. Способ получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума, включающий выделение антигенного комплекса и сенсибилизацию им эритроцитов, отличающийся тем, что для оптимального образования и выделения экстрацеллюлярных антигенов культуру H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста культивируют на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 мес., после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры, стерилизуют через мембранные фильтры, после чего осуществляют контроль стерильности и затем осаждают находящиеся в среде культивирования экстрацеллюлярные антигены охлажденным до -20°С двух-трехкратным объемом ацетона, полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают при тех же соотношениях новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают при 37°С, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу выделенного антигена и используют его для получения эритроцитарного диагностикума.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сенсибилизацию эритроцитов проводят в 0,01 М фосфатно-буферном растворе рН 5,9 при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч с последующей фиксацией путем добавления в реакционную смесь 1 об.% формалина с инкубацией в течение 30 мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к производству диагностикумов, используемых для выявления антител к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в реакции непрямой гемагглютинации.

Для определения антител к возбудителям особо опасных микозов известны диагностикумы, приготовленные с применением бараньих эритроцитов, обработанных танином [1, 4], с последующей конъюгацией их с полисахаридным антигенным комплексом, выделенным из клеток микромицетов бета-нафтольным методом [2].

1. Наиболее близким аналогом является препарат, описанный в статье Липницкого А.В. с соавт. [1] (прототип).

Однако известные препараты отличает относительно низкая стабильность, недостаточная воспроизводимость способа приготовления диагностикума, а также трудоемкость и длительность процесса выделения антигенов из клеточной массы грибов - возбудителей особо опасных микозов [2].

На сегодняшний день остается актуальным создание высокочувствительных эритроцитарных диагностикумов, пригодных для применения в условиях чрезвычайных ситуаций.

Цель изобретения - выделение антигенного комплекса, не требующего дополнительных этапов очистки, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, и создание на его основе антигенного эритроцитарного диагностикума, характеризующегося стабильностью и воспроизводимостью получаемых результатов.

Поставленная цель достигается за счет использования в качестве сенситина не полисахаридных антигенов, экстрагированных из клеточной массы грибов (см. прототип), а экстрацеллюлярного комплекса, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, способ выделения которого и сенсибилизация им эритроцитов характеризуются тем, что для оптимального образования и выделения экстрацеллюлярных антигенов культуру H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста культивируют на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 месяцев, после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры и стерилизуют через мембранные фильтры, осуществляют контроль стерильности, а затем осаждают находящиеся в среде культивирования антигены охлажденным до -20°С двух-трехкратным объемом ацетона; полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают при тех же соотношениях новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают при 37°С, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу выделенного антигена и используют последний при получении эритроцитарного диагностикума.

Полученный антиген не требует лиофилизации, относительно легко поддается точному дозированию, не содержит остатков дезинфицирующих средств, длительно хранится без потери серологической активности и обеспечивает высокую воспроизводимость метода. Таким образом, единовременно приготовленный в достаточном количестве экстрацеллюлярный антигенный комплекс может обеспечить получение стандартного диагностикума со стабильными свойствами в течение ряда лет.

В качестве жидкой питательной среды культивирования используют синтетическую солевую среду Смита [3]. Такой бульон не содержит в своем составе белково-пептонных компонентов питательной среды, что позволяет получить экстрацеллюлярный антиген для его дальнейшего использования без дополнительных этапов очистки. Сухой антиген для сенсибилизации растворяют в 0,01 М фосфатно-буферном растворе, рН 5,9. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. Данные параметры оптимизируют сенсибилизацию эритроцитов, улучшают качество препарата и, в конечном итоге, повышают чувствительность РИГА.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение антигенного комплекса из культурального фильтрата H.capsulatum G185P. Культивирование штамма проводят в синтетической солевой среде Смита, приготовленной по следующей прописи:

1. L-аспаргин	7,0 г
2. Хлористый аммоний	7,0 г
3. Калий фосфорнокислый однозамещенный	1,31 г
4. Цитрат натрия	0,9 г
5. Магний сернокислый	1,5 г
6. Железо лимоннокислое	0,3 г
7. Глюкоза	10 г
8. Глицерин	25 г
9. Вода	до 1 л

Среду стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 минут.

Приготовленную среду разливают по 600-800 мл в бактериологические матрацы, куда вносят культуру H.capsulatum G185P в мицелиальной фазе роста 5 мл в концентрации 5-10×10⁶ м.т./мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им Л.А.Тарасевича. Матрацы в горизонтальном положении инкубируют в термостате при 26-28°С в течение 3 месяцев. Биомассу отделяют от среды методом фильтрования через ватно-марлевый и мембранный стерилизующий фильтры. После проведения контроля стерильности комплекс антигенов осаждают из фильтрата путем добавления к последнему 2-3 объемов охлажденного до -20°С ацетона. Осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают в термостате при 37°С.

Полученный сухой антигенный комплекс используют при определении оптимальной сенсибилизирующей дозы антигена и получения диагностикума.

Пример 2. Приготовление диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного. Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса.

Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса проводят с использованием формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Осадок, полученный из 5 мл 2,5% взвеси эритроцитов, суспендируют в таком же объеме 0,01 М фосфатно-буферного раствора, рН 5,9, в который добавлены навески 50, 100, 200, 400 мкг/мл сухого антигенного комплекса соответственно. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. После трехкратного отмывания эритроциты доводят до концентрации 2,5 об.% в 0,15 М растворе хлористого натрия, рН 7,2, и используют в реакции непрямой гемагглютинации. Оптимальная сенсибилизирующая доза составила 100 мкг/мл, которая обусловливала чувствительность РИГА с контрольной гистоплазмозной сывороткой серии 2-1 в титрах 1:20480 с четкими отрицательными контролями.

Приготовление рабочих серий диагностикума проводят по вышеописанной методике при больших объемах реагентов. При этом оптимальную сенсибилизирующую дозу увеличивают в 2 раза (до 200 мкг/мл). Полученный диагностикум расфасовывают в ампулы в виде суспензии 10 об.% в протективной среде высушивания и подвергают лиофилизации.

Пример 3. Определение специфической активности диагностикума

Гистоплазмозные и кокцидиоидомикозные козьи иммунные сыворотки получали путем многоцикловой иммунизации продуцентов. Антигенами для иммунизации служили обеззараженные клетки мицелиальной фазы возбудителей H.capsulatum и C.immitis. При постановке РИГА сыворотки разводили 1:10 0,15 М раствором натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл в 1 об.% НКС и вносили одну каплю 2,5 об.% взвеси диагностикума. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Данные таблицы свидетельствуют о возможности применения диагностикума для определения уровня антител в иммунных сыворотках как к возбудителю гистоплазмоза (в титре до 1:40960), так и к возбудителю кокцидиоидомикоза (при некотором снижении титра).

Пример 4. Определение специфичности диагностикума

Для оценки специфичности были использованы иммунные сыворотки лабораторных животных (баранов, козлов, лошади), содержащие антитела к возбудителям сапа, мелиоидоза, чумы, а также сыворотки людей, больных микотическими инфекциями (кандидозом или инвазивным аспергиллезом), и нормальная сыворотка человека.

Гетерологичные сыворотки разводили 1:10 с помощью 0,15 М раствора натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл и использовали для постановки РИГА в макроварианте. Полученные результаты представлены в таблице 2 и свидетельствуют о том, что диагностикум, изготовленный по предложенному способу, способен выявлять группоспецифические антитела к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в титре от 1:160 и выше. Титры с более высокой концентрацией до 1:80 обусловлены перекрестно реагирующими антителами к гетерологичным антигенам, не имеющим диагностического значения.

Источники информации

1. Липницкий А.В., Валькова Е.Р., Вальков Б.Г. Разработка и применение реакции пассивной гемагглютинации и реакции нейтрализации антител при глубоких микозах. / Диагностика особо опасных инфекций. - Ростов на Дону. - 1968. - С.54-57 (прототип).

2. Дроздов А.И. Методы выделения антигенов из патогенных грибов (Методическое пособие). - Ленинград, 1971, 33 с.

3. Smith CD. Nutritional factors that are requaired for the grows and sporulation of Histoplasma capsulatum. / In Histoplasmosis . Proceeding of the Suond national conference / Ed. By A. Balows. - Springfild. - 1971. - P.64-70.

4. Валькова E.P., Липницкий A.B. Серологические показатели при экспериментальных глубоких микозах. // Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1970. - № 12. - С.55-59.

Таблица 1
Результаты определения специфической активности диагностикума
№ п/п	№ продуцента	Серия (цикл иммунизации)	Вид сыворотки	Серия диагностикума	Титр в РИГА	Контроль
1	2	1	Гистоплазмозная	2	1:40960	-
			3	1:20480	-
			4	1:20480	-
2	2	3	Гистоплазмозная	2	1:5120	-
			3	1:1280	-
			4	1:5120	-
3	2	4	Гистоплазмозная	2	1:10240	-
			3	1:5120	-
			4	1:10240	-
4	16	1	Гистоплазмозная	2	1:2560	-
			3	1:2560	-
			4	1:2560	-
5	16	2	Гистоплазмозная	2	1:10240	-
			3	1:2560	-
			4	1:10240	-
6	16	3	Гистоплазмозная	2	1:10240	-
			3	1:5120	-
			4	1:10240	-
7	18	1	Гистоплазмозная	2	1:5120	-
			3	1:2560	-
			4	1:2560	-
8	18	3	Гистоплазмозная	2	1:40960	-
			3	1:5120	-
			4	1:10240	-
9	18	5	Гистоплазмозная	2	1:40960	-
			3	1:20480	-
			4	1:20480	-
10	20	1	Гистоплазмозная	2	1:1280	-
			3	1:1280	-
			4	1:1280	-
	20	2	Гистоплазмозная	2	1:5120	-
11			3	1:1280	-
			4	1:2560	-
12	20	3	Гистоплазмозная	2	1:1280	-
			3	1:320	-
			4	1:2560	-
13	1	1	Кокцидиоидомикозная	2	1:1280	-
			3	1:320	-
			4	1:1280	-
14	1	3	Кокцидиоидомикозная	2	1:640	-
3	1:320	-
4	1:640	-

Продолжение таблицы 1
№ п/п	№ продуцента	Серия(цикл иммунизации)	Вид сыворотки	Серия диагностикума	Титр в РНГА	Контроль
			Кокцидиоидомикозная	2	1:320	-
15	1	4	3	1:160	-
			4	1:320	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:10240	-
16	9	1	3	1:5120	-
			4	1:5120	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:5120	-
17	9	5	3	1:2560	-
			4	1:5120	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
18	9	10	3	1:640	-
			4	1:1280	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:640
19	9	15	3	1:320	-
			4	1:2560	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
20	9	20	3	1:640	-
			4	1:1280	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
21	17	1	3	1:640	-
			4	1:1280	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
22	17	3	3	1:1280	-
			4	1:2560	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
23	17	6	3	1:640	-
			4	1:1280	-
			Кокцидиоидомикозная	2	1:2560	-
24	19	1	3	1:640	-
			4	1:1280	-
Условные обозначения: - отрицательный результат РИГА.
Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого», ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г.

Таблица 2
Результаты определения специфичности диагностикума
№ п/п	№ продуцента	Серия (цикл иммунизации)	Вид сыворотки	Серия диагностикума	Титр в РНГА	Контроль
	5574 (козел)		Мелиоидозная	2	1:80	-
1	2	3	1:40	-
		4	1:80	-
	5 (козел)		Мелиоидозная	2	1:40	-
2		14	3	1:20	-
			4	1:40	-
	7 (козел)		Мелиоидозная	2	1:20	-
3		21	3	-	-
			4	1:20	-
	6518 (баран)		Сапная	2	-	-
4	4	3	-	-
		4	-	-
	6518 (баран)		Сапная	2	-	-
5	12	3	-	-
		4	-	-
	2801 (козел)		Сапная	2	-	-
6	9	3	-	-
		4	-	-
	10 (баран)		Чумная	2	1:40	-
7		4	3	1:20	-
			4	1:40	-
	10 (баран)		Чумная	2	-	-
8		9	3	-	-
			4	-	-
	Кокетка (лошадь)	коммерческая	Чумная	2	1:20	-
9	3	-	-
	4	-	-
	Сыворотка больного	Клинич. диагноз: кандидоз	2	40	-
10	3	20	-
	4	40	-
	Сыворотка больного	Клинич. диагноз: кандидоз	2	40	-
11	3	1:20	-
	4	1:40	-
	Сыворотка больного	Клинич. диагноз: кандидоз	2	1:20	-
12	3	1:20	-
	4	1:20	-
	Сыворотка больного	Клинич. диагноз: аспергиллез	2	1:20	-
13	3	1:20	-
	4	1:20	-
	Нормальная сыворотка человека	-	2	1:20	-
14	3	-	-
	4	1:20	-
Условные обозначения: - отрицательный результат РНГА.
Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого» ФГЗУ Волгоград НИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г.