штамм вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов (варианты)

Формула изобретения

1. Штамм ПУУ-ТКД/VERO (PUU-TKD/VERO) вируса "ПУУМАЛА" (Puumala, род Hantavirus, семейство Bunyaviridae), депонированный под № 1026 в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН), адаптированный к размножению в культуре клеток почек зеленой мартышки VERO, предназначенный для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

2. Штамм ДОБ-EAT/VERO (DOB-EAT/VERO) вируса "ДОБРАВА" (Dobrava, род Hantavirus, семейство Bunyaviridae), депонированный под № 1027 в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН), адаптированный к размножению в культуре клеток почек зеленой мартышки VERO, предназначенный для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению штаммов-продуцентов, предназначенных для вакцинопрофилактики вирусных инфекций, а именно инфекции геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Возбудителями ГЛПС являются 4 вируса, из которых 2 вируса "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" циркулируют среди диких мышевидных грызунов и могут заражать людей, вызывая у них тяжелое заболевание, только на территории европейской части России и других европейских стран. В то же время два других вируса "ХАНТААН" и "СЕУЛ" существуют и заражают людей, как правило, только в азиатских странах, главным образом в Китае. Образцы вирусов, полученные в результате выделения вирусологическими методами из крови больных ГЛПС и органов погибших от ГЛПС людей или инфицированных животных, называются "ШТАММАМИ" вышеперечисленных вирусов-возбудителей ГЛПС. После детального изучения молекулярно-биологических характеристик штаммы могут быть использованы для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

В настоящее время коммерческие вакцины против ГЛПС производятся только в Китае, однако ни одна из этих вакцин не может применяться в европейских регионах России и других странах Европы, поскольку они производятся на основе вирусов "ХАНТААН" и "СЕУЛ", которые не обладают защитным действием против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА".

Известно, что трудности, связанные с разработкой вакцинных препаратов против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА", обусловлены особенностями репродукции штаммов этих вирусов в чувствительных клеточных системах. Для них характерен довольно длительный цикл размножения, низкий уровень продукции и отсутствие цитопатогенного действия. В связи с этим основное затруднение состоит в адаптации штаммов к разрешенной для вакцинного производства перевиваемой культуре клеток VERO. В настоящий момент в мировой практике не известно о существовании штаммов вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" с уровнем продукции вирусных частиц, достаточным для разработки профилактических препаратов.

Целью предлагаемого изобретения является получение впервые в мире штаммов вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА", способных к размножению в разрешенной для вакцинного производства перевиваемой культуре клеток VERO с накоплением вирусной массы в количествах, достаточных для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики ГЛПС.

В предлагаемом изобретении описаны вакцинные штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO, способные к размножению в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки, линии VERO (ATCC CCL-81) и используемые для накопления вирусной массы с целью изготовления профилактической вакцины против ГЛПС.

Методика выделения вирусных штаммов.

Клетки VERO-E6 выращивают на среде 2МЕМ с 5% телячьей сыворотки и по достижении 80-90% монослоя клеток используют для заражения штаммами ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА". Штаммы исходно были выделены в культуре клеток почек зеленой мартышки, линии VERO-E6 (ATCC CRL-13001): первый - из ткани легкого от погибшего больного ГЛПС во время вспышки ГЛПС в Башкирии в 1997 г., а второй из крови больного ГЛПС во время вспышки ГЛПС в Липецкой области в 2006 г.

В качестве поддерживающей рост клеток (после заражения) применяют ту же среду с 1% телячьей сыворотки. Для заражения клеток VERO-E6 используют 10% суспензию, приготовленную на среде 2МЕМ с 1% телячьей сыворотки из секционного материала легочной ткани погибшего больного, и цельную кровь, взятую в остром периоде болезни от больного ГЛПС. Через 10-12 дней культивирования при 37°С зараженные клетки снимают со стекла для выявления вирусспецифического антигена, после чего ими заражают свежие клетки. Выявление вирусного антигена осуществляют с помощью непрямого метода флюоресцирующих антител (МФА). Для приготовления препаратов для исследования в МФА клетки снимают со стекла смесью 0,02% версена и 2,5% трипсина, готовят суспензию инфицированных клеток (450-550 тыс кл/мл) и вносят ее по 0,005 мл в лунки предметных стекол для иммунофлюоресценции. После высушивания стекла помещают на 20 минут в охлажденный ацетон для фиксации клеток и затем высушивают при комнатной температуре. На готовые препараты наносят соответственно референт сыворотки от больных ГЛПС с антителами к известным вирусам-возбудителям ГЛПС в разведениях, начиная с 1:64 и заканчивая разведением, соответствующим титру сыворотки, а также нормальную сыворотку, не содержащую антител к возбудителям ГЛПС, в разведениях с 1:16 до 1:64. Препараты помещают во влажную камеру и инкубируют при 37±1°С в течение 30 мин (или при 6±2°С в течение 18 час). После окончания экспозиции препараты 3-кратно отмывают физиологическим раствором (0,85% NaCl), промывают дистиллированной водой, высушивают и наносят на них ФИТЦ-конъюгат против иммуноглобулинов человека. Препараты помещают во влажную камеру и инкубируют при 37±1°С в течение 30 мин. После чего их 3-х кратно промывают физиологическим раствором и 1-кратно дистиллированной водой, высушивают и исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, используя водно-иммерсионный объектив ×65. Аналогичные процедуры исследования клеток на присутствие вирусспецифического антигена повторяют с той же периодичностью после каждого из 5-6 пассажей инфицированных клеток. В случае обнаружения специфического антигена в клетках проводят сбор культурального вируса, который затем помещают на хранение в дъюар с жидким азотом.

После выделения и закрепления в 10 пассажах в культуре клеток VERO-E6 штаммы подвергают адаптированию к размножению в культуре клеток линии VERO.

Методика адаптации штаммов заключается в следующем.

Для первичного заражения клеток VERO используют вируссодержащую суспензию клеток VERO-E6, инфицированных штаммами ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06. Вирус (в ампулах или пробирках) извлекают из жидкого азота, оттаивают при комнатной температуре или в водяной бане (18±1)°С и разводят средой Игла MEM с двойным содержанием аминокислот и витаминов до концентрации, обеспечивающей множественность заражения 0,1-0,5 ФОЕ/клетку. Культуру клеток VERO перед заражением дважды отмывают рабочим раствором Хенкса, после чего в 1 л роллерную бутыль с монослоем клеток вносят 15 мл инокулята вируса. Для адсорбции вируса на клетки зараженные бутыли помещают в роллерную установку и инкубируют 1 час при температуре (37±1)°С. По истечении указанного времени в каждую бутыль вносят 100 мл поддерживающей среды Игла MEM с двойным содержанием аминокислот и витаминов (без добавления сыворотки крови плодов коров) и снова помещают в роллерную установку в термостатную комнату с температурой (37±1)°С. Сбор вируса осуществляют на 8-10 день с момента заражения клеток. Перед сбором вируса бутыли с зараженной культурой просматривают под микроскопом. Выбраковывают флаконы с признаками дегенерации клеток и бактериальной контаминацией. После удаления поддерживающей среды в зараженные флаконы вносят по 25-30 мл диспергента 0,02%-ный раствор версена, подогретого в термостате до температуры (36±1)°С. Поворачивая флакон, обмывают этим раствором весь монослой клеток, затем диспергент стерильно удаляют и обеззараживают автоклавированием. Культуру клеток оставляют при температуре (18±2)°С до тех пор, пока клетки не начнут отслаиваться от стекла. Отслоившиеся зараженные клетки ресуспендируют в минимальном объеме вируссодержащей культуральной жидкости, предварительно отобранной из флакона с зараженной культурой (15 мл на 1 литровый роллерный флакон). Клеточную взвесь из всех зараженных флаконов объединяют, 3-кратно замораживают при температуре минус (70±1)°С, оттаивают при температуре (18±2)°С и стерильно разливают по (1,5±0,1) мл в криогенные пробирки, маркируют и хранят при температуре минус (70±2)°С. Аналогичные процедуры применяют при последующих пассажах, при этом материалы каждого пассажа исследуют на содержание инфекционного вируса с помощью метода фокусобразующих единиц (ФОЕ). Монослой клеток VERO-E6, выращенных в 24-луночных панелях (фирма Costar), заражают 10-кратными разведениями вируссодержащей культуральной жидкости. После контакта с клетками при 37±1°С в течение 1 часа инокулят удаляют и вносят 0,6% метилцеллюлозное покрытие (800 мкл на лунку). После инкубации при 37±1°С в течение 6-8 суток полужидкое покрытие удаляют, клетки однократно отмывают 0,85% раствором NaCl. Для фиксации монослоя клеток вносят в лунки панели по 400 мкл 96° спирта и после 20 минутной экспозиции при комнатной температуре спирт удаляют, клетки 3-кратно по 10 мин отмывают 0,85% раствором NaCl и вносят в каждую лунку по 200 мкл специфической анти-"ПУУМАЛА" или анти-"ДОБРАВА" сыворотки в дозе 16-32 ед. После контакта при 37±1°С в течение 60 мин клетки 3-кратно по 5 мин отмывают 0,85% раствором NaCl, вносят в лунки по 200 мкл меченные пероксидазой антивидовые антитела или белок «А». После контакта в течение 60 мин при 37±1°С или 18 час при 6±2°С клетки 3-кратно по 10 мин отмывают 0,85% раствором NaCl и вносят индикатор пероксидазы хрена. В качестве субстрат-индикаторной системы применяют 0,05% диаминобензидин тетрахлорид с добавлением 0,02% NiCl ₂ и 0,01% Н₂О₂, после чего через 15-20 мин проводят учет опыта. Количество инфицированных колоний клеток в виде темно-серых пятен определяют визуально и титр вируса выражают в виде lg ФОЕ в 1 мл вносимого для инфицирования клеток образца.

На уровне 7-го пассажа в клетках VERO штаммы ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 очищают от клеточной ДНК путем обработки дезоксирибонуклеазой в концентрации 0,3 мкг/мл в оптимальных для этого фермента условиях. При этом по данным метода молекулярной гибридизации концентрация клеточной ДНК снижается до уровня менее 10 пг/мл. Далее, вирус концентрируют осаждением 7,5%-ным ПЭГ-6000 при (6±2)°С в течение (18±2) час и очищают зональным центрифугированием (25.000 об/мин, 3,5 час, 5°С) в градиенте плотности сахарозы (5-20%) с последующей фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Полученными материалами штаммов ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 заражают культуру клеток VERO. После достижения стабильного размножения вирусов с титрами не менее 5,5 lg ФОЕ/мл, штаммы ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 исследуют на видовую специфичность (с использованием непрямого МФА с моновалентными антигенами и реакции нейтрализации) и специфическую активность (иммуногенность) на мышах Balb/c.

Методика определения вируснейтрализующих антител.

Для определения вируснейтрализующих антител исследуемые сыворотки в 2-кратных разведениях смешивают с 50-100 ФОЕ каждого из взятых для идентификации вирусов "ПУУМАЛА" и ДОБРАВА" и инкубируют при 6±2°С в течение 18-20 часов. На монослой клеток VERO-E6, выращенных в 24 луночных панелях (Costar), вносят по 0,2 мл вируссывороточной смеси и инкубируют при 37±1°С в течение 1 часа. Затем добавляют метилцеллюлозное покрытие и через 6-7 дней инкубации при 37±1°С монослой фиксируют 96° спиртом. Образовавшиеся в культуре клеток фокусы выявляют с помощью твердофазного иммуноферментного метода, используя специфические анти-"ПУУМАЛА" и анти-"ДОБРАВА" сыворотки и меченный пероксидазой белок "А". В качестве индикаторной системы применяют 0,05% диаминобензидин тетрахлорид с добавлением 0,02% NiCl₂ и 0,01% H₂O ₂, после чего через 15-20 мин проводят учет опыта. Титр вируснейтрализующих антител определяют по 80% подавлению числа фокусобразующих единиц (ФОБ).

Методика определения специфической активности.

Предварительно из вируссодержащих жидкостей клеток VERO, инфицированных штаммами ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06, готовят инактивированные, концентрированные, очищенные и адсорбированные на гидроокиси алюминия препараты. Для иммунизации используют мышей линии Balb/c 9-10 недельного возраста, весом 18-20 г, которым вводят исследуемые препараты в объеме 0,5 мл подкожно 3-кратно с 2-недельным интервалом. В качестве контрольных используют мышей Balb/c, которым в те же сроки вводят адсорбент гидроокиси алюминия. Через 2 недели после последней инъекции у животных берут из орбитальной вены кровь и готовят из нее сыворотку. В полученных сыворотках крови определяют титр вируснейтрализующих антител к вирусам "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА", используя вышеописанный метод определения вируснейтрализующих антител.

При исследовании штаммов ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 в перекрестных опытах МФА и РН с прототипными штаммами вирусов "ПУУМАЛА", "ДОБРАВА", "СЕУЛ" и "ХАНТААН" подтверждена их видоспецифичность, а в опытах на мышах линии Balb/c - иммуногенная активность. Помимо результатов иммунологических исследований видоспецифичность штаммов подтверждена данными молекулярно-генетических исследований. Следовательно, по антигенным и молекулярно-биологическим свойствам штаммы ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 не отличаются от естественно циркулирующих в природе прототипных штаммов вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА".

Адаптированные к культуре клеток VERO вирусные штаммы ТКД/Уфа-97 и ЕАТ/Липецк-06 получили название вакцинных штаммов ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO. Штамм ПУУ-ТКД/VERO (PUU-TKD/VERO) вируса "ПУУМАЛА" (Puumala, род Hantavirus, семейство Bunyaviridae) депонирован 24 ноября 2009 г. под № 1026 в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН). Штамм ДОБ-EAT/VERO (DOB-TEA/VERO) вируса "ДОБРАВА" (Dobrava, род Hantavirus, семейство Bunyaviridae) депонирован 24 ноября 2009 г. под № 1027 в Государственной коллекции вирусов (НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН).

Морфологические характеристики варианта № 1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO и варианта № 2 - штамм ДОБ-EAT/VERO «Штамма вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов».

Вирионы имеют округлую форму с размером в диаметре от 90 до 120 нм. Липидосодержащая оболочка имеет выступы - пепломеры, длиной до 10 нм, сформированные вирионными гликопротеинами; вирусные частицы морфологически однородны. Вирионы располагаются в цитоплазме клетки, наибольшее их скопление наблюдается в цитоплазмитической сети и везикулах аппарата Гольджи. Плавучие плотности вирусных частиц в растворах сахарозы и хлорида цезия составляют 1.16-1.17 и 1,2-1,21 г/мл соответственно. Хантавирусы инактивируются растворителями липидов и термообработкой при температуре 50°С; стабильны в нейтральной среде при значениях рН от 5,5 до 8. Вирион проникает в клетку, прикрепляясь к ее поверхности участками одного или обоих наружных белков (G1 и G2), с последующим эндоцитозом. Предполагается, что необходимым условием проникновения вируса в клетку является закисление эндосом, что приводит к изменению конформации G1:G2 гетеродимеров и способствует слиянию клеточной и вирусной мембран.

Биотехнологические характеристики варианта № 1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO и варианта № 2 - штамм ДОБ-EAT/VERO «Штамма вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов».

Как известно, хантавирусы плохо размножаются даже в пермиссивных клеточных культурах. После заражения полученными в результате адаптации штаммами монослойной культуры клеток Vero получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей биомассы со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл, которая может быть использована для вакцинопрофилактики ГЛПС. Заявленные штаммовые варианты, получив в результате адаптации к размножению в клетках VERO способность накапливаться в высоких титрах в культуральной жидкости, сохранили свои основные характеристики, включая их иммуногенность. Иммуногенные свойства штаммовых вариантов определяли в опытах на мышах линии Balb/c по образованию вируснейтрализующих антител в ответ на введение подкожно 3-кратно с 2-недельным интервалом препаратов, приготовленных по схеме производства инактивированной цельновирионной вакцины, описанных в примерах 1 и 2. Методика определения вируснейтрализующих антител по подавлению фокусобразующих единиц (ФОЕ) была приведена в представленном описании (стр.4-5). Как видно из таблицы 1, заявленные штаммы обладают достаточно высокой иммуногенной активностью.

Таблица 1
Выявление нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей Balb/c
Разведения штаммовых вариантов	Титр нейтрализующих антител к штаммам
ПУУ-ТКД/VERO	ДОБ-EAT/VERO
Н/Р	145*	126
1/2	60	48
1/4	18,75	16,5
1/8	18,75	12
1/16	11,25	7,8
1/32	7,5	5
1/64	2,5	2,1
1/128	0	0
1/256	0	0
* - средний арифметический титр сыворотки (величина, обратная ее разведению), обеспечивающий подавление 50% ФОЕ/мл

Молекулярно-генетические характеристики варианта № 1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO и варианта № 2 - штамм ДОБ-EAT/VERO «Штамма вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом для изготовления вакцинных препаратов».

Геном вирусов представляет собой сегментированную одноцепочечную негативную РНК. Три сегмента генома - большой (L), средний (М) и малый (S) - кодируют вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу RdRp, поверхностные гликопротеины G1 и G2 и нуклеокапсидный белок N, соответственно. Каждый из геномных сегментов имеет единственную функционирующую открытую рамку считывания (ОРС). Вирусные белки - RdRp, G1, G2 и N - имеют молекулярные массы 200, 72, 56 и 45 кД соответственно. Все три сегмента хантавирусной РНК имеют на 3'-концах одну и ту же характерную короткую последовательность 3'-AUCAUCAUCUG- -5', отличающую их от других буньявирусов.

Подготовка образцов для сиквенирования включает: выделение тотальной РНК из лизата зараженных клеток VERO с помощью реагента Trizol(GibcoBRL), обратной транскрипции с использованием статистического гексануклеотида в качестве праймера, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в стандартных условиях с применением родоспецифических праймеров генома хантавирусов, комбинирование праймеров, комплементарных различным участкам малого и среднего сегментов генома, клонирование ПЦР-фрагментов с использованием вектора pCR 2.0 (ТА cloning kit; Invitrogen). Для каждого из образцов были приготовлены 3 клона, источником которых являлись различные колонии. Секвенирование проводили с использованием Sequenase version 2.0 (United States Biochemicals) в обоих направлениях.

В результате были получены следующие сиквенсы:

1) S сегмент генома варианта № 1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO

2) М сегмент генома варианта № 1 - штамм ПУУ-ТКД/VERO

3) S сегмент генома варианта № 2 - штамм ДОБ-EAT/VERO

4) М сегмент генома варианта № 2 - штамм ДОБ-EAT/VERO

Полученные штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO при размножении в разрешенной для вакцинного производства культуре клеток VERO могут быть использованы в качестве продуцентов вирусной массы при производстве инактивированной вакцины против ГЛПС.

Для лучшего понимания приведены следующие примеры.

Пример 1

Вируссодержащую культруральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ПУУ-ТКД/VERO вируса "ПУУМАЛА" в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл осветляют с помощью ультрафильтрационных кассет (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100000 Дальтон и площадью 0,2 м² , инактивируют формалином в концентрации 1:4000 при 6°С в течение 30 суток и концентрируют в 70-200 раз. Инактивированный концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 200±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.

Пример 2

Вируссодержащую культруральную жидкость получают путем репродуцирования штамма ДОБ-EAT/VERO вируса "ДОБРАВА" в монослойной перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (VERO). Монослой клеток получают в роллерных бутылях объемом 1 л в среде Игла MEM с двойным набором витаминов и аминокислот и 5% сыворотки крови плодов коров. После заражения монослойных культур для поддержки вирусного размножения используется среда, не содержащая компонентов сыворотки крови. Сбор вируссодержащей жидкости начинают на 6 день. С одного монослоя клеток получают от 3 до 5 сборов вируссодержащей жидкости. Полученную вируссодержащую жидкость со средним титром 5,5 lg ФОЕ/мл осветляют с помощью ультрафильтрационных кассет (Millipore) с молекулярным весом проходимых частиц 100000 Дальтон и площадью 0,2 м² , инактивируют формалином в концентрации 1:4000 при 6°С в течение 30 суток и концентрируют в 70-200 раз. Инактивированный концентрат очищают на колонке 2,6/70 с Сефарозой 6 Фаст Флоу со скоростью 7 мл/мин. Концентрация общего белка в очищенном концентрате составляет 200±50 мкг/мл. Очищенный инактивированный концентрат фильтруют через фильтр 0,22 мкм и используют для приготовления сорбированной на гидроокись алюминия моновалентной вакцины.

Вакцинные препараты, приготовленные по описанному выше способу, содержат допустимые количества балластных компонентов, таких как клеточный белок и дезоксирибонуклеиновая кислота, обладают иммуногенной активностью: сыворотки, полученные при 3-кратной иммунизации мышей Balb/c с интервалом 14 дней содержат антивирусные, в том числе вируснейтрализующие, антитела.

Штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO являются первыми в мире штаммами-продуцентами, которые могут быть применены для изготовления профилактических вакцин против вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА".

В результате адаптации штаммов ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO к размножению в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки VERO впервые получена система вирус/клетка-хозяин, используемая как источник вирусной массы для изготовления инактивированной вакцины против ГЛПС.

Штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO антигенно идентичны циркулирующим в природе прототипным штаммам вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" и вследствие этого пригодны для изготовления вакцинных препаратов для специфической профилактики ГЛПС.

Штаммы ПУУ-ТКД/VERO и ДОБ-EAT/VERO не теряют своих антигенных и инфекционных свойств при хранении в течение двух лет (срок наблюдения) при температуре минус 70°С. Создан значительный запас этих штаммов, которые могут быть использованы в качестве производственных штаммов вирусов "ПУУМАЛА" и "ДОБРАВА" для изготовления вакцинных препаратов против ГЛПС.