пептид, индуцирующий цитотоксические т-клетки (цтл), способ индукции цтл, антитело, связывающееся с этим пептидом, применение пептида в фармацевтической композиции и для лечения или предупреждения рака, антигенпредставляющая клетка

Формула изобретения

1. Соединение формулы (1)



где X представляет собой тирозиновый остаток или метиониновый остаток;

каждый из Y и Z независимо представляют собой простую связь;

R¹ представляет собой водород;

R² представляет собой гидроксил;

R³ представляет собой водород, амино, C_1-6 алкилкарбониламино, замещенный 1-2 заместителями, выбранными из группы, состоящей из карбокси и амино;

R⁴ представляет собой карбокси или группу формулы (2)



где W представляет собой аминокислотный остаток;

m равен 1 и

n равен целому числу 0-1, при условии, что, когда n равен 0, R³ представляет собой водород;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль,

где R ³ представляет собой водород или группу формулы (3)



где r равен целому числу 1-3, и

R ⁴ представляет собой карбокси или группу формулы (2')



где W' представляет собой глициновый остаток или -аланиновый остаток.

3. Соединение по п.2 или его фармацевтически приемлемая соль,

где R³ представляет собой группу формулы (3')



и

R⁴ представляет собой карбоксиметилкарбамоил.

4. Соединение по п.2 или его фармацевтически приемлемая соль,

где R³ представляет собой водород, и R⁴ представляет собой карбокси.

5. Соединение формулы (1')



где X' представляет собой тирозиновый остаток или метиониновый остаток,

R^1' представляет собой водород;

R^2' представляет собой гидроксил;

R^3' представляет собой амино, C_1-6 алкилкарбониламино, замещенный 1-2 заместителями, выбранными из группы, состоящей из карбокси и амино; и

R^4' представляет собой карбокси;

или его фармацевтически приемлемая соль.

6. Соединение формулы (4)



или его фармацевтически приемлемая соль.

7. Соединение формулы (5)



или его фармацевтически приемлемая соль.

8. Антитело, которое специфически связывается с соединением по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой солью.

9. Антигенпредставляющая клетка, которая представляет комплекс соединения по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли и антигена HLA-A24.

10. Способ индукции ЦТЛ соединением по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой солью.

11. Способ по п.10, в котором ЦТЛ узнает комплекс соединения по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли и антигена HLA-A24.

12. Способ по п.10, в котором ЦТЛ узнает комплекс пептида SEQ ID NO: 1 и антигена HLA-A24.

13. Фармацевтическая композиция для индукции ЦТЛ in vivo, включающая эффективное количество соединения по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемую соль или антигенпредставляющие клетки по п.9 вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

14. Фармацевтическая композиция по п.13, которую используют в качестве противораковой вакцины.

15. Применение соединения по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли или антигенпредставляющих клеток по п.9 для получения противораковой вакцины.

16. Лекарственное средство для иммунотерапии рака, включающее в качестве активного ингредиента эффективное количество соединения по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемую соль или антигенпредставляющие клетки по п.9.

17. Способ лечения или предупреждения рака, включающий введение пациенту, положительному на HLA-A24 и положительному на WT1, нуждающемуся в лечении или предупреждении рака, терапевтически или профилактически эффективного количества соединения по любому из пп.1-7 или его фармацевтически приемлемой соли, или антигенпредставляющих клеток по п.9.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к лечению противораковой вакциной, в особенности, к новому пептиду, применимому в качестве лечебного средства для иммунотерапии рака. В частности, настоящее изобретение относится к производному пептида ракового антигена, полученного из WT1, который обладает активностью по индукции ЦТЛ (CTL) in vivo и применим в качестве противораковой вакцины.

Уровень техники

Клеточно-опосредованный иммунитет, в особенности, цитотоксическими Т-клетками (далее в данном описании называемыми "ЦТЛ") играет существенную роль в отклонении in vivo раковых клеток или клеток, инфицированных вирусами. ЦТЛ узнают на раковой клетке комплекс пептида антигена ("пептида ракового антигена"), образовавшегося из белка ракового антигена, и антигена класса I ГКС (главного комплекса гистосовместимости), который называют "антигеном HLA" в случае человека, и атакуют и убивают клетку.

Вообще известно, что пептид ракового антигена, который связывается с молекулой класса I ГКС, представляет собой пептид из 8-12 аминокислотных остатков, полученный внутриклеточным процессингом белка. Таким образом, вообще, пептид с 8-12 аминокислотными остатками, образовавшийся из белка ракового антигена, может являться кандидатом в пептиды ракового антигена. Когда в пептиде ракового антигена присутствует глутаминовый остаток или цистеиновый остаток, такие аминокислотные остатки, как правило, спонтанно окисляются в воздушной атмосфере. Сообщается, что такое спонтанное окисление снижает аффинность связывания пептида с Т-клеточным рецептором (см. непатентные ссылки 1 и 2).

Опухолевый ген-супрессор WT1 опухоли Вильмса (ген WT1) выделен из хромосомы 11р13 как один из причинных генов опухоли Вильмса на основе анализа синдрома WAGR, который имеет место как осложнение опухоли Вильмса, аниридии, мочеполовых анормальностей, врожденного слабоумия и т.д., и аминокислотная последовательность WT1 достаточно известна (см. непатентную ссылку 3). Ген WT1 экспрессируется с высокой частотой при лейкозе человека, и когда лейкозные клетки обрабатывают антисмысловыми олигомерами WT1, рост клеток ингибируется. Таким образом, полагают, что ген WT1 действует, промотируя рост лейкозных клеток. Более того, ген WT1 также обильно экспресируется при солидных раковых опухолях, таких как рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, эмбриональный рак, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, цервикальный рак и рак яичников, и показано, что ген WT1 является новым белком ракового антигена при лейкозе и солидных раковых опухолях (см. непатентные ссылки 4 и 5). Кроме того, идентифицирован пептид ракового антигена с неполной последовательностью белка WT1, который является пептидом ракового антигена дикого типа (см. патентные ссылки 1 и 2).

В частности, WT1_235-243 (Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu; SEQ ID NO:1), который представляет собой пептид, перекрывающий позиции 235-243 белка ракового антигена WT1, является пептидом ракового антигена, обладающим активностью по индукции ЦТЛ по HLA-А24-ограниченному типу (см. непатентную ссылку 6 и патентную ссылку 1). Модифицированный пептид (Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu; SEQ ID NO:2, далее в описании он может называться WT1_235-243 (2М Y)), в котором метиониновый остаток в позиции 2 WT1 _235-243 заменен на тирозиновый остаток, имеет более высокую аффинность связывания в отношении антигена HLA-A24, чем пептид дикого типа (см. патентную ссылку 3). Предвещается разработка как пептида дикого типа WT1_235-243, так и модифицированного пептида WT1_235-243 (2М Y) в качестве иммунотерапевтического средства.

Кроме того, известно, что каждый из указанного пептида дикого типа и указанного модифицированного пептида имеет цистеиновый остаток в N-концевом сайте, окисление которого в воздушной атмосфере приводит к димерной связи через сульфидную связь, и указанный димер также может работать как пептид ракового антигена (см. патентную ссылку 4).

Патентная ссылка 1: WO 00/06602.

Патентная ссылка 2: WO 00/18795.

Патентная ссылка 3: WO 02/079253.

Патентная ссылка 4: WO 2004/063217.

Непатентная ссылка 1: Immunity, 6: 273, 1997.

Непатентная ссылка 2: J. Immunol., 160: 2099, 1998.

Непатентная ссылка 3: Cell, 60: 509, 1990.

Непатентная ссылка 4: J. Immunol., 164: 1873-80, 2000.

Непатентная ссылка 5: J. Clin. Immunol., 20: 195-202, 2000.

Непатентная ссылка 6: Clin. Cancer Res., 8: 2626, 2002.

Раскрытие изобретения

Проблема, которую решает изобретение

Проблемой, которую решает настоящее изобретение, является новый пептид, обладающий активностью по индукции ЦТЛ in vivo и применимый в качестве противораковой вакцины в иммунотерапии рака.

Способ решения проблемы

Авторы провели серьезные различные исследования по модификации пептидов ракового антигена WT1_235-243 и WT1_235-243 (2M Y), полученных из белка WT1, для того, чтобы получить пептид ракового антигена, обладающий улучшенными физико-химическими свойствами, устойчивостью и биоактивностью. В частности, авторы получили из таких пептидов модифицированные соединения и проверили иммуногенность с использованием трансгенных мышей HLA-A2402/Kb (см. WO 02/47474, далее в данном описании они также могут называться мышами HLA-A24).

В результате достигнут успех в получении пептида с улучшенными физико-химическими свойствами и устойчивостью посредством модификации цистеинового остатка (Cys) в N-концевом сайте WT1_235-243 или WT1_235-243 (2М Y), в особенности, модификации тиольной группы цистеинового остатка в N-концевом сайте. Пептид по настоящему изобретению обладает улучшенной иммуногенностью и активностью по индукции ЦТЛ. Т-Клетки, специфически индуцированные пептидом по настоящему изобретению, применимы в качестве лечебного средства для иммунотерапии рака из-за их перекрестного взаимодействия с пептидом дикого типа WT1_235-243, который изначально представлен раковыми клетками.

До сих пор было неизвестно, чтобы пептид, в котором модифицирован цистеиновый остаток WT1_235-243 или WT1_235-243 (2M Y) как пептида антигена WT1, показывал иммуногенность, достаточную для того, чтобы действовать как раковый антиген. Авторы настоящего изобретения впервые обнаружили, что производное пептида, полученное конденсацией тиольной группы цистеинового остатка в N-концевом сайте с тиольной группой цистеина, глутатиона или тиогликолевой кислоты с образованием дисульфидной связи, можно использовать в качестве эффективного ракового антигена.

Настоящее изобретение осуществлено на основе открытия, описанного выше.

Настоящее изобретение относится к

[1] соединению формулы (1)

где X представляет собой тирозиновый остаток или метиониновый остаток; каждый из Y и Z выбирают, независимо, из числа простой связи и двухвалентной пептидной группы, состоящей из 1-10 аминокислотных остатков,

R¹ представляет собой водород или алкил,

R² представляет собой гидроксил, амино, алкиламино или диалкиламино,

R³ представляет собой водород, алкил, амино, алкиламино, диалкиламино или замещенный, или незамещенный алкилкарбониламино,

R⁴ представляет собой водород, алкил, карбокси, карбамоил, алкилкарбамоил, диалкилкарбамоил или группу формулы (2)

где W представляет собой аминокислотный остаток,

m равен 1 или 2, и

n равен целому числу 0-2, при условии, что когда n равен 0, R³ представляет собой водород или алкил,

или его фармацевтически приемлемой соли;

[2] соединению, описаному выше в [1], или его фармацевтически приемлемой соли, где указанный замещенный алкилкарбониламино, представленный R ³, представляет собой алкилкарбониламино, замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из карбокси, амино, алкиламино и диалкиламино;

[3] соединению, описаному выше в [1] или [2], или его фармацевтически приемлемой соли, где

R³ представляет собой водород или группу формулы (3)

где r равен целому числу 1-3, и

R⁴ представляет собой карбокси или группу формулы (2')

где W' представляет собой глициновый остаток или -аланиновый остаток;

[4] соединению, описаному выше в [3], или его фармацевтически приемлемой соли,

где R³ представляет собой группу формулы (3')

и R⁴ представляет собой карбоксиметилкарбамоил;

[5] соединению, описаному выше в [3], или его фармацевтически приемлемой соли,

где R³ представляет собой водород, и R⁴ представляет собой карбокси;

[6] соединению формулы (1')

где X' представляет собой тирозиновый остаток или метиониновый остаток,

R^1' представляет собой водород или алкил,

R^2' представляет собой гидроксил, амино, алкиламино или диалкиламино,

R^3' представляет собой амино, алкиламино, диалкиламино или замещенный или незамещенный алкилкарбониламино, и

R^4' представляет собой карбокси, карбамоил, алкилкарбамоил, диалкилкарбамоил,

или его фармацевтически приемлемой соли;

[7] антителу, которое специфически связывается с соединением, описанным выше в любом из [1]-[6], или его фармацевтически приемлемой солью;

[8] антигенпредставляющей клетке, которая представляет комплекс соединения, описанного выше в любом из [1]-[6], или его фармацевтически приемлемой соли и антигена HLA-A24;

[9] ЦТЛ, индуцированному соединением, описанным выше в любом из [1]-[6], или его фармацевтически приемлемой солью;

[10] ЦТЛ, описаному выше в [9], который узнает комплекс соединения, описанного выше в любом из [1]-[6], или его фармацевтически приемлемой соли, и антигена HLA-A24;

[11] ЦТЛ, описаному выше в [9], который узнает комплекс пептида SEQ ID NO:1 и антигена HLA-A24;

[12] фармацевтической композиции, содержащей соединение, описанное выше в любом из [1]-[6], или его фармацевтически приемлемую соль, антигенпредставляющие клетки, описанные выше в [8], или ЦТЛ, описанные выше в любом из [9]-[11], вместе с фармацевтически приемлемым носителем;

[13] фармацевтической композиции, описанной выше в [12], которую используют в качестве противораковой вакцины;

[14] применению соединения, описанного выше в любом из [1]-[6], или его фармацевтически приемлемой соли, антигенпредставляющих клеток, описанных выше в [8], или ЦТЛ, описанных выше в любом из [9]-[11], для получения противораковой вакцины;

[15] лекарственному средству для иммунотерапии рака, содержащему в качестве активного ингредиента соединение, описанное выше в любом из [1]-[6], или его фармацевтически приемлемую соль, антигенпредставляющие клетки, описанные выше в [8], или ЦТЛ, описанные выше в любом из [9]-[11]; или

[16] способу лечения или предупреждения рака, включающему введение пациенту, положительному на HLA-A24 и положительному на WT1, нуждающемуся в лечении или предупреждении рака, терапевтически или профилактически эффективного количества соединения, описанного выше в любом из [1]-[6], или его фармацевтически приемлемой соли, антигенпредставляющих клеток, описанных выше в [8], или ЦТЛ, описанных выше в любом из [9]-[11].

Эффект, производимый настоящим изобретением

Настоящее изобретение относится к новому пептиду, применимому в качестве лекарственного средства для иммунотерапии рака, например раковому антигену, полученному из WT1, который обладает активностью по индукции ЦТЛ in vivo и применим в качестве противораковой вакцины. Пептид по настоящему изобретению, который получают модификацией меркаптогруппы цистеинового остатка, расположенного в N-конце WT1_235-243 или WT1 _235-243 (2М Y), с сохранением активности как пептида ракового антигена, обладает улучшенными физико-химическими свойствами и устойчивостью, и, таким образом, его можно широко применять для лечения или исследований. В частности, новый пептид по настоящему изобретению обладает преимуществами, такими как удобство в обращении без опасности снижения активности из-за обработки in vitro, проявление устойчивого лечебного эффекта и так далее.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой диаграмму, показывающую цитотоксическую активность (специфический лизис), индуцированную пептидом примера 1, с использованием трех мышей по отдельности (черные столбики на фигуре). Белые столбики на фигуре показывают результаты, полученные с использованием клеток, не подвергавшихся обработке в импульсном режиме каким-либо пептидом (то же применимо для последующих фигур).

Фигура 2 представляет собой диаграмму, показывающую цитотоксическую активность (специфический лизис), индуцированную пептидом примера 2, с использованием трех мышей по отдельности.

Фигура 3 представляет собой диаграмму, показывающую цитотоксическую активность (специфический лизис), индуцированную пептидом примера 3, с использованием трех мышей по отдельности.

Фигура 4 представляет собой диаграмму, показывающую цитотоксическую активность (специфический лизис), индуцированную пептидом примера 4, с использованием трех мышей по отдельности.

Фигура 5 представляет собой диаграмму, показывающую цитотоксическую активность (специфический лизис), индуцированную пептидом примера 5, с использованием трех мышей по отдельности.

Фигура 6 представляет собой диаграмму, показывающую цитотоксическую активность (специфический лизис), индуцированную пептидом примера 6, с использованием трех мышей по отдельности.

Фигура 7 представляет собой график, показывающий цитотоксическую активность (специфический лизис), индуцированную пептидом примера 1 в зависимости от дозы. Ось Х показывает дозу на одну отдельную мышь (600 мкг, 200 мкг, 60 мкг и 20 мкг), и ось Y показывает цитотоксическую активность (специфический лизис). Каждую дозу вводят трем мышам, соответственно, и результаты приводят как среднее цитотоксических активностей и среднеквадратическое отклонение (S.D.).

Фигура 8 представляет собой диаграмму, показывающую реактивность пептидспецифических Т-клеток, полученных иммунизацией мышей пептидом примера 1, в отношении клеток, обработанных в импульсном режиме различными пептидами. На фигуре заштрихованные столбики показывают результаты, полученные с использованием клеток, обработанных в импульсном режиме пептидом дикого типа (WT1 _235-243), черные столбики показывают результаты, полученные с использованием клеток, обработанных в импульсном режиме пептидом соединением примера 1, и незаштрихованные столбики показывают результаты, полученные с использованием клеток, обработанных в импульсном режиме пептидом, полученным из вируса гриппа, соответственно. Кроме того, на фигуре вертикальная ось показывает точки.

Фигура 9 представляет собой диаграмму, показывающую реактивность пептидспецифических Т-клеток, полученных их человеческих РВМС стимуляцией пептидом примера 1, в отношении клеток, обработанных в импульсном режиме различными пептидами. На фигуре столбик "пептид дикого типа" показывает результаты, полученные с использованием клеток, обработанных в импульсном режиме пептидом дикого типа (WT1_235-243), столбик "модифицированный пептид" показывает результаты, полученные с использованием клеток, обработанных в импульсном режиме модифицированным пептидом (WT1_235-243 (2M Y)), столбик "пептид примера 1" показывает результаты, полученные с использованием клеток, обработанных в импульсном режиме пептидом соединением примера 1, и столбик "без обработки пептидом в импульсном режиме " показывает результаты, полученные с использованием клеток, необработанных в импульсном режиме каким-либо пептидом, соответственно. Кроме того, на фигуре вертикальная ось показывает количество продуцированного интерферона- .

Наилучший способ осуществления изобретения

В описании и на чертежах настоящей заявки используются приведенные далее аббревиатуры аминокислотных остатков.

Ala - аланиновый остаток,

Arg - аргининовый остаток;

Asn - аспарагиновый остаток;

Cys - цистеиновый остаток;

Gln - глутаминовый остаток;

Glu -остаток глутаминовой кислоты;

Gly - глициновый остаток;

His - гистидиновый остаток;

Ile - изолейциновый остаток;

Leu - лейциновый остаток;

Lys - лизиновый остаток;

Met - метиониновый остаток;

Phe - фенилаланиновый остаток;

Pro - пролиновый остаток;

Ser - сериновый остаток;

Thr - треониновый остаток;

Trp - триптофановый остаток;

Tyr - тирозиновый остаток;

Val - валиновый остаток.

Используемый в данном описании термин "аминокислотный остаток" включает природные и неприродные остатки -аминокислот, -аминокислот, -аминокислот и -аминокислот. Например, "аминокислотный остаток" включает остаток природной -аминокислоты (например, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val), орнитиновый остаток, гомосериновый остаток, гомоцистеиновый остаток, -аланин, -аминобутановую кислоту или -аминопентановую кислоту.

Описанные выше аминокислоты могут представлять собой или L-энантиомеры или D-энантиомеры, когда аминокислота является оптическим изомером, более предпочтителен L-энантиомер.

В описании аминокислотная последовательность пептида описывается согласно обычной форме, когда N-концевой аминокислотный остаток располагается с левой стороны, и С-концевой аминокислотный остаток располагается с правой стороны.

(1) Пептид

В первом аспекте настоящее изобретение относится к соединению описанной выше формулы (1) или его фармацевтически приемлемой соли.

В формуле (1), предпочтительно, Х представляет собой тирозиновый остаток (Tyr).

В формуле (1) "двухвалентные пептидные группы, состоящие из 1-10 аминокислотных остатков", представленные Y и Z, включают одинаковые или различные двухвалентные пептидные группы, состоящие из 1-10 аминокислотных остатков, без какого-либо ограничения аминокислотной последовательности. Например, указанная двухвалентная пептидная группа, состоящая из 1-10 аминокислотных остатков, включает аминокислотную последовательность, содержащуюся в аминокислотной последовательности человеческого WT1 (Cell, 60: 509, 1990, GenBank, Acc. No. A38080). Например, Y может представлять собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из десяти аминокислотных остатков 225-234 человеческого WT1, которая описывается следующим образом: Asn-Leu-Tyr-Gln-Met-Thr-Ser-Gln-Leu-Glu (SEQ ID NO:3), или двухвалентную пептидную группу, имеющую фрагмент SEQ ID NO:3, в котором делегированы 1-9 аминокислотных остатков в N-конце. Кроме того, например, Z может представлять собой двухвалентную пептидную группу, состоящую из десяти аминокислотных остатков 244-253 человеческого WT1, которая описывается следующим образом: Gly-Ala-Thr-Leu-Lys-Gly-Val-Ala-Ala-Gly (SEQ ID NO:4), или двухвалентную пептидную группу, имеющую фрагмент SEQ ID NO:4, в котором делегированы 1-9 аминокислотных остатков в С-конце. Предпочтительно, каждый Y и Z может представлять собой простую связь.

В описании алкильная группа включает, например, линейную или разветвленную алкильную группу с 1-6 атомами углерода. Например, алкильная группа включает метил, этил, пропил, 1-метилэтил, бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, пентил и т.д.

В описании алкиламиногруппа включает, например, линейную или разветвленную алкиламиногруппу с 1-6 атомами углерода. Например, алкиламиногруппа включает метиламино, этиламино, пропиламино, 1-метилэтиламино, бутиламино, 1-метилпропиламиноамино, 2-метилпропиламино, 1,1-диметилэтиламино, пентиламино и т.д.

В описании диалкиламиногруппа включает, например, аминогруппу, замещенную двумя одинаковыми или различными и линейными или разветвленными алкильными группами с 1-6 атомами углерода. Например, диалкиламиногруппа включает диметиламино, диэтиламино, дипропиламино, метилпропиламино, бутилметиламино, метилпентиламино и т.д.

В описании "алкил" в алкилкарбониламиногруппе включает алкильную группу, описанную выше. "Алкил" в алкилкарбамоильной группе включает те же алкильные группы, что и описанная выше алкиламиногруппа. "Алкил" в диалкилкарбамоильной группе включает те же алкильные группы, что и описанная выше диалкиламиногруппа, когда два алкила могут быть одинаковыми или различными.

Каждый из R¹ и R² , предпочтительно, представляет собой атом водорода.

Когда R³ представляет собой замещенную алкилкарбониламиногруппу, заместитель алкилкарбониламиногруппы включает, например, карбокси, гидрокси, амино, алкиламино и диалкиламино, где указанная алкилкарбониламиногруппа может быть замещена одинаковыми или различными 1-4, предпочтительно, 1-2, заместителями.

Аминокислотный остаток, представленный W в формуле (2), может включать, предпочтительно, глициновый остаток (Gly).

Пептид по настоящему изобретению включает, например, соединения приведенных далее формул (4)-(9).

Пептиды по настоящему изобретению можно получить согласно способу, описанному в описании в примерах, или способу, обычно используемому в синтезе пептидов. Примерами таких способов получения являются способы, описанные в литературе, в том числе, в "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", Vol.2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Pepuchido-Gosei", Maruzen Co. Ltd., 1975; "Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikenn", Maruzen Co. Ltd., 1985; и "Iyakuhin-no-Kaihatu, Zoku, vol.14, Pepuchido-Gosei", Hirokawa Shoten, 1991. Пример способа получения пептида по настоящему изобретению включает способ получения пептида согласно методу с Fmoc или методу с Вос с помощью твердофазного синтезатора или способ получения пептида последовательной конденсацией Вос-аминокислоты или Z-аминокислоты согласно способу жидкофазного синтеза, где Fmoc представляет собой 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу, Boc представляет собой трет-бутоксикарбонильную группу, и Z представляет собой бензилоксикарбонильную группу, соответственно.

Функциональную группу промежуточного соединения в синтезе соединения по настоящему изобретению, такую как амино, карбоксильная и меркаптогруппа, можно защитить подходящей защитной группой и из защищенного соединения защитную группу можно удалить с использованием обычного метода введения/удаления защитной группы, если требуется. Подходящие защитные группы и способы введения и удаления защитной группы подробно описаны, например, в Protective Groups in Organic Synthesis, 2^nd Edition (John Wiley & Sons, Inc., 1990).

В частности, примером способа получения соединения по настоящему изобретению является способ, описанный следующей реакционной схемой

где в указанных формулах X, Y, Z, R¹, R², R³, R⁴, m и n имеют соответствующие значения, указанные выше. Каждый из R и R' представляет собой, независимо, атом водорода или защитную группу для меркаптогруппы.

Примеры указанной защитной группы для меркаптогруппы включают, например, ацетоамидометил или тритил.

Соединение формулы (1) можно получить окислением соединения формулы (1-1) и соединения формулы (1-2) в инретном растворителе.

Окисление можно осуществить традиционным способом, обычно применяемым в синтезе пептидов для образования дисульфидной связи. Например, дисульфидную связь можно образовать, смешивая два промежуточных соединения, содержащих меркаптогруппу, в подходящем растворителе и окисляя их. Можно использовать обычный способ окисления, такой как окисление на воздухе и окисление иодом. Растворителем может являться вода, уксусная кислота, метанол, хлороформ, ДМФА или ДМСО или их смесь. Реакция окисления иногда дает смесь симметричных и асимметричных дисульфидных соединений. Нужное асимметричное дисульфидное соединение можно получить очисткой смеси, такой как очистка с использованием различных видов хроматографии, очистка методом перекристаллизации и т.п.

С другой стороны, промежуточное соединение, содержащее активированную меркаптогруппу, смешивают с другим промежуточным соединением, содержащим меркаптогруппу, с образованием селективной дисульфидной связи. Примеры промежуточных соединений, содержащих активированную меркаптогруппу, включают, например, соединение, содержащее меркаптогруппу, связанную с группой Npys (3-нитро-2-пиридинсульфенильная группа).

С другой стороны, после смешивания одного из промежуточных соединений, содержащих активированную меркаптогруппу, с, например, 2,2'-дитиобис(5-нитропиридином) для активации меркаптогруппы к полученной смеси добавляют другое промежуточное соединение для образования селективной дисульфидной связи (Tetrahedron Letters, Vol.37, No.9, p.1347-1350).

Соединение формулы (1-1) можно получить согласно твердофазному или жидкофазному методу синтеза пептидов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники.

Кроме того, в случае, когда соединение формулы (1-1) представляет собой соединение, алкилированное по N-концу, в качестве N-концевой аминокислоты можно использовать N-алкиламинокислоту или N,N-диалкиламинокислоту которые, при необходимости, могут быть защищены защитными группами. N-Алкиламинокислота или N,N-диалкиламинокислота может быть коммерчески доступна или получена согласно способу, хорошо известному специалистам в данной области техники, в котором, например, исходное вещество аминокислоту или защищенную аминокислоту вводят во взаимодействие с алкилгалогенидом в присутствии основания. Например, N-концевую аминогруппу можно соответствующим образом алкилировать взаимодействием аминокислоты, которая содержит защитную трет-бутоксикарбонильную группу, с алкилгалогенидом в присутствии основания, такого как гидрид натрия, как поясняется на приведенной далее реакционной схеме 2.

[Реакционная схема 2]

В указанных формулах каждый из X, Y, Z, R¹, R², R³, R⁴ , m и R имеет значения, указанные выше, Hal представляет собой атом брома или атом иода, и Prot представляет собой защитную группу.

Далее, в случае, когда соединение представляет собой соединение, алкилированное или алкиламидированное по С-концу, в качестве С-концевого аминокислотного остатка исходного вещества можно использовать амидированную или алкиламидированную аминокислоту.

Соединение по настоящему изобретению или соединения, промежуточные при его синтезе, можно очистить согласно способу, хорошо известному специалистам в данной области техники. Например, очистку можно осуществить посредством различных видов хроматографии (например, колоночной хроматографией на силикагеле, ионообменной колоночной хроматографией, гель-фильтрацией или хроматографией с обращенной фазой) или перекристаллизации. Растворителями для перекристаллизации могут являться, например, спирты, такие как метанол, этанол и 2-пропанол, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, сложные эфиры, такие как этилацетат, ароматические углеводороды, такие как бензол и толуол, кетоны, такие как ацетон, углеводороды, такие как гексан, апротонные растворители, такие как диметилформамид и ацетонитрил, вода или смешанные растворители из их числа. Другим способом, используемым для очистки, может являться способ, описанный в томе 1 Jikkenkagakukoza (edited by Chemical Society of Japan, Maruzen).

В случае, когда соединение по настоящему изобретению имеет один или несколько асимметричных центров, для его получения согласно обычному способу можно использовать вещество (аминокислоту), имеющее асимметричный центр. Кроме того, можно осуществить расщепление на оптические изомеры на соответствующей стадии процесса получения для того, чтобы улучшить оптическую чистоту соединения по настоящему изобретению. Например, расщепление на оптические изомеры можно осуществить согласно способу диастереомеров, при котором соединение или промежуточное соединение по настоящему изобретению смешивают с оптически активной кислотой (например, монокарбоновой кислотой, такой как миндальная кислота, N-бензилоксианилин и молочная кислота, дикарбоновой кислотой, такой как винная кислота, о-диизопропилиденвинная кислота и яблочная кислота, или сульфоновой кислотой, такой как камфорсульфоновая кислота и бромкамфорсульфоновая кислота) в инертном растворителе (например, спиртовых растворителях, таких как метанол, этанол и 2-пропанол, простых эфирах, таких как диэтиловый эфир, сложных эфирах, таких как этилацетат, углеводородных растворителях, таких как толуол, апротонных растворителях, таких как ацетонитрил, или смешанных растворителях из их числа) для получения солевой формы. В случае, когда соединение или промежуточное соединение по настоящему изобретению содержит кислотную функциональную группу, такую как карбоксигруппа, расщепление на оптические изомеры можно осуществить, получая соль с оптически активным амином (например, органическим амином, таким как -фенетиламин, хинин, хинидин, цинхонидин, цинхонин и стрихнин).

Реакцию образования соли можно проводить при температуре, колеблющейся от комнатной температуры до температуры кипения растворителя. В целях улучшения оптической чистоты предпочтительно, чтобы температура повышалась до примерно температуры кипения растворителя. Выход можно улучшить, если потребуется, охлаждением смеси, когда выпавшую в осадок соль извлекают фильтрацией.

Оптически активные кислоту или амин соответственно используют в количестве от примерно 0,5 до примерно 2,0 эквивалентов на субстрат, предпочтительно, в количестве примерно 1 эквивалента на субстрат. Если требуется, кристаллическое вещество можно перекристаллизовать из инертного растворителя (например, спиртов, таких как метанол, этанол и 2-пропанол, простых эфиров, таких как диэтиловый эфир, сложных эфиров, таких как этилацетат, углеводородов, таких как толуол, апротонных растворителей, таких как ацетонитрил, или смешанных растворителей из их числа) и получить высокочистую оптически активную соль. Кроме того, при необходимости, оптически расщепленную соль можно обработать кислотой или основанием согласно обычному способу для того, чтобы получить соединение в свободной форме.

Фармацевтически приемлемая соль включает соль присоединения кислоты и соль присоединения основания. Например, соль присоединения кислоты включает соль с неорганической кислотой, такую как гидрохлорид, гидробромид, сульфат, гидроиодид, нитрат и фосфат, и соль с органической кислотой, такую как цитрат, оксалат, ацетат, формиат, пропионат, бензоат, трифторацетат, малеат, тартрат, метансульфонат, бензолсульфонат и пара-толуолсульфонат. Соль присоединения основания включает соль с неорганическим основанием, такую как натриевая соль, калиевая соль, кальциевая соль, магниевая соль и аммониевая соль, соль с органическим основанием, такую как соль триэтиламмония, соль триэтаноламмония, соль пиридиния и соль диизопропиламмония, а также соль аминокислоты, такой как аминокислота щелочного или кислотного характера, включая аргинин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

Кроме того, настоящее изобретение относится к сольвату пептида, представленного формулой (1), или его фармацевтически приемлемой соли, включая гидрат или сольват этанола. Кроме того, настоящее изобретение относится к любым возможным стереоизомерам, в том числе, любым диастереомерам и энантиомерам, соединения, представленного формулой (1), и любым его кристаллическим формам.

В ходе получения пептида, включающего стадии конденсации оптически активной -аминокислоты, удаления различного рода защитных групп или высвобождения пептида из смолы, как правило, образуются побочные продукты, в том числе, пептид с делецией аминокислот, пептид, разрушенный гидролизом, окислением или подобным образом, и пептид с эпимеризованной аминокислотой. В лабораторном масштабе для удаления таких примесей можно использовать сочетание различных способов хроматографии (например, колоночной хроматографии на силикагеле, ионообменной колоночной хроматографии, гель-фильтрации или хроматографии с обращенной фазой) с тем, чтобы получить пептид высокой степени чистоты. Однако в промышленном масштабе трудно получить пептид высокой степени чистоты для целей предоставления его как лекарственного средства.

Пептид по настоящему изобретению имеет физико-химические свойства, которые дают возможность крупномасштабного получения фармацевтических средств в массе. В частности, пептид по настоящему изобретению имеет такие свойства, как высокая растворимость, высокая устойчивость в растворе или отсутствие склонности к превращению в гель при конденсации, так что пептид высокой чистоты можно легко получить как фармацевтическое средство в массе даже в крупном масштабе посредством очистки с использованием колоночной хроматогрфии, такой как хроматография с обращенной фазой.

Пептид по настоящему изобретению применим для активного ингредиента, входящего в индуктор ЦТЛ или противораковую вакцину для иммунотерапии рака. Пептид по настоящему изобретению обладает высокой иммуногенностью и высокой иктивностью индукции ЦТЛ, как видно из примеров, приведенных в данном описании. ЦТЛ, индуцированные пептидом по настоящему изобретению, могут неожиданно узнавать пептид дикого типа WT1, изначально содержащийся в раковых клетках. Таким образом, пептид по настоящему изобретению применим в лекарственном средстве для лечения или предупреждения (включая предупреждение рецидива) онкозаболевания, при котором экспрессируется ген WT1, такого как рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, эмбриональный рак, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, цервикальный рак и рак яичников.

(2) Антитела по настоящему изобретению

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с пептидом, представленным формулой (1), или его фармацевтически приемлемой солью (далее такие антитела могут называться "антителами по изобретению"). Антитела по изобретению не ограничиваются специфическим антителом и могут представлять собой поликлональные антитела или моноклональные антитела, полученные с использованием пептида по настоящему изобретению в качестве иммуногена.

Антитела по настоящему изобретению не ограничиваются каким-либо антителом до тех пор, пока они специфически связываются с пептидами по изобретению, и конкретные примеры включают антитела, которые специфически связываются с пептидами, представленными одной из формул (4)-(9), описанных выше.

Способы получения антител уже хорошо известны, и антитела по настоящему изобретению можно получить согласно обычным способам (Current protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel et al. (1987), Publish. John Wiley and Sons, Section 11.12-11.13; Antibodies, A Laboratory Manual, Lane H.D. et al., ed., Cold Spring Harber Laboratory Press Publisher, New York, 1989).

Конкретно антитела можно получить с использованием пептидов по настоящему изобретению (например, соединения, представленного одной из формул (4)-(9)) в качестве иммуногена для иммунизации животного, не являющегося человеком, такого как кролик, с последующим получением антител из сыворотки иммунизированного животного обычным образом. С другой стороны, моноклональные антитела можно получить иммунизацией животного, не являющегося человеком, такого как мышь, соединением по настоящему изобретению, например, соединением, представленным одной из формул (4)-(9), и получая гибридомы из спленоцитов, полученных от животного, и клеток миеломы посредством слияния клеток, с последующим получением антител из гибридом (Current protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel et al. (1987), Publish. John Wiley and Sons, Section 11.4-11.11).

Антитела, направленные против соединений по изобретению, можно получить способом, когда иммунологическую реакцию усиливают с использованием разнообразных адъювантов, подходящих для реципиента. Примеры адъювантов включают адъювант Фрейнда, неорганические гели, такие как гель гидроксида алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиол плюроник, полианионные соединения, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин моллюска морское блюдечко и динитрофенол, и адъюванты от человека, такие как БЦЖ (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum.

Как описано выше, антитела, которые узнают соединение по настоящему изобретению, а также антитела, которые нейтрализуют активность соединения, можно легко получить соответственно иммунизацией животного соединениями по настоящему изобретению обычным образом. Такие антитела можно использовать в аффинной хроматографии, иммунологической диагностике и т.п. Иммунологическую диагностику можно соответственно выбрать из числа иммуноблоттинга, радиоиммуноанализа (РИА), иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA), флуоресцентного или люминисцентного анализа и т.п. Иммунологическая диагностика применима для диагностики онкозаболеваний, при которых экспрессируется ген WT1, таких как рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, эмбриональный рак, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, цервикальный рак и рак яичников.

(3) Антигенпредставляющие клетки по настоящему изобретению

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к антигенпредставляющим клеткам, на которых представлен комплекс между соединением по настоящему изобретению и антигеном HLA-A24.

Примеры, описанные далее, показывают, что введение соединений по настоящему изобретению индуцирует ЦТЛ. Иными словами, антигенпредставляющие клетки, на которых представлен комплекс между соединением по настоящему изобретению и антигеном HLA-A24, образуются в мононуклеарных клетках периферической крови и затем индуцируются ЦТЛ, которые специфически узнают клетки, представляющие такой комплекс. Такие антигенпредставляющие клетки, на которых представлен комплекс между антигеном HLA-A24 и соединением по настоящему изобретению, применимы в клеточной терапии (DC-терапии), как описано в данном описании далее.

Антигенпредставляющие клетки по настоящему изобретению не ограничиваются определенными клетками до тех пор, пока они представляют на своей поверхности комплекс между соединением по настоящему изобретению и антигеном HLA-A24. Конкретно такие клетки включают, например, антигенпредставляющие клетки дендритных клеток, на которых представлен комплекс между соединением, представленным любой из формул (4)-(9), и антигеном HLA-A24.

Антигенпредставляющие клетки, используемые в клеточной терапии (DC-терапии), можно получить путем выделения клеток с антигенпредставляющей способностью из организма онкобольного и воздействия в импульсном режиме на полученные клетки ех vivo соединения по настоящему изобретению, так что клетки представляют на своей поверхности комплекс между соединением по настоящему изобретению и антигеном HLA-A24. В данном контексте "клетка с антигенпредставляющей способностью" не ограничивается определенной клеткой до тех пор, пока она является клеткой, экспрессирующей на поверхности антиген HLA-A24, которая имеет способность представлять соединение по настоящему изобретению, и предпочтительным примером являются дендритные клетки, которые, как полагают, имеют особенно высокую антигенпредставляющую способность.

Антигенпредставляющие клетки по настоящему изобретению можно получить, например, путем выделения клеток с антигенпредставляющей способностью из организма онкобольного, воздействия в импульсном режиме на клетки ех vivo соединения по изобретению (например, соединения любой из формул (4)-(9)) и получения комплекса между антигеном HLA-A24 и соединением по настоящему изобретению (Cancer Immunol. Immunother., 46: 82, 1998; J. Immunol., 158: 1796, 1997; Cancer Res., 59: 1184, 1999). Когда используют дендритные клетки, антигенпредставляющие клетки по настоящему изобретению можно получить, например, путем выделения лимфоцитов из периферической крови онкобольного с использованием способа с фиколлом, удаления неадгезивных клеток, инкубации адгезивных клеток в присутствии GM-CSF и IL-4 для индукции дендритных клеток и воздействия в импульсном режиме на полученные дендритные клетки соединения по настоящему изобретению.

Антигенпредставляющие клетки, полученные так, как описано выше, применимы в качестве активного ингредиента, включенного в индуктор ЦТЛ или противораковую вакцину для клеточной терапии (CD-терапии), как описано в данном описании далее.

(4) ЦТЛ по настоящему изобретению

Пептиды по настоящему изобретению получают из человеческого WT1, и они обладают активностью по индукции ЦТЛ (иммуногенностью), ограниченной HLA-A24. В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к ЦТЛ, индуцированным пептидом по настоящему изобретению.

Примеры, описанные далее, показывают, что введение пептидов по настоящему изобретению, индуцирует ЦТЛ. Иными словами, антигенпредставляющие клетки, на которых представлен комплекс между соединением по настоящему изобретению и антигеном НLА-А24,образуются в мононуклеарных клетках периферической крови, и затем индуцируются ЦТЛ, которые специфически узнают клетки, представляющие такой комплекс. Такие ЦТЛ, индуцированные пептидом по настоящему изобретению, применимы в адоптивной иммунотерапии, как описано в данном описании далее.

ЦТЛ по настоящему изобретению не ограничиваются определенными ЦТЛ до тех пор, пока они индуцируются пептидом по настоящему изобретению, и, в частности, включают ЦТЛ, узнающие комплекс между соединением, представленным любой из формул (4)-(9), и антигеном HLA-A24, и ЦТЛ, узнающие комплекс между пептидом дикого типа (WT_235-243: SEQ ID NO:1) и антигеном HLA-A24.

ЦТЛ, используемые в адоптивной иммунотерапии, можно получить, например, выделением периферических лимфоцитов из организма пациента и стимулируя полученные периферические лимфоциты in vitro соединением по настоящему изобретению (например, соединением, представленным любой из формул (4)-(9)) (Journal of Experimental Medicine, 1999, 190: 1669).

ЦТЛ по настоящему изобретению, полученные так, как описано выше, применимы качестве активного ингредиента в противораковой вакцине для адаптивной иммунотерапии.

Фармацевтические композиции, применимые в качестве противораковых вакцин

Соединения по настоящему изобретению, антигенпредставляющие клетки по настоящему изобретению и ЦТЛ по настоящему изобретению, описанные выше в разделах (1)-(4), можно использовать в качестве активного ингредиента, включенного в индуктор ЦТЛ, иначе говоря, противораковую вакцину, в композиции в форме, подходящей для таких соответствующих веществ, которые описаны ниже.

1) Противораковые вакцины, содержащие в качестве активного ингредиента соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль

Соединение по настоящему изобретению обладает активностью по индукции ЦТЛ. ЦТЛ, индуцированные соединением по настоящему изобретению, могут разрушать раковые образования через свою цитотоксическую активность и продуцирование лимфокинов. Таким образом, соединения по настоящему изобретению можно использовать в качестве активного ингредиента, включенного в противораковую вакцину для лечения или предупреждения онкозаболеваний. В воплощении изобретение относится к противораковой вакцине, включающей в качестве эффективного ингредиента соединения по изобретению (фармацевтической композиции, применимой в качестве противораковой вакцины). Когда противораковую вакцину по изобретению вводят больному раком, положительному на HLA-A24 и положительному на WT1, соединение (например, представленное любой из формул (4)-(9)) представляется антигену HLA-A24 антигенпредставляющих клеток, и затем ЦТЛ, специфические для представленного комплекса, содержащего антиген HLA-A24, эффективно пролиферируют и разрушают раковые клетки. Таким путем достигается лечение или предупреждение онкозаболеваний. Противораковые вакцины по изобретению можно использовать для лечения или предупреждения онкозаболеваний, которые сопровождаются повышенным уровнем экспрессии гена WT1, в том числе, онкозаболеваний крови, таких как лейкоз, миелодиспластического синдрома, множественной миеломы и злокачественной лимфомы, и солидных онкозаболеваний, таких как рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, эмбриональный рак, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, цервикальный рак и рак яичников. В такой связи в другом воплощении изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака, который включает введение эффективного количества противораковой вакцины по настоящему изобретению больному раком, положительному на HLA-A24 и положительному на WT1.

Противораковая вакцина, включающая соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, может включать в качестве активного ингредиента или один пептид ракового антигена, иначе говоря, эпитоп ЦТЛ (например, соединение, представленное любой из формул (4)-(9)), или эпитопный пептид, соединенный с другим пептидом ракового антигена (эпитоп ЦТЛ), или хелперный эпитоп. Недавно показано, что эпитопный пептид, соединенный с несколькими эпитопами ЦТЛ (пептидами антигенов), обладает эффективной активностью по индукции ЦТЛ in vivo. Например, в Journal of Immunology, 1998, 161: 3186-3194, описывается, что примерно 30-мерный эпитопный пептид, с которым линейно соединены эпитопы ЦТЛ, HLA-A2, -A3, -А11, ограниченные В53 (пептиды антигенов), образовавшиеся из белка ракового антигена PSA, индуцируют in vivo ЦТЛ, специфические для соответствующего эпитопа ЦТЛ. Также показано, что эпитопный пептид, в котором эпитоп ЦТЛ и хелперный эпитоп соединены линейно, эффективно индуцируют ЦТЛ. Когда пептид по изобретению вводят в форме таких эпитопных пептидов, пептид внедряется в антигенпредставляющие клетки и затем подвергается внутриклеточному разложению с образованием соответствующих пептидов антигенов, которые связываются с антигеном HLA с образованием комплексов. Комплексы компактно представлены на клеточной поверхности антигенпредставляющих клеток, и затем ЦТЛ, специфические для комплексов, эффективно пролиферируют in vivo и разрушают раковые клетки. Таким путем достигается лечение или предупреждение онкозаболеваний.

Противораковые вакцины, содержащие в качестве активного ингредиента пептид по настоящему изобретению, также можно вводить вместе с фармацевтически приемлемым носителем, таким как подходящий адъювант, или в определенной лекарственной форме, для того, чтобы эффективно восстановить клеточный иммунитет. Для такой цели применимы адъюванты, описанные в литературе (Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994), которые включают конкретно компоненты бактериального происхождения, GM-CSF, цитокины, такие как интерлейкин-2, интерлейкин-7, интерлейкин-12 и т.п., компоненты растительного происхождения, компоненты, присходящие от морских организмов, неорганические гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолейцин и полоил плюроник, полианионные соединения, пептиды и масляные эмульсии (эмульсионные композиции). Компоненты бактериального происхождения включают липид А, монофосфориллипид А, который является производным липида А, убитые бактерии (например, микобактерии, такие как БЦЖ), белки или полинуклеотиды бактериального происхождения, неполный адъювант Фрейнда, полный адъювант Фрейнда, компоненты клеточных стенок (например, БЦЖ-CWS), димиколат трегалозы (TDM) и т.п. Возможны также липосомные композиции, композиции из частиц, в которых ингредиент связан с гранулами диаметром в несколькоо мкм, или композиции, в которых ингредиент присоединен в липидам.

Введения можно достичь, например, интрадермальной, подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекцией. Хотя доза соединения по настоящему изобретению в композициях может изменяться в зависимости от заболевания, от которого лечат, возраста и массы пациента и т.п., типично вводят 0,0001-1000 мг, предпочтительно, 0,001-1000 мг, предпочтительнее, 0, 1 мг - 10 мг соединения по изобретению, каждые несколько дней и до каждых нескольких месяцев.

2) Противораковые вакцины, содержащие в качестве активного ингредиента антигенпредставляющие клетки по настоящему изобретению

Настоящее изобретение относится к противораковой вакцине, содержащей в качестве активного ингредиента антигенпредставляющие клетки по настоящему изобретению.

В последнее время появились сообщения о клеточной терапии (DC-терапии), при которой лимфоциты выделяют из периферической крови больного раком, и дендритные клетки, индуцированные из лимфоцитов, обрабатывают in vitro в импульсном режиме пептидом антигена или подобным средством для получения антигенпредставляющих клеток, которые затем возвращают пациенту подкожной инъекцией или подобным способом (Cancer Immunol. Immunother., 46: 82, 1988; J. Immunol., 158: p1796, 1997; Cancer Res., 59: p1184, 1999; Cancer Res., 56: p5672, 1996; J. Immunol., 161: p5607, 1998; J. Exp. Med., 184: p465, 1996). Таким образом, антигенпредставляющие клетки по настоящему изобретению можно использовать в качестве активного ингредиента в противораковой вакцине в клеточной терапии.

Противораковая вакцина, включающая в качестве активного ингредиента антигенпредставляющие клетки по изобретению, предпочтительно, содержит физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), среду или подобное для устойчивого сохранения антигенпредставляющих клеток. Вакцину можно вводить, например, внутривенно, подкожно или интрадермально. Примерами доз являются дозы, описанные в вышеуказанной литературе.

Путем повторного введения противораковой вакцины в организм пациента у пациентов эффективно индуцируются специфические ЦТЛ, положительные на HLA-A24 и положителные на WT1, так что достигается лечение или предупреждение онкозаболеваний. Противораковую вакцину, включающую в качестве активного ингредиента антигенпредставляющие клетки по изобретению, можно использовать для лечения или предупреждения онкозаболеваний, при которых повышается уровень экспрессии гена WT1, включая онкозаболевания крови, такие как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома, и солидные онкозаболевания, такие как рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, эмбриональный рак, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, цервикальный рак и рак яичников.

3) Противораковые вакцины, содержащие в качестве активного ингредиента ЦТЛ по настоящему изобретению

Настоящее изобретение относится к противораковой вакцине, включающей в качестве активного ингредиента ЦТЛ по настоящему изобретению (фармацевтической композиции, применимой в качестве противораковой вакцины). ЦТЛ по настоящему изобретению применимы в адоптивной иммунотерапии, как описано в данном описании далее.

В случае меланомы отмечено, что адоптивная иммунотерапия приводит к лечебному эффекту, когда опухолевые инфильтрирующие Т-клетки, выделенные из организма самого/самой пациента/пациентки, культивируют ex vivo в больших количествах и затем возвращают в организм пациента/пациентки (J. Natl. Cancer. Inst, 86: 1159, 1994). Подобным образом, при меланоме мышей подавление метастазирования наблюдали при стимуляции in vitro спленоцитов пептидом ракового антигена TRP-2, пролиферации посредством этого ЦТЛ, специфических для пептида ракового антигена, и введении указанных ЦТЛ мыши с пересаженной меланомой (J. Ехр. Med., 185: 453, 1997). Такой результат получен при пролиферации in vitro ЦТЛ, которые специфически узнают комплекс между антигеном HLA и пептидом ракового антигена на антигенпредставляющих клетках. Соответственно, полагают, что способ лечения онкозаболеваний, который включает стимуляцию in vitro лимфоцитов периферической крови от пациента с использованием соединения по настоящему изобретению для пролиферации опухолеспецифических ЦТЛ in vitro и последующее возвращение ЦТЛ в организм пациента, является применимым. Таким образом, ЦТЛ по изобретению можно использовать в качестве активного ингредиента в противораковой вакцине, применимой в адоптивной иммунотерапии.

Противораковая вакцина, включающая в качестве активного ингредиента ЦТЛ по изобретению, предпочтительно, содержит физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), среду или подобное для устойчивого сохранения ЦТЛ. Вакцину можно вводить, например, внутривенно, подкожно или интрадермально. Примерами доз являются дозы, описанные в вышеуказанной литературе.

Путем повторного введения противораковой вакцины в организм пациента у пациентов усиливается цитотоксическое действие ЦТЛ на раковые клетки у пациента, положительного на HLA-A24 и положительного на WT1, и раковые клетки разрушаются, так что достигается лечение онкозаболеваний. Противораковую вакцину, включающую в качестве активного ингредиента ЦТЛ по настоящему изобретению, можно использовать для лечения или предупреждения онкозаболеваний, которые включают повышенный уровень экспрессии гена WT1. Примеры онкозаболеваний включают онкозаболевания крови, такие как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома, и солидные онкозаболевания, такие как рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, эмбриональный рак, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, цервикальный рак и рак яичников.

Далее настоящее изобретение поясняется приведенными примерами, но ни в каком отношении указанными примерами не ограничивается.

В последующих примерах соединение примера 2, соединение примера 4 и соединение примера 6 являются производными WT1_235-243 (SEQ ID NO:1) и соответствуют производному WT1_235-243, модифицированному цистином, глутатионом и тиогликолевой кислотой, соответственно. Кроме того, соединение примера 1, соединение примера 3 и соединение примера 5 являются производными WT1_235-243 (2М Y) (SEQ ID NO:2), модифицированному цистином, глутатионом и тиогликолевой кислотой, соответственно.

Примеры

В примерах используются приведенные далее аббревиатуры.

Boc - трет-бутоксикарбонил

Npys - 3-нитро-2-пиридинсульфенил

трет-Bu - трет-бутил

Trt - трифенилметил

Fmoc - 9-флуоренилметилоксикарбонил

ДМФА - диметилформамид

НОВТ - N-гидроксибензотриазол

DIPCI - диизопропилкарбодиимид

Пример 1

Синтез пептида формулы (4)

Пептид (1,5 г), полученный в препаративном примере 1, описанном ниже, и Вос-Cys(Npys)-OH (600 мг) смешивают в диметилсульфоксиде (20 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 минут. К реакционной смеси добавляют ацетонитрил (600 мл), смесь перемешивают на льду и полученное выпавшее в осадок вещество собирают фильтрацией. Твердое вещество на фильтре промывают ацетонитрилом и диэтиловым эфиром с последующей сушкой при пониженном давлении и получают пептид (1,65 г), в котором Boc-Cys-OH связан дисульфидной связью. Полученный пептид (0,53 г) растворяют в трифторуксусной кислоте (5 мл) и раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 10 минут. После выпаривания трифторуксусной кислоты при пониженном давлении остаток растворяют в смешанном растворителе ацетонитрил-уксусная кислота-вода (10/10/90) (110 мл) и затем осуществляют очистку с использованием ВЭЖХ.

Насос типа LC-8A (SHIMADZU CORPORATION);

колонка YMC ODS-A, Ф 3 см × L 25 см, 10 мкм;

элюент 1 - H₂O/0,1% ТФК;

элюент 2 - СН₃СН/0,1% ТФК;

скорость потока 20 мл/мин;

детекция УФ 220 нм.

Раствор неочищенного пептида загружают в колонку, уравновешенную 5% элюентом 2. Затем 5% элюент 2 пропускают в течение 10 минут, затем пропускают 10% элюент 2 в течение 15 минут и затем концентрацию элюента 2 повышают со скоростью 0,1%/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, собирают, ацетонитрил выпаривают при пониженном давлении с последующей лиофилизацией и получают нужный пептид (300 мг).

Масс-спектрометрия: ЖХ-ESI/MC, m/z=1292, [М+1]⁺ (теоретическая величина = 1291,5).

Пример 2

Синтез пептида формулы (5)

Нужный пептид (104 мг) получают взаимодействием пептида (500 мг), полученного в препаративном примере 2, описанном ниже, с Boc-Cys(Npys)-OH (200 мг) с последующими удалением Вос-гуппы в трифторуксусной кислоте и очисткой методом ВЭЖХ способом, подобным способу в примере 1.

Масс-спектрометрия: ЖХ-ESI/MC, m/z=1260, [М+1]⁺ (теоретическая величина = 1259,5).

Пример 3

Синтез пептида формулы (8)

Пептид (240 мг), полученный в препаративном примере 1, и 2,2'-дитиобис(5-нитропиридин) (60 мг) смешивают в диметилсульфоксиде (6 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляют восстановленный глутатион (120 мг) и затем смесь перемешивают при 30°С в течение 1 часа. После добавления к реакционной смеси еще восстановленного глутатиона (60 мг) и диметилсульфоксида (4 мл) с последующим перемешиванием в течение 30 минут к реакционной смеси добавляют ацетонитрил (200 мл), затем полученное выпавшее в осадок вещество собирают фильтрацией и сушат при пониженном давлении, и получают сырой пептид (440 мг). Полученный сырой пептид растворяют в смеси (110 мл) ацетонитрил-уксусная кислота и вода (10/10/90) и затем осуществляют очистку с использованием ВЭЖХ.

Насос типа LC-8A (SHIMADZU CORPORATION);

колонка YMC ODS-A, Ф 3 см × L 25 см, 10 мкм;

элюент 1 - H₂O/0,1% ТФК;

элюент 2 - СН ₃СN/0,1% ТФК;

скорость потока 20 мл/мин;

детекция УФ 220 нм.

Раствор неочищенного пептида загружают в колонку, уравновешенную 10% элюентом 2. Затем 10% элюент 2 пропускают в течение 10 минут, пропускают 17% элюент 2 в течение 15 минут и затем концентрацию элюента 2 повышают со скоростью 0,05%/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, собирают, ацетонитрил выпаривают при пониженном давлении с последующей лиофилизацией и получают нужный пептид (107 мг).

Масс-спектрометрия: ЖХ-ESI/MC, m/z=1477, [М+1]⁺ (теоретическая величина = 1477,5).

Пример 4

Синтез пептида формулы (9)

Пептид (120 мг), полученный в препаративном примере 2, и 2,2'-дитиобис(5-нитропиридин) (30 мг) смешивают в диметилсульфоксиде (3 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляют восстановленный глутатион (30 мг), затем смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут и затем к реакционной смеси добавляют еще воду (1 мл) и восстановленный глутатион (30 мг) с последующим перемешиванием в течение 20 минут. После добавления к реакционной смеси ацетонитрила (100 мл) полученное выпавшее в осадок вещество собирают фильтрацией и сушат при пониженном давлении и получают сырой пептид (160 мг). Полученный сырой пептид растворяют в смеси (55 мл) ацетонитрил-уксусная кислота-вода (5/5/45) и затем осуществляют очистку с использованием ВЭЖХ.

Насос типа LC-6A (SHIMADZU CORPORATION);

колонка YMC ODS-A, Ф 2 см × L 25 см, 10 мкм;

элюент 1 - H ₂O/0,1% ТФК;

элюент 2 - СН₃СН/0,1% ТФК;

скорость потока 10 мл/мин;

детекция УФ 220 нм.

Раствор неочищенного пептида загружают в колонку, уравновешенную 10% элюентом 2. Затем 10% элюент 2 пропускают в течение 10 минут, пропускают 17% элюент 2 в течение 15 минут и затем концентрацию элюента 2 повышают со скоростью 0,05%/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, собирают, ацетонитрил выпаривают при пониженном давлении с последующей лиофилизацией и получают нужный пептид (18 мг).

Масс-спектрометрия: ЖХ-ESI/MC, m/z=1445, [М+1]⁺ (теоретическая величина = 1445,5).

Пример 5

Синтез пептида формулы (6)

Пептид (240 мг), полученный в препаративном примере 1, и 2,2'-дитиобис(5-нитропиридин) (60 мг) смешивают в диметилсульфоксиде (6 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляют тиогликолят натрия (100 мг) и затем смесь перемешивают при 30°С в течение 30 минут, затем к реакционной смеси добавляют еще тиогликолят натрия (50 мг), диметилсульфоксид (4 мл) и воду (2 мл) с последующим перемешиванием в течение 30 минут. После добавления к реакционной смеси ацетонитрила (200 мл) полученное выпавшее в осадок вещество собирают фильтрацией и сушат при пониженном давлении и получают сырой пептид (305 мг). Полученный сырой пептид растворяют в смеси (330 мл) ацетонитрил-уксусная кислота-вода (30/30/270) с последующей фильтрацией и затем полученный фильтрат очищают с использованием ВЭЖХ.

Насос типа LC-8A (SHIMADZU CORPORATION);

колонка YMC ODS-A, Ф 3 см × L 25 см, 10 мкм;

элюент 1 - H₂O/0,1% ТФК;

элюент 2 - CH₃CN/0,1% ТФК;

скорость потока 20 мл/мин;

детекция УФ 220 нм.

Раствор неочищенного пептида загружают в колонку, уравновешенную 10% элюентом 2. Затем 10% элюент 2 пропускают в течение 10 минут, пропускают 20% элюент 2 в течение 15 минут, пропускают 23% элюент 2 в течение 15 минут и затем концентрацию элюента 2 повышают со скоростью 0,05%/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, собирают, ацетонитрил выпаривают при пониженном давлении с последующей лиофилизацией и получают нужный пептид (15 мг).

Масс-спектрометрия: ЖХ-ESI/MC, m/z=1263, [М+1]⁺ (теоретическая величина = 1262,5).

Пример 6

Синтез пептида формулы (7)

Пептид (240 мг), полученный в препаративном примере 2, и 2,2'-дитиобис(5-нитропиридин) (60 мг) смешивают в диметилсульфоксиде (6 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляют тиогликолят натрия (50 мг) и затем смесь перемешивают при 30°С в течение 30 минут. Кроме того, после добавления к реакционной смеси еще тиогликолята натрия (50 мг) с последующим перемешиванием при 30°С в течение 1 часа к реакционной смеси добавляют ацетонитрил (200 мл). Полученное выпавшее в осадок вещество собирают фильтрацией и сушат при пониженном давлении, и получают сырой пептид (194 мг). Полученный сырой пептид растворяют в смеси (120 мл) ацетонитрил-уксусная кислота-вода (10/20/90) с последующей фильтрацией и затем полученный фильтрат очищают с использованием ВЭЖХ.

Насос типа LC-8A (SHIMADZU CORPORATION);

колонка YMC ODS-A, Ф 3 см × L 25 см, 10 мкм;

элюент 1 - H₂O/0,1% ТФК;

элюент 2 - CH ₃CN/0,1% ТФК;

скорость потока 20 мл/мин;

детекция УФ 220 нм.

Раствор неочищенного пептида загружают в колонку, уравновешенную 10% элюентом 2. Затем 10% элюент 2 пропускают в течение 10 минут, пропускают 18% элюент 2 в течение 15 минут и затем концентрацию элюента 2 повышают со скоростью 0,1%/мин. Фракции, содержащие нужный продукт, собирают, ацетонитрил выпаривают при пониженном давлении с последующей лиофилизацией и получают нужный пептид (30 мг).

Масс-спектрометрия: ЖХ-ESI/MC, m/z=1230, [М+1]⁺ (теоретическая величина = 1230,4).

Пример 7

Синтез пептида формулы (4)

1. Синтез смолы с пептидом, содержащим защитные группы (Boc-Cys(Boc-Cys-ОН)-Tyr(трет-Bu)-Thr(трет-Bu)-Trp(Вос)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола)

Resin - смола

Смолу Fmoc-Leu-Alko-смола (где Alko представляет собой п-алкоксибензиловый спирт) (10 г) (0,74 ммоль/г, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) загружают в реактор (500 мл, твердофазный синтезатор типа АСТ90, Advanced ChemTech) и промывают один раз ДМФА или подобным растворителем (процесс 1). Затем смолу обрабатывают 25% пиперидином (3 минуты × 1 и 15 минут × 1) для отщепления групп Fmoc (процесс 2) и снова промывают ДМФА или подобным растворителем (процесс 6) для удаления пиперидина. В реактор добавляют раствор Fmoc-Asn(Trt)-OH (13,25 г) и НОВТ (1-гидроксибензотриазол) (3,4 г) в NMP (N-метилпирролидинон) (200 мл). После добавления DIPCI (N,N'-диизопропилкарбодиимид) (3,42 мл) смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 60 минут (процесс 3). Затем смолу промывают NMP (процесс 4) и снова проводят реакцию сочетания с использованием Fmoc-Asn(Trt)-OH (13,25 г), НОВТ (3,4 г) и DIPCI (3,42 мл) (процесс 3). После промывки смолы (процесс 6) ее перемешивают в 25% Ас₂ О (уксусный ангидрид) в течение 3 минут × 1 и в течение 15 минут × 2 для блокировки непрореагировавших аминогрупп (процесс 5). Смолу промывают (процесс 6), затем удаляют защитные группы (процесс 2) и осуществляют промывку (процесс 6) и получают продукт H-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола. Проводят реакцию сочетания с использованием Fmoc-Met-OH (8,25 г), Fmoc-Gln(Trt)-OH (13,56 г), Fmoc-Asn(Trt)-OH (13,25 г), Fmoc-Trp(Boc)-OH (11,69 г), Fmoc-Thr(трет-Bu)-ОН (8,82 г), Fmoc-Tyr(трет-Bu)-ОН (10,2 г) и (Boc-Cys-OH)₂ (19,56 г) подобным образом при условии, что сочетание повторяют три раза в случае затруднения при сочетании. После конденсации размещенного в N-конце (Boc-Cys-OH)₂ (N,N'-трет-бутоксикарбонилцистин) проводят промывку (процесс 6) с последующей двукратной промывкой диэтиловым эфиром (200 мл), затем проводят сушку при пониженном давлении и получают продукт Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(Tpeт-Bu)-Thr(Tpeт-Bu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола (пептидная смола формулы (10)) (22,87 г). Вышеперечисленные процессы синтеза суммированы в следующей таблице.

Таблица 1
Процессы синтеза
Процесс	Реагент	Число обработок	Время (мин)
1) Промывка	ДМФА	200 мл × 3	0,3
МеОН	200 мл × 1	0,3
ДМФА	200 мл × 3	0,3
2) Удаление защитных групп	25% пиперидин / ДМФА	200 мл	3,0
	200 мл	15,0
3) Сочетание	Аминозащищенная аминокислота (3 экв. для каждого) 60 × 1
НОВТ (3 экв.), DIPCI (3 экв.) / NMP 200 мл
4) Промывка	NMP	200 мл × 2	0,3
5) Блокировка	25% уксусный ангидрид / ДМФА	200 мл	3,0
	200 мл	15,0
6) Промывка	ДМФА	200 мл × 5	0,3
МеОН	200 мл × 1	0,3
ДМФА	200 мл × 5	0,3

2. Удаление защитных групп из пептидной смолы, содержащей защитные группы

Смесь (200 мл) трифторуксусная кислота/этандиол/Н ₂О/триизопропилсилан (94/2,5/2,5/1) добавляют к содержащей защитные группы пептидной смоле Boc-Cys(Boc-Cys-OH)-Tyr(Tpeт-Bu)-Thr(Tpeт-Bu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола (22,87 г), полученной согласно описанному выше способу, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. После фильтрации продукта реакции фильтрат добавляют к диэтиловому эфиру (400 мл) при охлаждении на льду. Полученное выпавшее в осадок вещество собирают фильтрацией с использованием стеклянного фильтра и затем промывают диэтиловым эфиром и сушат при пониженном давлении, и получают сырой пептид (8,27 г).

3. Очистка сырого пептида

Полученный сырой пептид (2,76 г) растворяют в смешанном растворителе из 20% водного раствора уксусного ангидрида (1400 мл) и ацетонитрила (35 мл) и полученные нерастворимые вещества удаляют фильтрацией. Полученный раствор сырого пептида очищают с использованием жидкостной хроматографии с обращенной фазой.

Насос типа LC-8A (SHIMADZU CORPORATION);

колонка YMC ODS-A, Ф 5 см × L 50 см, 15-30 мкм;

элюент 1 - H₂O/0,1% ТФК;

элюент 2 - CH₃CN/0,1% ТФК;

скорость потока 60 мл/мин;

детекция УФ 280 нм.

Раствор неочищенного пептида загружают в колонку, уравновешенную 10% элюентом 2. Затем 10% элюент 2 пропускают в течение 30 минут и затем концентрацию элюента 2 повышают до 34% в течение 120 минут. Фракции, содержащие нужный продукт, собирают, ацетонитрил выпаривают при пониженном давлении с последующей лиофилизацией и получают нужный пептид H-Cys(H-Cys-OH)-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (пептид формулы (4)) (0,91 г).

Пример испытаний 1

(Иммунизация мыши (1))

Иммуногенность каждого пептида антигена, полученного в примерах 1-6, оценивают с использованием трансгенных мышей HLA-A2402/K^b (см. WO 02/47474, и далее в данном описании мыши могут называться мышами HLA-A24). При иммунизации каждым пептидом для оценки иммуногенности используют трех мышей.

Фармацевтическую композицию, содержащую каждый такой синтетический пептид, получают следующим образом. Каждый синтетический пептид примеров 1-3, 5, 6 растворяют в ДМСО до 40 мг/мл. Затем раствор (32,5 мкл) смешивают с водой для инъекций (540 мкл). Затем полученный раствор (550 мкл) смешивают с неполным адъювантом Фрейнда (700 мкл) (Montanide ISA51) с использованием стеклянного шприца и получают эмульсию воды в масле. Пептид примера 4 растворяют в ДМСО до 50 мг/мл и также в ДМСО растворяют синтетический хелперный пептид (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE, SEQ ID NO:5) до 20 мг/мл. Затем по 30 мкл растворов обоих пептидов смешивают в воде для инъекций (540 мкл), после чего все смешивают с эквивалентным количеством неполного адъюванта Фрейнда (IFA) и получают эмульсию воды в масле.

Полученный препарат (200 мкл) инъецируют трансгенной мыше HLA-A2402/K^b интрадермально в основание хвоста для иммунизации. Через 7-8 дней после начала эксперимента извлекают селезенку и помещают на матированную часть предметного стекла, и собирают и получают спленопиты. Часть спленоцитов, подвергшихся гемолизу буфером АСК (0,15 М NH₄Cl, 10 мМ КНСО₃, 0,1 мМ ЭДТК, рН 7,2-7,4), обрабатывают в течение 1 часа в импульсном режиме пептидом антигена, используемым при иммунизации (100 мкг/мл), и высевают в 24-луночный планшет (7×10⁶ клеток/лунку). Одновременно добавляют спленоциты, не подвергавшиеся обработке в импульсном режиме каким-либо пептидом (7×10⁵ клеток/лунку), стимулируют in vitro и культивируют при 37°С в течение 5-6 дней. Стимуляцию in vitro осуществляют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FCS, 10 мМ HEPES, 20 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1 мМ заменимых аминокислот MEM, 1% витамина MEM и 55 мкМ 2-меркаптоэтанола. Через 5-6 дней после начала рестимуляции проводят испытание на цитотоксическую активность согласно обычному способу. Клетки EL4-A2402/K^b, полученные трансформацией клеток EL-4 (DAINIPPON PHARMACEUTICAL CO., LTD., каталожный № 06-039) экспрессирующим вектором, кодирующим HLA-A2402/K ^b, и клетки EL4-A2402/K^b, обработанные в импульсном режиме пептидом антигена WT1_235-243 или WT1_235-243 (2М Y), используют в качестве клеток-мишеней (Т). Конкретно, клетки, обработанные в импульсном режиме WT1_235-243 (2М Y), используют для оценки пептидов примеров 1, 3 и 5, а клетки, обработанные в импульсном режиме WT1_235-243 , используют для оценки пептидов примеров 2, 4 и 6. Указанные клетки метят ⁵¹Cr (1,85 МБк/10⁶ клеток) и обрабатывают пептидом в импульсном режиме при 100 мкг/мл в течение часа (мечение осуществляют в течение 2 часов и пептид добавляют через 1 час после инициации мечения). Проводят анализ на высвобождение ⁵¹Cr (J. Immunol, 159: 4753, 1997) для определения цитотоксической активности культивированных in vitro спленоцитов (Е) в отношении клеток-мишеней (Т). В данном анализе отношение Е/Т составляет 80.

Результаты показаны на фигурах 1-7. Фигуры 1-6 соответствуют цитотоксическим активностям пептидов примеров 1-6, соответственно. На фигурах вертикальная ось показывает цитотоксическую активность (специфический лизис), и горизонтальная ось показывает результаты для каждой из трех мышей по отдельности. Кроме того, на фигуре 7 показаны результаты в зависимости от дозы для соединения примера 1. На фигуре вертикальная ось показывает цитотоксическую активность (специфический лизис), и горизонтальная ось показывает отдельные вводимые дозы (600 мкг, 200 мкг, 60 мкг и 20 мкг). На фигуре цитотоксическая активность показана как среднее и среднеквадратическое отклонение (S.D.), при использовании трех мышей для каждой дозы. Как ясно видно из фигур, обнаруживается, что все синтетические пептиды обладают активностью по индукции ЦТЛ, иначе говоря, иммуногенностью.

Пример испытаний 2

(Иммунизация мыши (2))

Пептид примера 1 растворяют в ДМСО до 40 мкг/мл. Затем раствор (32,5 мкл) смешивают с водой для инъекций (540 мкл). Затем полученный раствор (550 мкл) смешивают с неполным адъювантом Фрейнда (700 мкл) (Montanide ISA51 (зарегистрированный товарный знак)) (SEPPIC, Inc., Париж, Франция) с использованием стеклянного шприца, и получают эмульсию воды в масле.

Полученный препарат (200 мкл) инъецируют трансгенной мыше HLA-A2402/K ^b интрадермально в основание хвоста для иммунизации. Через 7 дней после начала эксперимента извлекают селезенку и получают спленоциты обычным способом (WO 02/47474). Затем проводят испытания с использованием набора мышиного IFN-гамма ELISPOT (для ферментного точечного анализа) (Fujisawa, каталожный № BD-551083). Испытание проводят согласно инструкциям, прилагаемым к набору. Спленоциты высевают в количестве 5×10⁵ клеток-лунку и добавляют среду для культивирования, содержащую пептид примера 1, пептид дикого типа (WT1_235-243) или пептид, полученный из вируса гриппа (ASNENMETM, пептид для отрицательного контроля, который не связывается с HLA-A24), в конечной концентрации 10^-6 М, и затем проводят инкубацию с использованием инкубатора с СО₂ при 37°С в течение 18 часов.

Согласно прилагаемым инструкциям планшет промывают и детектируют ряд пятен с использованием системы KS Elispot Research System (Carl Zeiss). Метод Elispot известен как альтернатива испытанию на цитотоксическую активность (J. Immunological Methods, 1995, 181, 45-54). Результаты показаны на фигуре 8. В результате обнаружено, что пептид примера 1 может индуцировать HLA-А24-специфический клеточно-опосредованный иммунитет, который перекресно реагирует с пептидом дикого типа.

Пример испытаний 3

(Испытание с использованием человеческих РВМС)

У здоровых положительных на HLA-A24 субъектов берут периферическую кровь (50 мл) с использованием гепаринизированной вакуумной пипетки для взятия крови. Кровь, разбавленную в два раза PBS (-), доливают к фиколл-паку (Amersham Biosciences), количество которого составляет половину от количества крови, и затем центрифугируют в течение 20 минут при 2000 об/мин. Слой клеток, содержащий мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), собирают, добавляют к ним 3-4-кратное количество PBS (-) и затем центрифугируют в течение 10 минут при 1800 об/мин. Клеточный осадок дважды промывают PBS (-) и собирают РВМС.

РВМС суспендируют в среде для культивирования лимфоцитов (RPMI1640: AIM V=1:1, NEAA, 10% FCS) и выращивают в колбе для культивирования в течение двух часов и собирают неадгезивные клетки. С использованием набора для выделения CD8⁺ Т-клеток II (Miltenyi Biotec) среди неадгезивных клеток собирают Т-клетки, положительные на CD8. Адгезивные клетки выращивают в среде для культивирования лимфоцитов, содержащей GM-CSF (1000 Е/мл) и IL-4 (1000 Е/мл) в течение 7 суток. Плавающие клетки собирают как фракцию антигенпредставляющих клеток, содержащую дендритные клетки (DC). Собранные клетки замораживают для сохранения до тех пор, пока их не используют для экспериментов.

Фракцию DC, полученную так, как описано выше, обрабатывают в импульсном режиме пептидом примера 1 (50 мкг/мл) инкубацией клеток с пептидом в течение одного часа в среде AIM-V, содержащей митомицин (50 мкг/мл). После промывки средой три раза добавляют еще пептид примера 1 (50 мкг/мл) для обработки в импульсном режиме и получают антигенпредставляющие клетки. В день 0 антигенпредставляющие клетки, обработанные пептидом в импульсном режиме, добавляют к Т-клеткам, положительным на CD8, для проведения первой стимуляции, и клетки начинают культивировать в среде для культивирования лимфоцитов, содержащей IL-7 (10 нг/мл), с использованием 24-луночного планшета. В день 7 Т-клетки собирают и после их промывки проводят пептидную стимуляцию с использованием антигенпредставляющих клеток, обработанных пептидом в импульсном режиме, подобно первой стимуляции. На следующий день (день 8) добавляют IL-2 так, чтобы концентрация составляла 50 Е/мл. В день 14 Т-клетки собирают и проводят третью стимуляцию подобно первой или второй стимуляции. На следующий день (день 15) добавляют IL-2 так, чтобы концентрация составляла 50 Е/мл. В день 21 Т-клетки собирают и замораживают для сохранения.

В день 21 1×10⁵ Т-клеток добавляют к 2×10⁴ клеткам VA13/A2402, экспрессирующим HLA-A2402, подвергавшимися или не подвергавшимися обработке в импульсном режиме каждым из пептидов (пептидом дикого типа (WT1_235-243 ), модифицированным пептидом (WT1_235-243 (2М Y)) или пептидом примера 1), и через 18 часов собирают супернатант для определения количества IFN- с использованием ELISA.

Результаты по пептидспецифической реактивности Т-клеток, стимулированных синтетическим пептидом примера 1, приводятся на фигуре 9. Стимулированные пептидом примера 1 Т-клетки не взаимодействуют с клетками, неподвергавшимися обработке в импульсном режиме, но они в достаточной степени взаимодействуют с клетками, подвергавшимися обработке в импульсном режиме пептидом примера 1. Таким образом, обнаружено, что Т-клетки, специфические для пептида, взаимодействуют с клетками, обработанными в импульсном режиме пептидом дикого типа (WT1_235-243), а также клетками, обработанными в импульсном режиме модифицированным пептидом (WT1_235-243 (2M Y)).

Препаративный пример 1

1. Синтез пептидной смолы, содержащей защитные группы (H-Cys(Trt)-Tyr(Tpeт-Bu)-Thr(Tpeт-Bu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола)

Смолу Fmoc-Leu-Alko-смола (где Alko представляет собой п-алкоксибензиловый спирт) (10 г) (0,82 ммоль/г, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) загружают в реактор (500 мл, твердофазный синтезатор типа АСТ90, Advanced ChemTech) и промывают один раз ДМФА или подобным растворителем (процесс 1). Затем смолу обрабатывают 25% Pip (пиперидин) (3 минуты × 1 и 15 минут × 1) для отщепления групп Fmoc (процесс 2) и снова промывают ДМФА или подобным растворителем (процесс 1) для удаления Pip. В реактор добавляют раствор Fmoc-Asn(Trt)-OH (24,46 г) и НОВТ (1-гидроксибензотриазол) (6,28 г) в NMP (N-метилпирролидинон) (200 мл). После добавления DIPCI (N,N'-диизопропилкарбодиимид) (6,3 мл) смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут (процесс 3). Через тридцать минут смолу промывают NMP (процесс 4), и снова один раз подвергают реакции сочетания с использованием Fmoc-Asn(Trt)-OH (24,46 г), НОВТ (6,28 г) и DIPCI (6,3 мл) (процесс 5) для синтеза смолы Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола. Затем полученную смолу превращают в H-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола, отщепляя защитные группы в процессе 2. После промывки (процесс 1) последовательно добавляют 15,23 г Fmoc-Met-OH, 25,04 г Fmoc-Gln(Trt)-OH, 24,46 г Fmoc-Asn(Trt)-OH, 21,59 г Fmoc-Trp(Boc)-OH, 16,3 г Fmoc-Thr(трет-Bu)-ОН, 18,84 г Fmoc-Tyr(трет-Bu)-ОН и 24,01 г Fmoc-Cys(Trt)-OH для проведения реакции сочетания (процесс 3). В реакции сочетания с использованием Fmoc-Thr(Tper-Bu)-OH реакцию повторяют три раза и полученную смолу промывают ДМФА и обрабатывают 25% Ac₂O (уксусный ангидрид) (15 минут × 2) для блокировки непрореагировавших аминогрупп. После конденсации размещенного в N-конце Fmoc-Cys(Trt)-OH проводят удаление защитной группы (процесс 2) и промывку (процесс 6), и получают продукт H-Cys(Trt)-Tyr(Tpeт-Bu)-Thr(Tpeт-Bu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола. Вышеперечисленные процессы синтеза суммированы в следующей таблице.

Таблица 2
Процессы синтеза
Процесс	Реагент	Число обработок	Время (мин)
1) Промывка	ДМФА	200 мл × 6	0,3
МеОН	200 мл × 1	0,3
ДМФА	200 мл × 3	0,3
2) Удаление защитных групп	25% пиперидин / ДМФА	200 мл	3,0
	200 мл	15,0
3) Сочетание	Аминозащищенная аминокислота (5 экв. для каждого) 30 × 1
НОВТ (5 экв.) DIPCI (5 экв.)/NMP 200 мл
4) Промывка	NMP	200 мл × 2	0,3
5) Сочетание	Аминозащищенная аминокислота (5 экв. для каждого) 30 × 1
НОВТ (5 экв.) DIPCI (5 экв.)/NMP 200 мл
6) Промывка	ДМФА	200 мл × 5	0,3
МеОН	200 мл × 1	0,3
ДМФА	200 мл × 2	0,3

2. Удаление защитных групп из пептидной смолы, содержащей защитные группы

Смешанный раствор трифторуксусная кислота/этандиол/H ₂O/триизопропилсилан (94/2,5/2,5/1) (100 мл) добавляют к содержащей защитные группы пептидной смоле (Н-Cys(Trt)-Tyr(Tpeт-Bu)-Thr(Tpeт-Bu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола) (10,0 г), полученной так, как описано выше, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь добавляют к трет-бутилметиловому эфиру (625 мл) при охлаждении на льду, полученную смесь перемешивают в течение 15 минут и затем фильтруют с использованием стеклянного фильтра, и получают нерастворимые вещества. После промывки остатка на фильтре трет-бутилметиловым эфиром (примерно 100 мл) пять раз остаток на фильтре экстрагируют 6 М водным раствором гидрохлорида гуанидина (1 л) и получают раствор сырого пептида.

3. Очистка сырого пептида

Полученный раствор сырого пептида очищают с использованием жидкостной хроматографии с обращенной фазой.

Насос типа LC-8A (SHIMADZU CORPORATION);

колонка YMC ODS-A, Ф 5 см × L 50 см, 15-30 мкм;

элюент 1 - H₂O/0,1% ТФК;

элюент 2 - CH₃CN/0,1% ТФК;

скорость потока 60 мл/мин;

детекция УФ 220 нм.

Раствор неочищенного пептида загружают в колонку, уравновешенную 10% элюентом 2, и выдерживают на водяной бане при 50°С. После пропускания 10% элюента 2 в течение 30 минут концентрацию элюента 2 повышают до 20% в течение 40 минут и затем повышают до 40% в течение 360 минут. Фракции, содержащие нужный продукт, собирают, ацетонитрил выпаривают при пониженном давлении с последующей лиофилизацией и получают нужный пептид H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (SEQ ID NO:2) (1,50 г).

- Анализ аминокислот

Гидролиз: 1% фенола / 6 N соляная кислота, 110°С, 10 часов.

Метод анализа нингидринный.

Asx: 1,96(2); Thr: 1,05(1); Glx: 1,06(1); Met: 1,05(1); *Leu: (1); Tyr: 0,87(1).

*) Leu = стандартная аминокислота. Теоретическая величина описана в ().

- Анализ массы: ЖХ-ESI-MC m/z=1173 [М+1]⁺ (теоретическая величина = 1172,5).

- Анализ аминокислотной последовательности. Потверждается последовательность аминокислотных остатков от Tyr в позиции 2 от N-конца до Leu в С-конце.

Препаративный пример 2

1. Синтез содержащей защитные группы пептидной смолы (H-Cys(Trt)-Met-Thr(Tpeт-Bu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола)

Смолу Fmoc-Leu-Alko-смола (где Alko представляет собой п-алкоксибензиловый спирт) (10 г) (0,81 ммоль/г, Watanabe Chemical Industries, Ltd.) загружают в реактор (500 мл, твердофазный синтезатор типа АСТ90, Advanced ChemTech) и промывают один раз ДМФА или подобным растворителем (процесс 1). Затем смолу обрабатывают 25% Pip (пиперидин) (3 минуты × 1 и 15 минут × 1) для отщепления групп Fmoc (процесс 2) и снова промывают ДМФА или подобным растворителем (процесс 1) для удаления Pip. В реактор добавляют раствор Fmoc-Asn(Trt)-OH (24,17 г) и НОВТ (1-гидроксибензотриазол) (6,2 г) в NMP (N-метилпирролидинон) (200 мл). После добавления DIPCI (N,N'-диизопропилкарбодиимид) (6,2 мл) смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 минут (процесс 3). Через тридцать минут смолу промывают NMP (процесс 4) и снова один раз подвергают реакции сочетания с использованием Fmoc-Asn(Trt)-OH (24,17 г), НОВТ (6,2 г) и DIPCI (6,2 мл) (процесс 5) для синтеза смолы Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола. Затем полученную смолу превращают в H-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола. Затем полученную смолу превращают в H-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола, удаляя защитные группы в процессе 2. После промывки (процесс 1) последовательно добавляют 15,05 г Fmoc-Met-OH, 24,73 г Fmoc-Gln(Trt)-OH, 24,17 г Fmoc-Asn(Trt)-OH, 21,33 г Fmoc-Trp(Boc)-OH, 16,1 г Fmoc-Thr(трет-Bu)-OH, 15,05 г Fmoc-Met-OH и 23,72 г Fmoc-Cys(Trt)-ОН для проведения реакции сочетания (процесс 3). В реакции сочетания с использованием Fmoc-Thr(трет-Bu)-OH реакцию повторяют три раза и полученную смолу промывают ДМФА и обрабатывают 25% Ac₂O (уксусный ангидрид) (15 минут × 2) для блокировки непрореагировавших аминогрупп. После конденсации размещенного в N-конце Fmoc-Cys(Trt)-OH проводят удаление защитной группы (процесс 2) и промывку (процесс 6) и получают продукт H-Cys(Trt)-Met-Thr(трет-Bu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола. Вышеперечисленные процессы синтеза суммируют так же, как описано в таблице в препаративном примере 1.

2. Удаление защитных групп из пептидной смолы, содержащей защитные группы

Смесь трифторуксусная кислота/этандиол/Н₂ О/триизопропилсилан (94/2,5/2,5/1) (130 мл) добавляют к содержащей защитные группы пептидной смоле (H-Cys(Trt)-Met-Thr(TpeT-Bu)-Trp(Boc)-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Met-Asn(Trt)-Leu-Alko-смола) (13,0 г), полученной так, как описано выше, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь добавляют к диэтиловому эфиру (800 мл) при охлаждении на льду и полученную смесь перемешивают в течение 15 минут и затем фильтруют с использованием стеклянного фильтра, и получают нерастворимые вещества. После промывки остатка на фильтре диэтиловым эфиром (примерно 100 мл) пять раз остаток на фильтре экстрагируют 6 М водным раствором гидрохлорида гуанидина (1,3 л) и получают раствор сырого пептида.

3. Очистка сырого пептида

Полученный раствор сырого пептида очищают с использованием жидкостной хроматографии с обращенной фазой.

Насос типа LC-8A (SHIMADZU CORPORATION);

колонка YMC ODS-A, Ф 5 см × L 50 см, 15-30 мкм;

элюент 1 - H₂O/0,1% ТФК;

элюент 2 - СН₃СН/0,1% ТФК;

скорость потока 60 мл/мин;

детекция УФ 220 нм.

Раствор неочищенного пептида загружают в колонку, уравновешенную 10% элюентом 2, и выдерживают на водяной бане при 50°С. После пропускания 10% элюента 2 в течение 30 минут концентрацию элюента 2 повышают до 20% в течение 40 минут и затем повышают до 40% в течение 360 минут. Фракции, содержащие нужный продукт, собирают, ацетонитрил выпаривают при пониженном давлении с последующей лиофилизацией и получают нужный пептид H-Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH (SEQ ID NO:1) (2,32 г).

- Анализ аминокислот

Гидролиз: 4 N метансульфоновая кислота, 110°С, 17 часов.

Метод анализа нингидринный.

Asx: 1,87(2); Thr: 0,93(1); Glx: 0,95(1); Met: 1,72(2); *Leu: (1); Trp: 0,80(1).

*) Leu = стандартная аминокислота. Теоретическая величина описана в ().

- Анализ массы: ЖХ-ESI-MC m/z=1141 [М+1]⁺ (теоретическая величина = 1140,5).

- Анализ аминокислотной последовательности. Подтверждается последовательность аминокислотных остатков от Met в позиции 2 от N-конца до Leu в С-конце.

5. Промышленная применимость

Пептиды по настоящему изобретению применимы в качестве активного ингредиента, включенного в лекарственное средство для иммунотерапии рака.

Перечень последовательностей в исходном тексте

SEQ ID NO:1 - производное пептида

SEQ ID NO:2 - производное пептида

SEQ ID NO:3 - производное пептида

SEQ ID NO:4 - производное пептида

SEQ ID NO:5 - хелперный синтетический пептид.