способ получения d-глюкозы, меченной изотопом углерода в положении 1

Формула изобретения

1. Способ получения D-глюкозы, меченной изотопом углерода в положении 1, заключающийся в конденсации D-арабинозы с меченым нитрометаном, взятых в эквимолярном соотношении, в диметилсульфоксиде в присутствии основания, последующей бензольной экстракции избытка диметилсульфоксида, лиофилизации из бензола, охлаждении полученной смеси солей 1-дезокси-1-нитроальдитов до температуры жидкого азота, прибавлении воды, последующем медленном оттаивании при перемешивании и разложении солей 1-дезокси-1-нитроальдитов, содержащихся в полученном водном растворе, и выделении D-глюкозы с помощью хроматографии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве основания используют метилат натрия или гидроксид натрия.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для расщепления натриевых солей 1-дезокси-1-нитроальдитов используют серную кислоту или озон.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к органической химии, в частности к способам получения гексоз, содержащих изотопы углерода ¹³С или ¹⁴С, в частности D-глюкозы, меченной изотопом углерода в положении 1. Полученные продукты могут быть использованы в медицине в качестве изотопных диагностических средств, а также в научных исследованиях и других областях. Например, 1-¹³C-D-глюкоза может быть использована для диагностики онкологических заболеваний.

В работе [J.C.Sowden, H.O.Fischer, J. Am. Chem. Soc. 69, 1963 (1947)] раскрыт способ получения D-глюкозы путем конденсации D-арабинозы с нитрометаном в метаноле в присутствии метилата натрия и последующего разложения солей 1-дезокси-1-нитроальдитов действием серной кислоты при низкой температуре. Недостатком предложенного способа является низкий выход целевого продукта в связи с большими потерями солей 1-дезокси-1-нитроальдитов вследствие их ретрораспада при выделении из реакционной среды путем обработки катионитом и последующей кристаллизации. Другим серьезным недостатком этой методики является необходимость использования большого избытка нитрометана (11 экв.), что делает этот подход неприменимым для синтеза изотопно-меченой глюкозы. Позднее этот же способ был применен для синтеза 1- ¹⁴C-глюкозы, исходя из ¹⁴С-меченого нитрометана [J.C.Sowden, J. Biol. Chem. 180, 55 (1949)]. Выход глюкозы в расчете на нитрометан в обоих случаях не превышает 6%.

Аналогичный подход был использован в работе [K.-O.Schoeps, B.Langstrom, S.Stone-Elander, C.Halldin, Appl. Radiat. Isot, 42, 877 (1991)] для синтеза 1-¹¹С-глюкозы, однако вместо метанола в качестве растворителя использовали диметилсульфоксид (ДМСО), а в качестве основания - водный раствор NaOH. Для разложения солей 1-дезокси-1-нитроальдитов в этой работе также применяли серную кислоту. Реакционную смесь нейтрализовали на колонке с анионитом, отделяли ДМСО на колонке с аминофазой, а моносахарид выделяли с помощью ВЭЖХ. Для синтеза использовали недостаток нитрометана (0,7 экв.); при этом выход глюкозы в расчете на нитрометан составил 10%. Предложенная методика не пригодна для синтеза больших количеств глюкозы, т.к. масштабирование данного процесса требует дорогостоящих препаративных колонок для ВЭЖХ и неэффективно с ценовой точки зрения. Кроме того, особенностью обоих изложенных способов является кислотное разложение солей 1-дезокси-1-нитроальдитов, которое требует нейтрализации кислоты большим количеством анионита или гидроксида бария, что крайне неудобно с препаративной точки зрения при проведении синтеза в крупных масштабах, хотя и приемлемо для маломасштабных синтезов.

Поэтому был предложен другой вариант нитрометанового способа получения L-глюкозы из L-арабинозы, где расщепление солей 1-дезокси-1-нитроальдитов до свободных моносахаридов осуществляли действием озона [Patent 278067 SK, C07H 3/02, 19.02.1992] (прототип), что практически не ограничивает масштабирование синтеза. В этой работе конденсацию нитрометана с арабинозой проводили в присутствии метилата натрия в ДМСО, избыток которого удаляли фильтрованием осадка солей 1-дезокси-1-нитроальдитов с последующей их промывкой спиртами. После обработки полученных солей озоном образовавшуюся D-глюкозу выделяли из реакционной смеси кристаллизацией в виде фенилгидразона. Недостатком данного способа является необходимость фильтрования солей 1-дезокси-1-нитроальдитов с последующей промывкой н-бутанолом и смесью н-бутанола и метанола на воздухе с целью отделения диметилсульфоксида, в ходе которого протекает частичное разложение указанных солей и образование побочных примесей, что заставило авторов очищать L-глюкозу в виде фенилгидразона и лишь затем выделять ее в свободном виде с помощью лигандообменной хроматографии. Кроме того, в данном способе используют значительный избыток нитрометана (2,8 экв.), что весьма удорожает этот подход к синтезу изотопно-меченой глюкозы. Выход глюкозы в расчете на нитрометан составил 7%.

Задачей предлагаемого изобретения была разработка эффективного способа получения меченой D-глюкозы, меченной в положении 1, обеспечивающего повышение выхода и усовершенствование процесса. Поставленная задача решается тем, что конденсацию D-арабинозы с меченым нитрометаном, взятых в эквимолярном соотношении, проводят в растворе в диметилсульфоксиде в присутствии основания. В качестве основания используют метилат натрия или гидроксид натрия. Для отделения избытка диметилсульфоксида используют экстракцию реакционной смеси бензолом при комнатной температуре, после лиофилизации остатков бензола натриевые соли 1-дезокси-1-нитроальдитов получают в виде сухого порошка или сухой пены. Полученную смесь солей 1-дезокси-1-нитроальдитов охлаждают до температуры жидкого азота и прибавляют воду. Последующее медленное оттаивание при перемешивании позволяет получить водный раствор натриевых солей 1-дезокси-1-нитроальдитов в мягких условиях. Разложение солей 1-дезокси-1-нитроальдитов, содержащихся в полученном водном растворе, действием серной кислоты или озона приводит к смеси D-глюкозы, D-маннозы и D-арабинозы, из которой меченую D-глюкозу выделяют с помощью лигандообменной хроматографии.

Особенностью и одним из преимуществ предлагаемой методики является использование эквимолярного (1:1) соотношения реагентов (арабинозы и меченого нитрометана), что позволяет повысить эффективность использования изотопного сырья, минимизировав его расход, и тем самым повысить выход целевой глюкозы в расчете на введенный в реакцию нитрометан. С помощью этой методики впервые удалось получить синтетическую глюкозу с выходом 14% в расчете на введенный в реакцию нитрометан.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами его реализации.

Пример 1

1 г D-арабинозы (6,66 ммоль) растворили в 6 мл ДМСО, прибавили при перемешивании 360 мкл (6,66 ммоль) меченого нитрометана (¹³CH ₃NO₂), колбу заполнили аргоном, при перемешивании прибавили 2 мл раствора MeONa в МеОН (получен из 212 мг или 8,8 ммоль Na) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Метанол отогнали в вакууме без нагревания, к полученному раствору прибавили при интенсивном перемешивании 40 мл бензола, образовавшуюся суспензию центрифугировали, супернатант отбросили. Экстракцию бензолом повторили еще два раза до полного отсутствия ДМСО в экстракте (контроль - по отсутствию нелетучего остатка после испарения бензола). Полученный желтый осадок заморозили и лиофилизовали. Получили 2 г желтого порошка, который заморозили в жидком азоте, прибавили 10 мл воды, дали оттаять образовавшемуся льду и в полученный раствор при +10°С продували озон до существенного исчезновения окраски реакционной смеси. Остаток озона отдули, барботируя аргон через полученный раствор. Реакционную смесь деионизовали последовательной обработкой ионообменными смолами Amberlyst 15 (H⁺) и Dowex 1×8(HCO ₃ ^-), раствор лиофилизовали. Полученный сироп фракционировали на колонке с Dowex 50×8 (Ca²⁺ ) при элюировании водой. Выход D-глюкозы, меченной изотопом ¹³С, составил 170 мг (14,0%).

Пример 2

Синтез проводили аналогично примеру 1, однако после добавления меченого нитрометана (¹³CH₃NO ₂) в колбу при перемешивании прибавили 670 мкл 10 N раствора NaOH в воде (6,7 ммоль) и далее перемешивали при 40°С в течение 30 мин. Раствор охладили до комнатной температуры и прибавили при интенсивном перемешивании 40 мл бензола и далее обрабатывали, как описано в примере 1, до полного удаления ДМСО. Полученный желтый сироп заморозили и лиофилизовали. Полученную желтую пену подвергали озонолизу, как описано в примере 1, продувая озон до значения рН реакционной смеси 7,5-8,0 (5,5 мин). Выход D-глюкозы, меченной изотопом ¹³С, составил 125 мг (10,3%).

Пример 3

Синтез проводили аналогично примеру 2, однако использовали половинную загрузку: 500 мг D-арабинозы (3,33 ммоль), 3 мл ДМСО, 180 мкл меченого нитрометана (¹³ CH₃NO₂) (3,33 ммоль) и 350 мкл 10 N раствора NaOH (3,5 ммоль). Желтую пену, полученную после отделения ДМСО экстрацией бензолом, заморозили в жидком азоте, прибавили 10 мл воды, дали оттаять образовавшемуся льду. Полученный раствор при интенсивном перемешивании прибавили к смеси 1,1 мл конц. H₂SO₄ и 1,4 мл воды при -20°С. Дали нагреться до +10°С при перемешивании. Раствор разбавили водой до объема 30 мл, нейтрализовали кислоту анионитом Dowex 1×8 (НСО₃ ^-) до pH 7, смолу отфильтровали. Фильтрат обессолили последовательной обработкой катионитом Dowex 50×8 (H ⁺) и анионитом Dowex 1×8 (НСО₃ ^-). Фильтрат заморозили и лиофилизовали. Полученный сироп фракционировали на колонке с Dowex 50×8 (Са²⁺ ) при элюировании водой. Выход D-глюкозы, меченной изотопом С, составил 71 мг (11,5%).

Пример 4

2.5 г D-арабинозы (16,65 ммоль) растворили в 15 мл ДМСО, прибавили при перемешивании 900 мкл (16,65 ммоль) меченого нитрометана (¹³CH₃NO₂), колбу заполнили аргоном, при перемешивании прибавили 670 мг порошкообразного NaOH (16.65 ммоль) и перемешивали при 40°С ч. К полученному раствору прибавили при интенсивном перемешивании 40 мл бензола, образовавшуюся суспензию центрифугировали, супернатант отбросили. Экстракцию бензолом повторили еще два раза до полного отсутствия ДМСО в экстракте (контроль - по отсутствию нелетучего остатка после испарения бензола). Полученный желтый осадок заморозили и лиофилизовали. Полученный желтый порошок заморозили в жидком азоте, прибавили 15 мл воды, дали оттаять образовавшемуся льду и в полученный раствор при +10°С продували озон до pH 7. Остаток озона отдули, барботируя аргон через полученный раствор. Реакционную смесь деионизовали последовательной обработкой ионообменными смолами Amberiyst 15 (H⁺) и Dowex 1×8 (НСО₃ ^-), раствор лиофилизовали. Полученный сироп фракционировали на колонке с Dowex 50×8 (Ca²⁺ ) при элюировании водой. Выход D-глюкозы, меченной изотопом ¹³С, составил 378 мг (12,5%).

Подобным же образом при использовании ¹⁴C-меченого нитрометана (¹⁴CH₃NO₂) может быть получена D-глюкоза, меченная изотопом ¹⁴С. Преимущество данного способа состоит в том, что бензольная экстракция ДМСО, проводимая при комнатной температуре, позволяет быстро получить натриевые соли 1-дезокси-1-нитроальдитов в сухом виде без заметного разложения последних. Это повышает устойчивость натриевых солей 1-дезокси-1-нитроальдитов при хранении, увеличивает выход целевой D-глюкозы в расчете на введенный в реакцию нитрометан, а также резко снижает объем примеси диметилсульфоксида, что существенно облегчает контроль за полнотой превращения солей при озонолизе и выделение целевого продукта. Предложенная бензольная экстракция диметилсульфоксида из реакционной смеси значительно упрощает способ получения D-глюкозы и ранее не применялась в подобном процессе.

Для уменьшения разложения натриевых солей 1-дезокси-1-нитроальдитов при растворении в воде был применен оригинальный прием, заключающийся в предварительном охлаждении сосуда, содержащего сухие натриевые соли 1-дезокси-1-нитроальдитов, до температуры жидкого азота и быстрого прибавления необходимого количества воды, которая при этом сразу замерзает. Оттаивание полученной смеси солей при перемешивании позволяет получить водный раствор натриевых солей 1-дезокси-1-нитроальдитов в мягких условиях. Данная процедура также увеличивает выход целевого продукта - D-глюкозы - в расчете на введенный в реакцию нитрометан.

Выделение моносахарида проводится с помощью лигандообменной хроматографии в воде, что позволяет уверенно проводить очистку граммовых количеств смесей и существенно упрощает процедуру выделения конечного продукта.

Одним из преимуществ предлагаемой методики является также использование эквимолярного (1:1) соотношения реагентов (арабинозы и нитрометана), что позволяет повысить эффективность использования изотопного сырья, минимизировав его расход.

Сравнение различных способов синтеза глюкозы (Glc) из арабинозы (Ага) нитрометановым методом
Способ	Ara, ммоль	CH3NO 2, ммоль	CH 3NO2/Ara, моль/моль	Удаление растворителя	Метод разложения солей 1-дезокси-1-нитроальдитов	Выход Glc в расчете на CH3NO2, %	Метод выделения Glc
(Patent 278067 SK)	66,6	185	2,78	Фильтрование	O3	7	Образование фенилгидразона,
Прототип							кристаллизация, затем лигандо-обменная хроматография
Пример 1	6.66	6,66	1,0	Экстракция бензолом	O3	14	лигандо-обменная хроматография
Пример 2	6,66	6,66	1,0	Экстракция бензолом	O3	10	лигандо-обменная хроматография
Пример 3	3,33	3,33	1,0	Экстракция бензолом	H2SO 4	12	лигандо-обменная хроматография
Пример 4	16,65	16,65	1,0	Экстракция бензолом	O3	12	лигандо-обменная хроматография