способ диагностики течения сальмонеллёзно-протозойных острых кишечных инфекций у детей

Формула изобретения

Способ диагностики течения сальмонеллезно-протозойной инфекции у детей путем исследования проб кала у больных острыми кишечными инфекциями бактериологическим и микроскопическим методом, отличающийся тем, что предварительно одну пробу кала больного концентрируют путем эфир-уксусной седиментации, из полученного осадка готовят одновременно три мазка: первый из них - окрашивают карболовым фуксином по Цилю-Нильсену для индикации кислотоустойчивых кишечных простейших, второй - 1% раствором Люголя для обнаружения лямблий, третий - поливалентными адсорбированными сыворотками в реакции непрямой иммунофлуоресценции для индикации сальмонелл и при обнаружении специфического свечения диагностируют сальмонеллезно-протозойную острую кишечную инфекцию, причем если их количество в поле зрения составляет 1-4 клеток - диагностируют легкую форму, от 5-12 клеток - тяжелую форму инфекции.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии и инфекционным болезням, и может быть использовано для диагностики различных форм сальмонеллезно-протозойных острых кишечных инфекций у детей.

Особая актуальность проблемы сальмонеллезов определяется продолжающимся ростом их удельного веса в инфраструктуре острых кишечных инфекций (ОКИ). Преимущественное поражение сальмонеллезом детей, особенно раннего возраста, повсеместная распространенность, тяжесть и характер инфекционного процесса при сальмонеллезе, нередко принимающий затяжное и рецидивирующее течение, определяют приоритетность изучения проблемы.

В значительном числе случаев сальмонеллезы протекают по типу смешанных инфекций. На долю смешанных форм, по данным разных авторов, приходится до 70%. В структуре ассоциантов, при смешанных формах сальмонеллезов, наряду с иными типами энтеробактерий, а также вирусами, ведущее место занимают кишечные простейшие. Нередко такое сочетание возбудителей вызывает искажение типичной клинической симптоматики, а также делает неэффективными либо малоэффективными стандартные схемы антибактериальной терапии, что в целом значительно ухудшает исходы заболевания. В связи с этим улучшение этиологической расшифровки сочетанных сальмонеллезно-протозойных форм заболевания, таких как сальмонеллезно-лямблиозная, сальмонеллезно-криптоспоридиозная, сальмонеллезно-амебиазная и т.д., направленное на более полное выявление протозойной инвазии у детей с затяжными формами сальмонеллезов и дальнейшее проведение им адекватной терапии, является актуальной и неотложной проблемой инфектологии.

Известны способы диагностики смешанных форм ОКИ на основе оценки адгезивной активности возбудителей в смешанных инфекциях различной этиологии. Так, известен способ диагностики смешанных форм ОКИ, обусловленных Klebsiella spp., Citrobacter spp., Rettgerella spp. в ассоциации с Proteus vulgaris, основанный на выявлении адгезинов путем поиска клеток-мишеней и выяснении роли органелл, определяющих степень адгезивной активности бактерий рода Proteus в реакции гемагглютинации (З.Г.Габидуллин, И.Б.Ишкильдин. Башкирский медицинский институт Минздрава РСФСР, Уфимский НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Минздрава СССР, Уфа // Сб. научных трудов «Смешанные инфекции», НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, М., 1986).

Однако предложенный способ диагностики смешанных бактериально-протейных ОКИ, основанный на индикации адгезинов протея, лишь косвенно свидетельствует об этиологической роли протея в развитии микст-инфекционного процесса в кишечнике, т.к. способ не позволяет выявить истинный механизм взаимодействия штаммов возбудителей ОКИ, таких как Klebsiella spp., Citrobacter spp., Rettgerella spp. с Proteus vulgaris.

Известен также способ диагностики ОКИ условно-патогенной и смешанной этиологии (Диагностика, прогнозирование течения и лечения острых кишечных инфекций условно-патогенной и смешанной этиологии // Мет. рекоменд., Ленинградский НИИ детских инфекций, Ленинград, 1990 г.), основанный на проведении комплекса последовательных бактериологических и серологических исследований, обеспечивающих регистрацию нарастания титра антител УПМ (уровень специфических антител в РА с аутоштаммом или РПГА с эритроцитарным диагностикумом), в совокупности с клинической симптоматикой, свидетельствующей об ОКИ у ребенка, обусловленной УПМ, и направленных на подтверждение значимости выделенных микроорганизмов и их ассоциаций.

Однако вышеописанный способ диагностики ОКИ смешанной этиологии касается лишь бактериально-бактериальных сочетанных инфекций и не затрагивает взимоотношений в бактериально-протозойных ассоциациях, а также является весьма трудоемким и продолжительным по времени диагностики и не обеспечивавет точности.

В настоящее время в доступных нам источниках способа диагностики протозойно-бактериальных ОКИ не обнаружено.

Наиболее близким к предлагаемому способу является метод диагностики смешанных форм, описанный в МУ № 04-723/3 от 17.12.1984 г. «Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями», и МУК 4.2.735-99 «Паразитологические методы лабораторной диагностики гельминтозов и протозоозов», 2000 г. Согласно этому методу диагностика сальмонеллезной инфекции проводится преимущественно при помощи бактериологического исследования с использованием стандартных методик выделения и идентификации сальмонелл. Исследование предусматривает выделение сальмонелл в бактериологической лаборатории. При этом исследование фекалий пациента на кишечные протозоозы проводится в клинической лаборатории по общепринятой методике. Таким образом основным недостатком вышеописанного метода является проведение исследований проб фекалий от больного с подозрением на сальмонеллезно-протозойную ОКИ в различных лабораториях: бактериологической - для выделения сальмонелл и клинической - проведение протозооскопии. При этом исследования проб на сальмонеллез и протозоозы не всегда проводится из одной порции фекалий больного. Такой алгоритм проведения исследований не обеспечивает доказательств смешанной природы сальмонеллезно-протозойной ОКИ, не обладает достаточной результативностью и точностью.

С целью устранения вышеописанных недостатков авторами предложен принципиально новый способ диагностики течения сальмонеллезно-протозойных острых кишечных инфекций.

Технический результат заключается в повышении точности диагностики за счет количественной оценки адгезивной активности одновременно исследуемых проб кала как на сальмонеллы, так и на кишечные простейшие.

Этот результат достигается тем, что в известном способе, включающем исследование проб кала у больных с острыми кишечными инфекциями бактериологическим методом на сальмонеллы и микроскопическим методом на цисты простейших, согласно изобретению пробу кала концентрируют, из полученной взвеси готовят 3 мазка, одновременно в течение 1-1,5 ч окрашивают карболовым фуксином по Цилю-Нильсену для индикации кислотоустойчивых кишечных простейших, 1% раствором Люголя для обнаружения лямблий, поливалентными адсорбированными сыворотками в реакции непрямой иммунофлюоресценции для индикации сальмонелл и при наличии специфического свечения сальмонелл на поверхности цист простейших устанавливают смешанную этиологию сальмонеллезно-протозойной ОКИ, а по количеству адгезированных клеток сальмонелл на цистах в поле зрения, равному от 1-4, диагностируют легкую форму, от 5-12 клеток - затяжную форму инфекции.

Доля обнаружения и доказательства этиологической значимости цист простейших в ассоциации с сальмонеллами при помощи метода, предложенного авторами, составила 89%, тогда как выявление ассоциантов с применением прототипного метода разрозненного обнаружения на базах двух различных лабораторий, в сравнении с авторским методом, составила всего 15%(см. чертеж).

Мы впервые предлагаем одновременное приготовление мазков для окрашивания как на кислотоустойчивые кишечные простейшие, так и на лямблии, а также на сальмонеллы.

Мы предлагаем проводить предварительную концентрацию и обогащение пробы фекалий, путем эфир-уксусной седиментации цист простейших. При этом нами обнаружено достижение наибольшей концентрация цист, необходимой для дальнейшего исследования пробы на сальмонеллы.

Впервые нами установлена способность сальмонелл проявлять адгезивную активность к поверхности цист простейших, что является основным механизмом развитию инфекционного процесса, подобно механизму адгезии на клетках нефагоцитирующего эпителия, а также свободных клетках многоклеточных организмов. Авторы установили, что выявление сальмонелл, адгезированных на поверхности цист простейших, является подтверждением смешанного характера инфекции при сальмонеллезно-протозойном процессе в кишечнике, поскольку проведение этапов окраски и отмывки при постановке реакии непрямой иммунофлюоресценции полностью исключает возможность неспецифического характера адгезии сальмонелл на цистах.

Отличием способа является тот факт, что на постановку диагноза сальмонеллезно-протозойной инфекции затрачивается 1-1,5 ч, в отличие от наиболее близкого прототипного способа, при котором индикация сальмонелл и кишечных простейших требует 24-48 часов. Мы для окраски используем сальмонеллезную адсорбированную поливалентную АВСDЕ сыворотку, что подтверждает специфичность свечения в реакции непрямой иммунофлюоресценции на сальмонеллы.

Авторы впервые предлагают количественный учет адгезированных на цистах кишечных простейших сальмонелл и по количеству адгезированных клеток сальмонелл на цистах в поле зрения, равному от 1-4, диагностируют легкую степень, от 5-12 клеток сальмонелл - тяжелую степень течения смешанной инфекции, прогнозируя тем самым степень тяжести течения затяжных форм сальмонеллезно-протозойных ОКИ.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Пробы кала от пациентов с острыми кишечными инфекциями сальмонеллезной этиологии, доставленные в лабораторию, подвергаются эфир-уксусной седиментации для достижения наибольшей концентрации предполагаемо находящихся в них цист и трофозоитов кишечных простейших. Из получившегося осадка одновременно готовят три мазка. В один препарат немедленно вносят каплю 1%-ного водного раствора Люголя для дифференциальной диагностики амеб и жгутиковых простейших, включая лямблии и диэнтамебу. Микроскопируют, отмечая адгезию на поверхности цист мелких палочек.

Два других препарата подсушивают при комнатной температуре, затем фиксируют в холодном ацетоне и окрашивают карболовым фуксином по Цилю-Нилльсену на предмет обнаружения ооцист криптоспоридий и изоспоры. В случае обнаружения ооцист, окрашенных в красный цвет, отмечают адгезию на их поверхности мелких, окрашенных в зеленые цвета палочек. Оставшийся препарат подвергают исследованию в реакции непрямой иммунофлюоресценции с применением диагностической адсорбированной поливалентной сальмонеллезной O-сыворотки, основных групп А, В, С, D, Е. На фиксированный мазок наносят каплю кроличьей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной O-сыворотки А, В, С, D, Е. Затем препарат подкрашивают антивидовой люминесцирующей сывороткой с одновременным контрастированием. Специфичность адгезии подтверждается проведением этапов окраски и отмывки при постановке реакции непрямой иммунофлюоресценции и полностью исключает возможность неспецифического характера адгезии сальмонелл на цистах.

Положительным результатом считается яркое специфическое свечение (флюоресценция) зеленоватым светом по периферии цист (в области адгезии сальмонелл на поверхности), четко контрастирующее с темным телом цист кишечных простейших. Морфология видов, как правило, сохраняется. Оценка препарата должна проводиться комплексно с учетом таких показателей, как яркость и цвет специфической флюоресценции, локализация и структура свечения, а также количество адгезированных на цистах простейших сальмонелл в поле зрения.

Для установления формы заболевания проводится подсчет среднего значения адгезированных на поверхности цист клеток сальмонелл в поле зрения. Для этого, при микроскопии под люминесцентным микроскопом, просматривают не менее 3 полей зрения, в каждом из которых производят подсчет цист и агдезированных на них сальмонелл. Затем высчитывают среднее значение адгезированных клеток. При значении, равном от 1-4, диагностируют легкую форму, от 5-12 клеток сальмонелл - затяжную форму.

Для проведения полного спектра исследований по авторской методике и постановки диагноза сальмонеллезно-протозойной инфекции затрачивается 1-1,5 ч, в отличие от наиболее близкого прототипного способа, при котором индикация сальмонелл и кишечных простейших требует 24-48 часов.

Таким образом, преимуществом предлагаемого способа диагностики течения сальмонеллезно-протозойных острых кишечных инфекций у детей является его высокая чувствительность и специфичность, простота, доступность, точность диагностики, возможность получения результатов уже через 1-1,5 ч после взятия материала, а также использование способа как в ранней диагностике клинических форм сальмонеллезно-протозойной инфекции, так и при обследованиях пациентов при сальмонеллезном бактерионосительстве.

Заявляемый способ может быть подтвержден следующими примерами.

Пример 1.

Пациентка С., 5 лет 2 мес. Диагноз: сальмонеллез тифимуриум вар. копенгаген, тяжелая форма, острое течение.

Параметры	Показатели до проведения исследования по способу диагностики характера течения сальмонеллезно-протозойной инфекции у детей	Показатели в результате изменения тактики лечения после применения способа диагностики характера течения сальмонеллезно-протозойной инфекции у детей
1. Сроки поступления в стационар	7 сутки заболевания	-
2. Койко-дни	20 суток	-
3. Бактериовыделение	28 дней
4. Диагноз	При поступлении: сальмонеллез тифимуриум вар. копенгаген, тяжелая форма, острое течение	Окончательный: смешанная кишечная инфекция. Сальмонеллез. Лямблиоз. Гастроинтестинальная затяжная форма. Острое течение. Тяжелая степень
4 Наличие ДЖВП	Симптомы ДЖВП и изменения желчного пузыря и желчных протоков на УЗИ	Симптомы ДЖВП с меньшей интенсивностью и частотой, исчезновение изменений на УЗИ
5. Клинический анализ крови	Эозинофилы 12-14	Эозинофилы 1-2
СОЭ до 34 мм/час	СОЭ 4 мм/час
Hb повышен до 135 г/л	Hb 110 г/л
Лейкоцитоз до 9	Лейкоциты 2
Моноциты до 7-9	Моноциты 1-2
6. Копрограмма	ЖИРЫ:	ЖИРЫ:
нейтр. жиры до 3	нейтр. жиры 1
омыл. кисл. до 2	омыл. кисл. до 2
мыла до 2	мыла 1
Большое количество слизи	Лейкоциты 2-3
Лейкоциты покрывают все поле зрения (50-60), нейтрофильный характер	Клетки призматического эпителия в п/з отсутствуют
Клетки призматического эпителия в п/з
7.Клинические проявления: боли по ходу кишечника, лихорадка, симптомы интоксикации, нарушение стула, рвоты	+	-
8. Показатели способа диагностики характера течения сальмонеллезно-протозойной инфекции у детей	Массивное обсеменение цистами лямблий	Отсутствие в мазках цист с адгезированными на них сальмонеллами
Среднее значение адгезированных на поверхности цист в п.з. 10

Как видно из приведенных данных, после проведения авторской методики были внесены изменения в формулировку диагноза, поставлена смешанная сальмонеллезно-лямблиозная инфекция, была изменена стратегия этиотропной терапии, что определило нормализацию лабораторных показателей и клиническое выздоровление пациентки.

Пример 2.

Пациент К., 2 мес. Диагноз: сальмонеллез тифимуриум, среднетяжелая форма течения, гастороинтестинальная форма.

Параметры	Показатели до проведения исследования по способу диагностики характера течения сальмонеллезно-протозойной инфекции у детей	Показатели в результате изменения тактики лечения после применения способа диагностики характера течения сальмонеллезно-протозойной инфекции у детей
1. Сроки поступления в стационар	9 сутки заболевания	-
2. Койко-дни	19 суток	-
3. Бактериовыделение	20 дней	-
4. Диагноз	При поступлении: сальмонеллез тифимуриум, среднетяжелая форма течения, гастороинтестинальная форма	Окончательный: смешанная кишечная инфекция. Сальмонеллез. Лямблиоз. Гастроинтестинальная форма. Острое течение. Тяжелая степень
4 Наличие ДЖВП	Симптомы ДЖВП и изменения желчного пузыря и желчных протоков на УЗИ	Симптомы ДЖВП с меньшей интенсивностью и частотой, исчезновение изменений на УЗИ
5. Клинический анализ крови	Эозинофилы 3	Эозинофилы 1-2
СОЭ до 32 мм/час	СОЭ 4 мм/час
Hb повышен до 94 г/л	Hb 105 г/л
Лейкоцитоз до 10-13	Лейкоциты 2
Моноциты до 5	Моноциты 1-2
6. Копрограмма	ЖИРЫ:	ЖИРЫ:
нейтр. жиры до 3	нейтр. жиры 1
омыл. кисл. до 2	омыл. кисл. до 2
мыла до 2	мыла 1
Большое количество слизи	Лейкоциты 2-3
Лейкоциты покрывают все поле зрения (50-60), нейтрофильный характер	Клетки призматического эпителия в п/з отсутствуют
Клетки призматического эпителия в п/з
7. Клинические проявления: боли по ходу кишечника, лихорадка, симптомы интоксикации, нарушение стула, рвоты	+	-
8. Показатели способа диагностики характера течения сальмонеллезно-протозойиой инфекции у детей	Массивное обсеменение цистами лямблий	Отсутствие в мазках цист с адгезированными на них сальмонеллами
- Среднее значение адгезированных на поверхности цист в п.з.14

Как видно из приведенных данных, клинико-диагностические показатели в группе детей с сальмонеллезно-протозойной микст-инфекцией выражаются в искажении типичных клинических проявлений как сальмонеллезной, так и лямблиозной инфекций, проявляясь качественно новым инфекционным заболеванием, и характеризуются более продолжительным и волнообразным течением ОКИ, после постановки авторской методики были внесены изменения в формулировку диагноза, поставлена смешанная сальмонеллезно-лямблиозной инфекции, была изменена стратегия этиотропной терапии, что определило нормализацию лабораторных показателей и клиническое выздоровление пациента.

Предложенный способ апробирован на материале (пробах кала) от 110 больных ОКИ (сальмонеллез). Результаты изучения характера течения сальмонеллезно-протозойной микст-инфекции с количественной оценкой клеток сальмонелл, адгезированных на поверхности цист простейших, позволили установить, что при количестве адгезированных на цистах сальмонелл, равном 1-4, имеет место легкая степень, а при количестве от 5 до 12 - тяжелая степень течения сальмонеллезно-протозойной микст-инфекции, что кореллировало с тяжестью состояния и длительностью пребывания детей в стационаре. Клиническая картина у больных с микст-протозойной инфекцией в отличие от больных с моносальмонеллезом характеризовалась:

1) более поздними сроками обращения в стационар, увеличением койко-дней;

2) увеличением периода сальмонеллезного бактериовыделения, зачастую переходящего в бактерионосительство;

3) поступление в стационар на фоне регистрации течения сопутствующих заболеваний;

4) выраженной симптоматикой ДЖВП и специфическими изменениями желчного пузыря и печени на УЗИ;

5) аллергическими реакциями в анамнезе;

6) более длительным лихорадочным периодом с субфибрильными цифрами;

7) более выраженным синдромом эксикоза с токсикозом (I, II ст);

8) увеличением кратности рвот, при более длительном периоде их регистрации;

9) большим количеством детей с нарушениями микроструктуры просвета толстой кишки, а также более ранними сроками развития дисбиоза кишечника;

10) более выраженными качественными и количественными изменениями при дисбиозе кишечника;

11) специфическими изменениями в результатах анализов.

Таким образом, клинико-диагностические особенности в группе детей с сальмонеллезно-протозойными микст-инфекциями выражаются в искажении типичных клинических проявлений как сальмонеллезной, так и протозойной инфекций, проявляясь качественно новым инфекционным заболеванием, и характеризуются более продолжительным и волнообразным течением ОКИ.

Способ, разработанный авторами, может быть рекомендован для широкого использования в практическом здравоохранении для диагностики течения (легкая, тяжелая степень) сальмонеллезно-протозойных острых кишечных инфекций (ОКИ) у детей. Способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью, простотой и доступностью. Возможность получения результатов уже через 1-1,5 ч после взятия материала, а также использование способа как в ранней диагностике клинических форм сальмонеллезно-протозойной инфекции, так и при обследовании пациентов при сальмонеллезном бактерионосительстве, обуславливает его огромную практическую значимость.