виноградный экстракт (варианты) и способ его изготовления (варианты)
Классы МПК: | A23L2/00 Безалкогольные напитки; сухие составы или их концентраты и их производство A61K36/87 Vitaceae или Ampelidaceae (семейство виноградовых), например винный виноград, мускатный виноград или виноградовник (ампелопсис) C11B1/10 экстракцией |
Автор(ы): | ШРИКХАНДЕ Анил Дж. (US), ВАН Хайбо (US), КУПИНА Стив А. (US) |
Патентообладатель(и): | КОНСТЕЛЛЕЙШН БРЭНДЗ, ИНК. (US) |
Приоритеты: |
подача заявки:
2006-09-27 публикация патента:
10.08.2011 |
Изобретение относится к виноградным экстрактам и способам их изготовления. Как вариант, способ по изобретению предусматривает контактирование материала, выбранного из группы, состоящей из цельного винограда, виноградных семян, виноградных выжимок и их смесей, с водой при температуре около 140-212°F с получением первичного виноградного экстракта и обработку первичного виноградного экстракта пектолитическим ферментом в течение от около четырех до пяти дней при температуре около 80-120°F с получением полифенольного виноградного экстракта. Как вариант, способ по изобретению предусматривает получение первичного водного виноградного экстракта и обработку экстракта дрожжами, бактериями, грибками и их смесями при температуре около 70-100°F с получением полифенольного виноградного экстракта. Как вариант, способ по изобретению предусматривает получение первичного водного виноградного экстракта и обработку экстракта танназным ферментом при температуре около 70-100°F с получением полифенольного виноградного экстракта. Очищенные полифенольные виноградные экстракты, по изобретению, содержат около 2 вес.% или менее терминальных единиц эпикатехин-галлата и около 12 вес.% или менее удлиняющих единиц эпикатехин-галлата. Виноградные экстракты позволяют снизить кровяное давление у пациентов с предгипертоническим состоянием или у пациентов с метаболическим синдромом. 6 н. и 16 з.п. ф-лы, 8 табл., 4 ил.
Формула изобретения
1. Способ изготовления полифенольного виноградного экстракта, предусматривающий стадии:
(1) контактирования материала, выбранного из группы, состоящей из цельного винограда, виноградных семян, виноградных выжимок и их смесей, с водой при температуре около 140-212°F с получением первичного водного виноградного экстракта; и
(2) обработки первичного водного виноградного экстракта пектолитическим ферментом в течение от около четырех до пяти дней при температуре около 80-120°F с получением полифенольного виноградного экстракта.
2. Способ по п.1, в котором стадия контактирования дополнительно включает стадии:
(1а) отделения первичного водного виноградного экстракта от нерастворимых сухих веществ винограда и
(1b) охлаждения отделенного первичного водного виноградного экстракта.
3. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий стадии:
(3) подкисления полифенольного виноградного экстракта до рН от около 1,5 до 2,5 с получением подкисленного полифенольного экстракта;
(4) охлаждения подкисленного полифенольного экстракта; и
(5) фильтрования охлажденного подкисленного полифенольного экстракта с получением отфильтрованного полифенольного экстракта.
4. Способ по п.3, в котором стадия фильтрования дополнительно включает стадию обработки охлажденного подкисленного полифенольного экстракта адсорбирующей смолой с получением очищенного полифенольного экстракта.
5. Очищенный полифенольный экстракт, полученный способом по любому из пп.1-4, содержащий около 2 вес.% или менее терминальных единиц эпикатехин-галлата и около 12 вес.% или менее удлиняющих единиц эпикатехин-галлата.
6. Экстракт по п.5, содержащий 400-1500 м.д. (миллионных долей) галловой кислоты.
7. Способ изготовления полифенольного виноградного экстракта, предусматривающий стадии:
(1) контактирования материала, выбранного из группы, состоящей из цельного винограда, виноградных семян, виноградных выжимок и их смеси, с водой при температуре около 140-212°F (60-100°С) с получением первичного водного виноградного экстракта; и
(2) обработки первичного водного виноградного экстракта живой культурой, выбранной из группы, состоящей из дрожжей, бактерий, грибков и их смесей, при температуре около 70-100°F (21-38°С) с получением полифенольного виноградного экстракта.
8. Способ по п.7, в котором стадия контактирования дополнительно включает стадии:
(1а) отделения первичного водного виноградного экстракта от нерастворимых сухих веществ винограда и
(1b) охлаждения отделенного первичного водного виноградного экстракта.
9. Способ по п.7, в котором стадию обработки проводят в течение от около одного до десяти дней.
10. Способ по п.7, в котором стадия обработки дополнительно включает добавление пектолитического фермента.
11. Способ по п.7, дополнительно предусматривающий стадии:
(3) подкисления полифенольного виноградного экстракта до рН от около 1,5 до 2,5 с получением подкисленного полифенольного экстракта;
(4) охлаждения подкисленного полифенольного экстракта; и
(5) фильтрования охлажденного подкисленного полифенольного экстракта с получением отфильтрованного полифенольного экстракта.
12. Способ по п.11, в котором стадия фильтрования дополнительно включает стадию обработки охлажденного подкисленного полифенольного экстракта адсорбирующей смолой с получением очищенного полифенольного экстракта.
13. Очищенный полифенольный экстракт, полученный способом по любому из пп.7-12, содержащий около 2 вес.% или менее терминальных единиц эпикатехин-галлата и около 12 вес.% или менее удлиняющих единиц эпикатехин-галлата.
14. Экстракт по п.13, содержащий 400-1500 м.д. (миллионных долей) галловой кислоты.
15. Способ изготовления полифенольного виноградного экстракта, предусматривающий стадии:
(1) контактирования материала, выбранного из группы, состоящей из цельного винограда, виноградных семян, виноградных выжимок и их смесей, с водой при высокой температуре около 140-212°F (60-100°С) с получением первичного водного виноградного экстракта; и
(2) обработки первичного водного виноградного экстракта танназным ферментом при температуре около 70-100°F (21-38°С) с получением полифенольного виноградного экстракта.
16. Способ по п.15, в котором стадия контактирования дополнительно включает стадии:
(1а) отделения первичного водного виноградного экстракта от нерастворимых сухих веществ винограда и
(1b) охлаждения отделенного первичного водного виноградного экстракта.
17. Способ по п.15, в котором танназный фермент получен из микроорганизма, выбранного из группы, состоящей из дрожжей, грибков, бактерий и их смесей.
18. Способ по п.15, в котором стадия обработки дополнительно включает добавление пектолитического фермента.
19. Способ по п.15, дополнительно предусматривающий стадии:
(3) подкисления полифенольного виноградного экстракта до рН от около 1,5 до 2,5 с получением подкисленного полифенольного экстракта;
(4) охлаждения подкисленного полифенольного экстракта; и
(5) фильтрования охлажденного подкисленного полифенольного экстракта с получением отфильтрованного полифенольного экстракта.
20. Способ по п.19, в котором стадия фильтрования дополнительно включает стадию обработки охлажденного подкисленного полифенольного экстракта адсорбирующей смолой с получением очищенного полифенольного экстракта.
21. Очищенный полифенольный экстракт, полученный способом по любому из пп.15-20, содержащий около 2 вес.% или менее терминальных единиц эпикатехин-галлата и около 12 вес.% или менее удлиняющих единиц эпикатехин-галлата.
22. Экстракт по п.21, содержащий 400-1500 м.д. (миллионных долей) галловой кислоты.
Описание изобретения к патенту
Настоящая заявка имеет приоритет заявки США Сер. № 60/721721 от 28 сентября 2005 года, описание которой включено сюда путем ссылки в полном объеме.
Настоящее изобретение относится к новому виноградному экстракту и способам изготовления такого виноградного экстракта. Новый виноградный экстракт применяется, по существу, для снижения кровяного давления, например, у пациентов с предгипертоническим состоянием или метаболическим синдромом. Также настоящее изобретение относится к пищевой добавке, содержащей виноградный экстракт по изобретению.
Виноградные семена содержат около 5-8 вес.% флавоноидов. Флавоноиды представляют собой важную группу пищевых полифенольных соединений, которые широко представлены в растениях. Было идентифицировано более 4000 химически уникальных флавоноидов из растительных источников, таких как фрукты, овощи, бобовые, орехи, семена, травы, специи, цветы, также как и напитки, такие как чай, какао, пиво, вино и виноградный сок.
Термин флавоноиды в отношении виноградных семян означает мономерные флаван-3-олы, а именно (+)-катехин, (-)-эпикатехин и (-)-эпикатехин-3-галлат. Два или более химически связанные мономера флаван-3-ола называют проантоцианидинами или олигомерными проантоцианидинами («OPCs»), которые включают процианидины и проделфинидины. OPCs, содержащие два мономера, называют димерами, три мономера называют тримерами, четыре мономера называют тетрамерами, пять мономеров называют пентамерами и т.д. В структурном отношении олигомеры имеют длину цепи от 2 до 7 (от димеров до гептамеров); тогда как полимеры представляют собой компоненты с длиной цепи более 7. После продолжительной дискуссии был найден консенсус по методам оценки виноградных семян с комитетом (Национальной Ассоциацией продуктов питания), определяющим OPCs, как проантоцианидины, содержащие два или более мономера, включая полимеры или конденсированные танины. Таким образом, олигомеры виноградного экстракта включают, например, димеры и тримеры, и очевидно, что полимеры могут иметь до шестнадцати единиц.
Ниже приведена типичная структура проантоцианидина, демонстрирующая удлиняющие единицы и терминальные единицы. Удлиняющие единицы представляют собой, например, эпикатехиновые (2) и эпигаллокатехиновые (3) связывающие группы, тогда как терминальная единица представлена группой эпикатехин-галлата (4).
В качестве полифенольных соединений используют коммерческие, такие как виноградный экстракт, эти соединения могут быть выделены из винограда в более концентрированной форме.
Основной процесс, посредством которого экстрагируют, очищают и концентрируют полифенольные соединения из цельного винограда, виноградных выжимок и семян, описан в патенте США 6544581, введенный здесь ссылкой в полном объеме.
Сообщалось, что кроме антиоксидантной активности при исследованиях на животных флавоноиды проявляют противораковое воздействие, снижая рост новых кровеносных сосудов, и обладают противовоспалительной, противомикробной и противоаллергической активностью. Также было обнаружено, что виноградный экстракт по изобретению может быть применен для снижения кровяного давления у пациентов с предгипертоническим состоянием и у пациентов с метаболическим синдромом. Также предполагается, что виноградный экстракт по изобретению будет дополнительно к снижению кровяного давления снижать содержание окисленного ЛПНП-холестерина у пациентов с метаболическим синдромом. Повышенный уровень ЛПНП-холестерина признан фактором риска развития атеросклероза. Существуют убедительные доказательства того, что модифицированный окислением ЛПНП инициирует развитие патологического процесса. Следовательно, снижение концентрации окисленного ЛПНП может снижать и/или предотвращать развитие атеросклероза у пациентов с метаболическим синдромом.
Пациенты с предгипертоническим состоянием классифицируются как пациенты, у которых систолическое давление составляет в пределах от 120 до 139 мм рт.ст. или диастолическое давление которых составляет в пределах от 81 до 89 мм рт.ст. Эта классификация основывается на Седьмом докладе Объединенного национального комитета по предупреждению, выявлению, оценке и лечению высокого кровяного давления Seventh Report of the Joint National Committe on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure (JNC7), стр.87, NIH Publication No. 04-5230. Пациентов с предгипертоническим состоянием, как правило, не лечат с использованием лекарственных препаратов, вместо этого им предлагают вести здоровый образ жизни. Эти рекомендации включают поддержание нормальной массы тела; ведение физически активного образа жизни; следование плану здорового питания, который делает упор на фрукты, овощи и молочные продукты с низким содержанием жира; выбор и приготовление продуктов с минимальным содержанием натрия; и умеренное потребление алкогольных напитков или полный отказ от них. Ведение здорового образа жизни, как правило, является эффективным первым шагом как для предотвращения, так и для контроля ненормального кровяного давления.
«Метаболический синдром», также называемый «Синдром Х», «Синдром резистентности к инсулину» или «Смертельный квартет», характеризуется увеличением факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта и/или диабета II типа. Причиной метаболического синдрома может быть перепроизводство кортизола, гормона стресса, который является причиной накопления внутреннего жира в брюшной полости и резистентности к инсулину. В настоящее время для пациентов с метаболическим синдромом медикаментозная терапия не проводится. Факторы риска, характеризующие метаболический синдром, включают увеличение массы жировой ткани в брюшной полости (абдоминальное ожирение), резистентность к инсулину увеличивает риск развития диабета, гиперинсулимии, высоких уровней содержания жиров в крови, повышение кровяного давления и увеличение уровня содержания липидов в сыворотке крови. В Национальной Образовательной Программе по холестерину The National Cholesterol Education Adult Treatment Panel (ATP III) пациенты с метаболическим синдромом определены как пациенты по меньшей мере с тремя следующими факторами риска:
Фактор риска | Определяющий уровень |
Абдоминальное ожирение признается, когда окружность талии составляет* | |
Мужчины | > 102 см (> 40 дюймов) |
Женщины | > 88 см (> 35 дюймов) |
Триглицериды | 150 мг/дл |
ЛПВП-холестерин | |
Мужчины | < 40 мг/дл |
Женщины | < 50 мг/дл |
Кровяное давление | 130 85 мм рт. cт. |
Уровень глюкозы | 110 мг/дл |
*Избыточный вес и ожирение, связанные с резистентностью к инсулину и метаболическим синдромом. Наличие абдоминального ожирения, однако, в гораздо большей степени связано с факторами риска метаболического синдрома, чем с оцениваемым индексом массы тела. Следовательно, для определения такого компонента оценки метаболического синдрома, как масса тела, рекомендуется простое измерение окружности талии. У некоторых пациентов мужского пола могут иметь место сразу несколько факторов риска развития метаболического синдрома, если окружность талии имеет минимальное превышение, например, от 94 до 102 см (от 37 до 39 дюймов). У таких пациентов может быть значительная генетическая предрасположенность к резистентности к инсулину. Им также следует изменить образ жизни, аналогично мужчинам со значительным увеличением объема талии. Американская Ассоциация по диабету недавно установила норму 100 мг/дл, выше которого у пациента диагностируется преддиабетное состояние (сниженный уровень глюкозы) или диабет. Новая норма применяется для определения нижней границы повышенного уровня глюкозы как одного из критериев метаболического синдрома. |
Состояния, связанные с метаболическим синдромом, включают диабет II типа, дис-липопротеинемию, инфаркт миокарда, инсульт и другие атеросклеротические заболевания, также как и факторы риска этих заболеваний, включая, как правило, резистентность к инсулину, абдоминальное ожирение, причиной которого является накопление внутреннего абдоминального жира, повышенный уровень содержания липидов и глюкозы в сыворотке крови, повышенное диастолическое и/или систолическое кровяное давление и гипертонию.
Существует необходимость в виноградном экстракте и пищевой добавке, содержащей такой виноградный экстракт, которая может быть использована в качестве дополнительного лечебного мероприятия, обеспечивающего улучшение состояния здоровья, такое как снижение кровяного давления у пациентов с предгипертоническим состоянием или у пациентов с метаболическим синдромом.
На чертежах:
На Фиг.1 показана взаимосвязь между исходным кровяным давлением и снижением систолического давления у пациентов с метаболическим синдромом, получавших лечение экстрактом винограда по изобретению.
На Фиг.2 показана взаимосвязь между исходным кровяным давлением и снижением диастолического давления у пациентов с метаболическим синдромом, получавших лечение экстрактом винограда по изобретению.
На Фиг.3 показаны изменения концентрации окисленного ЛПНП у пациентов с метаболическим синдромом, получавших лечение экстрактом винограда по изобретению.
На Фиг.4 показана взаимосвязь между измененной концентрацией окисленного ЛПНП и исходной концентрацией окисленного ЛПНП у пациентов, получавших 300 мг виноградного экстракта по изобретению.
Настоящее изобретение относится к виноградному экстракту, который эффективен в лечении предгипертонического состояния и метаболического синдрома и/или состояний, включающих метаболический синдром. Как правило, виноградный экстракт по изобретению включает, по весу, около 5-15% мономеров, около 5-20% димеров, около 3-10% тримеров, около 2-10% тетрамеров и около 2-10% пентамеров. Общее количество низкомолекулярных фенольных соединений, включая мономеры, димеры, тримеры, тетрамеры и пентамеры, составляет от около 25 до 50 вес.%, предпочтительно от около 25 до 40 вес.%, более предпочтительно от около 30 до 40 вес.%, и наиболее предпочтительно от около 25 до 35 вес.%. Общее содержание фенольных соединений составляет около 80 вес.% или более и предпочтительно около 90 вес.% или более.
В одном варианте изобретения виноградный экстракт включает около 6-15% мономеров, около 7-15% мономеров, около 8-15% мономеров, около 9-15% мономеров, около 10-15% мономеров, около 11-15% мономеров, около 12-15% мономеров, около 13-15% мономеров и около 14-15% мономеров. В другом варианте изобретения виноградный экстракт включает около 5-14% мономеров, около 5-13% мономеров, около 5-12% мономеров, около 5-11% мономеров, около 5-10% мономеров, около 5-9% мономеров, около 5-8% мономеров, около 5-7% мономеров и около 5-6% мономеров. В другом варианте изобретения количество мономеров выбрано из группы, состоящей из около 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15%.
В одном варианте изобретения виноградный экстракт по изобретению включает около 6-20% димеров, около 7-20% димеров, около 8-20% димеров, около 9-20% димеров, около 10-20% димеров, около 11-20% димеров, около 12-20% димеров, около 13-20% димеров, около 14-20% димеров, около 15-20% димеров, около 16-20% димеров, около 17-20% димеров, около 18-20% димеров и около 19-20% димеров. В другом варианте изобретения виноградный экстракт включает около 5-19% димеров, около 5-18% димеров, около 5-17% димеров, около 5-16% димеров, около 5-15% димеров, около 5-14% димеров, около 5-13% димеров, около 5-12% димеров, около 5-11% димеров, около 5-10% димеров, около 5-9% димеров, около 5-8% димеров, около 5-7% димеров и около 5-6% димеров. В другом варианте изобретения количество димеров выбрано из группы, состоящей из около 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19 и 20%.
В одном варианте изобретения виноградный экстракт включает около 4-10% тримеров, около 5-10% тримеров, около 6-10% тримеров, 7-10% тримеров, 8-10% тримеров и около 9-10% тримеров. В другом варианте изобретения виноградный экстракт включает около 3-9% тримеров, около 3-8% тримеров, около 3-7% тримеров, около 3-6% тримеров, около 3-5% тримеров и около 3-4% тримеров. В другом варианте изобретения количество тримеров по изобретению выбрано из группы, состоящей из около 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10%.
В одном варианте изобретения виноградный экстракт включает около 3-10% тетрамеров, около 4-10% тетрамеров, около 5-10% тетрамеров, около 6-10% тетрамеров, около 7-10% тетрамеров, около 8-10% тетрамеров и около 9-10% тетрамеров. В другом варианте изобретения виноградный экстракт включает около 2-9% тетрамеров, около 2-8% тетрамеров, около 2-7% тетрамеров, около 2-6% тетрамеров, около 2-5% тетрамеров, около 2-4% тетрамеров и около 2-3% тетрамеров. В другом варианте изобретения количество тетрамеров выбрано из группы, состоящей из около 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10%.
В одном варианте изобретения виноградный экстракт включает около 3-10% пентамеров, около 4-10% пентамеров, около 5-10% пентамеров, около 6-10% пентамеров, около 7-10% пентамеров, около 8-10% пентамеров и около 9-10% пентамеров. В другом варианте изобретения виноградный экстракт включает около 2-9% пентамеров, около 2-8% пентамеров, около 2-7% пентамеров, около 2-6% пентамеров, около 2-5% пентамеров, около 2-4% пентамеров и около 2-3% пентамеров. В другом варианте изобретения количество пентамеров выбрано из группы, состоящей из около 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10%.
В одном варианте изобретения общее содержание низкомолекулярных фенольных соединений, т.е. мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров, составляет около 25% или выше, около 30% или выше, около 35% или выше, около 40% или выше, около 45% или выше, вплоть до около 50 вес.%. В другом варианте изобретения общее содержание фенольных соединений составляет около 25% или выше, 26% или выше, 27% или выше, 28% или выше, 29% или выше, 30% или выше, 31% или выше, 32% или выше, 33% или выше, 34% или выше, 35% или выше, 36% или выше, 37% или выше, 38% или выше, 39% или выше, 40% или выше, 41% или выше, 42% или выше, 43% или выше, 44% или выше, 45% или выше, 46% или выше, 47% или выше, 48% или выше, 49% или выше, вплоть до около 50 вес.%.
Виноградный экстракт по изобретению имеет профиль фенольных соединений, как определено с помощью нормально фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии («ВЭЖХ»), около 5-15% мономеров, около 5-20% димеров, около 4-10% тримеров, около 2-10% тетрамеров и около 2-10% пентамеров по весу. Виноградный экстракт по изобретению также имеет общее содержание фенольных соединений около 80 вес.% или более и предпочтительно около 90 вес.% или более, как определено с помощью метода Фолина-Чикальтеу. Виноградный экстракт по изобретению также включает около 2 вес.% или менее терминальных единиц эпикатехин-галлата, более предпочтительно около 1 вес.% или менее, как определено с помощью обратно-фазной ВЭЖХ после тиолиза. Виноградный экстракт по изобретению также включает около 12 вес.% или менее удлиняющих единиц эпикатехин-галлата, более предпочтительно около 8 вес.% и наиболее предпочтительно около 5 вес.% или менее, как определено с помощью обратно-фазной ВЭЖХ после тиолиза.
Виноградный экстракт по изобретению представляет собой продукт, полученный высокотемпературной водной экстракцией, описанной в патенте США № 6544581, как приведено ниже. Как правило, высокотемпературная водная экстракция, описанная в патенте США № 6544581, включает следующие стадии. На стадии (1) виноградные семена, сухие или свежие, нагревают горячей водой в течение периода времени, достаточного для экстракции большинства полифенолов. Могут быть использованы температуры около 140-212°F, предпочтительно около 160-212°F, более предпочтительно около 180-212°F, наиболее предпочтительно около 190-212°F в течение около 1-6 часов. Время нагревания может варьировать в зависимости от используемой температуры. Как правило, более низкие температуры требуют более длительного времени экстракции. На стадии (2) первичный водный экстракт семян винограда может быть отделен от использованных семян путем пропускания через металлическое сито. Затем экстракт охлаждают и обрабатывают любым коммерчески доступным пектолитическим ферментом, таким как Pectinex® Ultra SP-L, произведенным Novo Nordisk в концентрации около 50-200 м.д. (миллионных долей), для разрушения клеточных стенок. Предпочтительно, водный экстракт семян винограда может быть обработан ферментом в течение двух часов при температуре около 80-120°F. В качестве альтернативы, водный экстракт семян винограда может быть обработан ферментом в течение 7-14 дней или больше при температуре около 40-50°F. На стадии (3) полученный, в результате, мутный экстракт семян может быть подкислен кислотой, предпочтительно неорганической кислотой, более предпочтительно - серной кислотой до рН около 1,5-2,5, и реакция проходит от около одного часа до около двух дней. Подкисленный экстракт могут охлаждать в течение периода времени вплоть до нескольких недель для осаждения макромолекул, включая белки и другие полисахариды. Затем охлажденный подкисленный экстракт может быть отфильтрован с использованием диатомита с получением осветленного экстракта виноградных семян. Могут быть использованы другие фильтры, такие как перлит.
Стадия (2) по патенту США № 6544581 может быть модифицирована обработкой ферментом водного экстракта семян в течение от четырех до пяти дней при температуре около 80-120°F с получением виноградного экстракта по изобретению. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что большая длительность в сравнении с использованной в патенте США № 6544581 при определенных температурах на этой стадии, в результате, приводит к получению нового виноградного экстракта. Время обработки ферментом может варьировать в зависимости от применяемой температуры. Как правило, низкие температуры требуют более длительного времени обработки. Следовательно, водный экстракт семян может быть обработан ферментом в течение двух недель или более при температурах, равных около 60-80°F.
В одном варианте изобретения виноградный экстракт может быть получен по изобретению с использованием следующих стадий. После стадии экстракции (1) или после обработки пектиназой на стадии (2) по патенту США № 6544581 экстракт может быть нанесен на бактериологические агарные пластины. При инкубации могут присутствовать множество видов дрожжей, бактерий и/или грибков в зависимости от исходного материала. Живая культура может быть выделена как смесь. Сразу же после выделения смесь может быть подвергнута последующей экстракции и/или стадии обработки пектиназным ферментом. Например, водный экстракт семян может быть подвергнут ферментной обработке любым коммерчески доступным пектолитическим ферментом и скомбинирован с выделенной смесью дрожжей, бактерий и/или грибков. Скомбинированная смесь может быть подвергнута отстаиванию в течение периода времени, равного от около одного до десяти дней, предпочтительно, от около двух до пяти дней при температуре около 70-100°F. Время ферментной обработки может варьировать в зависимости от используемой температуры и от объема инокулята. Полученный в результате мутный экстракт семян может быть подкислен с использованием подходящей кислоты, как описано выше до рН 1,5-2,5, и реакция проходит от около одного часа до около двух дней. Подкисленный экстракт могут охлаждать и хранить в течение нескольких дней для флокуляции белков и полисахаридов. Затем охлажденный подкисленный экстракт может быть отфильтрован с использованием диатомита с получением осветленного экстракта виноградных семян, который затем может быть дополнительно обработан по патенту США № 6544581 с получением очищенного экстракта, подходящего для снижения кровяного давления и снижения концентрации окисленного ЛПНП.
Содержание галлиевой кислоты в виноградных экстрактах, полученных по патенту США № 6544581, сравнимо с содержанием галлиевой кислоты в виноградных экстрактах, полученных по изобретению с использованием смеси дрожжей, бактерий и/или грибков, согласно анализу ВЭХЖ. Такой анализ показал увеличение показателя содержания галлиевой кислоты с около 50-150 м.д. в виноградном экстракте по патенту США № 6544581 в сравнении с показателем содержания галлиевой кислоты в виноградном экстракте по изобретению с использованием смеси до около 400-1500 м.д. Увеличение показателя содержания галлиевой кислоты указывает, что терминальные и удлиняющие единицы эпикатехин-галлата деэтерифицированы из процианидинов. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что смесь дрожжей, бактерий или грибков использует виноградный экстракт в качестве субстрата для роста и активизирует продукцию танназного фермента, в результате чего происходит деэтерификация процианидинов и высвобождение галлиевой кислоты. По существу, при использовании смеси живых дрожжей, бактерий и/или грибков получают виноградный экстракт по изобретению, содержащий около 2 вес.% или менее терминальных единиц эпикатехин-галлата, более предпочтительно около 1 вес.% или менее и около 12% или менее по весу удлиняющих единиц эпикатехин-галлата, предпочтительно около 8 вес.% или менее и более предпочтительно около 5 вес.% или менее.
В одном варианте изобретения виноградный экстракт может быть получен с использованием следующих стадий. После стадии экстракции (1) или после обработки пектиназой на стадии (2) по патенту США № 6544581 в экстракт может быть введен любой подходящий коммерчески доступный танназный фермент, например грибковый танназный фермент, такой как танинацилгидролаза, Е.С3.1.1.20 в концентрации от около 5 до 1000 м.д. В зависимости от концентрации используемого танназного фермента смесь может реагировать от около одного часа до около двух дней, предпочтительно от около одного до двух дней или до тех пор, пока содержание терминальных единиц сократится до около 2% или менее, предпочтительно 1% или менее, и содержание удлиняющих единиц сократится до около 8% или менее, предпочтительно до около 5% или менее. После прохождения реакции в течение достаточного периода времени экстракт может быть подкислен до рН от около 1,5 до 2,5 для флокуляции белков и полисахаридов при холодильном хранении при температуре 40-60°F. Затем экстракт может быть отфильтрован для осветления и затем может быть дополнительно обработан по патенту США № 6544581 с получением виноградного экстракта с характеристиками, позволяющими снижать кровяное давление.
Виноградный экстракт по изобретению может входить в рецептуру пищевых добавок, включая капсулы, таблетки, порошки, растворы, гели, суспензии, кремы, пасты, гели, суппозитории, трансдермальные пластыри и т.д. Эти пищевые добавки, например, в виде порошков или растворов могут быть введены в нутрицевтики, пищевые продукты и/или напитки с получением функциональных нутрицевтиков, пищевых продуктов и/или напитков. Пищевые добавки могут быть получены в форме порошка, например, для смешивания с потребляемой жидкостью, такой как молоко, сок, вода или в форме потребляемых гелей или сиропов для смешивания с другими диетическими жидкостями или пищевыми продуктами. Пищевые добавки по изобретению могут входить в состав других пищевых продуктов или жидкостей с получением порционированных пищевых добавок, таких как однопорционная упаковка в виде батончика. Как правило, пищевые продукты, в которые может быть введен виноградный экстракт по изобретению, включают молочные пищевые продукты, такие как йогурт, зерновые, хлебцы, закуски, фруктовые соки и безалкогольные напитки. Если необходимо, могут быть введены ароматизаторы, связующие, белки, комплексные углеводы, витамины, минеральные вещества и т.д. Предпочтительно виноградный экстракт получают в форме, подходящей для перорального введения.
Настоящее изобретение также относится к пищевой добавке, содержащей виноградный экстракт по изобретению. Пищевая добавка при введении млекопитающим, включая человека, снижает кровяное давление у пациентов с предгипертоническим состоянием или метаболическим синдромом. Успешный курс лечения, например, пациентов с предгипертоническим состоянием или метаболическим синдромом или профилактики этих состояний, характеризуется, по существу, снижением одного или обоих систолического и/или диастолического кровяного давления по меньшей мере на около 2%, предпочтительно по меньшей мере на около 5% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на около 8% и является причиной очень незначительного повышения резистентности к инсулину.
Пищевые добавки по изобретению предназначены для ежедневного приема или по мере необходимости. Профилактическая или терапевтическая доза пищевой добавки для пациентов с предгипертоническим состоянием или метаболическим синдромом может варьировать в зависимости от тяжести лечимого состояния и пути введения. Доза или предполагаемая частота введения также может варьировать в зависимости от возраста, массы тела и ответа пациента. Как правило, общая дневная доза для состояний, описанных здесь, составляет от около 50 мг до около 1000 мг виноградного экстракта, вводимого единовременно или с разделением на дозы перорально, местно или трансдермально, предпочтительно перорально. Ежедневная пероральная доза предпочтительно составляет в пределах от около 50 мг до около 500 мг виноградного экстракта (то есть включая вспомогательное средство или носитель), более предпочтительно от около 150 мг до около 300 мг. Например, капсулы или таблетки могут быть получены в расфасовке по 150 мг или 300 мг, в то время как напитки могут содержать 50 мг виноградного экстракта по изобретению. Такой режим или прием предпочтительно поддерживать в течение по меньшей мере одного месяца, более предпочтительно - шесть месяцев или более.
Пищевая добавка по изобретению может быть получена подходящим способом (т.е. сухим смешиванием, сухим или влажным гранулированием, прямым прессованием) в смеси с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями, витаминами, минеральными веществами и/или другими нутриентами. Представители носителей и наполнителей включают без ограничения крахмалы, сахара, микрокристаллическую целлюлозу, разбавители, гранулирующие агенты, смазочные агенты, связующие, дезинтегрирующие агенты и им подобные в случае препаратов для перорального приема (таких как порошки, капсулы и таблетки).
Для введения пациенту пищевой добавки по изобретению может быть использован любой подходящий путь введения. Подходящие пути введения включают, например, пероральный, ректальный, парентеральный, внутривенный, местное нанесение, трансдермальный, подкожный и внутримышечный. Хотя может быть использован любой подходящий путь введения пациенту эффективного количества виноградного экстракта по изобретению, предпочтительным является пероральный прием, включающий использование твердых дозированных форм, таких как таблетки, капсулы или порошки. Предпочтительно также виноградный экстракт может входить в состав фукционального нутрицевтика, пищевого продукта или напитка.
Виноградный экстракт по изобретению также может быть скомбинирован с другими активными агентами, включая без ограничения диуретики, бета-блокаторы, ингибиторы АПФ, антагонисты ангиотензина, блокаторы кальциевых каналов, альфа-блокаторы, альфа-бета-блокаторы, ингибиторы нервной системы, вазодиляторы, антиоксиданты.
Характеристика виноградных экстрактов
Недавно сообщалось, что применение полифенолов виноградных семян у гипертоников не снижает систолическое кровяное давление, а, в действительности, повышает систолическое кровяное давление при комбинировании с витамином С. См. Ward et al. "The combination of vitamin C and grape-seed polyphenols increases blood pressure: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial," Journal of Hypertension 2005; 23:427-434. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что профиль фенольных соединений виноградных экстрактов очень важен для эффективного снижения кровяного давления. Виноградный экстракт, оцениваемый в исследовании Ward от Vinlife®, профиль фенольных соединений которого имеет общее содержание фенольных соединений 50,6 вес.%, как определено с помощью метода Фолина-Чикальтеу, 11,2% терминальных единиц эпикатехин-галлата и 11,8% удлиняющих единиц эпикатехин-галаата, как определено с помощью обратно-фазной ВЭЖХ после тиолиза, и 7,3% мономеров, 4,4% димеров, 2,0% тримеров, 1,9% тетрамеров и 1,1% пентамеров при общем содержании мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров 16,7%, как определено с помощью нормально фазовой ВЭЖХ.
Коммерчески доступные экстракты виноградных семян содержат различные мономеры и проантоцианидины. Профиль фенольных соединений некоторых коммерчески доступных экстрактов, определенный с помощью обратно-фазной ВЭЖХ, приведен в Таблице 1 и определенной с помощью прямо-фазной ВЭЖХ, приведен в Таблице 2. В соответствии с этими анализами виноградный экстракт по изобретению (на данный момент производимый Polyphenols, Inc. as MegaNatural®-ВР) имеет три фактора, отличающие его от других виноградных экстрактов:
1. Высокая степень чистоты, определяемая общим содержанием фенольных соединений, составляющим выше чем около 80 вес.% и более предпочтительно - выше, чем около 90 вес.%, как определено с помощью метода Фолина-Чикальтеу;
2. Высокое содержание, например, около 25-50 вес.% низкомолекулярных фенольных соединений, причем низкомолекулярные фенольные соединения представляют собой мономеры, димеры, тримеры, тетрамеры и пентамеры; и
3. От крайне малого до нулевого содержания, например, менее чем около 2%, предпочтительно, менее чем около 1% терминальных единиц эпикатехин-галлата и малое содержание, например, менее чем около 12%, предпочтительно, менее чем около 5% удлиняющих единиц эпикатехин-галлата.
Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что профиль фенольных соединений виноградных экстрактов очень важен для эффективного лечения или профилактики предгипертонического состояния или метаболического синдрома. В частности, считается, что отсутствие эпикатехин-галлата в терминальных единицах и малое содержание эпикатехин-галлата в удлиняющих единицах в виноградном экстракте по изобретению, наряду с наличием высокого содержания низкомолекулярных соединений, отвечает за усиление вазодилятации, которая отвечает за падение кровяного давления в клиническом исследовании у лица с метаболическим синдромом и предгипертоническим состоянием, описанными ниже.
Обратно-фазная ВЭЖХ для определения процентного соотношения мономеров, олигомеров и полимеров
Для определения пропорции мономеров, олигомеров и полимеров использовали обратно-фазный ВЭЖХ анализ виноградного экстракта, исходя из площади пика 280 нм.
Условия ВЭЖХ:
Подвижная фаза | А: 2% ледяной уксусной кислоты В: 80% ацетонитрила, 0,4% уксусной кислоты | |||
Градиент | Время (мин) | % А | % В | Кривая |
0.00 | 100 | 0 | - | |
3,00 | 100 | 0 | 6 | |
6,00 | 96 | 4 | 6 | |
15,00 | 90 | 10 | 6 | |
30,00 | 85 | 15 | 6 | |
50,00 | 77 | 23 | 6 | |
60,00 | 75 | 25 | 6 | |
66,00 | 70 | 30 | 6 | |
80,00 | 50 | 50 | 6 | |
83,00 | 20 | 80 | 6 | |
85,00 | 100 | 0 | 6 | |
105,00 | 100 | 0 | 6 | |
110 | 100 | 0 | 6 | |
Колонка | 250 мм × 4,6 мм, Prodigy 5µ ODS (3) 100 Е (Phenomenex, Torrance, CA) | |||
Скорость потока | 1,0 мл/мин | |||
Длина волны детектора | 280 нм | |||
Температура | 30°С | |||
Объем впрыскивания | 25 мкл |
Образец препарата. 0,1 г виноградного экстракта аккуратно отвешивали в 100 мл мерную колбу. Образец растворяли в небольшом количестве метанола ( 5 мл) диспергировали с помощью ультразвука, если требуется. Объем дополняют 18-тимегаомной водой. Образец центрифугировали (14000 об/мин, 10 мин) или фильтровали через 0,45 мкМ стеклянный фильтр перед впрыскиванием. Определяли процентное соотношение по весу мономеров, олигомеров и полимеров, исходя из стандартной площади пика и концентрации.
Способ определения терминальных и удлиняющих единиц проантоцианидинов на основе ВЭЖХ анализа после тиолиза
Тиолиз является способом определения среднего молекулярного размера (степени полимеризации) и основной структуры проантицианидинов виноградного экстракта. Полученная информация может указывать на биологическое качество виноградного экстракта для адсорбции питательных веществ виноградного экстракта.
Тиолизный реагент: 5% фенил метанэтиола (бензил меркаптан) в метаноле, содержащем 0,2 N HCl.
Условие: 0,1% метанольный раствор виноградного экстракта смешивали с эквивалентным количеством тиолизного реагента, тщательно перемешивали и нагревали до температуры 90°С в течение 2 мин. Для остановки реакции вводили воду. Затем продукт реакции центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость непосредственно анализировали с помощью ВЭЖХ.
Условия ВЭЖХ:
Подвижная фаза: | А: 10% уксусная кислота/0,1 ТФЭ/5% ацетонитрил/84,9% воды (об./об./об./об.) В: ацетонитрил |
Градиент: | 0-30 минут 0-50% В 30-35 минут 50-100% В |
Колонка | 150 см × 2,0 мм, внутренний диаметр, 4µ Synergi hydro-RP 80 Е (Phenomenex, Torrance, CA) |
Скорость потока | 0,3 мл/мин |
Длина волны детектора | HP 1100 FLD с излучением/с возбуждением при 276 нм и излучением/ с эмиссией при 316 нм и HP DAD 280 нм |
Температура | 30°С |
Объем впрыскивания | 1-3 мкл |
Для проведения анализа виноградные экстракты растворяли в метаноле, смешивали с равным объемом тиолизного реагента и нагревали до температуры 90°С в течение 2 мин. Высвободившиеся единицы идентифицировали с помощью масс-спектрометрии, количественное определение проводили с использованием ВЭЖХ с условиями, описанными выше. Среднюю степень полимеризации измеряли посредством высчитывания молярного соотношения всех флаван-3-ольных единиц (аддукты тиоэфира плюс терминальные единицы) к катехину, эпикатехину и эпикатехин-галлату, представляющим собой терминальные единицы. Процент эпикатехин-галлата терминальных единиц определяли, исходя из молярного соотношения эпикатехин-галлата, суммируя моли всех терминальных единиц, которые включают катехин, эпикатехин и эпикатехин-галлат. Процент эпикатехин-галлата удлиняющих единиц определяли, исходя из молярного соотношения тиоэфирных аддуктов эпикатехин-галлата, суммируя моли всех удлиняющих единиц тиоэфирных аддуктов, которые включают тиоэфирные аддукты катехина, эпикатехина и эпикатехин-галлата. Общее содержание фенольных соединений было определено в пересчете на эквивалент галлиевой кислоты (GAE) на грамм с помощью метода Фолина-Чикальтеу. Более детальное описание процедуры анализа по методу Фолина-Чикальтеу приведено в Waterhouse, A. L., Determination of Total Phenolics, in Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 11.1.1-11.1.8, Wrolstad, R.E., Wiley, 2001, или Singleton, V. L; Orthofer, R.; Lamuela-Raventos, R. M. "Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent," Methods in Enzymology 1999, 299, 152-178, каждый из которых введен здесь ссылкой в полном объеме.
Таблица 1 Сравнительные характеристики MegaNatural ®-BP и других виноградных экстрактов, представленных на рынке, определенные с помощью обратно-фазной ВЭЖХ | |||||||
Страна- произво-дитель | Название продукта | Общий фенол | Эпикатехин-галлат | Эпикатехин-галлат | Определены обратно-фазной ВЭЖХ с использованием площади пика | ||
г GAE/100г (как есть) | Терминаль-ные (%) | Удлиняю-щие (%) | Мономеры (%) | Олигомеры (%) | Полимеры (%) | ||
США | MegaNatural®-BP | 93,8 | 0,0 | 6,8 | 12,8 | 62,6 | 24,6 |
США | MegaNatural®-BP | 91,0 | 0,0 | 5,4 | 9,2 | 69,6 | 21,2 |
США | MegaNatural®-BP | 95,2 | 0,0 | 6,9 | 13,8 | 64,7 | 21,5 |
США | MegaNatural®-BP | 98,6 | 0,0 | 8,2 | 11,3 | 68,0 | 20,7 |
США | MegaNatural®-BP | 91,1 | 0,0 | 5,4 | 5,4 | 71,5 | 23,2 |
США | MegaNatural®-BP | 95,5 | 0,0 | 5,1 | 6,5 | 73,3 | 20,3 |
США | MegaNatural®-BP | 92,7 | 0,0 | 3,0 | 8,5 | 69,8 | 21,7 |
США | MegaNatural®-BP | 93,5 | 0,0 | 4,8 | 5,4 | 69,9 | 24,7 |
США | MegaNatural Gold® | 93,0 | 10,5 | 11,7 | 7,8 | 74,7 | 17,6 |
США | MegaNatural Gold® | 91,9 | 4,3 | 14,6 | 12,3 | 76,7 | 11,0 |
США | MegaNatural Gold® | 92,4 | 11,0 | 11,9 | 10,2 | 77,7 | 12,1 |
США | MegaNatural Gold® | 89,1 | 5,2 | 12,9 | 9,9 | 73,7 | 16,4 |
США | MegaNatural Gold® | 90,1 | 3,6 | 14,5 | 11,1 | 73,4 | 15,6 |
США | MegaNatural Gold® | 90,3 | 2,8 | 8,8 | 13,2 | 65,5 | 21,3 |
США | MegaNatural Gold® | 89,6 | 8,7 | 11,8 | 10,0 | 65,2 | 24,8 |
Австралия | Vinlife® | 50,6 | 11,2 | 11,8 | 6,3 | 60,6 | 33,1 |
Европа | Masquelier OPC® | 98,0 | 8,5 | 7,5 | 12,1 | 68,4 | 19,5 |
Европа | Naturex® | 78,5 | 8,3 | 6,2 | 6,3 | 64,2 | 29,5 |
Европа | Indena® | 93,0 | 10,5 | 8,8 | 10,1 | 64,4 | 25,5 |
Китай | Lycome® | 88,5 | 10,6 | 7,5 | 5,3 | 63,1 | 31,7 |
Китай | Recovery® | 95,8 | 3,9 | 5,4 | 9,1 | 58,4 | 32,5 |
Китай | Grape PE® | 92,6 | 9,8 | 6,8 | 3,6 | 51,9 | 44,4 |
Китай | MA® | 70,1 | 8,7 | 10,5 | 4,6 | 55,3 | 40,1 |
США | ME® | 68,9 | 12,1 | 6,3 | 1,9 | 52,6 | 45,4 |
США | San Joaquin® | 74,9 | 17,7 | 6,7 | 2,2 | 56,1 | 41,8 |
США | Activin® | 84,3 | 14,8 | 11,1 | 3,0 | 55,9 | 41,1 |
Япония | KIKKOMAN® | 44,5 | 5,2 | 13,1 | 8,1 | 52,9 | 38,9 |
Нормальнофазный ВЭЖХ анализ на проантоцианидины
ВЭЖХ анализ проантоцинидинов: Хроматографический анализ проводили на НР 1100, снабженном ВЭЖХ с автодозатором/дозатором, двойной помпой, колонкой с нагревателем, диодным матричным детектором, флюоресцентным детектором и НР ChemStation для сбора данных и манипуляций. Нормально-фазовые разделения олигомеров проантоцианидинов проводили на колонке Phenomenex Luna Silica (2).
Подвижная фаза: | А: дихлорметан, метанол, вода и уксусная кислота (83:13:2:2 (об./об.)) В: метанол, вода и уксусная кислота (96:2:2 (об./об.)) |
Градиент: | 0-30 минут линейный 0-17,6% В 30-45 минут линейный 17,6-30,7% В 45-50 минут линейный 30,7-87,8% В 50-60 минут линейный 87,8%В |
Колонка | Phenomenex Luna Silica (3,0 × 150 мм; 3,0 мкм) |
Скорость потока | 0,5 мл/мин |
Длина волны детектора | HP 1100 FLD с излучением/с возбуждением при 276 нм и излучением/с эмиссией при 316 нм |
Температура | 25°С |
Объем впрыскивания | 3 мкл |
Колонку уравновешивали каждый раз между впрыскиваниями эквивалентом 5 мл начальной подвижной фазы. Стандарты катехина получали и исследовали для установления ответной калибровочной кривой, по которой вычисляли концентрацию проантоцианидинов в образцах. Факторы относительной чувствительности димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров к мономерам определяли с помощью флюоресценции, как описано в R. L. Prior and L. Gu, Occurrence and biological significance of proanthocyanidins in American diet," Phytochemistry 2005, 66(18) 2264-2280, с использованием стандартов, выделенных и очищенных из какао-бобов. Эти факторы чувствительности использовали для расчета содержания димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров относительно мономеров.
Таблица 2
Сравнительные характеристики MegaNatural®-BP и других виноградных экстрактов, представленных на рынке, определенные с помощью прямофазной ВЭЖХ
Страна- производитель | Название продукта | Определены прямофазной ВЭЖХ с использованием эквивалента катехина и эпикатехина ( вес.%) | ||||||
Мономеры | Димеры | Тримеры | Тетраме-ры | Пентаме-ры | Мономеры к пентаме-рам | Другие | ||
США | MegaNatural®-BP | 6,3 | 8,7 | 4,0 | 4,4 | 2,8 | 26,2 | 73,8 |
США | MegaNatural®-BP | 9,1 | 13,6 | 5,6 | 6,2 | 3,5 | 38,1 | 61,9 |
США | MegaNatural®-BP | 9,2 | 14,8 | 5,2 | 5,4 | 2,7 | 37,3 | 62,7 |
США | MegaNatural®-BP | 10,0 | 14,2 | 5,4 | 5,2 | 2,8 | 37,6 | 62,4 |
США | MegaNatural®-BP | 7,5 | 11,9 | 5,2 | 5,5 | 3,4 | 33,4 | 66,6 |
США | MegaNatural®-BP | 8,2 | 12,1 | 5,4 | 5,7 | 3,5 | 34,9 | 65,1 |
США | MegaNatural®-BP | 9,0 | 11,3 | 5,4 | 4,7 | 2,5 | 32,9 | 67,1 |
США | MegaNatural®-BP | 5,2 | 9,8 | 4,1 | 4,8 | 2,6 | 26,4 | 73,6 |
Австралия | Vinlife® | 7,3 | 4,4 | 2,0 | 1,9 | 1,1 | 16,7 | 83,3 |
Европа | Masquelier OPC® | 15,5 | 14,2 | 6,2 | 4,8 | 2,9 | 43,6 | 56,4 |
Европа | Naturex® | 8,3 | 6,4 | 3,6 | 3,0 | 2,0 | 23,2 | 76,8 |
Европа | Indena® | 16,6 | 12,4 | 6,2 | 4,8 | 3,3 | 43,3 | 56,7 |
Китай | Lycome® | 7,6 | 6,2 | 3,4 | 2,8 | 1,9 | 22,0 | 78,0 |
Китай | Recovery® | 17,5 | 8,1 | 4,4 | 2,8 | 2,0 | 34,8 | 65,2 |
Китай | Grape PE® | 3,9 | 3,2 | 1,9 | 1,5 | 1,1 | 11,6 | 88,4 |
Китай | MA® | 4,1 | 3,8 | 1,9 | 1,7 | 0,8 | 12,3 | 87,7 |
США | ME® | 1,8 | 1,8 | 0,9 | 0,8 | 0,5 | 5,8 | 94,2 |
США | San Joaquin® | 5,3 | 5,8 | 2,6 | 1,8 | 1,3 | 16,8 | 83,2 |
США | Activin® | 5,5 | 4,8 | 2,1 | 1,3 | 1,3 | 15,1 | 84,9 |
Япония | KIKKOMAN® | 0,9 | 1,1 | 0,7 | 0,7 | 0,4 | 3,7 | 96,3 |
Результаты, приведенные в Таблицах 1 и 2, были получены с использованием различных способов, что объясняет различные пределы, например процентное содержание мономеров. Например, для определения процентного содержания мономеров, олигомеров и полимеров использовали обратно-фазную ВЭЖХ, исходя из площади пика этих трех групп соединений. В мономеры включена галлиевая кислота. Для определения содержания по весу в виноградном экстракте мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров при проведении прямофазной ВЭЖХ в качестве стандарта использовали катехины и эпикатехины. Факторы относительной чувствительности димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров к мономерам, определенные по R. L. Prior and L. Gu, использовали для расчета содержания димеров, тримеров, тетрамеров и пентамеров относительно мономеров.
2. Воздействия виноградного экстракта на кровяное давление у лиц с метаболическим синдромом.
Воздействия виноградного экстракта по изобретению на кровяное давление исследовали на двадцати четырех пациентах с диагнозом метаболический синдром. В исследовании участвовало равное количество мужчин и женщин от 20 до 50 лет. Метаболический синдром диагностировали, исходя из критериев, определенных Национальной Образовательной Программой по холестерину (The National Cholesterol Education Adult Treatment Panel III). У каждого субъекта было выявлено по меньшей мере три следующих признака: 1) содержание сахара в крови >110 мг/дл, 2) ЛПВП (<40 мг/дл у мужчин и <45 мг/дл у женщин), 3) кровяное давление >130/85 и 4) абдоминальное ожирение (>102 см для мужчин и >88 см для женщин). Пациенты не участвовали в исследовании, если они курили на момент проведения исследования или бросили курить (< 3 лет); принимали противовоспалительные или понижающие давление лекарственные препараты; или употребляли продаваемые без рецепта антиоксидантные соединения.
Пациентов произвольным образом разделили на три группы по восемь человек, и они получали по одной из следующих капсул в зависимости от группы, в которую они вошли:
Группа 1 получала капсулу с плацебо.
Группа 2 получала капсулу, содержащую 150 мг виноградного экстракта.
Группа 3 получала капсулу, содержащую 300 мг виноградного экстракта.
В течение последующих двадцати восьми дней пациенты получали капсулы с такой же дозировкой. По окончании этого периода были получены результаты измерения кровяного давления. Амбулаторное кровяное давление фиксировали через 12 часов после начала исследования и снова - через четыре недели. Процедура была неинвазивной с использованием манжеты для измерения кровяного давления, размещенной на руке. Манжета, снабженная фиксирующей лентой, была соединена с автоматическим устройством для наддува, одобренным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.
В Таблице 3 приведены данные по кровяному давлению трех групп пациентов с метаболическим синдромом. У тех, кто получал в качестве дневной дозы 300 мг и 150 мг виноградного экстракта по изобретению, наблюдалось значительное снижение, как систолического, так и диастолического давления. У группы, получавшей плацебо, значительных изменений не наблюдалось.
Таблица 3 Результаты применения виноградного экстракта по изобретению у пациентов с метаболическим синдромом | ||||||
Дневная доза 300 мг | Дневная доза 150 мг | Плацебо | ||||
Систолическое | Диастолическое | Систолическое | Диастолическое | Систолическое | Диастолическое | |
Начало | 129±4 | 79±3 | 137±4 | 84±3,3 | 124±4 | 74±4 |
4 недели | 117±3 | 71±3 | 125±4 | 78±1,9 | 123±4 | 71±4 |
р* | 0,007 | 0,006 | 0,003 | 0,009 | незначительный | незначительный |
р* - возможность того, что начальная и конечная оценка одинаковые. Как правило, р от 0,05 или менее (5%) считается значительным. |
На Фиг.1 и 2 показана взаимосвязь между исходным кровяным давлением и снижением обоих давлений - систолического и диастолического. Давление крови измеряли в мм рт. ст. Поскольку диагноз метаболического синдрома основывается на наличии трех факторов из списка факторов риска (один из которых кровяное давление), в исследовании пациентов не делили случайным образом по показателям кровяного давления. По существу, среднее давление в трех группах различалось (но варьировало в узком пределе).
Это исследование демонстрирует, что виноградный экстракт по изобретению в ежедневной дозе от 150 мг до 300 мг снижает оба кровяных давления - систолическое и диастолическое у пациентов с метаболическим синдромом. Снижение кровяного давления статистически значимо для обоих применяемых доз виноградного экстракта. Действительно, изменения кровяного давления, наблюдаемые при применении виноградного экстракта, сравнимы с изменениями, наблюдаемыми в большинстве клинических исследований при применении фармацевтических агентов.
3. Воздействие виноградного экстракта на окисленный ЛПНП у пациентов с метаболическим синдромом.
Воздействие виноградного экстракта по изобретению на окисленный ЛПНП исследовали на двадцати четырех пациентах с диагнозом метаболический синдром, как описано выше. Концентрацию окисленного ЛПНП измеряли после начала исследования и снова - через четыре недели применения. Для измерения концентрации окисленного ЛПНП у каждого пациента брали образец крови и анализировали его.
Изменения в концентрации ЛПНП трех групп суммированы на Фиг.3. На Фиг.3 показано незначительное изменение окисленного ЛПНП для плацебо - тенденция к изменению окисленного ЛПНП для пациентов, получавших 150 мг виноградного экстракта по изобретению, и статистически значимое изменение (р<0,05) окисленного ЛПНП для пациентов, получавших 300 мг виноградного экстракта по изобретению. На Фиг.4 показана взаимосвязь между исходной концентрацией окисленного ЛПНП и изменившейся концентрацией окисленного ЛПНП у пациентов, получавших 300 мг виноградного экстракта по изобретению. Коэффициент регрессии R2=0,52. Фиг.4 показывает большее изменение в концентрации окисленного ЛПНП у пациентов, имевших вначале более высокие уровни окисленного ЛПНП.
Это исследование демонстрирует, что виноградный экстракт по изобретению в ежедневной дозе от 150 мг до 300 мг снижает концентрацию окисленного ЛПНП в плазме у пациентов с метаболическим синдромом. Кроме того, наблюдается статистически значимое снижение концентрации окисленного ЛПНП у пациентов, получавших 300 мг виноградного экстракта по изобретению.
4. Воздействие виноградного экстракта на пациентов с предгипертоническим состоянием.
Воздействие виноградного экстракта по изобретению исследовали на двадцати четырех пациентах с диагнозом предгипертонического состояния. В исследовании участвовало равное количество мужчин и женщин от 30 до 60 лет. Предгипертоническое состояние диагностировали исходя из критериев, определенных Седьмым докладом Объединенного национального комитета по предупреждению, выявлению, оценке и лечению высокого кровяного давления (Seventh Report of the Joint National Committe on Prevention, Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure). Систолическое давление каждого субъекта составляло от 120 до 139 мм рт. ст. и/или диастолическое давление каждого субъекта составляло от 81 до 89 мм рт. ст. Пациенты не участвовали в исследовании, если они курили на момент проведения исследования или бросили курить (< 3 лет); принимали противовоспалительные или понижающие давление лекарственные препараты; или употребляли продаваемые без рецепта антиоксидантные соединения.
Пациентов произвольным образом разделили на две группы по двенадцать человек, и они получали по одной из следующих капсул в зависимости от группы, в которую они вошли:
Группа 1 получала капсулу с плацебо.
Группа 2 получала капсулу, содержащую 300 мг MegaNatural®-BP.
В течение последующих восьми недель пациенты получали капсулы с такой же дозировкой. По окончании этого периода были получены результаты измерения кровяного давления. Амбулаторное кровяное давление фиксировали через 12 часов после начала исследования и снова - через четыре недели. Процедура была неинвазивной с использованием манжеты для измерения кровяного давления, размещенной на руке. Манжета, снабженная фиксирующей лентой, была соединена с автоматическим устройством для наддува, одобренным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.
В Таблице 4 приведены данные по кровяному давлению двух групп пациентов с предгипертоническим состоянием. Исходное давление двух групп отличалось незначительно. У тех, кто получал в качестве дневной дозы 300 мг виноградного экстракта по изобретению, наблюдалось значительное снижение, как систолического, так и диастолического давления, однако у тех, кто получал плацебо, значительных изменений не наблюдалось. Например, среднее изменение систолического кровяного давления у группы, получавшей MegaNatural®-BP, составило 7,2±2,5 мм рт. ст., в то время как систолическое кровяное давление у группы, получавшей плацебо, возрастало на 0,03±1,5 мм рт. ст. Данные суммированы ниже. Показатели приведены в мм рт. ст. (среднее ± стандартная ошибка среднего).
Дневная доза 300 мг | Плацебо | |||
Систолическое | Диастолическое | Систолическое | Диастолическое | |
Начало | 133±2 | 80±2 | 134±2 | 79±2 |
8 недель | 126±2 | 73±2 | 134±2 | 80±2 |
р* | 0,021 | 0,042 | незначительный | незначительный |
р* - возможность того, что начальная и конечная оценка одинаковые. Как правило, р от 0,05 или менее (5%) считается значительным. |
Это исследование демонстрирует, что виноградный экстракт по изобретению в ежедневной дозе 300 мг снижает оба кровяных давления - систолическое и диастолическое у пациентов с предгипертоническим состоянием. Снижение кровяного давления статистически значимо. Действительно, изменения кровяного давления, наблюдаемые при применении виноградного экстракта, сравнимы с изменениями, наблюдаемыми в большинстве клинических исследований при применении фармацевтических агентов.
Примеры
Настоящее изобретение дополнительно описано следующими примерами способов изготовления виноградного экстракта и пищевых добавок. Примеры только иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его целей, сущности и объема.
Пример 1
Способ изготовления виноградного экстракта
Сухие виноградные семена экстрагировали водой при температуре 200°F в течение 2 ч и экстракт отделяли от семян на металлическом сите. Экстракт охлаждали до температуры 90-100°F и вводили пектиназу в концентрации 200 м.д. Экстракт разделяли на две порции. В первую порцию вводили коммерчески доступный танназный грибной фермент (таннинацилгидролаза, Е.С3.1.1.20) в концентрации 1000 м.д. Во вторую порцию вводили танназу в концентрации 50 м.д. Остаточная концентрация галлиевой кислоты в оригинальном экстракте составила 117 м.д. с 18,9% терминальных единиц и 11,1% удлиняющих единиц. При обработке 1000 м.д. танназного фермента в течение около 2 часов концентрация галлиевой кислоты возросла до 904 м.д. с 0% терминальных единиц и около 5,5% удлиняющих единиц. При обработке с 50 м.д. танназного фермента в течение около тридцати четырех часов концентрация галлиевой кислоты возросла до 810 м.д. с менее чем 1% терминальных единиц и менее чем 6% удлиняющих единиц. Примерно через два дня оба экстракта подкислили до рН от 1,5 до 2,5 для флокуляции белков и полисахаридов во время холодильного хранения при температуре 40-60°F. Экстракт фильтровали и дополнительно обрабатывали по патенту США № 6544581 с получением виноградного экстракта, характеризующегося способностью снижать кровяное давление и снижать концентрацию окисленного ЛПНП.
Пример 2
Капсулы
Виноградный экстракт MegaNatural®-BP (150 мг или 300 мг) смешивали сухим смешиванием со стеаратом магния (3 мг или 6 мг, соответственно) и заполняли в твердые желатиновые капсулы (полученные из желатина и воды). При дозировке 150 мг виноградный экстракт содержал минимум 90% фенолов или 135 мг фенолов на 150 мг виноградного экстракта. При дозировке 300 мг виноградный экстракт содержал минимум 90% фенолов или 270 мг фенолов на 300 мг виноградного экстракта. Ежедневная доза составила одну капсулу в день.
Пример 3
Порошок
Виноградный экстракт MegaNatural®-BP получали сухим смешиванием с наполнителем, как приведено в Таблице 4, для применения в качестве напитка, ингредиенты напитка смешивали сухим смешиванием. Для получения конечного напитка 9,47 г сухой смеси комбинировали с 500 мл холодной воды и тщательно перемешивали. Порция 500 мл содержит 16 калорий. Конечный напиток содержит 100 мг виноградного экстракта MegaNatural®-BP и 120 мг витамина С на порцию в 1 л с показателем ORAC 2200 TE. ORAC измеряли в ммолях Trolox (некоммерческие водорастворимые производные токоферолов) эквивалентах (ТЕ) на грамм «Степень адсорбции радикалов кислорода». Это является стандартом для измерения антиоксидантной активности в пищевых продуктах и добавках. Единичные порции свежих или свежеприготовленных фруктовых или овощных добавок в среднем имеют от 600 до 800 ORAC единиц. Считается, что увеличение потребления пищевых продуктов или добавок с от 2000 до 5000 ORAC единиц в день может оказывать благотворное воздействие на организм.
Таблица 4 | |
Ингредиенты | % сухой смеси (г) |
Мальтодекстрин | 37,48 |
Лимонная кислота | 29,99 |
Замутняющий агент (Purity Gum 2000)* | 5,25 |
Аспартам | 3,85 |
Цитрат натрия, FCC Grade | 3,75 |
UltraGuar ** | 3,75 |
N&A ароматизатор апельсин (SN 313897)*** | 7,5 |
Nat FF ароматизатор маракуйя (SN 313898)*** | 4,27 |
FD&C желтый #6 (20:1 в мальтодекстрине) | 2,24 |
FD&C желтый #5 (20:1 в мальтодекстрине) | 0,75 |
Аскорбиновая кислота | 0,64 |
Виноградный экстракт MegaNatural®-BP (Polyphenolics, Inc.) | 0,53 |
Итого | 100 |
*Доступный от National Starch & Chemical Corporation, Bridgewater, NJ **Доступный от P.L. Thomas & Co., Inc. Morristown, NJ ***Доступный от International Flavors & Fragrances, Dayton, NJ |
Пример 4
Напиток
Виноградный экстракт MegaNatural®-BP получали в виде напитка с наполнителем, как приведено в Таблице 5. Полученный напиток содержал 50 мг виноградного экстракта MegaNatural®-BP и 60 мг витамина С (100% RDI) на порцию в 8 жидких унций. Порция в 8 жидких унций содержит 0 калорий и 0,15 г общих углеводов. Порция в 16 жидких унций будет иметь показатель ORAC 2200 ТЕ:
Таблица 5 | |
Ингредиенты | вес.% |
Вода | 99,4373 |
Лимонная кислота | 0,2640 |
Пурпурный краситель MegaNatural (Canandaigua Conc.) | 0,0528 |
Ароматизирующая система Sethness-Greenleaf | 0,0867 |
Бензоат натрия | 0,0448 |
Сорбат калия | 0,0448 |
Аскорбиновая кислота | 0,0338 |
Виноградный экстракт MegaNatural®-BP (Polyphenolics, Inc.) | 0,0211 |
Аспартам | 0,0147 |
Итого | 100,0000% |
Пример 5
Напиток
Виноградный экстракт MegaNatural®-BP получали в виде напитка с наполнителем, как приведено в Таблице 6. Полученный напиток содержал 50 мг виноградного экстракта MegaNatural®-BP и 60 мг витамина С (100% RDI) на порцию в 8 жидких унций. Порция в 8 жидких унций содержит 15 калорий и 4г общих углеводов. Порция в 16 жидких унций будет иметь показатель ORAC 2200 ТЕ:
Таблица 6 | |
Ингредиенты | вес. % |
Вода | 95,8778 |
Концентрат апельсинового сока 65 | 1,3973 |
Концентрат клюквенного сока 50 | 0,8691 |
Пурпурный краситель MegaNatural (Canandaigua Conc.) | 0,5032 |
Ароматизирующая система Sethness-Greenleaf | 1,1074 |
Бензоат натрия | 0,0444 |
Сорбат калия | 0,0444 |
Аскорбиновая кислота | 0,0357 |
Виноградный экстракт MegaNatural®-BP (Polyphenolics, Inc.) | 0,0210 |
Неотам (The NutraSweet Co.) | 0,0997 |
Итого | 100,0000% |
Пример 6
Витаминно/минеральная добавка
Виноградный экстракт MegaNatural®-BP (150 мг) смешивали сухим смешиванием с наполнителем, приведенным в списке Таблицы 7, и прессовали в форме таблетки с получением мультивитаминной/минеральной добавки. Ежедневная доза составила одну таблетку в день, предпочтительно, во время еды.
Таблица 7 | |
Ингредиенты | % от суточной нормы |
Витамин А 3500 IU (29% в виде бета-каротина) | 70 |
Витамин С 60 мг | 100 |
Витамин D 400 IU | 100 |
Витамин Е 45 IU | 150 |
Витамин К 10 мкг | 13 |
Тиамин 1,5 мг | 100 |
Рибофлавин 1,7 мг | 100 |
Ниацин 20 мг | 100 |
Витамин В6 3 мг | 150 |
Фолиевая кислота 400 мкг | 100 |
Витамин В12 25 мг | 417 |
Биотин 30 мкг | 10 |
Пантотеновая кислота 10 мг | 100 |
Кальций 299 мг | 20 |
Фосфор 48 мг | 5 |
Йод 150 мкг | 100 |
Магний 100 мг | 25 |
Цинк 15 мг | 100 |
Селен 20 мг | 29 |
Медь 2 мг | 100 |
Марганец 2 мг | 100 |
Хром 150 мкг | 125 |
Молибден 75 мкг | 100 |
Хлор 72 мг | 2 |
Калий 80 мг | 2 |
Виноградный экстракт MegaNatural®-BР 150 мг | * |
Бор 150 мкг | * |
Никель 5 мкг | * |
Кремний 2 мг | * |
Ванадий 10 мкг | * |
Лютеин 250 мкг | * |
Ликопен 300 мкг | * |
*Суточная норма (% СН) не установлена. |
Пример 7
Витаминно/минеральная добавка
Виноградный экстракт MegaNatural®-BP (150 мг) смешивали в V миксере до достижения однородности со следующими ингредиентами и наполнителями, приведенными в списке Таблицы 8. Смесь прессовали в форме таблетки с массой 755 мг ±2% с получением мультивитаминной/минеральной добавки. На таблетки распылением наносили прозрачное покрытие из водорастворимой камеди, такой как гидроксипропилцеллюлоза, и сушили. Ежедневная доза составила одну таблетку в день. Размер партии по рецептуре, приведенной в таблице 8, составляет 500000 таблеток.
Таблица 8 | ||||
Ингредиенты (единицы измерения) | Как указано на этикетке | Избыток (%)* | Количество/ Таблетка (мг) | Количество/Партия (кг) |
Витамин А пальмитат при 500 К IU/г (IU) | 5000 IU | 30 | 13,000 | 6,500 |
Витамин D 3 при 850 К IU/г (IU) | 400 IU | 30 | 0,612 | 0,306 |
Витамин Е сукцинат (D- ) при 1210 IU/г (IU) | 15 IU | 5 | 13,017 | 6,508 |
Витамин С (мг) | 30 мг | 2 | 30,600 | 15,300 |
Тиамин HCl при 89,2% (мг) | 1,5 мг | 2 | 1,715 | 0,858 |
Рибофлавин (мг) | 1,7 мг | 2 | 1,734 | 0,867 |
Ниацинамид (мг) | 10 мг | 2 | 10,200 | 5,100 |
Пиридоксин HCl 82,3% (мг) | 2 мг | 5 | 2,552 | 1,276 |
Фолиевая кислота, порошок 1,0% (мкг) | 400 мкг | 25 | 50,000 | 25,000 |
Витамин В-12, порошок 1,0% (мкг) | 6 мкг | 20 | 0,720 | 0,360 |
Пантотеновая кислота (Cal Pan) (мг) | 10 мг | 5 | 10,500 | 5,250 |
Биотин, порошок 1,0% (мкг) | 30 мкг | 20 | 3,600 | 1,800 |
Кальций (дикальций фосфат) 29,46% (мг) | 100 мг | 0 | 344,119 | 172,060 |
Фосфор (дикальций фосфат) 22,77% (мг) | 75 мг | 0 | 0,000 | 0,000 |
Магний (MgO) 60,32% (мг) | 20 мг | 0 | 33,156 | 16,578 |
Цинк (ZnO) 80,34% (мг)) | 5 мг | 0 | 6,224 | 3,112 |
Йод (KI) 76,45% (мкг) | 150 мкг | 0 | 0,196 | 0,098 |
Медь (глюконат) 14,00% (мг) | 2 мг | 0 | 14,286 | 7,143 |
Марганец (глюконат) 12,34% (мг) | 2 мг | 0 | 16,207 | 8,104 |
Виноградный экстракт MegaNatural®-BР | 150 мг | 150,000 | 25,000 | |
Микрокристаллическая целлюлоза | 33,750 | 16,875 | ||
Кросс-кармелоза натрия | 20,250 | 10,125 | ||
Стеариновая кислота Стеарат магния | 13,500 | 6,750 | ||
Стеарат магния | 5,063 | 2,531 | ||
Итого | 775,000 | 337,500 | ||
*Процентное содержание ингредиента сверхуказанного на этикетке использовано для того, чтобы получить количество, указанное на этикетке. |
Класс A23L2/00 Безалкогольные напитки; сухие составы или их концентраты и их производство
Класс A61K36/87 Vitaceae или Ampelidaceae (семейство виноградовых), например винный виноград, мускатный виноград или виноградовник (ампелопсис)