штамм культивируемых гибридных клеток животных mus. musculus l - продуцент моноклональных антител, специфичных к лпс холерных вибрионов о139 серогруппы

Формула изобретения

Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L - продуцент моноклональных антител, специфичных к ЛПС холерных вибрионов О139 серогруппы, депонированный под номером РККК (П) 674Д в «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института Цитологии (Санкт-Петербург).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной биотехнологии, и может быть применено в здравоохранении при создании диагностических тест-систем на основе моноклональных антител для ускоренной идентификации холерных вибрионов O139 серогруппы.

Возможность завоза возбудителя холеры «Бенгал» в Россию диктует необходимость привлечения в отечественной лабораторной практике новых диагностических препаратов с высокой специфичностью и чувствительностью для повышения достоверности серологического анализа холерных вибрионов O139 серогруппы.

Известен способ идентификации некультивируемых форм холерных вибрионов O139 серогруппы (см. Л.П.Алексеева, О.И.Сальникова и др. «Моноклональные антитела к липополисахариду Vibrio cholerae O139». Журнал Биотехнология, 2002 г., № 2. С.79-84), заключающийся в клонировании и реклонировании 8 штаммов гибридомных клеток, продуцирующих МКА к V. cholerae O139, которые строго специфичны в отношении ЛПС и микробных клеток V. cholerae O139, среди последних преобладают JgM, и в зависимости от концентрации антител в культуральной жидкости показатели титра в реакции ИФА составляют от 1:50 до 1:400, при этом положительное свечение в реакции непрямой иммунофлуоресценции и окраска проб в ИФА обеспечивают все моно AT из культуральной жидкости.

Однако в известном способе отсутствует целенаправленный отбор МКА, взаимодействующих с детерминантами, широко представленными на поверхности холерных вибрионов O139 серогруппы.

Такие исследования не предпринимались, поэтому не были установлены МКА, отвечающие диагностическим требованиям.

За прототип выбран способ определения специфической активности антител к капсульному антигену Vibrio cholerae O139 серовара (см. Федорова В.А. и др. «Специфическая активность антител к капсульному антигену Vibrio cholerae O139 серовара», материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, М., 1997, т.1, с.313-314), заключающийся в использовании специфических поликлональных антител, получаемых за счет совместного применения в качестве биопродуцентов иммунных мышей гибридной линии BALB/C и миелом сингенных линий.

Недостатком известного способа является то, что несмотря на заявленную специфичность и концентрацию в асцитической жидкости, упомянутые антитела не нашли практического применения в отличие от кроличьих, используемых в настоящее время для идентификации холерных вибрионов O139 серогруппы.

Более оправданным с точки зрения экономических затрат и диагностической эффективности получаемых препаратов является привлечение гибридомной технологии для решения задач, связанных с совершенствованием имеющихся или разработкой новых тест-систем, позволяющих существенно повысить эффективность лабораторных исследований на холеру.

Целью предлагаемого изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus, продуцирующих диагностически значимые МКА к эпитопам ЛПС холерных вибрионов O139 серогруппы.

Поставленная цель достигается получением штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L-продуцента моноклональных антител, специфичных к ЛПС холерных вибрионов 0139 серогруппы, депонированной под номером РККК (П) 674Д в «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института Цитологии (г.Санкт-Петербург).

Способ получения штамма включает несколько этапов:

I - Получение иммунных спленоцитов. Мышей Balb С иммунизируют клетками Vibrio cholerae O139 (штамм Р-16064), убитыми нагреванием (100°С, 15 мин). Иммунизацию мышей проводят трехкратно с интервалом 2 недели, вводя внутрибрюшинно 0,1 мл инактивированной взвеси холерных вибрионов (10⁹ кл/мл). В стерильных условиях извлекают селезенку мышей через 3-4 дня после заключительной инъекции антигена, растирают в гомогенизаторе и готовят суспензию спленоцитов в бессывороточной среде RPMI-1640.

II - Проведение гибридизации. Клетки перевиваемой миеломы NSO гибридизуют с иммунными клетками селезенки в соотношении 5:1 в 45% растворе полиэтиленгликоля 1500 с 10% диметилсульфоксида на среде RPMI 1640 в течение 1 мин совместной инкубации. После гибридизации клетки рассеивают культуральными микропанелями в селективной среде состава: RPMI 1640, 15% сыворотки плода коровы, 4 mM 1-глютамина, компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипоксантина, 0,000191 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/мл тимидина). Через три недели после завершения этапа селекции гибридных клеток от родительской миеломы их продолжают культивировать на среде того же состава, исключая гипоксантин, аминоптерин, тимидин. Из лунок с моноклональным ростом отбирают на анализ супернатанты и тестируют на наличие в них антител к ЛПС V. cholerae O139 твердофазным иммуноферментным методом. Затем отбирают супернатанты и соответствующие штаммы гибридных клеток, которые показывают достоверную положительную реакцию с ЛПС V. cholerae O139.

III - Культивирование гибридом. Суспензию слившихся клеток в ГАТ-среде разливают по 0,1 мл в четыре 96-луночных плоскодонных культуральных планшета на фидерный слой предварительно высеянных (за сутки) перитонеальных макрофагов белых мышей в дозе 10000 на лунку. Регистрируемые колонии гибридных клеток мышей появляются на 7-10 день. Гибридому культивируют 14 дней на среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде ГТ. После чего переводят на ростовую среду без селективных компонентов.

IV - Скрининг гибридом. Периодически отбирают культуральные жидкости гибридом для тестирования в иммуноферментном анализе (ИФА) и рекакции непрямой иммунофлуоресценции.

V - Клонирование. Отборный штамм гибридомы трижды клонируют методом предельных разведений в жидкой среде в 96-луночных планшетах на фидере из перитонеальных макрофагов белых мышей. В последнем клонировании процент позитивных клонов равен 100%. В результате клонирования получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих МКА заданной специфичности.

Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии (г.Санкт-Петербург) под номером РККК (П) 674 Д.

Заявляемый штамм гибридом обладает следующими характеристиками.

Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой крупные округлые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы. Ядра гиперхромные, неправильно-овальной формы, крупные, с грубой структурой ядерного хроматина.

Культуральные признаки. В культуре клетки профилируют в интервале концентраций 10 ⁵-10⁶ в 1 мл и требуют пересева каждые 72 часа. Коэффициент рассева 1:4-1:5. Клетки гибридомы культивируют при 37°С в пластиковой или стеклянной посуде в среде RPMI 1640 с 10% раствором сыворотки эмбриона коровы в СО₂-инкубаторе (Nuare).

Культивирование штамма в организме экспериментальных животных. Клетки прививают в организм мышей Babl С, предобработанных за 10-14 дней до инокуляции гибридомы в брюшную полость 0,5 мл/мышь пристана. Доза клеток на мышь от 3 до 10 млн, опухоль растет смешанным асцитносолидным образом. Объемы асцитных жидкостей от 3 до 7 мл от мыши. Титр МКА в ТИФА в асцитных жидкостях составляет 10⁵-5·10⁵.

Кариологические признаки. Модальное число хромосом 88, кариотип клеток штамма 674 Д по видовой принадлежности - мышиный.

Биотехнологическая характеристика полезного продукта. Антитела, продуцируемые клетками штамма 674 Д, относятся к классу иммуноглобулинов Ig M по данным ТИФА с типирующими моноспецифическими антисыворотками против отдельных классов иммуноглобулинов мыши. Оценивать серологическую активность МКА можно в реакциях слайд-агглютинации, не прямой иммунофлуоресценции, дот-иммунологическом и твердофазном иммуноферментном анализе, реакции преципитации. Методом иммуноблота установлено, что МКА штамма 674 Д направлены к эпитопам полисахаридной части ЛПС. Гибридный клон отличается стабильностью, продуцирует МКА, специфические только в отношении V. cholerae O139, не обладающие перекрестной активностью со штаммами холерных вибрионов O1 и не O1/O139 серогруппы и гетерологичными микроорганизмами. Титр МКА в культуральной жидкости составляет в ТИФА 1:500 - 1:1000, слайд-агглютинации 1:8-1:16, в асцитической жидкости в ТИФА - 10⁵-5·10⁵, слайд-агглютинации 1:128-1:256.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре клеток не обнаруживаются. Заражение микоплазмой не выявлено.

Криоконсервирование. После центрифугирования осадок клеток штамма 674 Д ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 50% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% глицерина или 10% диметилсульфоксида. Замораживание проводят в программном замораживателе со снижением температуры на 1°С (до -40°С), далее на 10°С (до -100°С). Затем клетки помещают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток по включению трипанового синего составляет 70-80%.

Пример 1. Получение МКА из штамма гибридом РККК (П) 674Д.

Гибридому выращивают in vitro до конечной концентрации 1·10⁶-5·10⁵ кл. среды.

Клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин и вводят внутрибрюшинно мышам линии Babl С, предварительно обработанных пристанном, по (5-10)·10 ⁶ клеток в объеме 1,5-2 мл после формирования асцитной опухоли осуществляют забор иммуноасцитической жидкости. Клетки осаждают из ИАЖ центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин, используют для последующего пассажа in vitro и in vivo.

Супернатант в виде МКА используют в иммунодиффузии, непрямой иммунофлуоресценции, ИФА для идентификации штаммов V. cholerae O139. Бесклеточный супернатант также используют для выделения моноклональных антител путем осаждения насыщенным раствором сульфата аммония, которые можно длительно хранить в условиях низкотемпературного холодильника без потери специфической активности. На их основе представляется возможной разработка новых иммуноглобулиновых препаратов и тест-систем для лабораторной диагностики холеры O139.

Пример 2. Подтверждение специфической активности МКА штамма как диагностического реагента в реакции слайд-агглютинации.

Постановку реакции осуществляют следующим образом.

На стекло наносят каплю препарата МКА в рабочем разведении и каплю 0,9% раствора хлорида натрия, а затем к ним добавляют исследуемую культуру, тщательно растирая петлей или стеклянной палочкой. Положительная реакция характеризуется образованием четкого крупно- или мелкозернистого агглютината в течение 30 секунд. Источником МКА для исследования широкого набора штаммов V. cholerae O139 служит асептическая жидкость в разведении 1:64.

Результаты, отраженные в таблице 1, свидетельствуют о том, что МКА быстро образовывают агглютинат со всеми 19-ю штаммами холерных вибрионов O139 серогруппы независимо от того, выделены они от человека или из внешней среды. Подтверждением высокой специфичности МКА является отрицательная реакция агглютинации с представителями V. cholerae O1, V. cholerae не O1/ не O139, а также с представителями родов Aeromonas, Plesiomonas, вида V. parahaemolyticus.

Таким образом, полученные данные показывают, что МКА штамма гибридомы 674 Д отличаются строгой специфичностью, выявляя в реакции агглютинации холерные вибрионы только O139 серогруппы, и поэтому могут быть использованы в лабораторной диагностике для их идентификации.

Пример 3. Оценка диагностических свойств МКА гибридомы в тесте иммунодиффузии.

Для исследования были взяты 24 штамма от человека и 30 штаммов водных вибрионов V. cholerae O139 и рассмотрено их взаимодействие с моно- и поликлональными антителами клеток V. cholerae O139 в реакции преципитации.

Из таблицы 2 следует, что в случае использования 1 млрд взвеси вибрионов образование преципитата наблюдается у 20 из 24 штаммов от человека, тогда как повышение концентрации до 5 млрд способствовало выявлению 22 штаммов. У всех 30 штаммов водных вибрионов V.cholerae O139 в реакции с МКА штамма гибридомы 674 Д линии преципитации отсутствовали. Взаимодействие вибрионов с поликлональной мышиной сывороткой O139 не показало таких четких различий между вибрионами водного и человеческого происхождения, как в случае МКА гибридомы 674 Д, так как у 9 штаммов «водных» вибрионов наблюдалось формирование линии преципитации. Таким образом, метод иммунодиффузии с использованием МКА штамма гибридомы 674 Д может быть использован в качестве дополнительного теста для дифференциации штаммов V.cholerae O139, выделенных из клинического материала и воды.

Пример 4. Использование диагностически значимых МКА в тест-системах.

На основе МКА гибридомы предварительно получают экспериментальные серии препаратов МКА, меченных флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ-МКА O139) для постановки прямого варианта иммунофлуоресценции.

Препарат ФИТЦ-МКА берут в рабочем разведении 1:16. Специфичность и чувствительность ФИТЦ-МКА исследуют на 55 штаммах V. cholerae O139, выделенных из различных источников, а также штаммах V. cholerae O1, не O1/не 0139. Содержание вибрионов в пробах, подлежащих тестированию, должно быть не ниже 10⁴-10⁵ м.кл./мл.

В результате испытаний (см. таблицу 3) положительная иммунофлуоресценция на «4+» с четко выраженной формой клеток отмечена у 75% холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных от человека, меньшая же их часть (25%), вступая в реакцию с мечеными иммуноглобулинами, обеспечивала свечение на «3+». Интенсивное свечение на 4+ наблюдалось у 45,2% «водных» вибрионов V.cholerae 0139, и 38,7% штаммов светились на 3+. Перекрестные реакции с представителями близкородственных и гетерологичных микроорганизмов отсутствовали. Из таблицы также видно, что эффективность выявления штаммов человеческого происхождения МКА гибридомы 674 Д, меченных ФИТЦ, составила 100%, в то время как этот показатель в отношении «водных» вибрионов находился на уровне 83,9%. Таким образом, на основе МКА гибридомы 674 Д можно получить диагностические люминесцирующие иммуноглобулины, отличающиеся строгой специфичностью и чувствительностью, предназначенные для ускоренной идентификации холерных вибрионов O139 серогруппы в реакции прямой иммунофлуоресценции.

МКА, секретируемые гибридным клоном, могут быть применены как диагностические реагенты для идентификации холерных вибрионов О139 серогруппы человеческого и водного происхождения в иммунологических реакциях: слайд-агглютинации, твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА), непрямом иммунофлуоресцентном методе (НИФМ) преципитации.

Кроме того, МКА штамма РКК(П) 674 Д также могут быть использованы в научных исследованиях и практическом здравоохранении при создании диагностических тест-систем нового поколения для идентификации холерных вибрионов O139 серогруппы.

Таблица 1
№ п/п	Штаммы	Количество исследуемых штаммов	Количество штаммов, агглютинирующихся МКА 674Д (1:32)
1	V.cholerae О139	19	19
2	V.cholerae eltor Inaba	25	Результаты в реакции слайд-агглютинации отрицательные
3	V.cholerae cholerae Inaba	2
4	V.cholerae cholerae Ogawa	7
5	V.cholerae eltor Ogawa	52
6	V.cholerae RO	7
7	V.cholerae не O1 /не O139, выделенные в период 2002-2008 г.	100
8	Plesiomonas	7
9	Aeromonas	108
10	Comamonas	30
11	Vibrio parahaemolyticus	12

Таблица 2
Штаммы	Кол-во исследованных штаммов	Количество штаммов с положительной реакцией преципитации
1 млрд м.к./мл	5 млрд м.к./мл
МКА гибридомы 674 Д	Сыворотка O139	МКА гибридомы 674 Д	Сыворотка O139
V.cholerae O139 от человека	24	20	10	22	18
V.cholerae O139 из воды	30	-	4	-	9

Таблица 3
Штаммы	Количество штаммов	Количество штаммов с положительной флуоресценцией в %	Количество выявляемых штаммов в %
Интенсивность свечения	674 Д
4+	3+
V.cholerae O139 от человека	24	18/24 (75)	6/24 (25)	100
V.cholerae O139 из воды	31	14/31 (45,2)	12/31 (38,7)	83,9
V.cholerae O22	1	-	-	-
RCA-385	1	-	-	-
V.cholerae O1	10	-	-	-
E.coli	2	-	-	-
Brucella sp.	4	-	-	-
Salmonella sp.	4	-	-	-
Примечание: (-) - реакция отрицательна.