способ определения концентрации циклоспорина а в крови пациентов

Формула изобретения

Способ количественного определения циклоспорина А в крови пациентов, включающий осаждение белков крови путем добавления водного раствора сульфата цинка и метанола, перемешивания, центрифугирования и отбора центрифугата; разделение компонентов центрифугата методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, масс-спектрометрическую детекцию циклоспорина А и определение содержания циклоспорина А с построением калибровочной кривой, отличающийся тем, что для осаждения белков крови используют цельную кровь, после осаждения белков крови дополнительно осаждают солевые примеси путем добавления в центрифугат метанола до общего содержания не менее 90% по объему, повторного перемешивания, центрифугирования и отбора центрифугата, после чего проводят разделение его компонентов, детекцию и определение содержания циклоспорина А.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к клиническому лабораторному анализу, и может быть использовано для осуществления мониторинга концентрации циклоспорина А в крови больных в присутствии метаболитов последнего в целях подбора оптимальной дозы препарата и ее последующей корректировки.

В трансплантологии отдельное место занимает иммуносупрессивная терапия, которая проводится в посттрансплантационный период для подавления отторжения трансплантата и успех которой в значительной степени определяет результаты операционного вмешательства.

Циклоспорин А является действующим веществом ряда иммуносупрессивных препаратов («Сандиммун», «Неорал» и др.). Вместе с тем, терапия циклоспорином А связана с рядом сложностей, вызванных узким диапазоном терапевтических концентраций препарата, сильной зависимостью скорости всасывания и метаболизма от состояния и индивидуальных особенностей пациента и целого ряда других факторов. Это делает простые стратегии подбора дозы малоэффективными и вызывает необходимость непосредственного мониторинга концентрации циклоспорина А для корректного подбора дозы препарата.

Введение в широкую лабораторную практику методов мониторинга циклоспорина А при помощи вариантов иммуноферментного анализа (ИФА), в т.ч. основанных на использовании моноклональных антител (Randall W. Yatacoff et al. Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clinical Chemistry, 1990, v.36, No 11, p.1969-1973) привело к улучшению качества иммуносупрессивной терапии, однако не позволило в полной мере решить ряд проблем, связанных с недостаточной специфичностью антител к циклоспорину А по отношению к его метаболитам, что приводит к тому, что точность результатов измерения данными методами в значительной степени зависит от концентрации метаболитов препарата в крови пациента. Таким образом, ошибочное завышение результатов измерений при значительном накоплении метаболитов в крови пациентов способно, в ряде случаев, привести к получению пациентом недостаточной дозы препарата и общему ухудшению результатов терапии.

Для решения указанной проблемы был разработан и применяется ряд способов мониторинга циклоспорина А в крови пациентов, основанных на методе хромато-масс-спектрометрии. В силу того, что данные способы основаны на измерении совокупности сигналов, специфичных для циклоспорина А, они избавлены от недостатков, связанных с кроссреактивностью метаболитов, присущих методам ИФА.

Так, известен способ масс-спектрометрического мониторинга циклоспорина А, включающий разбавление образцов крови водой, осаждение белков крови 0.33М раствором ZnSO₄ в 66% метаноле, содержащим внутренний стандарт с последующим центрифугированием, твердофазную экстракцию в онлайн-варианте с использованием дополнительного хроматографического насоса, разделение методом обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии и детектирование при помощи тандемного трехквадрупольного масс-спектрометрического детектора (Christoph Seger et al. A rapid HPLC-MS/MS method for simultaneous quantification of cyclosporine A, tacrolimus, sirolimus and everolimus in human blood samples. Nature Protocols, 2009, v.4. No 4, p.526-533).

Указанный способ, позволяющий проводить определение циклоспорина А в присутствии метаболитов с достаточной точностью и специфичностью, выбран в качестве прототипа. Недостатками данного способа являются его сложность и повышенные требования к оборудованию (необходимо устройство для онлайн-экстракции, масс-спектрометрический детектор особого типа) и материалам (обязательное использование внутренних стандартов), что делает данный способ дорогостоящим.

Указанные недостатки, по-видимому, связаны с высокой сложностью компонентного состава образцов, получаемых в результате осаждения белков из крови, что осложняет осуществление масс-спектрометрического анализа в силу интерференции примесей с сигналами анализируемого вещества. Обеспечение необходимой точности в этом случае достигается использованием дорогостоящего масс-спектрометра повышенной чувствительности типа тройного квадрупольного анализатора, что позволяет за счет предварительного разбавления образцов водой снизить эффект влияния примесей в силу общего снижения концентрации веществ, введением внутреннего стандарта, который частично корректирует существующее влияние примесей, проведением онлайн-экстракции, которая позволяет провести предварительную очистку анализируемого соединения перед хроматографическим разделением. Все эти меры по снижению влияния примесей на результаты измерения в совокупности, по-видимому, и обеспечивают необходимую точность и специфичность анализа в способе, описанном в прототипе, за счет повышенной сложности и стоимости реализации.

Нами поставлена задача - создание простого и универсального способа хромато-масс-спектрометрического определения концентрации циклоспорина А в крови пациентов.

Технический результат, достигаемый при осуществлении предложенного способа, заключается в обеспечении простоты и универсальности анализа при достижении достаточной чувствительности и селективности за счет исключения необходимости во внутреннем стандарте и онлайн-экстракции и снижения требований к техническим характеристикам используемого масс-спектрометра путем проведения предварительного осаждения примесей.

Нами было установлено, что стадия дополнительного осаждения примесей позволяет добиться существенного увеличения интенсивности сигнала циклоспорина А и расширения линейного диапазона его количественного определения. Данный эффект улучшения результатов детектирования при осаждении интерферирующих примесей в сочетании с тщательно подобранными условиями хроматографического разделения и делает реализацию предлагаемого метода возможной.

Сущность изобретения

Предлагаемый способ заключается в осаждении белков крови путем добавления водного раствора сульфата цинка и метанола, перемешивании, центрифугировании и отборе центрифугата, дополнительном осаждении солевых примесей путем добавления в центрифугат метанола до общего содержания не менее 90% по объему, повторных перемешивании, центрифугировании и отборе центрифугата, разделении компонентов центрифугата методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии; масс-спектрометрической детекции циклоспорина А и определении содержания циклоспорина А с построением калибровочной кривой.

Для доказательства возможности реализации указанного назначения и достижения технического результата приводим следующие результаты.

Приготовление образцов: к 150 мкл анализируемой крови добавляют 300 мкл раствора 1% ZnSO₄ в 80% метаноле без внутреннего стандарта, перемешивают 10 мин на шейкере IKA-VIRBAX-VXR со скоростью 2200 об/мин, центрифугируют 10 мин на центрифуге Abbot со скоростью 10900 об/мин, отбирают 150 мкл супернатанта, к которому добавляют 150 мкл метанола (что соответствует общему содержанию метанола в растворе 93% по объему), перемешивают 0.5 мин на шейкере IKA-VIRBAX-VXR со скоростью 2200 об/мин, центрифугируют 10 мин на центрифуге Abbot со скоростью 10900 об/мин, отбирают 300 мкл супернатанта, который помещают в хроматографическую виалу.

Хроматографический анализ и масс-спектрометрическая детекция: 5 мкл образца подвергают разделению на хроматографе Agilent 1100 в составе: дегазатор, кватернарный насос с градиентом на стороне низкого давления, автосемплер без термостатирования образцов, термостат колонок, который не содержит устройства для онлайн-экстракции. В качестве хроматографической колонки используют, например, колонку Agilent Zorbax Eclipse С-8, в качестве элюента, например, 10 мМ HCOONH ₄ 50% МеОН 10 мМ HCOONH₄ 98% МеОН. Детектирование осуществляют масс-спектрометром, например, Agilent 1100 Series LC/MSD Trap VL, который относится к типу ионных ловушек и не относится к типу тройных квадрупольных анализаторов повышенной чувствительности. Регистрируют интенсивности, например, фрагмента с соотношением масса/заряд 1184, полученного фрагментацией изолированного иона соотношением масса/заряд 1203. Рабочие параметры масс-спектрометрического детектора предварительно оптимизированы для максимальной чувствительности к ионам с указанными соотношениями масса/заряд.

Определение концентрации: Серия калибраторов была приготовлена из цельной крови человека, не принимавшего циклоспорин А, путем приготовления из чистого циклоспорина A (Novartis) серии концентрированных растворов последнего методом последовательного разбавления с последующим добавлением одинаковых объемов концентрированных растворов к аликвотам крови. Для калибровки используют предварительно дозированные калибраторы с концентрациями циклоспорина А, например, 15.1, 62.5, 250, 1000 и 2000 нг/мл, которые подвергают пробоподготовке вместе с анализируемыми образцами и хромато-масс-спектрометрическому анализу непосредственно перед ними.

Для доказательства точности измерения предлагаемым методом концентраций циклоспорина А в отсутствии его метаболитов из цельной крови человека, не принимавшего циклоспорин А, были приготовлены и проанализированы контрольные образцы с концентрациями циклоспорина А 31.25, 125.0 и 500.0 нг/мл. Максимальная ошибка измерения для предлагаемого метода составила 4.6%. В целях осуществления независимого контроля концентрации циклоспорина А в указанных контролях были измерены также методом флюоресцентного иммуноанализа на поляризационном флюориметре Abbot TDXFLX с использованием набора TDX/TDXFLX Cyclosporine Monoclonal Whole Blood. Максимальная ошибка для метода флюоресцентного иммуноанализа составила 8.2%. Соответствие точности измерения концентрации циклоспорина А в отсутствии метаболитов другим принятым в отрасли методом подтверждает достижение достаточной для практических целей точности при реализации предлагаемого метода.

Для доказательства соответствия селективности измерения циклоспорина А в присутствии метаболитов было проведено исследование на клинической базе лаборатории трансплантационной иммунологии «ФГУ ФНЦ трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И.Шумакова» Минздравсоцразвития РФ, включающее анализ проб крови 9 пациентов, выбранных случайным образом среди получавших препараты циклоспорина А после трансплантации. В целях оценки селективности к циклоспорину А проводилось сопоставление значений его концентраций, измеренных предлагаемым способом и методом флюоресцентного иммуноанализа на поляризационном флюориметре Abbot TDXFLX с использованием набора TDX/TDXFLX Cyclosporine Monoclonal Whole Blood.

Среднее значение отклонения результата измерения предлагаемым методом по отношению к результатам метода Abbot TDx, дающего систематическую погрешность измерения в силу кросс-селективности к метаболитам, составляет 21.0% в меньшую сторону. Это значение в пределах ошибки измерения находится в соответствии с данными, приведенными в литературе для среднего отклонения результатов измерения концентрации циклоспорина А в образцах, содержащих его метаболиты, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией и методом Abbot TDx (Norman В. Roberts et al. Evaluation of a novel semi-automated HPLC procedure for whole blood cyclosporin A confirms equivalence to adjusted monoclonal values from Abbott TDx, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2005, v.43, No 2, p.228-36). Это обстоятельство подтверждает достижение селективности предлагаемого метода к циклоспорину А в присутствии метаболитов.