способ коррекции анемии, вызываемой введением препарата дапсон, в эксперименте

Формула изобретения

Способ коррекции анемии, вызываемой введением препарата дапсон в эксперименте, состоящий в воздействии альфа-токоферола ацетата, отличающийся тем, что в качестве корректора используют альфа-токоферол ацетат, который вводят в комбинации с дапсоном белым нелинейным крысам-самцам per os в дозах 2-10 мг/кг 1 раз в сутки в течение 21 дня.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, в том числе к лепрологии, в частности, для коррекции анемии, вызываемой введением данного препарата.

Из практики медицины известен способ коррекции неблагоприятных последствий применения препарата дапсон, состоящий в использовании метаболического ингибитора - циметидина, с целью уменьшить окисление дапсона в печени до гидроксиламина, который и является гемотоксикантом (Coleman MD, Scott АК, Breckenridge AM, Park BK.The use of cimetidine as a selective inhibitor of dapsone N - hydroxylation in man // Br J Clin Pharmacol. - 1990. - Vol.120. - P.1582-1584). Однако данный способ имеет следующие недостатки. Циметидин является наименее гидрофильным и умеренно липофильным среди всех Н ₂-блокаторов, что определяет его способность проникать в разные органы и при длительном применении вызывать побочные эффекты: антиандрогенный; нарушение функции сердечно-сосудистой системы (аритмии, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, артериальная гипотензия); гепатотоксичность; неврологические побочные эффекты - дезориентация, галлюцинации; бронхоспазм; лейкопения, тромбопения; аллергические реакции.

Известен также способ коррекции неблагоприятного воздействия препарата дапсон на показатели красной крови, заключающийся в применении витамина C (Prussick R., Ali MA, Rosenthal D., Guyatt G. The protective effect of vitamin E on the hemolysis associated with dapsone treatment in patienens weit dermatitis herpetiformis // Arch. Dermatol. - 1992. - Vol.128. - P.210-213.). Однако известный способ имеет следующие недостатки: скорость процесса связывания аскорбиновой кислоты с токсичными метаболитами низкая; длительное применение способно вызвать такие побочные эффекты, как повышенную возбудимость ЦНС; повреждение поджелудочной железы, почек (повышенное образование оксалатов), повышение эстрогенного фона; повышение протромбина; усиление аллергических реакций. Имеются сведения о его незначительной эффективности как корректора.

Наиболее близким способом предлагаемому является способ коррекции анемии, заключающийся в применении такого антиоксиданта, как альфа-токоферол. Этот способ принят авторами в качестве прототипа (Prussick R., Ali MA, Rosenthal D., Guyatt G. The protective effect of vitamin E on the hemolysis associated with dapsone treatment in patienens weit dermatitis herpetiformis // Arch. Dermatol. - 1992. - Vol.128. - P.210-213). Однако способ-прототип имеет следующие существенные недостатки:

- недостаточная коррекционная эффективность способа;

- ежедневный прием альфа-токоферола 800 мг и более может иметь антикоагуляционный эффект, привести к геморрагической активности, что сопровождается снижением протромбинового индекса;

- группы, в которых апробировался способ, не были рандомизированы: отсутствовал плацебо-контроль и двойной слепой метод, что в целом ставит под сомнение достоверность выводов, к которым приходят авторы известного способа.

Задачей предлагаемого способа является повышение коррекционной эффективности известного способа.

Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Поставленная задача решается в изобретении тем, что в качестве корректора используют альфа-токоферол ацетат, который вводят сочетанно с дапсоном белым нелинейным крысам-самцам per os в дозах 2-10 мг/кг 1 раз в сутки в течение 21 дня.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что авторы впервые для коррекции анемии, вызываемой препаратом дапсон, использовали альфа-токоферол ацетат в соответствующих пределах дозировки, определив степень эффективности каждой из доз в разных возрастных группах в эксперименте.

Одной из важнейших функций живого организма является обеспечение оптимального уровня кислорода в тканях, которое позволяет нормально осуществлять молекулярные окислительно-восстановительные процессы. Эти процессы определяются саморегуляцией специальной функциональной системы, поддерживающей оптимальный для метаболизма уровень дыхательных показателей в организме.

В физиологических условиях транспорт кислорода от легких к тканям обеспечивает нормальное течение метаболизма тканей, если потребление ими составляет примерно 4 мл кислорода/мин/кг массы тела. Транспорт кислорода к тканям обеспечивается слаженно работающим комплексом различных механизмов, включающим регуляцию минутного объема дыхания, диффузионной способности легких, объема циркулирующих эритроцитов, сродства гемоглобина к кислороду и ряда др. При кратковременных воздействиях на организм отрицательных факторов включаются адаптивные механизмы, например, перераспределение кровотока, изменение минутного объема легких и т.д.

При длительно действующих гипоксических стимулах действуют более тонкие механизмы: изменяется количество циркулирующих эритроцитов, как следствие, объем плазмы крови и насыщение крови кислородом на уровне капилляров, что предполагает усиленную стимуляцию продукции эритропоэтина. Следовательно, кислородтранспортная емкость крови и обеспечивающее ее количество эритроцитов, а также их качественные характеристики являются одним из предконечных результатов в функциональной системе, определяющей уровень газовых показателей крови.

Дапсон - синтетический сульфон, структурно напоминающий сульфаниламиды, является не только основным препаратом при лепре, но и эффективен при лечении самых различных дерматологических нарушений, причем с наибольшим успехом тех, которые характеризуются нарушением аккумуляции нейтрофилов и эозинофилов. Это - герпетиформные дерматиты, гангренозные пиодермиты, пустулезный псориаз, плоский лишай и др. Применяется для профилактики малярии (комбинированный препарат Маолирим). В последние годы дапсон используют для лечения воспаления легких, вызванного Pneumocystis carini, у больных СПИД.

Токсичность сульфаниламидных препаратов, особенно дапсона, связана с формированием в ходе его метаболизма гидроксиламин-производных, являющихся метгемоглобинобразователями. Волнообразный характер образования метгемоглобина связан с циклом биотрансформации ксенобиотиков-окислителей. Существует мнение, что активным окислительным агентом в реакциях превращения гемоглобина в другие формы являются свободные радикалы, образующиеся как в процессе окисления промежуточных метоболитов фенилгидроксиаминов в нитробензол, так и в процессе восстановления нитрозогруппы в гидроксил аминогруппу.

Экспериментальные и клинические исследования показывают, что гидроксиламин и его соединения обладают уникальными биологическими эффектами, характеризующимися в сравнении с другими ксенобиотиками-окислителями, более быстрым и интенсивным формированием токсической метгемоглобинемии и выраженной гемолитической анемии, однако механизмы ее формирования окончательно не установлены, что затрудняет проведение эффективной терапии.

По данным Byrd S.R. и Gelber R.H. (1991) средний уровень гемоглобина у больных лепрой, получающих ежедневно дапсон, снижается почти до 2 г/дл в сутки прежде, чем достигнуть минимума, в то время как у 16% больных гемоглобин падает по меньшей мере до 3 г/дл. Эти же авторы отмечают, что частота возникновения гемолиза увеличивается по некоторым наблюдениям с возрастом и повышением дневной дозы.

Точно механизм гемолиза не установлен, хотя и высказывается гипотеза о том, что в этом процессе участвуют свободные радикалы кислорода (Bradshaw T.R. с соавт., 1997).

Несмотря на огромные успехи в области фармакотерапии дерматологических нарушений, дапсон продолжает сохранять значимое место в терапевтическом арсенале дерматологов. В этой связи проблема улучшения переносимости дапсона является особенно актуальной.

Ряд исследователей сходятся во мнении, что несмотря на хорошо развитую антиоксидантную систему, эритроциты все равно повреждаются в окислительном стрессе, не исключено, что причиной является их низкая энергетическая обеспеченность (отсутствие митохондрий). Структурные изменения мембранных белков эритроцитов являются следствием окисления глутатиона, сульфгидрильных групп мембран, образования смешанных белковых дисульфидов, именно эти процессы способствуют альтерации мембран и формированию острых и хронических гемолитических нарушений.

Альфа-токоферол является одним из наиболее доступных лекарственных препаратов с антиоксидантной активностью. Он способен ингибировать процессы перекисного окисления липидов, обладая высокой константой взаимодействия со свободными радикалами, раньше других антиоксидантов расходуется в окислительных реакциях, протекающих в липидах мембран. Следует также отметить большую распространенность дефицита этого витамина в популяции, что может усугублять повреждающее действие сульфаниламидов.

В данном случае для коррекции анемии, вызываемой введением дапсона, используют 10% раствор альфа-токоферол ацетата фирмы ICN, вводимый per os в комбинации с дапсоном 1 раз в сутки в дозах 2-10 мг/кг в течение 21 дня.

Предлагаемый способ позволяет обеспечить значимый защитный эффект против дапсон-индуцированного гемолиза и развития стойкой анемии с применением небольших доз альфа-токоферола, что практически исключает возникновение побочных негативных эффектов при длительном его применении с учетом возрастных особенностей, что способствует повышению коррекционной эффективности по сравнению со способом-прототипом.

Способ осуществляется следующим образом: для исследования используют белых нелинейных крыс самцов двух возрастных групп: половозрелых продуктивного возраста (7-9 мес.) и старых, в возрасте 21-24 мес. Каждую возрастную популяцию разбивают на три группы по 10-11 особей. 1-ая группа получает в качестве плацебо дистиллированную воду, 2-ая группа - дапсон (фирма «Novartis») в дозе 25 мг/кг (согласно рекомендациям ВОЗ соответствует по эффектам воздействия 100 мг/кг в день для человека), 3-я - альфа-токоферол ацетат в соответствующей дозе. Плацебо, дапсон (Д) и альфа-токоферол ацетат (AT) вводят per os 1 раз в день в утреннее время в течение 21 дня. Исследования во всех сериях проводят в осенний сезон, все животные содержатся в стандартных условиях вивария при естественном освещении и синхронизированы по питанию при свободном доступе к воде. По завершении экспериментов животных забивают декапитацией под хлороформным наркозом. Забирают кровь. В крови определяют уровень гемоглобина (Гб), количество эритроцитов (Эр) (Меньшиков В.В., 1987), уровень малонового деальдегида (МДА) (Бондарь Т.П. и соавт., 2007) и каталазы в эритроцитах (Галактионова Л.П. и соавт., 1998). Все манипуляции с животными проводят согласно Международным правилам GLP. Все полученные данные обработаны статистически с применением t-критерия Стьюдента.

Предлагаемый способ был успешно апробирован в НИИ по изучению лепры Росздрава на 322 нелинейных белых крысах-самцах двух возрастных групп: старых (21-24 мес.) и зрелых - продуктивного возраста (7-9 мес.), весом 240-360 г. в течение 2006-2009 г.г.

Пример № 1.

Способ осуществляли по приведенной выше схеме. Крысам опытных групп альфа-токоферол вводили в дозе 2 мг/кг веса животного 1 раз в сутки в комбинации с дапсоном в течение 21 дня. Результаты, полученные в ходе исследования, приведены в табл. 1.

Таблица 1
Возраст	Группы	Уровень Гб (г/л)	Кол-во Эр 1012/л	МДА Мкмоль/л	Каталаза %
Старые (21-24 мес.)	Контроль	142,0±3,1	7,84±0,68	4,06±0,11	46,3±3,3
Дапсон	130,6±1,0**	5,7±0,3**	4,46±0,06*	33,2±1,8**
АТ(2 мг/кг)+Д	141,6±3,0	6,3±0,45	4,15±0,12	44,3±3,4
Зрелые (7-9 мес.)	Контроль	141,3±2,1	7,6±0,35	3,55±0,15	50,1±3,2
Дапсон	129,4±1,8**	5,25±0,5**	4,09±0,16*	47,3±2,3
АТ(2 мг/кг)+Д	141,5±2,3	6,69±0,33	3,86±0,11	56,6±1,8
Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 в сравнении с контролем.

Из приведенной таблицы видно, что курсовое введение дапсона вызывает у крыс обоих возрастных групп статистически достоверное снижение гемоглобина и эритроцитов. При этом повышается уровень МДА, что свидетельствует о нарастании прооксидантного статуса и снижении активности антиоксидантной защиты эритроцитов, о чем можно судить по снижению активности каталазы, особенно у старых крыс. Антиоксидантный статус зрелых крыс страдает в меньшей степени. При применении в комплексе с дапсоном альфа-токоферола в дозе 2 мг/кг изменений уровня гемоглобина не выявлено, количество эритроцитов ниже, чем в контроле, однако эта разница не является статистически достоверной, отсутствуют значимые различия в концентрации МДА. У старых крыс наблюдается сопоставимый с контрольным уровень каталазы, а у более молодых - тенденция к его повышению.

Таким образом, альфа-токоферол в дозе 2 мг/кг, вводимый в комбинации с дапсоном, обеспечивает стабилизацию антиоксидантного статуса эритроцитов и коррекцию дапсон-индуцированной анемии.

Пример № 2.

Способ осуществляли по приведенной выше схеме. Крысам опытных групп альфа-токоферол вводили в дозе 5 мг/кг веса животного 1 раз в сутки в комбинации с дапсоном в течение 21 дня. Результаты, полученные в ходе исследования, приведены в табл.2.

Таблица 2
Возраст	Группы	Уровень Гб (г/л)	Кол-во Эр 1012 /л	МДА Мкмоль/л	Каталаза %
Старые (21-24 мес.)	Контроль	145,1±1,4	7,9±0,41	4,2±0,16	44,2±2,8
Дапсон	128,7±1,0***	5,69±0,3***	4,6±0,08**	31,3±1,3***
АТ(5 мг/кг)+Д	140,1±2,3	6,72±0,39	4,3±0,13	44,3±3,4
Зрелые (7-9 мес.)	Контроль	146,1±1,7	7,93±0,36	3,67±0,13	52,4±2,3
Дапсон	130,2±1,5***	4,92±0,4***	4,12±0,11*	46,9±2,1
АТ(5 мг/кг)+Д	144,1±2,1	6,8±0,4	3,86±0,11	57,2±1,35
Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 в сравнении с контролем.

Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют, что так же как и в первом примере дапсон, оказывая прооксидантный эффект, индуцирует у крыс анемию, о чем свидетельствует статистически значимое снижение гемоглобина и эритроцитов. Сочетанное введение дапсона и альфа-токоферола в дозе 5 мг/кг обеспечивает повышение антиоксидантного статуса эритроцитов. При этом наблюдается коррекция картины красной крови: сохранение уровня гемоглобина, сопоставимого с контрольным, и количества эритроцитов, статистически значимо не отличающегося у крыс, не получавших препараты.

Таким образом, альфа-токоферол в дозе 5 мг/кг, вводимый в комбинации с дапсоном, обеспечивает стабилизацию антиоксидантного статуса эритроцитов и коррекцию дапсон-индуцированной анемии.

Пример № 3.

Способ осуществляли по приведенной выше схеме. Крысам опытных групп альфа-токоферол вводили в дозе 10 мг/кг веса животного 1 раз в сутки в комбинации с дапсоном в течение 21 дня. Результаты, полученные в ходе исследования, приведены в табл.3.

Таблица 3
Возраст	Группы	Уровень Гб (г/л)	Кол-во Эр 1012 /л	МДА Мкмоль/л	Каталаза %
Старые (21-24 мес.)	Контроль	144,2±1,8	7,81±0,52	4,08±0,1	46,8±3,2
Дапсон	131,1±2,3***	5,89±0,2**	4,48±0,08**	30,4±1,8***
АТ(10 мг/кг)+Д	142,5±2,8	6,57±0,35	4,0±0,06	43,8±2,1
Зрелые (7-9 мес.)	Контроль	143,3±2,1	8,17±0,48	3,59±0,13	52,3±1,8
Дапсон	130,4±1,8***	5,85±0,5**	4,09±0,1**	49,2±1,7
АТ(10 мг/кг)+Д	142,6±3,7	7,58±0,43	3,68±0,16	57±3,1
Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 в сравнении с контролем.

При введении дапсона выявлено снижение уровня гемоглобина и эритроцитов, повышение прооксидантного статуса (увеличение МДА) и статистически достоверное снижение активности каталазы у старых крыс. Сочетанное введение дапсона и альфа-токоферола в дозе 10 мг/кг обеспечивает повышение антиоксидантного статуса эритроцитов, что приводит к лучшей сохранности эритроцитарных мембран и, как следствие, снижению гемолиза, что способствует поддержанию концентрации гемоглобина на должном уровне.

Таким образом, альфа-токоферол в дозе 10 мг/кг, вводимый в комбинации с дапсоном, обеспечивает стабилизацию антиоксидантного статуса эритроцитов и коррекцию дапсон-индуцированной анемии.

Пример № 4.

Способ осуществляли по приведенной выше схеме. Крысам опытных групп альфа-токоферол вводили в дозе 1 мг/кг веса животного 1 раз в сутки в комбинации с дапсоном в течение 21 дня. Результаты, полученные в ходе исследования, приведены в табл.4.

Таблица 4
Возраст	Группы	Уровень Гб (г/л)	Кол-во Эр 1012 /л	МДА Мкмоль/л	Каталаза %
Старые (21-24 мес.)	Контроль	143,7±2,1	7,76±0,17	4,12±0,08	44,7±1,3
Дапсон	128,4±1,3***	5,44±0,2***	4,45±0,13**	30,1±1,1***
АТ(1 мг/кг)+Д	131,1±3,1***	5,62±0,4***	4,32±0,15	32,4±1,6***
Зрелые (7-9 мес.)	Контроль	142,0±3,35	7,83±0,32	3,86±0,1	50,7±1,9
Дапсон	127,9±1,8***	5,6±0,21**	4,25±0,13*	48,2±1,7
АТ(1 мг/кг)+Д	130,0±2,3***	6,0±0,35**	4,15±0,08*	50,24±1,8
Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 в сравнении с контролем.

Из таблицы 4 видно, что при сочетанном введении дапсона и альфа-токоферола в дозе 1 мг/кг уровень гемоглобина остается сопоставимым с таковым у крыс, получавших только дапсон, эти тенденции характерны и для эритроцитов. Значимых изменений оксидантного статуса также не наблюдается.

Таким образом, альфа-токоферола в дозе 1 мг/кг, вводимый в комбинации с дапсоном, не обеспечивает, в отличие от доз 2 мг/кг-10 мг/кг, стабилизацию антиоксидантного статуса эритроцитов и коррекцию признаков дапсон-индуцированной анемии.

Пример № 5.

Способ осуществляли по приведенной выше схеме. Крысам опытных групп альфа-токоферол вводили в дозе 15 мг/кг веса животного 1 раз в сутки в комбинации с дапсоном в течение 21 дня. Результаты, полученные в ходе исследования, приведены в табл.5.

Таблица 5
Возраст	Группы	Уровень Гб (г/л)	Кол-во Эр 1012 /л	МДА Мкмоль/л	Каталаза %
Старые (21-24 мес.)	Контроль	144,9±1,9	7,85±0,23	4,18±0,09	45,8±1,3
Дапсон	129,6±2,1***	6,0±0,21***	4,67±0,13*	30,8±1,1***
АТ(15 мг/кг)+Д	130,8±2,3***	5,9±0,18***	4,25±0,11	28,9±1,8***
Зрелые (7-9 мес.)	Контроль	142,9±1,8	8,4±3,1	3,51±0,08	51,4±2,1
Дапсон	128,5±2,4***	5,84±1,9***	4,09±0,12**	46,0±3,4
АТ(15 мг/кг)+Д	127,3±1,7***	5,65±2,7***	3,6±0,11	44,7±2,1
Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 в сравнении с контролем.

Результаты показывают, что при сочетанном введении дапсона и альфа-токоферола в дозе 15 мг/кг изменений уровня гемоглобина и количества эритроцитов в сравнении с группой, получавших только дапсон, не наблюдается. Кроме того, при выявленном снижении концентрации МДА, сочетанное применение дапсона и альфа-токоферола не вызывает значимого изменения уровня каталазы.

Таким образом, альфа-токоферол в дозе 15 мг/кг, вводимый в комбинации с дапсоном, не обеспечивает, в отличие от доз 2 мг/кг - 10 мг/кг, стабилизацию антиоксидантного статуса эритроцитов и коррекцию дапсон-индуцированной анемии.

Анализ приведенных примеров показывает, что альфа-токоферол, вводимый в комбинации с дапсоном per os ежедневно в дозах 2 мг/кг - 10 мг/кг 1 раз в сутки сочетанно с дапсоном в эксперименте до его завершения (21 день), обеспечивает стабилизацию антиоксидантного статуса эритроцитов и коррекцию признаков дапсон-индуцированной анемии.

Предлагаемым способом достигается повышение коррекционной эффективности способа коррекции анемии, вызываемой введением препарата дапсон в эксперименте. Повышение эффективности заключается в том, что при ежедневном введении с первого дня эксперимента per os совместно с дапсоном альфа-токоферол ацетата в дозах 2 мг/кг - 10 мг/кг предотвращается развитие стойкой анемии, характерной при применении дапсона. Показатели гемоглобина при осуществлении предложенного способа поддерживаются на уровне контрольных, количество эритроцитов достигает 85%-96% от контрольного, в то время как у особей, получающих дапсон без коррекции альфа-токоферолом, данный показатель снижен на 30%-40%.

Предложенный способ в отличие от способа-прототипа предлагает

- осуществление коррекции небольшими дозами альфа-токоферола, что позволяет длительное использование альфа-токоферола без возможных негативных эффектов;

- диапазон доз от 2 мг/кг до 10 мг/кг позволяет предпринимать индивидуальный подход при коррекции;

- способ осуществлен на строго рандомизированных группах, что доказывает возможность его применения на разновозрастных особях: как половозрелых, продуктивного возраста, так и старых.

Предлагаемый способ может быть рекомендован для использования в экспериментальных научных лабораториях медицинского и биологического профиля. На основании предлагаемого способа может быть разработан способ коррекции дапсон-индуцированной анемии для клинического использования в дерматологии, в частности в лепрологии, при лечении ряда инфекционных болезней (малярии, пневмоцистной пневмонии и др.).