способ получения сусла

Формула изобретения

1. Способ производства пивоваренного сусла, предусматривающий

a) получение затираемого материала, содержащего солод и добавку в виде гранулированного крахмала, полученного из кукурузы, риса, сорго или проса,

b) затирание затираемого материала в присутствии экзогенно добавленной альфа-амилазы при температуре ниже температуры начала желатинизации вышеупомянутого гранулированного крахмала,

c) окончание процесса затирания при температуре выше температуры начала желатинизации, и

d) разделение отработанного зерна и затора и получение сусла.

2. Способ по п.1, в котором добавка представляет собой кукурузный крахмал или рисовый крахмал.

3. Способ по пп.1 или 2, в котором затираемый материал содержит 60-80% ячменного солода.

4. Способ по пп.1 или 2, в котором затираемый материал содержит от 10 до 40% крахмала в качестве добавки.

5. Способ по пп.1 или 2, в котором альфа-амилаза является бактериальной альфа-амилазой.

6. Способ по п.5, в котором альфа-амилаза является бактериальной альфа-амилазой, содержащей модуль связывания крахмала.

7. Способ по любому из пп.1, 2, 6, в котором альфа-амилаза является полипептидом, имеющим по меньшей мере 50%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1.

8. Способ по любому из пп.1, 2, 6, в котором альфа-амилаза является полипептидом, имеющим по меньшей мере 50%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.

9. Способ по п.7, в котором альфа-амилазу используют в количестве от 0,5 до 5 тыс.ед./г сухой массы.

10. Способ по п.8, в котором альфа-амилазу используют в количестве от 0,5 до 5 тыс.ед./г сухой массы.

11. Способ производства пива, предусматривающий получение пивоваренного сусла способом по любому предшествующему пункту, и ферментирование сусла.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу получения сусла, использующему затирание солода, содержащего нежелатинизированную добавку.

Традиционное пиво варят только из ячменного солода, хмеля и воды. Однако часть ячменного солода иногда заменяют такими материалами, как кукуруза, рис, сорго и пшеница, очищенный крахмал, или легко ферментируемыми углеводами, такими как сахар или сиропы. Добавки используются в основном потому, что они являются широко доступными и предоставляют углеводы более низкой стоимости, чем ячменный солод. Также могут иметься и другие преимущества, например повышенная физическая стабильность, повышенная устойчивость к охлаждению и повышенная яркость.

Затирание - это процесс преобразования крахмала из молотого ячменного солода и добавок в способные и неспособные к брожению сахара с целью получения сусла желаемого состава. Традиционное затирание предусматривает смешивание молотого ячменного солода и добавок с водой заданной температуры и объема для продолжения биохимических изменений, начатых во время производства солода. Процесс затирания проводится в течение периода времени при различных температурах с целью активирования эндогенных ферментов, ответственных за расщепление белков и углеводов. Однако рисовый и кукурузный крахмалы, которые часто используются в качестве добавки, имеют более высокую температуру желатинизации, чем ячменный крахмал. Следовательно, такие добавки варятся и желатинизируются в отдельном «разварнике зерна» до добавления к ячменному крахмалу. Таким образом, хотя использование добавок снижает стоимость сырых материалов, оно требует дополнительных вложений в разварник зерна, а также дополнительных расходов на энергию для нагревания добавок. Таким образом, существует потребность в более простом способе затирания с использованием нежелатинизированной добавки к солоду.

Автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил, что дополнительный крахмал, добавленный в ячменный затор, может эффективно затираться без предварительной желатинизации. Следовательно, такие добавки, как кукурузное зерно, кукурузный крахмал или рисовый крахмал, могут затираться вместе с солодом при температурах, при которых эндогенные солодовые ферменты являются активными. Для разжижения нежелатинизированной добавки требуется, чтобы к эндогенным солодовым ферментам была экзогенно добавлена ферментная композиция.

В соответствии с первым аспектом изобретение предлагает способ производства пивоваренного сусла, предусматривающий затирание материала, содержащего солод и добавку в виде гранулированного крахмала, в присутствии экзогенно добавленной ферментной композиции при температуре, при которой эндогенные солодовые ферменты являются активными. Изобретение также представляет способ производства пивоваренного сусла, предусматривающий: a) получение затора, содержащего i) солод, ii) добавку, содержащую гранулированный крахмал, и iii) экзогенно добавленную ферментную композицию, b) затирание вышеупомянутого затора при температуре ниже температуры начала желатинизации вышеупомянутого гранулированного крахмала, c) окончание процесса затирания при температуре выше температуры начала желатинизации, и d) разделение отработанного зерна и затора и получение сусла.

Третий объект изобретения касается сусла, полученного способом, соответствующим первому и второму объектам изобретения.

Четвертый объект изобретения касается пива, полученного путем ферментации сусла из третьего аспекта.

Задача настоящего изобретения состоит в создании более простого способа затирания, позволяющего использовать добавку в виде нежелатинизированной крупы в процессе затирания.

Определения

В данном описании используются различные термины, обычное значение которых понятно специалистам в соответствующей области техники. Однако несколько терминов используется в специфическом значении, и их определение приведено ниже.

В данном описании термин «затираемый материал» используется для обозначения материала, содержащего крахмал или сахар и являющегося основой для производства пива, например ячменный солод и добавка.

Термин «солод» используется для обозначения любого осоложенного зерна злаковых, в частности ячменя.

Термин «добавка» используется для обозначения части затираемого материала, не являющейся ячменным солодом. В качестве добавки может использоваться любой богатый крахмалом растительный материал, такой как кукуруза, рис, сорго и пшеница, но не ограничивающийся вышеперечисленным. Предпочтительной добавкой в данном изобретении являются зерна кукурузы.

Термин «затор» используется для обозначения крахмалосодержащей жидкой массы, включающей ячменный солод, неосоложенное дробленое зерно, другой крахмалосодержащий материал или комбинацию вышеуказанного, погруженную в раствор для создания сусла.

Термин «сусло» используется для обозначения неферментированной жидкости, экстрактированной из затираемого материала при затирании.

Термин «отработанное зерно» используется для обозначения высушенного остатка, получаемого после извлечения солодовой крупки и отделения сусла.

Термин «пиво» используется здесь для обозначения ферментированного сусла, то есть алкогольного напитка, сваренного из ячменного солода, необязательной добавки и хмеля.

Термин «гранулированный крахмал» используется для обозначения нежелатинизированного крахмала, или необработанного крахмала.

Термин «температура начала желатинизации» используется для обозначения самой низкой температуры, при которой начинается желатинизация крахмала. Крахмал, разогретый в воде, начинает желатинизироваться между 50°C и 75°C; точная температура желатинизации зависит от конкретного крахмала и может быть легко определена квалифицированным специалистом. Таким образом, температура начала желатинизации может изменяться в зависимости от вида растения, от конкретной культуры, а также от условий произрастания. В контексте изобретения температура начала желатинизации конкретного крахмала - это температура, при которой двойное лучепреломление не происходит на 5% гранул крахмала при использовании метода, описанного в Gorinstein S. and Lii. C, Starch/Starke, Vol. 44 (12) pp. 461- 466 (1992). Для кукурузного крахмала температура начала желатинизации составляет приблизительно 62°C (средняя точка: 67°C, завершение: 72°C), а для рисового крахмала температура начала желатинизации составляет приблизительно 68°C (средняя точка: 74.5°C, завершение: 78°C) (Starch, 2nd ed. Industrial microscopy of starch by Eileen Maywald Snyder).

Термин «экстрактивность» сусла используется для обозначения объединения растворимых веществ, извлеченных из солодовой крупки (солода и добавок), выраженного в процентах сухого вещества.

Термин «идентичность» при использовании в отношении последовательностей ДНК или полипептидов в данном описании используется для обозначения степени идентичности двух последовательностей, определяемой при выведении первой последовательности из второй. Идентичность может быть надлежащим образом определена посредством компьютерных программ, известных в технике, например GAP, представленной в пакете программ GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. and Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Для сравнения полипептидных последовательностей использовались следующие настройки: штраф за создание GAP - 3,0, штраф за расширение GAP - 0,1.

Первый объект изобретения касается способа производства пивоваренного сусла. Способ предусматривает затирание материала, включающего солод и добавку в виде гранулированного крахмала, в присутствии экзогенно добавленной ферментной композиции при температуре, при которой эндогенные солодовые ферменты являются активными. Изобретение также касается способа производства пивоваренного сусла, предусматривающего: a) получение затора, содержащего i) солод, ii) добавку, содержащую гранулированный крахмал, и iii) экзогенно добавленную ферментную композицию, b) затирание вышеупомянутого затора при температуре ниже температуры начала желатинизации вышеупомянутого гранулированного крахмала, c) окончание процесса затирания при температуре выше температуры начала желатинизации, и d) разделение отработанного зерна и затора и получение сусла.

В соответствии с изобретением затираемый материал, содержащий солод и добавку в виде гранулированного крахмала, затирают в присутствии экзогенно добавленной ферментной композиции при температуре, при которой эндогенные солодовые ферменты, например альфа-амилазы, протеазы и бета-амилазы, на использовании которых основываются традиционные способы затирания, являются активными.

Предпочтительно, чтобы вода нагревалась до добавления в затираемый материал с той целью, чтобы температура затора достигала необходимое значение в момент формирования затора. Если температура сформированного затора ниже необходимой температуры затирания, то предпочтительным является осуществление дополнительного нагрева с целью достижения необходимой для процесса температуры. Предпочтительно, чтобы необходимая температура затирания достигалась в течение 15 минут, или, более предпочтительно, в течение 10 минут, например в течение 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 минут, или, даже более предпочтительно, в течение 1 минуты после формирования затора, или в самом предпочтительном случае необходимая температура затирания достигается при формировании затора.

Температурный профиль способа затирания может соответствовать профилю обычного способа затирания, для которого значения температуры заданы с целью достижения оптимального расщепления сухого вещества затираемого материала солодовыми ферментами.

Предпочтительно, чтобы солод получали из одного или более видов зерна, выбранных из списка, состоящего из кукурузы, ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса или риса. Предпочтительным является использование ячменного солода.

Предпочтительно, чтобы затираемый материал содержал от 0,5% до 99%, предпочтительно от 1 % до 95%, более предпочтительно от 5% до 90%, еще более предпочтительно от 10% до 80%, и наиболее предпочтительно от 50% до 70% осоложенного зерна. В дополнение к осоложенному зерну затираемый материал может, предпочтительно, содержать добавку, например неосоложенную кукурузу или другое неосоложенное зерно, такое как ячмень, пшеница, рожь, овес, кукуруза, рис, сорго, просо и/или сорго обыкновенное, или неочищенный и/или очищенный крахмал и/или сахар, содержащий материал, полученный из растений, таких как пшеница, рожь, овес, кукуруза, рис, сорго, просо, сорго обыкновенное, картофель, сладкий картофель, маниок, тапиока, саго, банан, сахарная свекла и/или сахарный тростник. Добавки для данного изобретения могут быть получены из клубней, корней, стеблей, листьев, стручков, злаков и/или цельного зерна. Предпочтительной является добавка, полученная из кукурузы и/или риса, наиболее предпочтительным является рисовый крахмал, луковичный крахмал и/или кукурузные зерна. Затор предпочтительно содержит от 1% до 50%, более предпочтительно от 5% до 45%, еще более предпочтительно от 10% до 40% и наиболее предпочтительно от 20 до 35% добавки в виде крахмала. Добавка, содержащая легко ферментируемые углеводы, такие как сахара или сиропы, может быть добавлена в солодовый затор до, во время или после осуществления способа затирания данного изобретения, но предпочтительным является добавление после окончания затирания.

Предпочтительно, чтобы до формирования затора солод и/или добавка размалывались, и наиболее предпочтительно для этого использовались мельницы сухого или мокрого измельчения.

В соответствии с изобретением ферментная композиция добавляется экзогенно и может быть добавлена к ингредиентам затора, например к воде или солоду, до, во время и после формирования затора. В конкретном предпочтительном варианте осуществления ферментная композиция содержит альфа-амилазу (EC 3.2.1.1) и/или глюкоамилазу (EC 3.2.1.3). Предпочтительно, чтобы в качестве альфа-амилазы использовалась бактериальная альфа-амилаза и/или альфа-амилаза грибов, например кислотная грибная альфа-амилаза. В качестве глюкоамилазы предпочтительной является грибная глюкоамилаза. Посредством выбора ферментов, составляющих ферментную композицию, можно контролировать состав сахаров выходного сусла. При использовании ферментной композиции, включающей альфа-амилазу, предпочтительно бактериальную альфа-амилазу, и небольшое количество глюкоамилазы (или вообще без нее), будет получено сусло, богатое мальтозой, похожее на сусло из одного солода. При использовании ферментной композиции, включающей глюкоамилазу, будет получено сусло, богатое глюкозой. В еще одном предпочтительном варианте использования добавляется дополнительный фермент, при этом данный фермент выбирается из группы, состоящей из целлюлазы, пуллуланазы, протеазы, фермента, образующего мальтозу, лакказы, липазы, фосфолиполазы, фитазы, фитиновой эстеразы и ксиланазы.

Во время процесса затирания крахмал, извлекаемый из затираемого материала, постепенно гидролизуется до ферментируемых сахаров и меньших по размеру декстринов. Предпочтительно, чтобы затор имел негативную реакцию на крахмал при проверке йодом до экстрагирования сусла.

Затирание завершается отзаториванием при температуре 70°C и выше, предпочтительно не менее 71°C, не менее 72°C, не менее 73°C, не менее 74°C, не менее 75°C, не менее 76°C, не менее 77°C, не менее 78°C, не менее 79°C, не менее 80°C и, более предпочтительно, не менее 81°C, или даже не менее 82°C или выше.

Получение сусла из затора обычно предусматривает фильтрование сусла от отработанного зерна, то есть от нерастворимого зерна и пленки зерна, составляющих часть солода. Выполаскивание или промывание оставшегося экстракта из солода можно осуществить посредством прокачки горячей воды. Предпочтительно, чтобы экстрактивность составляла не менее 80%, более предпочтительно не менее 85%, не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% и еще предпочтительнее не менее 99% или даже не менее 100%. Сусло может использоваться само по себе или в концентрированном и/или высушенном виде.

В предпочтительном варианте осуществления затираемый материал, содержащий 60-80% ячменного солода и от 20% до 40% кукурузного крахмала и/или зерен кукурузы и/или рисового крахмала, затирается в присутствии альфа-амилазы. Предпочтительным является использование альфа-амилазы AMY1 или AMY2 в количестве приблизительно 2 тыс. ед./г сухой массы, предпочтительнее в количестве от 0,05 до 10 тыс. ед./г сухой массы, более предпочтительно от 0,1 до 8 тыс. ед./г сухой массы и даже предпочтительнее - от 0,5 до 5 тыс. ед./г сухой массы. Предпочтительным является, чтобы крахмал затирался с использованием температурного профиля, в котором значение температуры начинается приблизительно в 52°C, возрастает до приблизительно 64°C, и отзаторивание происходит при приблизительно 78°C или выше.

Второй объект изобретения касается сусла, полученного посредством вышеописанного способа. В дополнение к этому, сусло, полученное способом согласно первому объекту изобретения, может ферментироваться с целью производства алкогольного напитка, предпочтительно пива. Ферментирование сусла может предусматривать введение в сусло дрожжевой суспензии, содержащей свежие дрожжи, то есть дрожжи, которые ранее не использовались в изобретении, или дрожжи, являющиеся повторно используемыми дрожжами. Применяемые дрожжи могут быть любыми дрожжами, подходящими для пивоварения, в особенности дрожжами, выбранными из рода Saccharomyces, такими как S. cerevisiae и S. uvarum , включая естественные или искусственно полученные варианты этих организмов. Способы ферментирования сусла с целью производства пива хорошо известны квалифицированному специалисту в соответствующих областях техники.

Способы, описанные в данном изобретении, могут предусматривать добавление силикатного гидрогеля к ферментированному суслу с целью увеличения коллоидной стабильности пива. Способы могут также предусматривать добавление диатомита к ферментированному суслу и фильтрацию с целью осветления пива.

Третьим аспектом изобретения является пиво, полученное посредством способов, представленных в изобретении, при этом пиво может быть пивом любого типа. Предпочтительные типы пива включают эль, крепкий эль, стаут, портер, лагер, светлое пиво, экспортное пиво, солодовое пиво, хапусю, пиво с высоким содержанием алкоголя, пиво с низким содержанием алкоголя, низкокалорийное пиво или легкое пиво.

ФЕРМЕНТЫ

Экзогенные ферменты, предназначенные для применения в представленном изобретении, должны выбираться исходя из их способности к сохранению достаточной активности при температуре процессов, являющихся частью способов, представленных в данном изобретении, а также исходя из их способности к сохранению достаточной активности при средней кислотности в заторе и должны добавляться в эффективных количествах. Ферменты могут быть получены из любого источника, предпочтительно из растений или водорослей, и предпочтительнее из микроорганизма, например бактерии или гриба.

Альфа-амилаза (EC 3.2.1.1)

В качестве конкретного фермента альфа-амилазы, предназначенного для использования в способах изобретения, может применяться альфа-амилаза Bacillus , например, полученная из штаммов B. licheniformis, B. amyloliquefaciens и B. stearothermophilus. Предпочтительной бактериальной альфа-амилазой является рекомбинантный вариант альфа-амилазы B. stearothermophilus с мутациями: I181 ^*+G182^*+N193F. Последовательность данного варианта показана в приложении - SEQ ID NO:2 (AMY1). Также предпочтительными являются альфа-амилазы, имеющие аминокислотную последовательность с по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% и особенно с по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. Даже более предпочтительной для изобретения является бактериальная альфа-амилаза, содержащая модуль связывания крахмала, предпочтительно модуль связывания крахмала из семейства 20. Такая альфа-амилаза может быть получена из Bacillus flavothermus (син. Anoxybacillus contaminans). Самой предпочтительной является альфа-амилаза, обладающая по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% и особенно с по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 (AMY2).

Альфа-амилазы Bacillus могут добавляться в количестве 1,0-1000 ед./кг сухой массы, предпочтительно 2,0-500 ед./кг сухой массы и предпочтительнее 10-200 ед./кг сухой массы.

Другой конкретной альфа-амилазой, которая может использоваться в способах данного изобретения, является грибная альфа-амилаза. Особенно предпочтительными являются кислотные грибные альфа-амилазы. Наиболее пристального внимания заслуживают грибные альфа-амилазы, имеющие высокую степень идентичности, то есть, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% или даже по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:10, представленной в WO 96/23874.

Грибные альфа-амилазы могут добавляться в количестве 1-1000 альфа-амилазных единиц/кг сухой массы, предпочтительно 2-500 альфа-амилазных единиц/кг сухой массы, предпочтительнее 20-100 альфа-амилазных единиц/кг сухой массы.

Глюкоамилазы

Еще одним конкретным ферментом, который может использоваться в осуществлении способов данного изобретения, является глюкоамилаза (E.C.3.2.1.3), полученная из микроорганизма или растения. Предпочтительными являются глюкоамилазы грибного или бактериального происхождения, выбранные из группы, состоящей из глюкоамилаз Aspergillus, в частности глюкоамилазы G1 или G2 A. niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), или их варианты, в соответствии с описанием WO92/00381 и WO00/04136; глюкоамилазы A. awamori (WO84/02921), A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55(4), p. 941-949), или их варианты или фрагменты.

Другие рассматриваемые варианты глюкоамилаз Aspergillus включают варианты для увеличения температурной стабильности: G137A и G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9, 499-505); D257E и D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); дисульфидные связи, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704; и внесение остатков пролина в позиции A435 и S436 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1199-1204). Другие рассматриваемые глюкоамилазы включают глюкоамилазы Talaromyces , в частности, полученные из Talaromyces emersonii (WO99/28448), Talaromyces leycettanus (патент США 32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (США 4,587,215). Рассматриваемые бактериальные глюкоамилазы включают глюкоамилазы из рода Clostridium, в частности C. thermoamylolyticum (EP 135,138) и C. thermohydrosulfuricum (WO86/01831). Предпочтительные глюкоамилазы включают глюкоамилазы, полученные из Aspergillus oryzae, такие как глюкоамилазы, имеющие по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% и особенно по меньшей мере 99% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 в WO 00/04136. Также рассматриваются коммерческие продукты AMG 200L; AMG 300 L; SAN SUPER и AMG E (производства Novozymes); OPTIDEX 300 (производства Genencor Int.); AMIGASE и AMIGASE PLUS (производства DSM); G-ZYME G900 (производства Enzyme Bio-Systems); G-ZYME G990 ZR (глюкоамилаза A. niger и низкое содержание протеаз). Глюкоамилазы могут добавляться в эффективных количествах, хорошо известных квалифицированному специалисту в данной области техники.

Целлюлаза (E.C. 3.2.1.4)

Целлюлаза может иметь микробное происхождение, например, быть полученной из штамма мицелиального гриба (например, Aspergillus , Trichoderma, Humicola, Fusarium). Конкретные примеры целлюлаз включают эндоглюканазу (эндоглюканазу I), получаемую из H. insolens и задаваемую аминокислотной последовательностью на фиг. 14 в WO 91/17244, и 43 кДа эндоглюканазу H. Insolens , описанную в WO 91/17243. В качестве конкретной целлюлазы, используемой в осуществлении способов данного изобретения, может выступать эндоглюканаза, например эндо-1,4-бета-глюканаза. Рассматриваются бета-глюканазы, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 в WO 2003/062409, например по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% и особенно по меньшей мере 99% идентичностью. Коммерчески доступные целлюлазные композиции, которые могут быть использованы, включают CELLU-CLAST®, CELLUZYME®, CEREFLO® и ULTRAFLO® (доступны от Novozymes A/S), LAMINEX и SPEZYME® CP (доступны от Genencor Int.) и ROHAMENT® 7069 W (доступны от Rohm, Германия).

Бета-глюканазы могут быть добавлены в количестве 1.0-10000 бета-глюканазных единиц/кг сухой массы, предпочтительно 10-5000 бета-глюканазных единиц/кг сухой массы, предпочтительнее 50-1000 бета-глюканазных единиц/кг сухой массы и наиболее предпочтительно - 100-500 бета-глюканазных единиц/кг сухой массы.

Деветвящие ферменты

Еще одним ферментом, который может применяться в процессе осуществления изобретения, является деветвящий фермент, такой как изоамилаза (E.C. 3.2.1.68) или пуллуланаза (E.C. 3.2.1.41). Изоамилаза гидролизирует альфа-1,6-D-глюкозидные ветвящиеся связи амилопектина и предельных бета-декстринов, при этом изомилаза отличается от пуллуланазы по неспособности к атаке на пуллулан и по ограниченному воздействию на предельные альфа-декстрины. Деветвящий фермент может добавляться в эффективных количествах, хорошо известных квалифицированному специалисту в данной области техники.

Протеаза

Подходящие протеазы включают микробные протеазы, такие как грибные и бактериальные протеазы. Предпочтительными протеазами являются кислотные протеазы, то есть протеазы, характеризующиеся способностью гидролизировать белки в кислотных условиях при значениях pH ниже 7.

Рассматриваемые кислотные грибные протезы включают грибные протеазы, полученные из Aspergillus, Mucor, Rhizopus , Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra , Irpex, Penicillium, Sclerotiumand Torulopsis. Наиболее пристально рассматриваются протеазы, полученные из Aspergillus niger (см., например, Koaze et al., (1964), Agr. Biol. Chem. Japan, 28, 216), Aspergillus saitoi (see, e.g., Yoshida, (1954) J. Agr. Chem. Soc. Japan, 28, 66), Aspergillus awamori (Hayashida et al., (1977) Agric. Biol. Chem., 42(5), 927-933), Aspergillus aculeatus (WO 95/02044), или Aspergillus oryzae, например протеаза pepA; а также кислотные протеазы из Mucor pusillus или Mucor miehei.

Также рассматриваются нейтральные и щелочные протеазы, например протеазы, полученные из штамма Bacillus. Конкретная протеаза, рассматриваемая в изобретении, получена из Bacillus amyloliquefaciens и имеет последовательность, содержащуюся в базе Swissprot под кодом доступа P06832, также рассматриваются протеазы, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью с указанной аминокислотной последовательностью, например по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% и особенно по меньшей мере 99% идентичностью.

Также рассматриваются протеазы, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 в заявках на патент Дании PA 2001 01821 и PA 2002 00005, например по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% и особенно по меньшей мере 99% идентичностью.

Также рассматриваются папаин-подобные протеазы, такие как протеазы класса E.C. 3.4.22. ^* (цистеиновые протеазы), например EC 3.4.22.2 (папаин), EC 3.4.22.6 (химопапаин), EC 3.4.22.7 (асклепаин), EC 3.4.22.14 (актинидаин), EC 3.4.22.15 (катепсин L), EC 3.4.22.25 (глицилэндопептидаза) и EC 3.4.22.30 (карикаин).

Протеазы осуществляют редуцирование в заторе общей длины белков с высокой молекулярной массой до белков с низкой молекулярной массой. Белки с низкой молекулярной массой необходимы для питания дрожжей, а белки с высокой молекулярной массой обеспечивают стабильность пены. Таким образом, квалифицированному специалисту хорошо известно, что протеазу следует добавлять в сбалансированном количестве, которое в одно и то же время допускает движение свободных аминокислот для дрожжей и оставляет достаточное количество белков с высокой молекулярной массой для обеспечения стабильности пены. Протеазы могут добавляться в количестве 0,1-1000 ед. Энсона /кг сухой массы, предпочтительно 1-100 ед. Энсона/кг сухой массы и наиболее предпочтительно - 5-25 ед. Энсона/кг сухой массы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ферменты

AMY1: Вариант альфа-амилазы S.stearothermophilus, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 в WO 99/19467 с мутациями: I181^* + G182^* + N193F.

AMY2: Альфа-амилаза Anoxybacillus имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

Методы

Протеолитическая активность

Протеолитическая активность может быть определена с использованием денатурированного гемоглобина в качестве субстрата. В гемоглобиновом методе Энсона для определения протеолитической активности денатурированный гемоглобин расщепляется и нерасщепленный гемоглобин осаждается посредством трихлоруксусной кислоты. Количество продукта, растворимого в трихлоруксусной кислоте, определяется с помощью фенольного реагента, который дает окрашивание в синий цвет для тирозина и триптофана.

Одна единица Энсона определяется как количество фермента при стандартных условиях (то есть 25°C, pH=7,5 и времени реакции = 10 мин), расщепляющее гемоглобин с такой начальной скоростью, что в минуту высвобождается количество продукта, растворимого в трихлоруксусной кислоте, которое дает такое же окрашивание при использовании фенольного реагента, что и миллиграмм-эквивалент тирозина.

Буклет AF 4/5, в котором аналитический метод описывается подробнее, доступен по запросу к Novo Nordisk A/S, Дания, при этом данный буклет включен в данный документ посредством ссылки.

Альфа-амилазная активность

Амилолитическая активность может быть определена с использованием картофельного крахмала в качестве субстрата. Данный способ основан на разрушении модифицированного картофельного крахмала ферментом, после чего производится смешивание образцов раствора крахмала/фермента с раствором йода. Первоначально формируется черно-синий цвет, однако в процессе разрушения крахмала синий цвет становится слабее и постепенно превращается в красновато-коричневый, который сравнивается со стандартным цветным стеклом.

Одна тысяча новых альфа-амилазных единиц определяется как количество фермента, которое при стандартных условиях (то есть при 37°C +/- 0,05; 0,0003 M Ca2+; и pH=5,6) превращает в декстрин 5.26 г сухого вещества крахмала («растворимый крахмал» фирмы Merck).

Буклет AF 9/6, в котором аналитический метод описывается подробнее, доступен по запросу к Novozymes A/S, Дания, при этом данный буклет включен в данный документ посредством ссылки.

Глюкоамилазная активность

Новая глюкоамилазная единица определена как количество фермента, которое гидролизирует 1 микромоль мальтозы в минуту при 37°C и pH = 4,3.

Активность измеряется в глюкоамилазных единицах/мл посредством модифицированного способа (AE L-S M-0131, доступен по запросу к Novozymes) с использованием набора Glucose GOD-Perid производства Boehringer Mannheim, 124036. Стандарт: AMG-стандарт, партия 7-1195, 195 глюкоамилазных единиц/мл. 375 мкл субстрата (1% мальтозы в 50 мМ ацетата натрия, pH = 4,3) инкубируется в течение 5 минут при 37°C. Добавляется 25 мкл фермента, растворенного в ацетате натрия. Реакция останавливается через 10 минут посредством добавления 100 мкл 0,25M NaOH. 20 мкл переносится на микротитрационный планшет серии 96-well, и добавляется 200 мкл раствора GOD-Perid (124036, Boehringer Mannheim). После 30 минут при комнатной температуре измеряется коэффициент поглощения на 650 нм, и активность рассчитывается в глюкоамилазных единицах/мл в соответствии с AMG-стандартом. Подробное описание аналитического метода (AEL-SM-0131) доступно по запросу к Novozymes.

Бета-глюканазная активность

Целлюлазная активность может быть измерена в бета-глюканазных единицах. Бета-глюканаза вступает в реакцию с бета-глюканом с образованием глюкозы или редуцирующего углевода, который определяется как редуцирующий сахар с использованием метода Сомоджи-Нельсона. 1 бета-глюканазная единица - это количество фермента, которое, в стандартных условиях, выделяет глюкозу или редуцирующий углевод с редуцирующей способностью, эквивалентной 1 мкмоль глюкозы в минуту. Стандартные условия определяются как 0,5% бета-глюкана в качестве субстрата при pH=7,5 и 30°C для реакции, проводимой в течение 30 минут. Подробное описание аналитического метода (EB-SM-0070.02/01) доступно по запросу к Novozymes.

Стандартный конгрессный способ затирания

Стандартный конгрессный способ затирания осуществлялся в соответствии с процедурой EBC: 4.5.1 Экстракция солода: конгрессный затор. Температурный профиль включал поддержание начальной температуры затирания, равной 45°C, в течение 30 минут, увеличение до 70°C при изменении 1,0°C/мин в течение 25 минут, и завершение при 70°C в течение 65 минут, таким образом, суммарное время затирания составляло 2 часа.

Дополнительные методы

Методы анализа необработанных продуктов, сусла, пива и т.д. могут быть найдены в источнике Analytica-EBC, Analysis Committee of EBC, the European Brewing Convention (1998), Verlag Hans Carl Geranke-Fachverlag. В представленном изобретении способы, применяемые для определения нижеследующих параметров, предусматривали:

Плотность Плато: рефрактометр.

Доступный азот: на основе EBC: 8.10, но с использованием TNBS (2,4,6 тринитробензолсульфокислоты) в качестве реагента вместо нингидрина. TNBS вступает в реакцию в растворе свободных аминогрупп или аминокислот и пептидов с образованием комплекса желтого цвета, который измеряется посредством спектрофотометра на 340 нм.

Бета-глюкан: EBC: 8.13.2 (содержание высокомолекулярного бета-глюкана в сусле: метод флюорометрии).

Цвет: EBC: 4.7.2

Растворение: EBC: 4.14 Растворимость и гомогенность солода, метод окрашивания калкофлоруайтом)

Фильтрующая способность: определение объема фильтрата (мл): в соответствии с EBC: 4.5.1 (Экстракция солода: конгрессный затор), подраздел 8.2. Фильтрация: объем фильтрации определяется после 1 часа фильтрации через рифленый бумажный фильтр диаметром 320 мм. Schleicher and Schull No.597 ¹/₂ , Machery, Nagel and Co., в воронках диаметра 200 мм, установленных в 500 мл кюветах.

pH: EBC: 8.17 (pH сусла).

Индекс Колбаха: EBC: 4.9.1 (Растворимый азот в заторе: спектрофотометрический метод) и EBC: 3.3.1 (Общее количество азота в ячмене: Метод Кьельдаля (RM)).

Экстрактивность: EBC: 4.5.1 (Экстракция солода: конгрессный затор, выход сухой экстракции). Термин «экстрактивность сусла» определяется как сумма растворимых веществ (глюкоза, сахароза, мальтоза, мальтотриоза, декстрины, белок, смолы, неорганические и другие вещества), извлеченных из затираемого материала (солод и добавки), выраженная в процентах сухого вещества. Оставшаяся нерастворимая часть называется отработанным зерном.

а)

b)

где

E₁ = экстрактивность образца, в мас.%

E₂ = экстрактивность сухого затираемого материала, в мас.%

P = экстрактивность сусла, в % плотности Плато

M = содержание влаги в затираемом материале, в мас.%

800 = количество дистиллированной воды, добавленной в затор, содержащий 100 г солодовой крупки.

Приготовление затора

Если не указано другое, затирание осуществляли следующим способом. Затор приготавливали в соответствии с EBC: 4.5.1 с использованием солода, размолотого в соответствии с EBC: 1.1. Пробы затора проводили в 500 мл сосудах с крышкой, каждый из которых содержал затор с 50 г солодовой крупки, масса которого была доведена до 250±0,2 г посредством добавления воды, предварительно нагретой до температуры на 1 градус Цельсия выше начальной температуры затирания. Во время затирания сосуды инкубировали на водяной бане с взбалтыванием. После затирания, но до фильтрации, в каждый сосуд добавляли воду с доведением общей массы до 300 г. После фильтрации сусло кипятили в течение 10 минут и разводили водой в соотношении 1:1. К 200 г порциям сусла добавляли 1,2 г дрожжей, после чего ферментацию проводили в течение 4 дней.

Примеры

Пример 1

Затираемый материал, содержащий 65% хорошо растворенного солода и 35% кукурузного крахмала, затирали в присутствии альфа-амилазы с использованием температурного профиля, включающего 34 минуты при 52°C, повышение на 1°C/мин в течение 18 минут, 60°C в течение 60 минут, повышение на 1°C/мин в течение 18 минут, 78°C в течение 20 минут, затем охлаждение до 20°C. Сусло и молодое пиво анализировались посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии. Результаты показаны в таблице 1.

Таблица 1 Кукурузный крахмал: состав сахаров, плотность Плато и выход разбавленного сусла, содержание алкоголя в молодом пиве

Пример 2

Затираемый материал, содержащий 65% хорошо растворенного солода и 35% рисового крахмала, затирали в присутствии альфа-амилазы с использованием температурного профиля, включающего 34 минуты при 52°С, повышение на 1°С/мин в течение 18 минут, 60°С в течение 60 минут, повышение на 1°С/мин в течение 18 минут, 78°С в течение 20 минут, затем охлаждение до 20°С. Сусло и молодое пиво анализировались посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии. Результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2
Рисовый крахмал: состав сахаров, плотность Плато и выход разбавленного сусла, содержание алкоголя в молодом пиве
Дозировка фермента, тыс. ед./г сухой массы	DP1, г/л	DP2, г/л	DP3, г/л	Ферментированные сахара, г/л	DP3+, г/л	Плот ность Плато	Выход, %	Содержание алкоголя (массовая доля)	Реальная степень фермен тации	Реальная степень фермен тации
-	0,00	15,50	28,41	13,41	57,32	14,63	7,25	86,11	2,57	82,8	67,2
AMY1	0,50	14,70	26,99	13,79	55,48	12,87	7,52	89,87	2,70	83,9	68,1
AMY1	0,75	15,37	28,25	14,60	58,22	12,79	7,22	85,77	2,54	84,4	68,6
AMY1	1,00	14,33	26,65	13,94	54,93	11,69	7,31	86,94	2,56	84,9	68,9
AMY1	1,50	14,32	26,33	13,99	54,64	11,08	7,32	87,14	2,56	85,2	69,2
AMY1	2,00	14,46	26,39	14,34	55,18	11,22	7,41	88,38	2,60	85,4	69,4
AMY2	0,50	14,23	28,36	14,61	57,20	11,01	7,61	91,22	2,70	86,1	69,9
AMY2	0,75	14,41	28,69	15,05	58,15	10,55	7,49	89,52	2,62	86,2	70,0
AMY2	1,00	14,16	28,67	15,13	57,96	9,94	7,34	87,38	2,60	87,0	70,6
AMY2	1,50	14,53	29,60	15,78	59,91	9,53	7,72	92,72	2,76	88,1	71,5
AMY2	2,00	14,76	29,77	16,12	60,65	9,51	7,55	90,32	2,70	87,3	70,8