способ биосинтеза цефалоспорина с с использованием нового штамма acremonium chrysogenum вкм f-4081d

Формула изобретения

Способ биосинтеза цефалоспорина С путем культивирования его продуцента Acremonium chrysogenum на ферментационной питательной среде, содержащей источники углеводов - глюкозу, крахмал кукурузный, декстрин, источники азота - кукурузный экстракт, Фармамедиа, сульфат аммония, а также неорганические соли - фосфорно-кислый калий, серно-кислый калий, мел, серно-кислую медь, серно-кислый цинк, серно-кислый марганец, серно-кислое железо, отличающийся тем, что в качестве продуцента антибиотика используют штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D, а ферментационная среда в качестве растительного жира содержит рапсовое масло и дополнительно фосфатидилхолин и/или ситостерин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Техническим результатом изобретения является увеличение уровня антибиотической активности, сокращение времени ферментации и уменьшение содержания предшественника в культуральной жидкости, что достигается использованием нового штамма - продуцента цефалоспорина С Acremonium chrysogenum BKM F-4081D, новой технологии биосинтеза антибиотика и приводит в целом к повышению рентабельности промышленного производства субстанции цефалоспорина С.

Мицелиальные грибы Acremonuim chrysogenum являются продуцентами -лактамного антибиотика цефалоспорина С. Природный цефалоспорин С обладает слабой антибактериальной активностью, но он является исходным материалом для химического синтеза различных лекарственных субстанций, обладающих широким спектром антибактериального действия и более устойчивых к действию -лактомаз, чем пенициллины. Благодаря этому -лактамные антибиотики цефалоспоринового ряда нашли широкое применение в антимикробной химиотерапии (1).

Процесс микробиологического образования цефалоспорина C с помощью гриба-продуцента из рода Acremonium широко изучен и документирован. Известна способность различных штаммов Acremonium chrysogenum к биосинтезу цефалоспорина С. Одним из близких является штамм Acremonium chrysogenum 12/9.

Культивирование гриба Acremonium chrysogenum осуществляют на питательных средах, содержащих различные источники углерода, азота, неорганические соли, аминокислоты, жиры в условиях интенсивной аэрации и перемешивания. Изучению влияния компонентного состава питательных сред посвящено большое число исследований (2, 3).

Образование цефалоспорина С у многих штаммов Acremonium chrysogenum стимулируется добавлением в среду культивирования аминокислоты метионин. Одним из механизмов этого влияния на синтез цефалоспорина С является роль метионина в процессе дифференциации культуры (4). Образование из фрагментируемого мицелия клеток типа артроспор в присутствии метионина является определяющим фактором развития высокопродуктивных культур. Однако добавление метионина в питательную среду удорожает процесс и неблагоприятно влияет на экологию окружающей среды за счет выделения меркаптана.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения цефалоспорина C с использованием культуры Acremonium chrysogenum при культивировании продуцента в жидкой питательной среде в отсутствие метионина. Процесс антибиотикообразования заканчивается на 140 часов роста при активности культуральной жидкости 24000 мкг/мл (5). Недостатком этого процесса является длительность ферментации при относительно невысоком уровне активности культуральной жидкости.

Задача, решение которой предусмотрено настоящим изобретением, заключается в интенсификации процесса биосинтеза цефалоспорина С путем использования нового штамма Acremonium chrysogenum BKM F-4081D и оптимизации питательных сред в условиях глубинного культивирования. Сущность изобретения заключается в том, что согласно способу микробиологического синтеза цефалоспорина С используют новый штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D, а в составе питательных сред используют новые соединения различной химической природы.

Новый штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D отличается от штамма Acremonium chrysogenum 12/9 повышенной чувствительностью к метионину, замедленным ростом на твердых питательных средах, ускоренным биосинтезом цефалоспорина С при культивировании в глубинных условиях культивирования и более высоким уровнем антибиотикообразования. Штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками:

на среде, содержащей бакто-пептон 10 г/л, мальтозу 40 г/л, мальт-экстракт сухой 20 г/л на 15 сутки роста имеет диаметр колонии 0,7 мм. Колонии приподнятые, конусообразные, нерегулярно складчатые, поверхность молодых колоний игольчатая, цвет слоновой кости или розоватые, пигмента в среду не выделяют, воздушный мицелий очень слабо выраженный. Прототроф, строгий аэроб, оптимальная температура роста на агаровой среде - 24-28°С. Видимый рост колоний проявляется на 8 сутки инкубации при 28°С. На вышеприведенной среде с добавлением 0,1% метионина на 15 сутки роста диаметр колоний в среднем 0,9 мм. Колонии приподнятые, слабо нерегулярно складчатые, светло бежевые, воздушный мицелий практически отсутствует, пигмента в среду не выделяет (таблица 1).

Таблица 1
Сравнение скорости роста и накопления биомассы штаммов 12/9 (родительский штамм) и ВКМ F-4081D (новый штамм)
Штамм	Появление видимого роста колоний на среде без метионина (сутки)	Диаметр (мм) колоний на агаровой среде на 15 сутки роста	Сухая биомасса, при ферментации в колбах (г/мл)
Среда без метионина	Среда с метионином	На посевной среде, 48 час	На ферментационной среде, 120 час
без метионина	с метионином
12/9 (контроль)	4	3,9	2,7	0,0474	0,1176	0,1206
ВKМ F-4081D (новый штамм)	8	2.8	0,9	0,0314	0,1087	0,1012

Указанный штамм получен путем многоступенчатой селекции на средах, содержащих низкие концентрации метионина: 0,3-0,01%. Штамм Acremonium chrysogenum депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВKМ) под номером F-4081D.

Биосинтез цефалоспорина С, с использованием нового штамма Acremonium chrysogenum ВKМ F-4081D, осуществляют на ферментационной питательной среде, содержащей источники углеводов, такие как глюкоза, крахмал кукурузный, декстрин, и источники азота, такие как кукурузный экстракт, Фармамедиа, сульфат аммония. Питательная среда содержит также неорганические соли, такие как фосфорнокислый калий, сернокислый магний, микроэлементы, и отличается от заявленной в прототипе (5) тем, что в качестве растительного жира содержит рапсовое масло. Кроме того, в среду вводят сложные органические соединения такие, как фосфолипид и ситостерин. Фосфолипиды являются источником «метаболического топлива», наряду с полиненасыщенными жирными кислотами входят в состав рапсового масла. Ситостерин, добавленный к ферментационной среде, способствует более раннему началу дифференциации мицелия и образованию артроспороподобных клеток с укороченной стадией прорастания в гифы. Это имеет большое значение в условиях промышленного производства, так как раннее образование артроспор и быстрая смена генераций улучшает реологические свойства культуральной жидкости, в первую очередь вязкость, что немаловажно для протекания биохимических процессов в стадии ферментации и дает возможность заканчивать биосинтез на более ранний срок при достижении высокого уровня антибиотикообразования. Культивирование осуществляют в колбах при перемешивании при температуре 24-28°С или в ферментаторе вместимостью 20 л в условиях регулируемой ферментации. Активность культуральной жидкости в нерегулируемом процессе в колбах 15000-17000 мкг/мл на 115-120 час, при культивировании в ферментаторе 32000-34000 мкг/мл на 106-110 часов. Количество цефалоспорина определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Преимуществами заявляемого способа являются:

1. Новый штамм Acremonium chrysogenum BKM F-4081D со сниженным уровнем образования мицелия в поверхностных и глубинных условиях роста.

2. Увеличение уровня антибиотикообразования по сравнению с прототипом при нерегулируемом процессе биосинтеза в 2 раза, а в условиях регуляции на 40%.

3. Сокращение времени ферментации на 20%.

4. Промежуточный продукт дазацетилцефалоспорин С образуется в количестве не более 5%.

Следующие примеры иллюстрируют антибиотикообразующую способность штамма Acremonium chrysogenum BKM F-4081D.

Пример № 1

Культуру штамма Acremonium chrysogenum BKM F-4081D смывают с агаровой среды, суспензию дезинтегрируют, вносят в колбы Эрленмейера вместимостью 0,75 л, содержащие 0,04 л посевной среды следующего состава, г/л:

дрожжевой экстракт	28,0
пептон (мясной)	10,0
мальт-экстракт	28,3
мел	4,0
рапсовое масло	3,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное.

Значение pH доводят до стерилизации до 7,0-7,1 конц. NaOH.

Инокулюм выращивают 48 часов при 28°С на качалке, делающей 230-240 об/мин. В выросшем посевном мицелии определяют количество биомассы методом центрифугирования при 3000 об/мин 15 мин. Биомасса составляет 28-30 об.%.

Инокулюм в количестве 15 об.% вносят в колбу Эрленмейера вместимостью 0,75 л, содержащую 0,04 л питательной среды следующего состава, г/л:

кукурузный экстракт	93,0
крахмал кукурузный	32,0
Фармамедиа	12
декстрин	43,0
глюкоза	4,0
СаСО3	11,0
(NH 4)2SO4	13,5
MgSO 4	3,5
KH2PO 4	4,0
CuSO4·5H 2O	0,017
ZnSO4 ·7H2O	0,16
MnSO 4·7H2O	0,03
FeSO 4·7H2O	0,08
масло рапсовое	30,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.

Ферментацию осуществляют на круговой качалке, делающей 230-240 об/мин, первые сутки при 28°С, затем до конца ферментации при 24°С. Содержание цефалоспорина С в культуральной жидкости на 115 часов составляет 15500 мкг/мл.

Пример № 2

Для выращивания инокулюма используют среду следующего состава, г/л:

Сахароза	32,0
мясной экстракт	17,0
кукурузный экстракт	6,0
рапсовое масло	3,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН до стерилизации 7,0.

Инокулюм выращивают 48 часов при 28°С на качалке с 230-240 об/мин. Количество биомассы на 48 часов роста составляет 28-29 об.%. Ферментацию проводят как указано в примере № 1. Активность культуральной жидкости на 120 часов 15000 мкг/мл.

Пример № 3

Инокулюм культуры Acremonium chrysogenum BKM F-4081D выращивают, соблюдая условия культивирования и посевную среду как в примере № 1.

Инокулюм в количестве 15% вносят в ферментационную среду следующего состава, г/л:

кукурузный экстракт	105,0
крахмал кукурузный	38,0
Фармамедиа	16,0
декстрин	42,0
глюкоза	4,5
СаСО 3	11,0
ситостерин	0,1
(NH4)2SO4	13,5
MgSO 4	3,5
KH2PO 4	4,0
CuSO4·5H 2O	0,017
ZnSO4 ·7H2O	0,16
MnSO 4·7H2O	0,03
FeSO 4·7H2O	0,08
масло рапсовое	35,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.

Ферментацию осуществляют согласно примеру № 1. Активность культуральной жидкости на 115 часов роста составляет 16000 мкг/мл.

Пример № 4

Выращивание инокулюма культуры Acremonium chrysogenum BKM F-4081D и ферментацию осуществляют как в примере 1. Для ферментации используют среду следующего состава, г/л:

кукурузный экстракт	105,0
крахмал кукурузный	38,0
Фармамедиа	16,0
декстрин	43,0
глюкоза	4,0
СаСО3	11,0
фосфатидилхолин	1,0
(NH4)2SO 4	13,5
MgSO4	3,5
KH2PO4	4,0
CuSO4·5H 2O	0,017
ZnSO4 ·7H2O	0,16
MnSO 4·7H2O	0,03
FeSO 4·7H2O	0,08
масло рапсовое	35,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.

Ферментацию осуществляют согласно примеру № 1. Активность культуральной жидкости на 115 часов роста составляет 16600 мкг/мл.

Пример № 5

Способ ферментации осуществляют согласно примеру № 4 с содержанием фосфатидилхолина 2 г/л и рапсового масла 40 г/л. Активность культуральной жидкости на 120 часов ферментации 16400 мкг/мл.

Пример № 6

Культуру Acremonium chrysogenum BKM F-4081D для засева ферментационной среды получают согласно примеру № 1. Ферментацию проводят как в примере № 1 на следующей среде, г/л:

кукурузный экстракт	105,0
крахмал кукурузный	38,0
Фармамедиа	16,0
декстрин	43,0
глюкоза	4,0
СаСО3	11,0
фосфатидилхолин	1,0
ситостерин	0,1
(NH 4)2SO4	13,5
MgSO 4	3,5
KH2PO 4	4,0
CuSO4·5H 2O	0,017
ZnSO4 ·7H2O	0,16
MnSO 4·7H2O	0,03
FeSO 4·7H2O	0,08
масло рапсовое	40,0 (вносится в каждую колбу отдельно)
вода дистиллированная	остальное

Значение рН доводят до стерилизации раствором концентрированной NaOH до 6,0-6,2.

Содержание цефалоспорина С в культуральной жидкости на 115 часов ферментации составляет 17000 мкг/мл. Содержание дезацетилцефалоспорина С составляет 4,8%.

Пример № 7

Вегетативный посевной материал культуры Acremonium chrysogenum ВKМ F-4081D передают в количестве 15 об.% в ферментатор вместимостью 20 л, содержащий 12 л ферментационной среды, состав которой указан в примере № 1. Процесс культивирования ведут при следующем режиме: температура 28°С от начала культивирования до 30 часов, а затем 24°С до конца ферментации. Вводимая мощность 4,5 кВт/час. При вспенивании добавляют пеногаситель пропинол Б-400. Аэрацию и перемешивание осуществляют таким образом, чтобы поддерживалась максимальная интенсивность дыхания при избыточном воздушном давлении (0,04±0,01 МПа) и парциальном давлении растворенного кислорода не ниже 30% от насыщения. Значение рН на уровне 5,7±0,2 поддерживают дозированием аммиачной воды и 12%-ных растворов NaOH, (NH₄)₂SO₄ и дозированием рапсового масла. При этом массовая доля аммонийного азота должна быть в пределах 0,04-0,1%, а слой масла на поверхности при определении влажной биомассы методом центрифугирования при 3000 об/мин, в течение 15 минут не превышал 1 мм. Расход масла 9,06% от объема загружаемой среды.

Через 110 часов культивирования активность культуральной жидкости, определенной методом ВЭЖХ, составляет 32000 мкг/мл. Дезацетилцефалоспорин - 4,8%.

Пример № 8

Вегетативный посевной материал Acremonium chrysogenum BKM F-4081D передают в количестве 15 об.% в ферментатор вместимостью 20 л, содержащий 12 л ферментационной среды, состав которой указан в примере № 6. Процесс культивирования ведут при следующем режиме: температура 28°С от начала культивирования до 25 часов, а затем 24°С до конца ферментации. Значение водородного показателя, массовой доли аммонийного азота, рапсового масла и парциального давления растворенного кислорода поддерживают в пределах, указанных в примере № 7. Расход масла 8,0%. Содержание цефалоспорина С на 106 часов ферментации составляет 34000 мкг/мл, дезацетилцефалоспорина С - 4,1%.

Источники информации

1. Elander R.P. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003,v61, № 5-6, p.385-392.

2. Shen Y-Q, Heim J., Solomon N.A., Demain A.L. The journal of Antibiotics. May 1984, v.37 n 5, p.503-511.

3. Demain A.L., Vaishnar P. Critical Reviews in Biotechnology, 2006, v 26, n 2, p.67-82.

4. Queener S.W., Ellis L.F. Canadian Journal of Microbiology. 1975, v 21, n 12, p.1981-1996.

5. Патент РФ «Способ биосинтеза цефалоспорина С», № 2241038, 27 ноября 2004 г.