дозирование олигонуклеотидов

Формула изобретения

1. Применение олигонуклеотида последовательности SEQ ID NO: 5 для получения фармацевтического препарата для профилактики и/или лечения злокачественной опухоли и/или метастазов у млекопитающего, причем указанный олигонуклеотид гибридизуется с матричной РНК гена TGF-бета2, и указанный препарат содержит указанный олигонуклеотид в концентрации от приблизительно 5 мкМ до приблизительно 25 мкМ.

2. Применение по п.1, где фармацевтический препарат содержит олигонуклеотид в концентрации от приблизительно 5 мкМ до приблизительно 15 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 5 мкМ до приблизительно 14 мкМ, еще более предпочтительно от приблизительно 5 мкМ до приблизительно 13 мкМ, еще более предпочтительно от приблизительно 5 мкМ до 12,5 мкМ, наиболее предпочтительно приблизительно 20 мкМ, 10 мкМ или 5 мкМ.

3. Применение по п.1 или 2, где олигонуклеотид содержит нуклеотид с 2'-модификацией рибонуклеотида, предпочтительно 2'-модификация представляет собой метокси- или метоксиэтилокси-группу.

4. Применение по п.1, где указанный олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид.

5. Применение по п.1, где по меньшей мере одна связь между двумя последовательными нуклеотидными строительными блоками является фосфоротиоатной или метилфосфонатной.

6. Применение по п.1, где указанный препарат используется для инфузии в ткань, опухоль или полость тела.

7. Применение по п.6, где указанная ткань выбрана из группы, состоящей из желчного протока, мочевого пузыря, кости, костного мозга, головного/спинного мозга, молочной железы, ободочной кишки, эндометрия, эпителия, желчи, желчного пузыря, головы, головы и шеи, сердца, кишечника, суставов, почки, гортани, печени, легкого, лимфатического узла, лимфатических сосудов, мышцы, пищевода, яичника, поджелудочной железы, предстательной железы, прямой кишки, мочеиспускательного канала, кожи и ее слоев, селезенки, желудка, семенника, тимуса, щитовидной железы, миндалины или матки, или опухоль выбрана из группы, состоящей из адамантиномы длинных костей, аденомы, амелобластомы, астроцитомы, карциномы желчного протока, карциномы мочевого пузыря, карциномы кости, карциномы костного мозга, опухоли мозга, рака молочной железы, рака легких (бронхогенной карциномы), рака шейки матки, хондромы, хориокарциномы, карциномы ободочной кишки, карцинома ободочной и прямой кишки, цистаденокарциномы, эмбриональной карциномы, рака эндометрия, эпендимомы, рака пищевода, фибромы, фолликулярной тимомы, рака желчного пузыря, рака желудка, глиобластомы, глиомы, рака головы и шеи, рака сердца, гепатоцеллюлярного рака, рака брюшной полости, рака кишечника, карциномы почки, рака гортани, липомы, карциномы печени, карциномы легкого, рака лимфатических узлов, рака лимфатических сосудов, злокачественной глиомы, мезентелиомы, менингиомы, медуллярной карциномы, миомы, нейробластомы, немелкоклеточного рака легких, рака пищевода, остеосаркомы, рака яичника, карциномы поджелудочной железы, папиллярной карциномы, папиллярной аденокарциномы, папиллярной тимомы, феохромоцитомы, рака предстательной железы, рака прямой кишки, рака почки, почечно-клеточной карциномы, карциномы мочеточника, карциномы сальной железы, семиномы, рака кожи, мелкоклеточной карциномы легкого, карциномы тонкой кишки, рака мягких тканей, карциномы селезенки, плоскоклеточной карциномы, карциномы желудка, тератомы, тестикулярной карциномы, карциномы семенника, тимомы, рака щитовидной железы, опухолей щитовидной железы и рака тела матки, или полость тела является полостью сустава или пространством желудочка.

8. Применение по п.6, где полость тела представляет собой внутрибрюшинное пространство или плевральную полость.

9. Применение по п.7, где препарат предназначен для введения со скоростью потока от приблизительно 0,1 мкл/мин до приблизительно 0,1 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 0,5 мкл/мин до приблизительно 0,05 мкл/мин, еще более предпочтительно от приблизительно 0,8 мкл/мин до приблизительно 0,04 мл/мин, еще более предпочтительно от приблизительно 1 мкл/мин до приблизительно 0,02 мл/мин, еще более предпочтительно от приблизительно 2 мкл/мин до приблизительно 10 мкл/мин, наиболее предпочтительно 4 мкл/мин.

10. Применение по п.8, где препарат предназначен для введения со скоростью потока от приблизительно 5 мкл/мин до приблизительно 2 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 0,05 мл/мин до приблизительно 1 мл/мин, еще более предпочтительно от приблизительно 0,1 мл/мин до приблизительно 0,5 мл/мин, еще более предпочтительно от приблизительно 0,3 мл/мин до приблизительно 0,4 мл/мин, наиболее предпочтительно приблизительно 0,35 мл/мин.

11. Применение по п.9, где указанный препарат предназначен для введения в опухоль мозга, более предпочтительно в астроцитому, включая глиобластому и олигоастроцитому.

12. Применение по любому из пп.9-11, где указанный препарат предназначен для введения на протяжении от приблизительно 4 дней до приблизительно 14 дней, более предпочтительно на протяжении приблизительно от 3 до 8 дней.

13. Применение по п.1, где указанный препарат предназначен для введения во множестве курсов, более предпочтительно приблизительно от 2 до 20 раз, причем каждый из указанных курсов отделен интервалом от одного дня до 12 недель, более предпочтительно от приблизительно 2 дней до приблизительно 8 недель, еще более предпочтительно от приблизительно 4 дней до приблизительно 4 недель и еще более предпочтительно от приблизительно 6 дней до приблизительно 12 дней.

14. Применение по п.1 для лечения млекопитающего, более предпочтительно человека.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к получению фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения заболеваний, которые модулируются геном TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкином-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2.

Введение

Всеобщей характеристикой фармацевтических веществ является их увеличивающаяся эффективность, сопровождающаяся ростом вводимых количеств. Для конкретных веществ, применяемых в терапии опухолей, показана существенная корреляция между суммарным вводимым количеством и ингибированием опухолевого роста.

Кроме того, клеточный захват является лимитирующим фактором в отношении эффективности введения олигонуклеотидов «in vivo», когда большие количества олигонуклеотидов вводят для ингибирования продукции соответствующего белка.

Тем не менее, клинический успех этих веществ ограничен, так как рост концентрации и суммарного количества этих веществ, которые могут вводиться млекопитающему, страдающему от метастазов опухолей, нервного заболевания и иммуносупрессии, коррелирует с сильным увеличением тяжелых побочных эффектов и токсичности.

До настоящего времени в терапии рака, метастазов, заболевания нервной системы и иммуносупрессии нет результатов клинических испытаний, предоставляющих данные о количестве олигонуклеотидов, которое подходит для успешной терапии опухолей.

Патенты EP 1008649 и EP 0695354 указывают на то, что олигонуклеотиды, гибридизующиеся с мРНК TGF-бета1 и/или TGF-бета 2, могут быть использованы для получения фармацевтических композиций. Патент EP 1089764 дополнительно указывает на то, что ингибиторы веществ, отрицательно влияющих на иммунную систему, в сочетании с олигонуклеотидами, гибридизующимися с мРНК TGF-бета, VEGF, интерлейкина-10, а также их соответствующих рецепторов и рецептора простагландина E2, также могут быть использованы для получения фармацевтической композиции. Однако эти патенты предлагают широкий диапазон концентраций, при которых могут быть введены олигонуклеотиды.

Результаты токсикологических исследований на млекопитающих показали, что можно вводить большие количества олигонуклеотидов для ингибирования продукции соответствующих мишеней без токсических побочных эффектов (смотри примеры 1, 2, 3 и Schlingensiepen, R. et al, 2005). Впоследствии стало очевидным введение высоких концентраций и больших количеств олигонуклеотидов для ингибирования мишеней, вовлеченных в терапию рака, метастазов, заболевания нервной системы и иммуносупрессии.

Краткое изложение сущности изобретения

Неожиданно в ходе клинических испытаний заявители обнаружили, что фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один олигонуклеотид в более низкой концентрации и/или вводимые в более низких суточных количествах, ингибируют опухолевый рост быстрее и с меньшими симптомами при прогрессии заболевания, чем таковые с более высокими концентрациями и/или с более высокими суточными количествами.

Кроме того, эти концентрации или суточные количества были от 10 до 50 раз ниже, чем максимальная концентрация, тестируемая в токсикологических исследованиях без тяжелых побочных эффектов (смотри также фиг.4).

Таким образом по меньшей мере один олигонуклеотид, применяемый для получения фармацевтического препарата настоящего изобретения, имеет концентрацию от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 25 мкМ и длину от приблизительно 8 до приблизительно 30 нуклеотидных строительных блоков, вводится для профилактики и/или лечения заболеваний, которые модулируются TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкином-10, c-jun, c-fos и/или рецептором простагландина E2, и гибридизуется с матричной РНК гена TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкина-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2.

Дополнительным аспектом изобретения является введение указанного фармацевтического препарата с помощью инфузии в ткань, полость тела или опухоль со скоростью потока от приблизительно 0,1 мкл/мин до приблизительно 2 мл/мин или с помощью болюсной инъекции.

Еще одним аспектом изобретения является нанесение по меньшей мере одного олигонуклеотида на ткань, опухоль, полость тела в количествах от приблизительно 0,15 нмоль до приблизительно 3 мкмоль, при введении в опухоль, ткань или полость тела, выбранных из группы полости сустава или пространства желудочка, соответственно в количествах от приблизительно 0,005 мкмоль до приблизительно 0,06 ммоль, при введении в большую полость тела, такую как внутрибрюшинная полость или плевральная полость, в количествах от приблизительно 0,005 мкмоль до приблизительно 0,05 ммоль.

Дополнительными преимуществами вариантов осуществления, описанных в настоящем изобретении, являются повышенная эффективность, повышенная аффинность для нуклеиновой кислоты-мишени, повышенный клеточный захват, повышенная безопасность, сниженные побочные эффекты и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

Чертежи

На фиг.1 представлено количество больных анапластической астроцитомой с симптомами, обусловленными прогрессией заболевания, после лечения растворами (0,9% хлорид натрия) 10 мкМ и 80 мкм олигонуклеотида, гибридизованного с мРНК TGF-бета2, идентифицированного в последовательности, представленной как SEQ ID NO 5, вводимого внутрь опухоли с помощью доставки, усиленной конвекцией CED при скорости потока 4 мкл/мин. Как можно видеть на фиг.1, количество больных анапластической астроцитомой с симптомами, обусловленными прогрессией опухоли, а также со стадией и тяжестью этих эффектов после лечения 10 мкМ раствором указанного олигонуклеотида снижено по сравнению с больными, которым инфузировали 80 мкМ раствора указанного олигонуклеотида. Смотри более подробно в примере 3. Степени определяли в соответствии с NCI CTC Toxicity Scale Version 2.0. SAEs (= серьезные неблагоприятные эффекты) определяли как любое неблагоприятное медицинское проявление, возникшее в результате такой дозы, которая, например, ведет к опасным для жизни эффектам, требует госпитализации больного или продления существующей госпитализации.

На фиг.2 представлено снижение размера опухоли в течение двух месяцев у четырех больных анапластической астроцитомой, подвергаемых лечению 10 мкМ (фиг.2A, 2B, 2C) и 80 мкМ (фиг.2D) раствором (0,9% хлорид натрия, DAB7) антисмыслового олигонуклеотида против мРНК TGF-бета2, описываемого последовательностью, представленной SEQ ID NO 5, введенного внутрь опухоли с помощью конвекционной увеличенной доставки. Более подробно смотри пример 10. У трех больных, которых лечили 10 мкМ раствором (фиг.2A, 2B, 2C), наблюдалось снижение размера опухоли в течение периода от приблизительно 2 до 5 месяцев в диапазоне от приблизительно 30% до 66%, в то время как у больного, которого лечили 80 мкМ, выявлялось увеличение роста опухоли (фиг.2D). Более подробно смотри в примере 10.

На фиг.3 изображены предпочтительные олигонуклеотиды, способные гибридизоваться с мРНК-мишенями, таких как TGF-бета1 (SEQ ID NO с 1 по 4), TGF-бета2 (SEQ ID NO с 5 по 8), TGF-бета3 (SEQ ID NO с 9 по 38), рецептор простагландина E2 (SEQ ID NO с 39 по 49), VEGF (SEQ ID NO с 50 по 56), интерлейкин 10 (SEQ ID NO с 57 по 76), c-jun (SEQ ID NO с 78 по 83) и c-fos (SEQ ID NO с 85 по 93).

На фиг.4 качественно изображены эффективность и токсичность олигонуклеотидов, коррелирующие с концентрацией. Вертикальная ось качественно показывает токсичность и эффективность, а горизонтальная ось отображает концентрацию олигонуклеотида. На фигуре можно видеть, что пик эффективности достигается при намного более низкой концентрации, чем при концентрации, проявляющей токсические эффекты.

На фиг.5 представлено ингибирование секреции TGF-бета2 клетками A-172, обработанными 5 мкМ, 10 мкМ и 80 мкМ олигонуклеотида, описываемого последовательностью SEQ ID NO 5, в течение 7 дней, представлено в процентах от необработанного контроля (столбик 1). Инкубация клеток A-172 с тремя различными концентрациями этого олигонуклеотида приводила к среднему показателю ингибирования 61,1% (5 мкМ, столбик 2), 68,1% (10 мкМ, столбик 3) и 56,2% (80 мкМ, столбик 4). Следовательно, 10 мкМ олигонуклеотида, описываемого последовательностью SEQ ID NO 5, как обнаружено, проявляет наилучшее ингибирование экспрессии TGF-бета2 по сравнению с 5 и 80 мкМ этого олигонуклеотида. Секретируемый TGF-бета2 количественно определяли с помощью ИФА. Результаты получены в четырех независимых экспериментах. Более подробно смотри в примере 12.

На фиг.6 показано отношение выживаемости больных в зависимости от времени для трех групп, подвергаемых лечению. В одной группе SEQ ID NO 5 вводили в концентрации 10 мкМ (сплошная линия) и 80 мкМ (пунктирная линия). Больные контрольной группы (точечная линия), с другой стороны, получали стандартную химиотерапию. Более подробно смотри в примере 11. Больные, которые были живы к моменту оценки, представлены как «цензурные» величины с их соответствующим временем выживания до оценки (точки на кривых). Этот вид представления известен как «кривая выживания Каплана-Мейера». Данные показывают, что больные, получавшие 10 мкМ SEQ ID NO 5, имеют намного лучшую возможность выживания, чем те, которых лечили 80 мкМ, и контрольная группа.

Подробное описание изобретения

Выражение «около» в контексте настоящего изобретения включает отклонения от абсолютной величины, данной в тексте, от 0 до 100%, более предпочтительно от 1 до 80%, еще более предпочтительно от 2 до 60%, более предпочтительно от 3 до 40%, более предпочтительно от 4 до 20% и еще более предпочтительно от 5 до 10%, от соответствующей величины.

Неблагоприятное событие в контексте настоящего изобретения понимается как любой неблагоприятный медицинский эпизод у больного или индивида, подвергаемого клиническому исследованию, после введения фармацевтического препарата, который не имеет причинной связи с лечением соответствующим фармацевтическим препаратом. Неблагоприятное событие может, следовательно, быть любым неблагоприятным и непредполагаемым признаком (включая ошибочные лабораторные данные), симптомом или заболеванием, например, обусловленным прогрессией заболевания. Другое проявление неблагоприятного события представляет собой симптом.

Термин «мозговая опухоль», применяемая как синоним термина «опухоли мозга» в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой любую опухоль мозга, включая метастазы, метастазы, происходящие из других частей мозга или происходящие из любой другой опухоли организма и метастазы спинного мозга. Опухоль мозга дополнительно включает первичную опухоль мозга, астроцитому, включая глиобластому и олигоастроцитому, олигодендроглиому и глиосаркому.

Под термином «полость» в контексте настоящего изобретения понимают, например, ободочную кишку, двенадцатиперстную кишку, подвздошную кишку, полость суставов, плевральную полость, внутрибрюшинное пространство, просвет пищевода, гортань, гайморову полость, носовую полость, глотку, прямую кишку, желудок, кишечный тракт, мочеточник, мочевой пузырь и пространство желудочков.

В настоящем изобретении выражение «заболевание» включает неоплазмы, метастазы, неврологические нарушения и иммуносупрессию.

Под «гибридизацией» в контексте настоящего изобретения подразумевает, что две нуклеотидные цепи по меньшей мере частично образуют двойную цепь с помощью водородных мостиков. Двойная цепь образуется полностью, когда две нуклеотидные цепи имеют точные антисмысловые последовательности. Но даже, если любой нуклеотид олигонуклеотида, также обозначаемый как нуклеотидный строительный блок, замещен другим нуклеотидом, соответствующий нуклеотид модифицирован или даже, когда на месте соответствующего олигонуклеотида находится спейсер, олигонуклеотид все еще может гибридизоваться с молекулой-мишенью, обычно с мРНК белка, и в результате этого ингибировать продукцию указанного белка.

«Метастаз» в контексте настоящего изобретения обозначает, что по меньшей мере одна клетка отделяется или диссоциирует от опухолевой ткани и передвигается по лимфатической системе, кровеносным сосудам и/или, проникая в окружающую ткань, достигает другой части организма млекопитающего, предпочтительно человека, где она прикрепляется и образует новую опухолевую ткань.

Термин «олигонуклеотиды изобретения» охватывает любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или любое другое соединение, которое при введении млекопитающему способно дать его биологически активный метаболит или остаток. Это осуществляется с помощью специфической гибридизации соединений с одной или более нуклеиновыми кислотами, кодирующими TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бетаa3, VEGF и интерлейкин-10, и/или рецептор простагландина E2.

Термины «нуклеиновые кислоты» и «олигонуклеотиды» применяют как синонимы в контексте настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не являются антисмысловыми нуклеиновыми кислотами, что означает, что они не работают в клетке в результате частичного или полного связывания с видами комплементарной геномной ДНК или РНК, тем самым ингибируя функцию указанных видов геномной ДНК или РНК.

В одном варианте осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения также включают олигонуклеотиды, как описано в патентах EP 0695354 и EP 1008649, а также олигонуклеотиды из международных патентных заявок, опубликованных под No WO 01/68146, WO 98/33904, WO 99/63975 и WO 99/63975, включенных здесь в качестве ссылки. Олигонуклеотиды, гибридизующиеся с TGF-бета, в одном предпочтительном варианте осуществления включают по меньшей мере одну последовательность, предлагаемую как SEQ ID № с 1 по 93.

Олигонуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают олигонуклеотиды, имеющие не существующие в природе части со сходной функцией. Существующие в природе нуклеотиды, а также не существующие в природе нуклеотиды, модификации и спейсеры также относятся к нуклеотидному строительному блоку. Наиболее обычным нуклеотидным строительным блоком является нуклеотид. Модифицированные или замещенные нуклеотиды, а также спейсеры также включаются в выражение «нуклеотидный строительный блок».

Эти модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто являются предпочтительными по сравнению с нативными формами из-за желаемых свойств, таких как повышенный клеточный захват, повышенное сродство к нуклеиновой кислоте-мишени (например, белку), измененная внутриклеточная локализация и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз. Модификации олигонуклеотидов, как применятся здесь, включают любую химическую модификацию сахара, основной части и/или межнуклеозидной связи.

В одном варианте осуществления кольцевая структура рибозной группы нуклеотидов в модифицированном олигонуклеотиде или полинуклеотиде имеет в кольцевой структуре кислород, замещенный N-H, N-R (где R представляет собой алкил, более предпочтительно алкил с от 1 до 20 углеродами, очень предпочтительными алкилами являются метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, или R представляет собой арильный заместитель), S и/или метилен.

Фармацевтический препарат в контексте настоящего изобретения включает олигонуклеотид настоящего изобретения с фармацевтически приемлемым носителем.

В одном варианте осуществления нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды с ковалентно модифицированным основанием и/или сахаром включают, например, нуклеиновые кислоты, имеющие сахара остова, которые ковалентно присоединены к органическим группам с низкой молекулярной массой, отличным от гидроксильной группы в 3' и/или 2' положении или фосфатной группы в 5' положении. Модифицированные таким образом нуклеиновые кислоты могут дополнительно включать по меньшей мере одну 2'-O-замещенную рибозную группу. В целях настоящего изобретения термин «2'-замещенная» обозначает замещение 2'-OH молекулы рибозы. O может быть замещен N, S, и заместитель может дополнительно включать алкил с от 1 до 20 углеродами, например O-алкил, S-алкил, NH-алкил, N-диалкил, O-арил, S-арил, NH-арил, O-аралкил, S-аралкил, NH-аралкил. В предпочтительных вариантах осуществления 2'-O-алкильных групп представляют собой метокси-, этокси-, пропилокси-, изопропилокси-, метоксиэтокси. Дополнительные модификации нуклеотидных строительных блоков также даны в патентах США 6143881, US 5591721, US 5652355, US 5962425, US 5969116 и US 5914396, включенных здесь в качестве ссылки. Другим предпочтительным вариантом осуществления является нуклеотидный строительный блок, включающий по меньшей мере одну дезоксирибозу с алкильной группой, связанной с 2'-углеродом. Алкил может иметь от приблизительно 1 до приблизительно 30 углеродов, от 1 до приблизительно 20 углеродов, от 1 до приблизительно 10 углеродов или от 1 до приблизительно 5 углеродов. Предпочтительными алкильными группами являются этил-, пропил-, изопропил-, бутильная группа, наиболее предпочтительной является метильная группа.

В еще одном варианте осуществления модифицированные нуклеиновые кислоты включают сахара, такие как арабиноза вместо рибозы. Таким образом, нуклеиновые кислоты могут быть гетерогенными по составу остова, в результате чего содержащими любое возможное сочетание полимерных единиц, связанных друг с другом, таких как пептид-нуклеиновые кислоты (которые имеют аминокислотный остов, связанный с основаниями нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются гомогенными по составу остова.

Замещенные пурины и пиримидины нуклеиновых кислот включают стандартные пурины и пиримидины, такие как цитозин, а также аналоги оснований, такие как замещенные основания (Wagner et al., 1993). Пурины и пиримидины включают, но ими не ограничиваются, аденин, цитозин, гуанин, тимин, инозин, 5-метилцитозин, 2-аминопурин, 2-амино-6-хлорпурин, 2,6-диаминопурин, гипоксантин и другие существующие и не существующие в природе нуклеиновые основания, замещенные и незамещенные ароматическими частями.

Одиночные нуклеотиды в каждом олигонуклеотиде могут содержать те же самые модификации, могут содержать сочетания этих модификаций или могут сочетать эти модификации с фосфодиэфирными связями. Способы придания олигонуклеотиду устойчивости к нуклеазам включают, но ими не ограничиваются, ковалентную модификацию пуриновых или пиримидиновых оснований. Например, основания могут быть метилированы, гидроксиметилированы или замещены другим образом (например, гликозилированы), так что олигонуклеотидам или полинуклеотидам придается существенная устойчивость к кислотам и нуклеазам.

В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один конец олигонуклеотида представляет собой биотин, аналог биотина, авидин или аналог авидина. Эти молекулы обладают способностью блокировать деградацию защищенного олигонуклеотида и обеспечивают возможность присоединения модифицированных нуклеиновых кислот к твердой подложке с высоким сродством. Производные авидина и биотина, которые могут быть применены для получения реагентов настоящего изобретения, включают стрептавидин, сукцинилированный авидин, мономерный авидин, биотин (биотин-эпсилон-N-лизин), гидразид биотина, аминные или сульфгидрильные производные 2-иминобиотина и гидразид биотинил-эпсилон-аминокапроновой кислоты. Дополнительные производные биотина, такие как биотин-N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, сложный эфир биотинил-эпсилон-аминокапроновой кислоты N-гидроксисукцинимида, сульфосукцинимидил-6-(биотинамино)гексаноат, N-гидроксисукцинимидиминобиотин, биотинбромацетилгидразид, п-диазобензоилбиоцитин и 3-(N-малеимидпропионил)-биоцитин, также могут быть применены в качестве концевых блокирующих групп на олигонуклеотидах настоящего изобретения.

В еще одном варианте осуществления основные единицы поддерживаются для гибридизации подходящим соединением-мишенью нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, олигонуклеотидный миметик, который, как показано, обладает прекрасными свойствами гибридизации, обозначается как пептид-нуклеиновая кислота (PNA). В соединениях PNA сахарный остов олигонуклеотида заменен содержащим амиды остовом, в частности аминоэтилглициновым остовом. Нуклеотидные основания связываются прямо или непрямо с аза атомами азота амидной части остова. Примеры патентов США, которые указывают на получение соединений PNA, включают, но ими не ограничиваются, патенты США № 5539082, 5714331 и 5719262, каждый из которых включен здесь в качестве ссылки. Дополнительное указание на соединения PNA может быть найдено в Nielsen et al. 1991.

Другие олигонуклеотиды с модифицированным остовом включают, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфоротриэфиры, аминоалкилфосфоротриэфиры, метил- и другие алкил-фосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты, и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионо-фосфор-амидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5' связи, их 2'-5'- соединенные аналоги, и те, которые имеют инвертированную полярность, где соседние пары нуклеозидных единиц соединены 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Включаются также различные соли, смешанные соли и формы свободной кислоты. Одним предпочтительным вариантом осуществления является натриевая соль нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеотид олигонуклеотида модифицирован, как описано в одной из модификаций выше. Модификация может охватывать олигонуклеотид либо непрерывно, либо нерегулярно.

В еще одном варианте осуществления по меньшей мере две модификации, как описано выше, сочетаются в одном олигонуклеотиде.

В другом варианте осуществления от 1 до приблизительно 12, или от 1 до приблизительно 8, или от 1 до приблизительно 4, или от 1 до приблизительно 2 олигонуклеотидных и/или нуклеотидных связей у 3' и/или 5' конца олигонуклеотида модифицированы, как описано выше.

В одном варианте осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения гибридизуются с мишенью, например, TGF-бета или его подтипами, более предпочтительно TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, ИЛ-10 и низкий PGE₂. Эти мишени хорошо известны специалистам в данной области техники. Антисмысловая структура мРНК указанных мишеней также дана в патенте PCT/EP2004/053604, включенном здесь в качестве ссылки.

Удлинение цепи обозначает, что олигонуклеотиды представленных последовательностей и другие олигонуклеотиды, которые имеют дополнительные нуклеотиды в последовательности соответствующей антисмысловой структуры мРНК указанных мишеней, все еще находится в объеме настоящего изобретения. Дополнительные нуклеотиды в одном варианте осуществления находятся в соответствии с кодирующей областью мРНК, в еще одном варианте осуществления дополнительные нуклеотиды находятся также в некодирующем участке мРНК, включая интроны и экзоны. Дополнительные нуклеотиды включают от приблизительно 1 до приблизительно 10000 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 5000 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 3000 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 1000 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 500 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 100 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 50 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 25 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 10 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 5 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 2 нуклеотидов, связанных с по меньшей мере одним из 3'- и/или 5'-концом, в другом варианте осуществления с по меньшей мере одним из 2'- и/или 5'-концом. В еще одном варианте осуществления некоторые нуклеотидные строительные блоки этих олигонуклеотидов или полинуклеотидов могут быть модифицированы или замещены с помощью спейсеров и/или модификаций, как здесь описано.

Фармацевтически приемлемые соли относятся к физиологически и фармакологически приемлемым солям соединений, применяемых в изобретении, что означает, что соли сохраняют биологическую активность родительских соединений без нежелательных токсикологических эффектов.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид или его активное производное представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид, в еще одном варианте осуществления олигонуклеотид является двухцепочечным, что означает, что олигонуклеотид полностью или частично гибридизован со вторым олигонуклеотидом, который имеет от приблизительно 50% до приблизительно 100% точную антисмысловую структуру указанного олигонуклеотида. Это может приводить к двойной цепи, в которой оба олигонуклеотида гибридизуются с меньшей силой связи, или к двойной цепи с перекрывающимися концами. Два олигонуклеотида могут иметь одну и ту же длину, другими словами, они имеют одинаковое количество нуклеотидных строительных блоков, или их длина может различаться, также приводя к перекрыванию концов на одном или обоих концах.

Экспрессионный спейсер в контексте настоящего изобретения включает любой нуклеотидный строительный блок, который не обязательно является производным или модификацией нуклеотида, но связывает два нуклеотидных строительных блока таким образом, что полученный олигонуклеотид все еще гибридизуется со своей мишенью, например мРНК TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, рецептора простагландина E2, c-fos, c-jun или интерлейкина-10.

Одним вариантом осуществления изобретения является применение по меньшей мере одного олигонуклеотида с длиной в от 8 до 30 нуклеотидных строительных блоков для получения фармацевтического препарата для профилактики и/или лечения заболеваний, которые модулируются TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкином-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2, у млекопитающего, где указанный олигонуклеотид гибридизуется с матричной РНК гена TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкина-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2, и где указанный препарат включает указанный олигонуклеотид в концентрации от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 25 мкМ.

В других вариантах осуществления фармацевтический препарат настоящего изобретения включает олигонуклеотиды в концентрации от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 15 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 2,5 мкМ до приблизительно 14 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 4 мкМ до приблизительно 13 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 5 мкМ до приблизительно 12,5 мкМ, наиболее предпочтительно концентрация олигонуклеотидов составляет приблизительно 20 мкМ, приблизительно 10 мкМ или приблизительно 5 мкМ.

В еще одном варианте осуществления фармацевтический препарат этого изобретения включает олигонуклеотиды в концентрации от приблизительно 50 мкМ до приблизительно 150 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 60 мкМ до приблизительно 100 мкМ, еще более предпочтительно от приблизительно 70 мкМ до приблизительно 90 мкМ и наиболее предпочтительно приблизительно 80 мкМ, 60 мкМ или 100 мкм.

Тогда как олигонуклеотиды настоящего изобретения являются одноцепочечными, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере части одноцепочечной нуклеиновой кислоты являются двухцепочечными. Двухцепочечные молекулы более стабильны in vivo, в то время как одноцепочечные молекулы имеют повышенную активность.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид имеет длину между приблизительно 6 и приблизительно 30 нуклеотидов и является комплементарным мРНК мишеней TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкина-10, c-jun, c-fos и рецептора простагландина E2. В более предпочтительных вариантах осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения имеют длину от приблизительно 7 до приблизительно 25 нуклеотидов, от приблизительно 8 до приблизительно 20 нуклеотидов, еще более предпочтительно от приблизительно 12 до 18 нуклеотидов. Предпочтительные варианты осуществления олигонуклеотидов, применяемых в настоящем изобретении, показаны в перечне последовательностей под SEQ ID NO с 1 по 93, наиболее предпочтительными вариантами осуществления являются SEQ ID NO с 1 по 38, наиболее предпочтительны SEQ ID NO 2 и/или 5.

Другие олигонуклеотиды, применяемые в фармакологических препаратах в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой олигонуклеотиды, описанные в перечне последовательностей, соответственно в примерах патентов EP 1089764, EP 0695534, PCT/EP 98/00497 и PCT/EP 2005/002101, включенных здесь в качестве ссылки.

В других вариантах осуществления по меньшей мере один олигонуклеотид для получения фармацевтического препарата включает по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь между двумя нуклеотидными строительными блоками. Фосфоротиоатная связь может составлять 0% - 5%, от 5% до 10%, от 10% до 15%, от 15% до 20%, от 20% до 25%, от 25% до 30%, от 30% до 35%, от 35% до 40%, от 40% до 45%, от 45% до 50%, от 50% до 55%, от 55% до 60%, от 60% до 65%, от 65% до 70%, от 70% до 75%, от 75% до 80%, от 80% до 85%, от 85% до 90%, от 90% до 95% или от 95% до 100% связей. Фосфоротиоатные связи могут быть разбросаны по олигонуклеотиду регулярно или нерегулярно. В некоторых вариантах осуществления фосфоротиоат аккумулируется либо на одном, либо на обоих 3'- и/или 5'-концах олигонуклеотида. Другим предпочтительным вариантом осуществления является олигонуклеотид, в котором все связи между нуклеотидами представляют собой фосфоротиоаты.

В одном варианте осуществления олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид. Одноцепочечный означает, что все олигонуклеотидные строительные блоки построены в одну линию и не гибридизуются со вторым олигонуклеотидом или антисмысловым олигонуклеотидом и не связываются иным способом.

В еще одних вариантах осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения применяют для профилактики и/или лечения заболевания, выбранного из группы рака, метастазов, заболевания нервной системы и иммуносупрессии.

В других вариантах осуществления фармацевтические препараты олигонуклеотидов вводят путем инфузии в ткань, опухоль или полость тела. В более предпочтительных вариантах осуществления ткань выбрана из группы желчного протока, пузыря, кости, костного мозга, мозга, молочной железы, ободочной кишки, эндометрия, эпителия, желчного пузыря, головы, головы и шеи, сердца, кишечника, суставов, почки, гортани, печени, легкого, лимфатического узла, лимфатических сосудов, мышцы, пищевода, яичника, поджелудочной железы, простаты, прямой кишки, мочеточника, кожи и ее слоев, селезенки, желудка, семенника, тимуса, щитовидной железы, миндалины или матки и/или вводят в соответствующую опухоль данной ткани.

В более предпочтительном вариантах осуществления фармацевтический препарат вводят в опухоль в мозге, предпочтительно в опухоль мозга, выбранную из группы астроцитомы, включая глиобластому и олигоастроцитому.

В другом варианте осуществления фармацевтический препарат олигонуклеотидов вводят в полость тела, выбранную из группы желчного протока, пузыря, ободочной кишки, желчного пузыря, полости сустава, плевральной полости, внутрибрюшинного пространства, прямой кишки, кишечного тракта, мочеточника, мочевого пузыря и пространства желудочков.

В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические препараты, включающие по меньшей мере один олигонуклеотид настоящего изобретения, вводят в опухоль или ткань, полость сосуда или пространство желудочков со скоростью потока от приблизительно 0,1 мкл/мин до приблизительно 2 мл/мин. Дополнительно предпочтительными являются скорости потока от приблизительно 0,5 мкл/мин до приблизительно 0,05 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 0,8 мкл/мин до приблизительно 0,04 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 1 мкл/мин до приблизительно 0,02 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 2 мкл/мин до приблизительно 10 мкл/мин, наиболее предпочтительно от приблизительно 4 мкл/мин. В наиболее предпочтительном варианте осуществления фармацевтический препарат вводят при этих скоростях потока в опухоль мозга, более предпочтительно в астроцитому, включая глиобластому и олигоастроцитому.

В другом варианте осуществления фармацевтический препарат вводят в полости тела, которые не представляют собой пространство желудочков или полость сустава, например ободочную кишку, плевральную полость, внутрибрюшинное пространство, прямую кишку, желудок, кишечный тракт, мочеточник или мочевой пузырь. В этих вариантах осуществления фармацевтический препарат вводят со скоростями потока от приблизительно 5 мкл/мин до приблизительно 2 мл/мин, более предпочтительно от приблизительно 0,05 мл/мин до приблизительно 1 мл/мин, еще более предпочтительно от приблизительно 0,1 мл/мин до приблизительно 0,5 мл/мин, еще более предпочтительно от приблизительно 0,3 мл/мин до приблизительно 0,4 мл/мин, наиболее предпочтительно приблизительно 0,35 мл/мин.

В еще одних вариантах осуществления олигонуклеотиды настоящего изобретения применяют для профилактики и/или лечения заболевания, выбранного из группы рака, метастазов, заболевания нервной системы и иммуносупрессии.

В предпочтительных вариантах осуществления рак, метастазы, нервную систему и/или иммуносупрессию лечат соответствующими олигонуклеотидами, гибридизующимися с мРНК мишеней TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, VEGF, интерлейкина-10, c-jun, c-fos и/или рецептора простагландина E2, еще более предпочтительными являются последовательности, идентифицированные в перечне последовательностей SEQ ID NO 1-93. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК TGF-бета1, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 1-4, наиболее предпочтительной является SEQ ID NO 2. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК TGF-бета2, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 5-8, наиболее предпочтительной является SEQ ID NO 5. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК TGF-бета3, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 9-38. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК рецептора простагландина E2, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 39-49. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК интерлейкина-10, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 57-76. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК c-jun, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 78-83. Предпочтительные последовательности, гибридизующиеся с мРНК c-jun, идентифицированы в перечне последовательностей SEQ ID NO 85-93.

Другим вариантом осуществления заболеванием нервной системы является боковой амиотрофический склероз. В предпочтительном варианте осуществления нейрональные нарушения лечат соответствующими олигонуклеотидами, гибридизующимися с мРНК мишеней c-jun или j-fos, еще более предпочтительными являются последовательности c-jun, идентифицированные в перечне последовательностей SEQ ID NO 78-83, соответственно последовательности c-fos, идентифицированные в перечне последовательностей SEQ ID NO 85-93.

В одном варианте осуществления фармацевтический препарат вводят с помощью аппликационной системы. Предпочтительная аппликационная система включает портативный насос, связанный гибкими трубками с системой входа. Система входа связана с катетером для инфузии, хирургически имплантированным в центр опухоли, ткани или краем полости тела. В другом варианте осуществления применяют несколько катетеров для инфузии при инфузии фармацевтического препарата. В еще одних вариантах осуществления катетеры для инфузии располагают не в центре опухоли или ткани, а их располагают на краю ткани и/или опухоли, инфузируемых фармацевтическим препаратом. Аппликационные системы, применимые в настоящем изобретении, описаны также в международной патентной заявке PCT/EP 2004/004211, включенной здесь в качестве ссылки.

Суммарный объем в день фармацевтического препарата, предпочтительно инфузируемого в опухоли, ткани или полости тела, выбранные из полости суставов или желудочкового пространства, варьирует от приблизительно 0,15 мл/д до приблизительно 0,15 л/д, более предпочтительно от приблизительно 0,7 мл/д до приблизительно 0,07 л/д, еще более предпочтительно от приблизительно 1,2 мл/д до приблизительно 0,06 л/д, еще более предпочтительно от приблизительно 2 мл/д до приблизительно 0,03 л/д, еще более предпочтительно от приблизительно 3 мл/д до приблизительно 15 мл/д и наиболее предпочтительно он составляет приблизительно 5,6 мл/д или приблизительно 11 мл/д.

В другом варианте осуществления суммарный объем фармацевтического препарата, предпочтительно инфузируемого в большие полости тела, такие как внутрибрюшинное пространство или плевральное пространство, составляет от приблизительно 5 мл/д до приблизительно 3 л/д, более предпочтительно от приблизительно 0,05 л/д до приблизительно 1,5 л/д, еще более предпочтительно от приблизительно 0,15 л/д до приблизительно 1 л/д, еще более предпочтительно от приблизительно 0,4 л/д до приблизительно 0,6 л/д, наиболее предпочтительно приблизительно 0,5 л/д.

В другом варианте осуществления суммарное количество олигонуклеотида, нанесенного на опухоли, ткани или полости тела, выбранные из полости суставов или желудочкового пространства, с помощью средств настоящего изобретения составляет от приблизительно 0,15 нмоль до приблизительно 3 мкмоль, более предпочтительно от приблизительно 1 нмоль до приблизительно 2 мкмоль, еще более предпочтительно от приблизительно 0,01 мкмоль до приблизительно 1 мкмоль, еще более предпочтительно от приблизительно 0,02 мкмоль до приблизительно 0,1 мкмоль и наиболее предпочтительно приблизительно 0,224 мкмоль, приблизительно 0,112 мкмоль, приблизительно 0,056 мкмоль или приблизительно 0,028 мкмоль.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления эти количества вводят в опухоль мозга, в одном предпочтительном варианте осуществления опухоль мозга представляет собой астроцитому, включая глиобластому, или представляет собой олигоастроцитому.

Для лечения опухолей мозга предпочтительны олигонуклеотиды, которые могут гибридизоваться с мРНК TGF-бета, более предпочтительными являются последовательности, идентифицированные в перечне последовательностей как SEQ ID NO с 1 по 38. Более предпочтительными являются олигонуклеотиды, которые гибридизуются с TGF-бета2, еще более предпочтительными являются последовательности, идентифицированные в перечне последовательностей как SEQ ID NO с 5 по 8. В особо предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид идентифицирован в протоколе последовательностей как SEQ ID NO 5. В одном предпочтительном варианте осуществления SEQ ID NO 5 вводят в форме ее натриевой соли, имеющей молекулярную массу 6142,4 г, соответственно 7115,3 г в виде гидрата, включающего 54 молекулы кристаллической воды на олигонуклеотид.

В еще одном варианте осуществления суммарное количество олигонуклеотида, нанесенного на большие полости тела, такие как внутрибрюшинная полость или плевральная полость, в виде фармацевтического препарата настоящего изобретения составляет от приблизительно 0,005 мкмоль до приблизительно 0,05 ммоль, более предпочтительно от приблизительно 0,05 мкмоль до приблизительно 0,025 ммоль, более предпочтительно от приблизительно 0,1 мкмоль до приблизительно 0,01 ммоль и наиболее предпочтительно приблизительно 10 мкмоль, приблизительно 5 мкмоль или приблизительно 2,5 мкмоль.

В другом варианте осуществления суммарное количество олигонуклеотида, нанесенного на опухоли, ткани или полости тела, выбранные из полости суставов или желудочкового пространства, с помощью средств настоящего изобретения составляет от приблизительно 7,5 нмоль до приблизительно 22,5 мкмоль, более предпочтительно от приблизительно 50 нмоль до приблизительно 10 мкмоль, еще более предпочтительно от приблизительно 0,1 мкмоль до приблизительно 5 мкмоль, еще более предпочтительно от приблизительно 0,4 мкмоль до приблизительно 1 мкмоль и наиболее предпочтительно приблизительно 0,21 мкмоль, приблизительно 0,28 мкмоль или приблизительно 0,35 мкмоль.

В более предпочтительном варианте осуществления соответствующее количество вводят в опухоль мозга, в наиболее предпочтительном варианте осуществления опухоль мозга представляет собой астроцитому, включая глиобластому или олигоастроцитому.

В еще одном варианте осуществления суммарное количество олигонуклеотида, нанесенного на большие полости тела, такие как внутрибрюшинная полость или плевральная полость, в виде фармацевтического препарата настоящего изобретения составляет от приблизительно 0,25 мкмоль до приблизительно 0,45 ммоль, более предпочтительно от приблизительно 1 мкмоль до приблизительно 0,5 ммоль, более предпочтительно от приблизительно 0,01 ммоль до приблизительно 0,1 ммоль и наиболее предпочтительно приблизительно 50 мкмоль, приблизительно 40 мкмоль или приблизительно 30 мкмоль.

В одном варианте осуществления фармацевтический препарат настоящего изобретения вводят в опухоль, ткань или полость тела в течение от приблизительно 4 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до приблизительно 16 часов, от приблизительно 16 часов до приблизительно 24 часов, от приблизительно 24 часов до приблизительно 36 часов, от приблизительно 36 часов до приблизительно 2 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 3 дней, от приблизительно 3 дней до приблизительно 5 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 8 дней и от приблизительно 11 дней до приблизительно 15 дней. Этот период времени обозначается также как курс. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтический препарат вводят в течение от приблизительно 3 до приблизительно 8 дней. Период в 4 дня и 7 дней предпочтителен для лечения опухоли мозга, где наиболее предпочтительным вариантом опухоли мозга является астроцитома, включая глиобластому или олигоастроцитому.

В других вариантах осуществления олигонуклеотиды в фармацевтическом препарате вводят множество раз, другими словами курс, как определено выше, повторяют множество раз, предпочтительно от 2 до 20 раз. В предпочтительных вариантах осуществления процедуру повторяют от одного до двадцати раз, например от двух до трех раз, от четырех до пяти раз, от шести до семи раз, от восьми до девяти раз, от десяти до одиннадцати раз, от двенадцати раз до тринадцати раз, от четырнадцати раз до пятнадцати раз, от шестнадцати раз до семнадцати раз, от восемнадцати раз до девятнадцати раз или двадцать раз.

Все курсы могут иметь одинаковую продолжительность или могут варьироваться. В некоторых вариантах осуществления время между двумя курсами составляет от приблизительно 1 дня до приблизительно 2 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 3 дней, от приблизительно 4 дней до приблизительно 5 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 7 дней, от приблизительно 8 дней до приблизительно 10 дней, от приблизительно 10 дней до приблизительно 2 недель, от приблизительно 2 недель до приблизительно 3 недель, от приблизительно 3 недель до приблизительно 4 недель, от приблизительно 4 недель до приблизительно 6 недель и от приблизительно 6 недель до приблизительно 12 недель. В предпочтительном варианте осуществления время между двумя курсами варьируется от приблизительно 2 дней до 8 недель, более предпочтительно от приблизительно 4 дней до приблизительно 4 недель, еще более предпочтительно от приблизительно 6 дней до приблизительно 12 дней.

В одном предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид, растворенный в физиологическом (= изотоническом) растворе, вводят в течение 7 дней и затем в течение последующих 7 дней олигонуклеотид не вводят. Этот курс повторяют несколько раз.

В еще одном варианте осуществления фармацевтический препарат включает по меньшей мере один олигонуклеотид и в дополнение по меньшей мере один дополнительный адъювант. Более подробно об адъювантах, также обозначаемых как иммуностимуляторы, смотри также патент EP 1089764. В предпочтительном варианте осуществления адъювантов он представляет олигонуклеотид, включающий CpG-мотив. Дополнительные подробности о CpG мотивах смотри также Krieg 2002.

Предпочтительные варианты осуществления фармацевтических препаратов настоящего изобретения применяются для млекопитающих, где предпочтительным млекопитающим является человек. Кроме употребления при лечении человека настоящее изобретение также может быть применимо для других индивидов, включая ветеринарных животных, экзотических животных и сельскохозяйственных животных, включая млекопитающих, грызунов и тому подобное. Млекопитающие включают людей, лошадей, собак, свиней, кошек или приматов (например, обезьяну, шимпанзе или лемура). Грызуны включают крыс, мышей, белок или морских свинок.

В одном варианте осуществления фармацевтический препарат с олигонуклеотидом настоящего изобретения вводят млекопитающему, сначала растворяя олигонуклеотид до концентрации от приблизительно 1 до 150 мкМ в фармацевтически приемлемом носителе раствора и затем вводя указанный раствор при скорости потока от приблизительно 0,1 мкл/мин до приблизительно 2 мл/мин в ткань, опухоль или полость тела млекопитающего. Дополнительные предпочтительные концентрации, скорости потока и последовательности даны выше в этом изобретении.

В одном варианте осуществления фармацевтический препарат с по меньшей мере одним олигонуклеотидом настоящего изобретения для лечения опухолей и/или метастазов вводят млекопитающему в количестве, дающем концентрацию этого олигонуклеотида в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 50 микрограмм на 1 см³ соответствующей опухоли.

В еще одном варианте осуществления фармацевтический препарат вводят таким путем, при котором концентрация олигонуклеотида составляет от приблизительно 2 до приблизительно 20 микрограмм на 1 см³ опухолевой ткани в день, более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 10 микрограмм на 1 см ³ опухолевой ткани в день.

Фармацевтический препарат настоящего изобретения может быть введен с помощью ряда путей в зависимости от того, желательно ли местное или системное введение и от области, которая подвергается лечению. Фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно вводить с помощью инфузии прямо в ткань, в опухоль и/или в полость тела. Введение фармацевтических препаратов настоящего изобретения может осуществляться с помощью любых способов, известных специалисту в данной области техники. Пути введения включают, но ими не ограничиваются, парентеральный (например, внутримышечный), внутрибрюшинный, внутрижелудочковый, внутримозговой, внутриопухолевый, внутрь желудочков мозга, внутриоболочечный, внутриматочный, инфузию и инъекцию в пузырь и плевру.

Фармацевтические препараты включают жидкие фармацевтические препараты, содержащие олигонуклеотид в концентрации от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 25 мкМ. В другом предпочтительном варианте осуществления фармацевтический препарат содержит олигонуклеотид в концентрации от приблизительно 50 мкМ до приблизительно 150 мкМ. Более предпочтительные концентрации даны выше. Такие препараты могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как, но ими не ограничиваясь, усилители проницаемости, приемлемые носители или эксципиенты. Термин «фармацевтический препарат» подразумевает, что жидкости или вещества этой композиции являются чистыми и/или объединяются с фармацевтически приемлемыми носителями.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает один или более совместимых жидких эксципиентов, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения человеку или другому млекопитающему. Термин «носитель» обозначает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяется активный ингредиент для облегчения применения. Компоненты фармацевтических препаратов также способны объединяться с соединениями настоящего изобретения и друг с другом таким образом, что не возникает взаимодействия, которое должно существенно ослабить желаемую фармацевтическую эффективность. Такие носители дают возможность составить олигонуклеотиды изобретения в виде жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий, эмульсий.

Как описано выше, фармацевтические композиции могут также включать микрокапсулы, нанокапсулы, микро- и наносферы, эмульсии и суспензии, олигонуклеотиды, нанесенные на микроскопические частицы золота, или препараты с длительным высвобождением олигонуклеотидов, в препаратах которых обычно применяют эксципиенты и добавки и/или вспомогательные агенты, такие как разрыхляющие агенты, связующие агенты, покрывающие агенты, агенты набухания, смазывающие агенты или солюбилизаторы.

Для инфузии в желудок, кишечник, ободочную кишку или прямую кишку пригодна клизма.

Для краткого обзора современных способов доставки лекарств смотри Langer (1990), который включен в настоящее описание качестве ссылки.

В еще одном варианте осуществления олигонуклеотиды представлены в фармацевтических носителях для парентерального введения с помощью инфузии. Составы для инфузии могут быть представлены в виде единичной лекарственной формы с добавленным консервантом. Фармацевтические композиции имеют такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных пузырьках, и содержат агенты состава, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

В одном варианте осуществления фармацевтические носители для парентерального введения включают водные растворы олигонуклеотидов в водорастворимой форме. В одном предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотид растворен в физиологическом (изотоническом) растворе, более предпочтительно в растворе 0,9% хлорида натрия.

В еще одном варианте осуществления получают суспензию соединений в виде подходящего масляного настоя. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инфузии включают вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость соединений для обеспечения получения сильно концентрированных растворов.

В еще одном варианте осуществления олигонуклеотиды могут находиться в форме порошка для воссоздания с подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой, перед применением. В других вариантах осуществления олигонуклеотид воссоздают с изотоническим раствором. Изотонический раствор представляет собой любой водный раствор с таким же осмотическим давлением, как осмотическое давление тела. Обычно применяют растворы солей, сахаров и тому подобного. В предпочтительных вариантах осуществления изотонический раствор представляет собой 0,9% раствор хлорида натрия или раствор Рингера с лактатом (например, DAB7).

В еще одном варианте осуществления активные соединения могут находиться в форме концентрата для разведения подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой, перед применением.

В еще одном варианте осуществления соединения составляют в ректальные или вагинальные композиции, такие как суппозитории или удерживаемые клизмы или таблетки, например, содержащие традиционные основы суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

В еще одном варианте осуществления соединения составляют в виде депо-препарата. В одном варианте осуществления такие препараты длительного действия составляют с подходящими полимерными или гидрофобными веществами (например, в виде эмульсии в подходящем масле) или ионообменными смолами или в виде медленно растворяющихся производных, например, в виде медленно растворяющейся соли.

В других вариантах осуществления системы доставки включают системы доставки с высвобождением в установленное время, с задержанным высвобождением или с непрерывным высвобождением. Такие системы могут обеспечить избежание повторных введений соединений, увеличить удобство для индивида и врача. Доступны и известны специалистам в данной области техники многие типы систем высвобождения и доставки.

В одном варианте осуществления системы доставки включают системы на основе полимеров, таких как поли(лактид-гликолид), кополиоксалаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полигидроксимасляная кислота и полиангидриды, более предпочтительно полиангидриды с молекулярной массой более 20000 Да. В одном предпочтительном варианте осуществления полиангидрид представляет собой поликонденсат дикарбоновых кислот с высокой молекулярной массой. Подробнее смотри также EP 0260415. Микрокапсулы перечисленных полимеров, содержащие лекарства, описаны, например, в патенте США No 5075109.

В другом варианте осуществления улучшение захвата олигонуклеотида было достигнуто с помощью различных систем векторизации, включая липосомы (нейтральные, катионные, иммунолипосомы), микро- и наночастицы, полимеры или ковалентное присоединение к носителю (C. Lefebure et al. 1995). Для доставки олигонуклеотидов также использовали опосредуемую липидом трансфекцию (Wang and Martini 1996). В других вариантах осуществления системы доставки включают неполимерные системы, которые являются, например, липидами, включающими стеролы, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирных кислот, или нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды, гидрогелевые системы высвобождения, силастиковые системы, системы на основе пептидов и тому подобное.

Конкретные примеры включают, но не ограничиваются этим: (a) эрозионные системы, в которых агент изобретения содержится в форме внутри матрикса, такого как описанные в патентах США № 4452775, 4675189 и 5736152 и (b) диффузионные системы, в которых активный компонент выходит с контролируемой скоростью из полимера, такого как описанные в патентах США № 3854480, 5133974 и 5407686.

В еще одном варианте осуществления олигонуклеотиды составляют с GELFOAM®, имеющимся в продаже продуктом, состоящим из модифицированных коллагеновых волокон, которые медленно деградируют.

В одном варианте осуществления фармацевтические композиции также включают подходящие носители или эксципиенты твердой или гелевой фазы. Примеры таких носителей или эксципиентов включают, но не ограничиваются этим, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

В одном варианте осуществления олигонуклеотиды вводят как таковые или в форме фармацевтически приемлемой соли. Соли должны быть фармацевтически приемлемыми, но фармацевтически неприемлемые соли могут быть свободно использованы для получения их фармацевтически приемлемых солей. Такие соли включают, но ими не ограничиваются, соли, получаемые из следующих кислот: хлористоводородной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, п-толуолсульфокислоты, винной, лимонной, метансульфокислоты, муравьиной, малоновой, янтарной, нафталин-2-сульфокислоты и бензолсульфокислоты. Кроме того, такие соли могут быть получены в виде солей щелочных или щелочноземельных металлов, таких как натриевые, калиевые или кальциевые соли карбоновой кислотной группы.

В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает по меньшей мере один буфер и/или по меньшей мере один консервант.

В одном варианте осуществления подходящие буферирующие агенты включают, но не ограничиваются этим, уксусную кислоту и соль (1-2 мас.%/об.), лимонную кислоту и соль (1-3 мас.%/об.), борную кислоту и соль (0,5-2,5 мас.%/об.) и фосфорную кислоту и соль (0,8-2 мас.%/об.).

Подходящие консерванты включают бензалкония хлорид (например, 0,003-0,03 мас.%/об.), хлорбутанол (например, 0,3-0,9 мас.%/об.), парабены (например, 0,01-0,25 мас.%/об.) и тиомерзал (например, 0,004-0,02 мас.%/об.).

В еще одном варианте осуществления фармацевтические композиции также включают усилители проникновения для повышения алиментарной доставки. Усилители проникновения можно классифицировать по принадлежности к одной из пяти широких категорий, т.е. жирным кислотам, желчным кислотам, хелатирующим агентам, поверхностно-активным веществам и веществам, отличным от поверхностно-активных веществ (Lee et al. 1991, Muranishi 1990). Могут быть включены один или более усилителей проникновения из одной или более этих широких категорий.

Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют как усилители проникновения, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, рецинлеат, моноолеин (1-моноолеоил-рац-глицерол), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, моно- и диглицериды и их физиологически приемлемые соли (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.д.) (Lee et al. 1991, Muranishi 1990, El-Hariri et al. 1992). Примерами некоторых предпочтительных в настоящее время жирных кислот являются капрат натрия и лаурат натрия, применяемые раздельно или в сочетании при концентрациях от 0,5 до 5%.

Физиологическая функция желчи включает облегчение диспергирования и всасывания липидов и жирорастворимых витаминов (Brunton 1996). Различные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют в качестве усилителей проникновения. Таким образом, термин «желчная соль» включает любой из естественных компонентов желчи, а также любое из их синтетических производных. Предпочтительной в настоящее время желчной солью является хенодезоксихолевая кислота (CDCA) (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.), обычно используемая в концентрациях от 0,5 до 2%.

Могут быть использованы комплексные составы, включающие один или более усилителей проникновения. Например, желчные соли могут быть использованы в сочетании с жирными кислотами с получением комплексных составов. Предпочтительные сочетания включают CDCA, соединенную с капратом натрия или лауратом натрия (обычно от 0,5 до 5%).

В одном варианте осуществления дополнительно применяют хелатирующие агенты, которые включают, но ими не ограничиваются, этилендиаминтетраацетат динатрия (ЭДТА), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомованиллат), N-ацильные производные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацильные производные бета-дикетонов (энамины)(Lee et al. 1991, Muranishi 1990, Buur et al. 1990). Хелатирующие агенты обладают дополнительным преимуществом, действуя также в качестве ингибиторов ДНКаз.

В еще одном варианте осуществления дополнительно применяют поверхностно-активные вещества. Поверхностно-активные вещества включают, например, лаурилсульфат натрия, простой эфир полиоксиэтилен-9-лаурил и простой эфир полиоксиэтилен-20-цетил (Lee et al. 1991) и эмульсии перфторированных соединений, такие как FC-43 (Takahashi et al. 1988).

Отличные от поверхностно-активных веществ соединения включают, например, ненасыщенные циклические производные мочевины, 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканоновые производные (Lee et al. 1991) и нестероидные противовоспалительные агенты, такие как диклофенак натрия, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al. 1987).

В одном варианте осуществления фармацевтические композиции настоящего изобретения дополнительно содержат другие вспомогательные компоненты, традиционно включаемые в фармацевтические композиции, в количестве, установленном для их применения в данной области техники. Так, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные вещества, такие как, например, противозудные агенты, вяжущие агенты, местные анестетики или противовоспалительные агенты, или могут содержать дополнительные вещества, пригодные для физически составленных различных лекарственных форм композиции настоящего изобретения, такие как красители, отдушки, консерванты, антиоксиданты, глушители, загустители и стабилизаторы. Такие вещества, однако, при их добавлении не должны чрезмерно влиять на биологическую активность компонентов композиций изобретения.

Настоящее изобретение может быть использовано для описанного введения лекарства в любую ткань индивида, где показан данный способ. Такие ткани включают, например, желчный проток, пузырь, кость, костный мозг, мозг, молочную железу, ободочную кишку, эндометрий, эпителий, желчь, желчный пузырь, голову, голову и шею, сердце, кишечник, суставы, почку, гортань, печень, легкое, лимфатический узел, лимфатические сосуды, мышцу, пищевод, яичник, поджелудочную железу, предстательную железу, прямую кишку, мочеточник, кожу и ее слои, селезенку, желудок, семенник, тимус, щитовидную железу, миндалину или матку.

Соответствующая опухоль ткани, обозначаемая также как опухоль или неоплазма, включает адамантиному длинных костей, аденому, амелобластому, астроцитому, карциному желчного протока, карциному пузыря, карциному кости, карциному костного мозга, опухоль мозга, рак молочной железы, бронхогенную карциному, рак шейки матки, хондрому, хориокарциному, карциному ободочной кишки, колоректальную карциному, цистаденокарциному, эмбриональную карциному, рак эндометрия, эпендимому, рак пищевода, фиброму, фолликулярную тимому, рак желчного пузыря, рак желудка, глиобластому, глиому, рак головы и шеи, рак сердца, гепатоцеллюлярный рак, рак в брюшной полости, рак кишки, карциному почки, рак гортани, липому, карциному печени, карциному легкого, рак лимфатического узла, рак лимфатических сосудов, злокачественную глиому, мезентелиому, менингиому, медуллярную карциному, миому, нейробластому, немелкоклеточную бронхогенную/легочную карциному, рак пищевода, остеосаркому, рак яичника, карциному поджелудочной железы, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциному, папиллярную тимому, феохромоцитому, рак предстательной железы, рак прямой кишки, рак почки, почечно-клеточную карциному, карциному мочеточника, карциному сальной железы, семиному, рак кожи, мелкоклеточную карциному легкого, карциному тонкой кишки, рак мягких тканей, карциному селезенки, плоскоклеточную карциному, карциному желудка, тератому, карциному семенника, карциному семенника, тимому, рак щитовидной железы, опухоли щитовидной железы и рак тела матки.

В контексте настоящего изобретения термины опухоль, рак и неоплазма используются как синонимы.

Примеры

В настоящей заявке представлены результаты исследований локальной токсичности у животных, а также клинических испытаний у больных. Все эти исследования проводились в соответствии с действующими указаниями Good Clinical Practice (GCP) и были одобрены местными комитетами по этике. Более того, испытания на больных соответствовали существующей международной Хельсинской декларации об экспериментах на людях.

Пример 1

Исследование локальной токсичности после внутриоболочечной болюсной инъекции у кроликов

Локальная безопасность и переносимость фармацевтического препарата, включающего антисмысловой олигонуклеотид против мРНК TGF-бета2, представленный SEQ ID NO 5, была продемонстрирована в исследованиях локальной токсичности при нанесении указанного олигонуклеотида внутриоболочечно кроликам в виде болюса.

Каждое из двух исследований проводили на восьми кроликах (2/пол/группа обработки) с введением 0,1 мл 14 мкМ или 500 мкМ раствора указанного олигонуклеотида в обычном физиологическом растворе, соответственно путем однократной внутриоболочечной болюсной инъекции в подпаутинное пространство поясничной области. Контрольные группы получали 0,9% раствор NaCl таким же образом. Местные реакции обследовали макроскопически через 2, 6 и 30 часов после введения. Через шесть и 30 часов после введения 1 животное/пол/группа умерщвляли. Гистологически исследовали образцы ткани мозга (толщина приблизительно 5 мкм).

При обеих концентрациях ни у одного из кроликов не было отмечено каких-либо клинических признаков токсичности или макроскопически видимых изменений. В обоих исследованиях гистопатологическое обследование не выявило связанных с веществом гистоморфологических повреждений в подпаутинном пространстве поясничной области. Не наблюдалось связанных с веществом изменений в сером и белом веществе спинного мозга. Не выявлено каких-либо патологий в нервном стволе и нервных клетках.

У одного контрольного кролика (0,9% хлорид натрия) была обнаружена геморрагия от умеренной до выраженной степени в лептомениксе и нервном стволе, слабая маляция и инфильтрация нейтрофильных гранулоцитов и умеренные фибринозные отложения.

У всех животных, за исключением одного контрольного кролика (0,9% хлорид натрия), была обнаружена геморрагия от слабой до умеренной степени в белом веществе, просвете центрального канала, сером веществе и/или подпаутинном пространстве. Все эти изменения рассматриваются как обусловленные механическим повреждением, вызванным внутриоболочечной инъекцией, и, следовательно, не связаны с веществом.

Таким образом, олигонуклеотид, определяемый последовательностью ID No 5, проявил прекрасную местную переносимость у кроликов после внутриоболочечного болюсного нанесения вплоть до концентрации 500 мкМ раствора олигонуклеотида.

Пример 2

Исследование локальной токсичности после внутриоболочечной болюсной инъекции яванскому макаку.

Для исследования безопасности и местной переносимости раствора антисмыслового олигонуклеотида с последовательностью ID No 5 у более высокоорганизованного животного внутриоболочечное болюсное нанесение, описанное в примере 1, было повторено на яванском макаке. Благодаря прекрасной местной переносимости 500 мкМ раствора указанного антисмыслового олигонуклеотида против мРНК TGF-бета2 исследовали только одну эту концентрацию.

Двух яванских макак обрабатывали 0,1 мл 500 мкМ раствором (0,9% хлорид натрия) олигонуклеотида, гибридизуемого с мРНК TGF-бета2, представленного в протоколе последовательностей как SEQ ID NO 5, путем однократной внутриоболочечной болюсной инъекции в подпаутинное пространство поясничной области. Местные реакции обследовали макроскопически через 2, 6 и 30 часов после введения и затем животных умерщвляли. Гистологически исследовали образцы ткани мозга (толщина приблизительно 5 мкм).

Не было отмечено каких-либо клинических признаков токсичности и макроскопически видимых изменений у обезьян. При гистопатологическом обследовании не было выявлено связанных с веществом гистоморфологических повреждений в подпаутинном пространстве поясничной области. Не наблюдалось изменений в сером и белом веществе спинного мозга. Не выявлялось каких-либо патологий в нервном стволе и нервных клетках. У обеих обезьян обнаруживалась слабая очаговая смешанная инфильтрация клеток лептоменикса, ассоциированная со слабой очаговой минерализацией в области воспаления. Изменения рассматриваются как обусловленные механическим повреждением, вызванным внутриоболочечной инъекцией, но не как связанные с веществом.

Таким образом, как это наблюдалось в экспериментах на кроликах, описанных в примере 1, указанный олигонуклеотид проявил и у обезьян прекрасную местную переносимость при нанесении в виде высококонцентрированного 500 мкМ раствора. Локальные токсические эффекты не наблюдались.

Пример 3

Исследование локальной токсичности после продолжительной внутримозговой инфузии у кроликов

Основываясь на прекрасной местной переносимости 500 мкМ раствора олигонуклеотида, описываемого SEQ ID NO 5, после внутриоболочечного болюсного нанесения у кроликов и обезьян, описанного в примерах 1 и 2, исследовали локальную токсичность долговременной непрерывной внутримозговой инфузии 500 мкМ раствора указанного олигонуклеотида кроликам на протяжении семи дней.

Восемь кроликов (2/пол/группа обработки) обрабатывали 500 мкМ раствором (0,9 хлорид натрия) антисмыслового олигонуклеотида против мРНК TGF-бета2, описываемого последовательностью, представленной SEQ ID NO 5, путем непрерывной инфузии в паренхиму головного мозга или 0,9% раствором хлорида натрия в качестве контроля соответственно. Инфузию производили при скорости потока 1 мкл/час на протяжении 7 дней с помощью имплантированной под кожу осмотической помпы. Клинические признаки и смертность проверяли и фиксировали ежедневно. Через 6 и 30 часов после окончания инфузии 1 животное/пол/группа умерщвляли. Образцы ткани мозга (толщина приблизительно 5 мкм) обследовали гистологически.

Ни у одного из кроликов не было отмечено клинических признаков токсичности или макроскопически наблюдаемых изменений.

В обеих группах, обработанной веществом и контрольной группе, были отмечены очаговая дегенерация и некроз нервной ткани с пролиферацией глиальных клеток, наличие однородного желто-зеленого вещества и темных нейронов, а также геморрагии от слабой до умеренной степени. Эти повреждения рассматриваются как связанные с процессом непрерывной инфузии и иммерсионной фиксацией и, следовательно, не связаны с веществом. Не было различий при умерщвлении через 6 и 30 часов после окончания нанесения.

Таким образом, внутримозговое нанесение 500 мкМ раствора указанного олигонуклеотида со скоростью 1 мкл/час хорошо переносилось кроликами.

Пример 4

Влияние концентрации олигонуклеотида при лечении больных злокачественной глиомой

Представленную здесь оценку производили для сравнения дозировок 40 мкМ и 80 мкМ специфичного в отношении TGF-бета2 олигонуклеотида у больных злокачественной глиомой, не поддающихся стандартному лечению (хирургическая операция, рентгенотерапия и лечение различными антинеопластическими веществами) или рецидивирующих после него.

Антисмысловой олигонуклеотид против мРНК TGF-бета2, определяемый SEQ ID NO 5, вводили с помощью катетера внутрь опухоли в центр опухолевого повреждения-мишени. Больных лечили 40 мкМ (4 больных) и 80 мкМ (13 больных) раствором указанного олигонуклеотида (0,9% хлорид натрия) при скорости потока 4 мкл/мин и 8 мкл/мин соответственно.

В таблице 1 представлено сравнение среднего показателя выживаемости больных и количество больных с полной ремиссией после лечения 40 мкМ и 80 мкМ раствором антисмыслового олигонуклеотида против мРНК TGF-бета2, определяемого в протоколе последовательностей SEQ ID NO 5.

Таблица 1
Доза	Количество больных	Выживание после начала AP 12009 (средний показатель, недели)	Количество больных с полной ремиссией
40 мкМ	4	9,6	0
80 мкМ	13	35,9	1

Больные, подвергнутые лечению раствором 40 мкМ, имели средний показатель выживания приблизительно 9,6 недель после начала лечения указанным олигонуклеотидом, тогда как больные, подвергнутые лечению раствором 80 мкМ, имели средний показатель выживания приблизительно 35,9 недель после начала лечения указанным олигонуклеотидом. Но только в группе больных, лечившихся раствором 80 мкМ, имелись больные с полной ремиссией.

Выбранные концентрации растворов олигонуклеотида, а также скорости потока были значительно ниже по сравнению с условиями, использованными в экспериментах на животных, описанных в примере 3, где не наблюдалось локальной токсичности раствора олигонуклеотида при 500 мкМ и скорости потока 1 мкл/мл.

Пример 5

Эффект растворов олигонуклеотида с низкой концентрацией при лечении больных злокачественной глиомой.

Представленную здесь оценку производили для сравнения дозировок с низкой концентрацией 2,5 мкМ и 10 мкМ специфичного в отношении TGF-бета2 олигонуклеотида у больных злокачественной глиомой, не поддающихся стандартному лечению (хирургическая операция, рентгенотерапия и лечение различными антинеопластическими веществами) или рецидивирующих после него.

Антисмысловой олигонуклеотид против мРНК TGF-бета2, определяемый SEQ ID NO 5, вводили с помощью катетера внутрь опухоли в центр опухолевого повреждения-мишени. Больных лечили 2,5 мкМ (3 больных) и 10 мкМ (4 больных) раствором указанного олигонуклеотида (0,9% хлорид натрия) при скорости потока 4 мкл/мин.

В таблице 2 представлено сравнение среднего показателя выживаемости больных и количество больных с полной ремиссией после лечения 2,5 мкМ и 10 мкМ раствором олигонуклеотида, гибридизующегося с мРНК TGF-бета2, определяемого в протоколе последовательностей SEQ ID NO 5.

Таблица 2
Доза	Количество больных	Выживание после начала AP 12009 (средний показатель, недели)	Количество больных с полной ремиссией
2,5 мкМ	3	52	0
10 мкМ	4	44	1

Неожиданно оказалось, что растворы указанного олигонуклеотида с низкой концентрацией вызывают высокий средний показатель выживаемости подвергнутых лечению больных при введении раствора со скоростью 4 мкл/мин. Больные, подвергнутые лечению раствором 2,5 мкМ, имели в среднем выживание приблизительно 52 недели после начала лечения указанным олигонуклеотидом. Больные, подвергнутые лечению раствором 10 мкМ, имели в среднем выживание приблизительно 44 недели после начала лечения указанным олигонуклеотидом. Однако лишь в группе, подвергнутой лечению раствором 10 мкМ, наблюдались больные с полной ремиссией.

Пример 6

Влияние концентрации олигонуклеотида при лечении больных анапластичной астроцитомой

Представленную здесь оценку производили для сравнения дозировок 2,5 мкМ, 10 мкМ и 80 мкМ специфичного в отношении TGF-бета2 олигонуклеотида у больных анапластичной астроцитомой, не поддающихся стандартному лечению (хирургическая операция, рентгенотерапия и лечение различными антинеопластическими веществами) или рецидивирующих после него.

Антисмысловой олигонуклеотид против мРНК TGF-бета2, определяемый в протоколе последовательностей SEQ ID NO 5, вводили с помощью катетера внутрь опухоли в центр опухолевого повреждения-мишени. Больных лечили 2,5 мкМ, 10 мкМ и 80 мкМ раствором указанного олигонуклеотида (0,9% хлорид натрия) при скорости потока 4 мкл/мин и 8 мкл/мин соответственно. Олигонуклеотид имеет молекулярную массу 6142,4 г/моль в виде натриевой соли и 7115,3 в виде гидрата натриевой соли. Таким образом, общее количество наносимого олигонуклеотида составляло приблизительно 344 мкг/день (натриевая соль) и 398 мкг/день (натриевая соль, включающая кристаллическую воду) соответственно.

Истории болезни:

Больного #1 с диагностированной анапластичной астроцитомой лечили 2,5 мкМ раствором (0,9% хлорид натрия) антисмыслового олигонуклеотида против мРНК TGF-бета2 с SEQ ID NO 5, наносимым непрерывным потоком со скоростью 4 мкл/мин в течение 4 дней (2 цикла) непосредственно в опухоль с помощью катетера. Больной #1 показал выживаемость приблизительно 146 недель после лечения, которая была неожиданно высокой по сравнению с выживаемостью при стандартной терапии темозоломидом, обеспечивающей средний показатель выживания приблизительно 42 недели (Theodosopoulos et al. 2001).

Больного #4 с диагностированной анапластичной астроцитомой (4 опухолевых повреждения/метастаза, включая два на противоположной стороне) лечили 10 мкМ раствором (0,9% хлорид натрия) антисмыслового олигонуклеотида против мРНК TGF-бета2 с SEQ ID NO 5, наносимым непрерывным потоком со скоростью 4 мкл/мин в течение 4 дней непосредственно в наибольшую опухоль с помощью катетера. Больного #17 с диагностированной анапластичной астроцитомой лечили 80 мкМ раствором (0,9% хлорид натрия) олигонуклеотида, гибридизуемого с мРНК TGF-бета2, определяемого в протоколе последовательностей SEQ ID NO 5, при скорости потока 8 мкл/мин.

Таблица 3
Номер больного	Количество циклов	Концентрация	Месяцы (от базального уровня*) максимального размера опухоли	Объем опухоли после 17 месяцев наблюдения
#4	1	10 мкМ	2,5	12 см3
#17	12	80 мкМ	9,7	27 см3

* Исходный уровень соответствует началу лечения фармацевтическим препаратом, включающим олигонуклеотид, определяемый в перечне последовательностей SEQ ID NO 5.

У больного #4, подвергнутого лечению фармацевтическим препаратом, включающим 10 мкМ олигонуклеотид, определяемый в протоколе последовательностей SEQ ID NO 5, а также у больного #17, подвергнутого лечению тем же фармацевтическим препаратом с 80 мкМ указанного олигонуклеотида, обнаружен почти такой же объем опухоли, что и исходный. У больного #4 максимальный размер опухоли приблизительно 58 см³ был достигнут через приблизительно 2,5 месяца, тогда как у больного #17 рост опухоли до максимума 66 см³ можно было наблюдать до приблизительно 9,7 месяцев.

После приблизительно 17 месяцев наблюдения объем опухоли у больного #4 уменьшился до приблизительно 12 см³, а опухоль у больного #17 имела еще приблизительно двойной объем (27 см³).

Кроме того, по сравнению с больным (#4), получавшим дозу 10 мкМ, с выявленной регрессией опухоли уже после лишь одного цикла нанесения, больному (#17), получавшему дозу 80 мкМ, потребовалось 12 циклов для достижения регрессии опухоли.

Пример 7

Влияние концентрации олигонуклеотида при лечении больных злокачественной глиомой нанесением со скоростью 4 мкл/мин

Представленную здесь оценку производили для сравнения дозировок 10 мкМ и 80 мкМ специфичного в отношении TGF-бета2 олигонуклеотида, наносимого со скоростью потока 4 мкл/мл у больных злокачественной глиомой, не поддающихся стандартному лечению (хирургическая операция, рентгенотерапия и лечение различными антинеопластическими веществами) или рецидивирующих после него.

Антисмысловой олигонуклеотид против мРНК TGF-бета2, определяемый SEQ ID NO 5, вводили непрерывной микроперфузией с высокой скоростью внутрь опухоли. Больных лечили 10 мкМ (9 больных) и 80 мкМ (10 больных) раствором олигонуклеотида (0,9% хлорид натрия) при скорости потока 4 мкл/мин в течение семи дней с последующим семидневным интервалом без лекарства (= один цикл). Больных лечили до 12 циклов.

Таблица 4
Доза	Количество больных	Количество больных со снижением размера опухоли	Больные с прогрессирующим заболеванием (%)	Отличие размера опухоли от исходного, последнее посещение (средний показатель, мм3)
10 мкМ	9	5	33,3%	-264
80 мкМ	10	2	50%	19940

В таблице 4 представлено сравнение снижения размера опухоли при исходном и последнем посещении, количество больных с прогрессирующим заболеванием и со снижением размера опухоли у больных со злокачественной глиомой, подвергнутых лечению 10 мкМ и 80 мкМ раствором антисмыслового олигонуклеотида против мРНК TGF-бета 2, определяемого SEQ ID NO 5, наносимого при скорости потока 4 мкл/мин.

В группе больных, подвергнутых лечению 10 мкМ раствором указанного олигонуклеотида, вводимым при скорости потока 4 мкл/мин, лишь у 33,3% больных обнаружена прогрессия заболевания по сравнению с 50% больных, подвергнутых лечению 80 мкМ раствором указанного полипептида при той же скорости потока. У пяти из девяти больных выявлено снижение размера опухоли в группе 10 мкМ по сравнению с лишь 2 из 10 больных в группе 10 мкМ. Разница в размере опухоли между исходной и выявленной при последнем посещении в группе 10 мкМ снизилась до -264 мм³ (средний показатель). Напротив, в группе, получавшей раствор 80 мкМ, выявлено увеличение размера опухоли до 19940 мм³ (средний показатель).

Пример 8

Влияние концентрации олигонуклеотида при лечении больных анапластичной астроцитомой

Представленную здесь оценку производили для сравнения дозировок 10 мкМ и 80 мкМ специфичного в отношении TGF-бета2 олигонуклеотида у больных анапластичной астроцитомой, не поддающихся стандартному лечению (хирургическая операция, рентгенотерапия и лечение различными антинеопластическими веществами) или рецидивирующих после него. Больных отбирали, как описано в примере 2.

Антисмысловой олигонуклеотид против мРНК TGF-бета2, определяемый SEQ ID NO 5, вводили внутрь опухоли в виде непрерывной микроперфузии с высокой скоростью. Больных лечили 10 мкМ (11 больных) и 80 мкМ (11 больных) раствором (0,9% хлорид натрия) указанного олигонуклеотида при скорости потока 4 мкл/мин в течение семи дней с последующим семидневным интервалом без лекарства (= один цикл). Больных лечили до 12 циклами.

Количество больных анапластичной астроцитомой с симптомами, обусловленными прогрессией заболевания (стадия Aes с 1 по 4 и SAE) в группе больных, подвергнутых лечению 10 мкМ раствором указанного олигонуклеотида, была неожиданно низкой по сравнению с больными, получавшими инфузию 80 мкМ раствора, как показано на фиг.1. Лишь один больной из одиннадцати в группе 10 мкМ пострадал по сравнению с девятью из одиннадцати больных в группе 80 мкМ. В группе 10 мкМ наблюдались симптомы лишь 3 стадии. В группе 80 мкМ 6 из 9 симптомов были классифицированы/определены как SAEs (тяжелые неблагоприятные случаи).

Пример 9

Совместимость скорости потока при лечении больных злокачественной глиомой

Антисмысловой олигонуклеотид против мРНК TGF-бета2, определяемый в перечне последовательностей SEQ ID NO 5, вводили в виде непрерывной микроперфузии с высокой скоростью внутрь опухоли. Больных лечили 10 мкМ раствором указанного олигонуклеотида при скорости потока 4 мкл/мин и 40 мкл/мин при введении 5,75 мл и 57 мл за 24 часа соответственно. Обе скорости потока хорошо переносились, что свидетельствует о безопасности введения больным 10 мкМ раствора со скоростью до 40 мкл/мин.

Пример 10

Влияние концентрации олигонуклеотида при лечении больных злокачественной глиомой

Представленную здесь оценку производили для тестирования дозировки 10 мкМ специфичного в отношении TGF-бета2 олигонуклеотида у больных анапластичной астроцитомой, не поддающихся стандартному лечению (хирургическая операция, рентгенотерапия и лечение различными антинеопластическими веществами) или рецидивирующих после него.

Антисмысловой олигонуклеотид против мРНК TGF-бета2, определяемый SEQ ID NO 5, вводили внутрь опухоли в виде непрерывной микроперфузии с высокой скоростью. Больных лечили 10 мкМ раствором олигонуклеотида (0,9% хлорид натрия) при скорости потока 4 мкл/мин в течение семи дней с последующим семидневным интервалом без лекарства (= один цикл). Больных лечили до 12 циклами.

На фиг.2 показано снижение размера опухоли у трех больных анапластичной астроцитомой, которых подвергали лечению 10 мкМ раствором указанного олигонуклеотида, наносимого со скоростью 4 мкл/мин. У больного #409 (фиг.2A) выявлено снижение размера опухоли с приблизительно 19 см³ до приблизительно 7 см³ после пяти месяцев лечения. Опухоль у больного #412 (фиг.2B) уменьшилась с приблизительно 39 см³ до приблизительно 26 см ³ после только двух месяцев лечения 10 мкМ раствором указанного олигонуклеотида. Размер опухоли у больного #413 (фиг.2C) снизился с приблизительно 19 см³ до приблизительно 11 см ³ после лечения 10 мкМ раствором указанного олигонуклеотида.

В отличие от этого у больного #17 (фиг.2D), подвергнутого лечению указанным олигонуклеотидом с концентрацией 80 мкМ при скорости потока 8 мкл/мин, обнаружено увеличение роста опухоли в течение первых 5 месяцев от приблизительно 8 см³ до приблизительно 18 см³.

Пример 11

Данные о выживании больных с анапластичной астроцитомой

Было проведено многонациональное рандомизированное клиническое испытание фазы II с активным контролем. Отобранные больные характеризовались AA, WHO стадии III, не поддающимися стандартному лечению (хирургическая операция, рентгено- и химиотерапия) или рецидивирующих после него и не подлежащими дополнительному удалению опухоли. Больные не получали противоопухолевой терапии в течение 10 дней до начала исследования (средний показатель: 42 дня, диапазон от 10 до 295 дней до начала лечения олигонуклеотидом). Показатель состояния Карнофски (KPS) составлял по меньшей мере 70%. Больные с клинически значимыми острыми инфекциями, существенными сердечно-сосудистыми патологиями или плохо контролируемыми приступами, а также беременные и кормящие женщины были исключены.

Каждому больному имплантировали катетер и перфорированную часть катетера помещали в твердую, контрастно усиливаемую область опухолевого повреждения. Катетер вставляли с помощью стандартной трубки с отверстием в наибольшее из имеющихся опухолевое повреждение.

Систему ввода имплантировали в подкожный мешочек передней грудной стенки. Вводящий катетер располагали подкожно и соединяли с опухолевым катетером и выходом наружной помпы.

Олигонуклеотид с SEQ ID NO 5, растворенный в 0,9% растворе хлорида натрия, инфузировали посредством помпы через вход в опухоль при непрерывном потоке. В течение семидневного интервала между двумя циклами лечения олигонуклеотидом производили инфузию изотонического физиологического раствора со скоростью 1 мкл/мин. В ходе испытания большинство больных получало профилактические антибиотики перед операцией, но не профилактические стероиды. Олигонуклеотид вводили внутрь опухоли в виде непрерывной микроперфузии с высокой скоростью с помощью устройств наружной помпы, PEGASUS® Vario (PEGASUS GmbH, Kiel). Катетер и систему нанесения удаляли в конце всего периода инфузии. Для оценки безопасности за больным наблюдали в течение 28 дней. Исследователи продолжали сбор данных о выживаемости.

Были оценены данные по выживаемости 38 больных, из которых 12 больных лечили 10 мкМ раствором олигонуклеотида, 14 больных лечили 80 мкМ и 12 больных контрольной группы получали стандартную химиотерапию темозоломидом или PCV (химиотерапевтический режим, состоящий из прокарбазина, CCNU и винкристина, см. ниже подробнее).

В группе 10 мкМ 83,3% больных имели возраст менее 55 лет, в группе 80 мкМ - 87,5%, и в контрольной группе - 91,7%. Поскольку, как известно, возраст является прогностическим фактором, влияющим на исход для больного, контрольная группа с более 90% более молодых больных имела больший шанс на выживание по сравнению с группами, подвергнутыми лечению олигонуклеотидом, особенно группой с 10 мкМ концентрацией олигонуклеотида. Несмотря на эту исходно худшую ситуацию, группа с олигонуклеотидом SEQ ID NO 5 имела значительно более высокий шанс выживания по сравнению с таковым в контрольной группе или в группе с 80 мкМ концентрацией олигонуклеотида. После выравнивания по возрасту (ковариационный анализ) это различие становилось даже еще более значительным.

Известно также, что характеристика состояния Карнофски (KPS) является прогностическим фактором. В контрольную группу было включено значительно больше больных с более высоким (= лучшим) KPS: KPS >80, в группе AP10 66,6%, в группе AP80 71,4%, и в контрольной группе 83,3%. Распределение по полу также было различным. В группе 10 мкМ олигонуклеотида было 50% мужчин, в группе 80 мкМ олигонуклеотида было 92,9% мужчин, а в контрольной группе было 50% мужчин. Пол, по-видимому, не влияет на шанс выживания, поэтому не требовалось выравнивания по этому параметру.

Результаты испытания представлены в таблице 5 и на фиг.6.

Типичный стандартный цикл PCV состоит из 29-дневного периода лечения, сопровождаемого 4-недельным периодом без лечения. Во время 29-дневного периода лечения CCNU, винкристин и прокарбазин вводили в соответствии со схемой, представленной ниже (Levin et al 1990):

День 1	110 мг/м2 CCNU перорально
Дни 8 и 29	1,4 мг/м 2 (2 мг/м2 максимально) в день винкристина внутривенно
Дни с 8 по 21	60 мг/м2 в день прокарбазина перорально

Таблица 5
	10 мкМ против 80 мкМ	10 мкМ против контроля	80 мкМ против контроля
HR	3,4	1,7	0,9
HR (возраст)*	3,8	1,8	0,9

*Отношение риска с «возрастом» в качестве ковариата.

Отношение риска (HR) позволяет сравнивать шанс на выживание в двух группах в любой момент времени. Поскольку на исход (выживание) оказывает значительное влияние исходная разница в возрасте, эту разницу следует учитывать путем применения ковариантного анализа, который выравнивает результаты по этой исходной разнице. Выровненное по возрасту отношение риска (HR(возраст)), равное 1,8 для 10 мкМ против контроля, означает, что шанс на выживание для каждого отдельного больного в 1,8 раз выше при получении SEQ ID NO 5 в концентрации 10 мкМ по сравнению с больным, получавшим стандартную химиотерапию (т.е. темозоломид или PCV = химиотерапевтический режим, состоящий из прокарбазина, CCNU и винкристина). Для больных, получающих SEQ ID NO 5 в концентрации 10 мкМ, шанс на выживание в 3,8 раза выше по сравнению с больными, получающими данный олигонуклеотид в концентрации 80 мкМ.

Пример 12

Сравнение влияния разных концентраций олигонуклеотида на секрецию TGF-бета2 в линии клеток A-172

Культура клеток: Была создана линия клеток A-172 глиобластомы человека (регистрационный № CRL-1620) от 53-летнего мужчины с глиобластомой.

Опухолевые клетки A-172 культивировали в среде DMEM с 4,5 г/л глюкозой и 10% (об./об.) FCS при 37°С, 5% CO₂ и 95% относительной влажности в соответствии с инструкциями Cell Line Service. Для исследования подавления TGF-бета2 40000 клеток A-172/лунку высевали в 12-луночные планшеты для культуры ткани. Через шесть часов после высева супернатанты удаляли и заменяли раствором для обработки, состоящим из среды культивирования клеток, содержащей 5 мкМ, 10 мкМ или 80 мкМ антисмыслового олигонуклеотида, определяемого SEQ ID NO 5. Среду отрицательного контроля (= необработанных клеток) заменяли без добавления SEQ ID NO 5. Замену повторяли через 2 и 4 дня. На 7 день супернатанты собирали и анализировали на предмет секреции TGF-бета2 с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

Способы: TGF-бета2 количественно определяли с помощью стандартного набора для ИФА TGF-бета2 в соответствии с инструкциями производителя. Супернатанты осветляли удалением клеточных компонентов центрифугированием (850 g, 5 мин). Анализ TGF-бета2 проводили с помощью планшетного ридера Multiscan Ascent Type 354200-240V с применением логистической модели с 4 параметрами.

Результаты: Линию клеток A-172 глиобластомы человека тестировали в ряде экспериментов по секреции TGF-бета2 для оценки влияния различных концентраций антисмыслового олигонуклеотида, определяемого SEQ ID NO 5. Клетки A-172 продуцируют TGF-бета2 в условиях клеточной культуры. Были выбраны продолжительность обработки клеток (7 дней), а также три разные концентрации (5 мкМ, 10 мкМ и 80 мкМ) SEQ ID NO 5.

Было обнаружено, что 10 мкМ олигонуклеотида, определяемого SEQ ID NO 5, являются наилучшим ингибитором экспрессии TGF-бета2 по сравнению с 5 и 80 мкМ данного олигонуклеотида.

Ссылки