способ получения амидов креатина

Формула изобретения

1. Способ получения амидов креатина в виде солей, заключающийся в обработке креатина пара-толуолсульфокислотой в органическом растворителе с последующим взаимодействием полученного комплекса со сложноэфирными или амидными производными алифатических или ароматических аминокислот, содержащими первичную или вторичную аминогруппу, в присутствии последовательно вводимых конденсирующего агента и основания.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве креатина используют безводный креатин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве креатина используют креатин моногидрат.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве конденсирующего агента используют производные карбодиимида.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве конденсирующего агента используют изобутилхлорформиат.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве основания используют производные морфолина.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку пара-толуолсульфокислотой осуществляют, как минимум, в эквимолярном по отношению к креатину количестве.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к способам получения биологически активных веществ (БАВ), в частности амидов креатина.

Креатин (Кр) является эндогенным питательным веществом, присутствующим в различных тканях млекопитающих, например в печени, почках, мышечной ткани, ткани головного мозга, крови, находится как в свободном состоянии, так и в форме креатинфосфата. Креатин рассматривается в качестве средства, улучшающего энергетический тканевый метаболизм - повышающего энергетический резерв АТФ, прежде всего, в мышечных и нервных клетках.

Креатинфосфат (КрФ) поддерживает уровень АТФ при увеличении затрат энергии в клетке, т.е. участвует в физиологическом процессе фосфорилирования АДФ с образованием АТФ. Наряду с гликогеном, КрФ является одним из основных источников цикла превращений высокоэнергетичных фосфатов и, таким образом, участвует в окислительном фосфорилировании глюкозы, что обеспечивает выделение энергии, необходимой для функционирования клеток мышечной ткани, включая скелетные мышцы и сердечную мышцу. В связи с тем, что креатинфосфат способен обеспечивать биосинтез АТФ, увеличение количества креатина в мышцах увеличивает также и мышечные запасы креатинфосфата, улучшает тканевый энергетический метаболизм, улучшает работоспособность (выносливость) мышц, увеличивает мышечную массу.

Креатинфосфат и креатин являются также и аллостерическими регуляторами клеточных процессов (N.Brustovetsky et al., J. of Neurochemistry, 2001, 76, 425-434). Так, прием от 20 до 30 г моногидрата креатина в сутки в течение нескольких дней приводит к повышению более чем на 20% общего содержания креатина в скелетных мышцах человека. Данные свойства привлекают особое внимание в связи с возможностью использования креатина в качестве пищевой добавки для укрепления организма и повышения работоспособности, особенно - в качестве добавки к рациону спортсменов. Так, применение креатина моногидрата в суточной дозе 15 г в течение, по крайней мере, 2 дней, используется для повышения мышечной силы (WO 94/02127, 1994).

Креатин и креатинфосфат находят достаточно широкое применение в медицине. Так, креатин, креатинфосфат и циклокреатин (US 6706764, 2004) рекомендованы для лечения заболеваний нервной системы, таких как диабетические и токсические невропатии, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, инсульт и т.п., таких нарушений метаболизма, как гипергликемиия и сахарный диабет (US 6193973, 2001). Пероральное применение креатина описано для лечения сердечной и дыхательной недостаточности (WO/EP97/06225, 1999), астмы (US 6093746, 2000). Показано применение креатинфосфата для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, перспективность для лечения новообразований (US 5219846, 1993). Вместе с тем применение креатина и креатинфосфата ограничено плохой растворимостью и нестабильностью в водных средах при физиологических значениях pH (RU 2295261, 2007).

Более того, креатин плохо абсорбируется из желудочно-кишечного тракта - степень абсорбции составляет 1-14%. Это вызывает необходимость применения высоких доз креатина. Для того чтобы употребление креатина было эффективным, композиции, производимые в настоящее время, принимаются в количестве до 20 г в сутки. Вместе с тем наряду с повышением стоимости терапии введение высоких доз креатина может приводить к негативным последствиям для организма - нарушение азотного обмена, желудочно-кишечные расстройства, диарея и т.п.

В этой связи большой интерес представляет получение производных креатина, обладающих большей стабильностью или более высокой биологической активностью, что позволит, с одной стороны, снизить дозу применяемого вещества, а с другой стороны - обнаружить новые области применения. При этом наибольший интерес вызвали производные креатина и различных органических кислот. Так, известно использование пируватов креатина (US 6166249, 2000; RU 2114823, 1998) для повышения работоспособности, снижения веса тела, адаптации к условиям кислородной недостаточности при ишемии, в качестве пищевой добавки, для защиты кожи от старения и воздействия солнечных лучей (US 7186754, 2007) при лечении женских половых расстройств, в частности дисменореи (US 6503951, 2000).

Производные креатина и малоновой, малеиновой, фумаровой, оротовой кислот и таурина (CN 10/249338, 2003; US 6861554, 2005; US 6166249, 2000; CA 10/740263, 2003) показаны для лечебного питания как пищевые добавки; креатина цитрат (US 2004/077719, 2004) рекомендован в качестве ноотропного средства.

Одними из наиболее перспективных производных креатина являются синтезированные и исследованные авторами амиды креатина общей формулы: NH=C(NH₂)-N(CH₃)-CH ₂-CO-NH-R*X, где R - аминокислотный остаток или замещенный аминокислотный остаток; Х - органическая или минеральная кислота или вода (RU 2354645, 2009).

Как было установлено в ходе биологических экспериментов, синтезированные амиды креатина по сравнению с известными аналогами обладали повышенной растворимостью и стабильностью в водных растворах, что позволяет более широко использовать их в качестве источника креатина в организме.

Способ получения подобных амидов креатина, являющийся наиболее близким по достигаемому эффекту к заявляемому, состоит во взаимодействии свободных или защищенных гуанидилирующих агентов с амидами саркозина в полярных органических растворителях при температуре не более 50°С. На основе амидов саркозина возможно получение иных производных аминокислот с использованием стандартных химических реакций, описанных в литературе (А.А.Гершкович, В.К.Кибирев «Синтез пептидов. Реагенты и методы». Киев: «Наукова думка», 1987).

Недостатками данного способа являются его многостадийность, связанная с необходимостью предварительного получения амидов саркозина, недостаточно высокий выход целевого продукта, который, в частности, для креатинил-глицин бензилового эфира гидрохлорида, составляет около 5%.

Задачей, решаемой авторами, являлось создание более простой и эффективной технологии получения амидов креатина с более высоким выходом.

Техническая задача решалась путем перевода креатина (Кр) в комплекс, растворимый в органических растворителях, в результате его обработки пара-толуолсульфокислотой (n-ТСК) до полного растворения Кр, с последующим взаимодействием данного комплекса с производными аминокислот, содержащими первичную или вторичную аминогруппу, в частности с эфирными или амидными производными алифатических или ароматических аминокислот, в присутствии последовательно вводимых конденсирующего агентов и основания.

В качестве Кр используют безводный креатин или более дешевый креатин моногидрат.

В качестве конденсирующего агента могут быть использованы карбодиимиды, в частности дициклогексилкарбодиимид, N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, диизоиропилкарбодиимид или хлорангидриды моноэфиров угольной кислоты, в частности этилхлорформиат, изо-бутилхлорформиат, а в качестве основания, связывающего выделяющуюся соляную кислоту, основания, растворимые в органических растворителях, в частности - третичные амины, например N-морфолин, триэтиламин, диизопропиламин и пр.

Введение n-ТСК осуществляют, как минимум, в эквимолярном по отношению к креатину количестве.

В результате обработки Кр n-ТСК одновременно решается проблема перевода креатина в раствор и защита гуанидиновой группы креатина путем образования комплекса, что затрудняет превращение креатина в креатинин в результате внутримолекулярной циклизации.

В качестве органических растворителей могут быть использованы диметилформамид, диметилацетамид, диметилсульфоксид, N-метилпирролидон и т.п., обеспечивающие полное растворение комплекса креатина и n-ТСК.

Введение в раствор производных аминокислот и конденсирующего агента осуществляют после растворения комплекса креатина и n-ТСК, а введение основания - через 10-15 мин после начала реакции и установления реакционного равновесия для сдвига последнего в заданном направлении. Использование в качестве конденсирующего агента хлорангидридов моноэфиров угольной кислоты, в частности изо-бутилхлорформиата или этилхлорформиата, а в качестве карбодиимидов - дициклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида, предпочтительно, т.к. при этом снижается количество посторонних примесей и упрощается технология выделения целевого продукта.

Полученную в ходе процесса реакционную смесь очищают, как правило, с использованием ионообменных смол с последующей перекристаллизацией целевого продукта, выход которого достигает 20% с чистотой, по данным ВЭЖХ анализа, более 90%. Основная примесь при синтезе - креатинин, содержание которого в целевом продукте, как правило, не превышает 1.5%.

Амиды креатина, полученные в ходе осуществления заявляемого способа, могут быть в дальнейшем модифицированы с использованием стандартных технологий органического синтеза.

Контроль за ходом реакции, а также оценка чистоты конечных и промежуточных продуктов проводится методом ОФ ВЭЖХ на хроматографе Alliance (Waters), колонки Zorbax ODS, 3.5 мкм, 3×100 мм, (Agilent Technologies). Для элюирования используют смесь буферного раствора, содержащего 0.01 М натрия октансульфоната и 0.02 М натрия дигидрофосфата, с ацетонитрилом. Детектирование проводится методом УФ-спектроскопии, при длине волны 210 нм. Содержание основного вещества в амидах креатина определяют методом неводного титрования раствором хлорной кислоты в ледяной уксусной кислоте в присутствии индикатора - кристаллического фиолетового.

Определение молекулярной массы амидов креатина проводится масс-спектрометрическим методом на времяпролетном масс-рефлектроне МХ-5303 с источником ионов типа "Электроспрей" (ФИНЭПХФ РАН).

Сущность и преимущества заявляемого способа иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Получение креатинилглицин изо-пропилового эфира ацетата.

В одногорлую круглодонную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 5.67 г (38 мМ) креатин моногидрата в 40 мл диметилформамида и при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 7.23 г (38 мМ) моногидрата n-толуолсульфокислоты. Приблизительно через 5 мин креатин моногидрат полностью растворяется. Затем прибавляют 6.71 г (40 мМ) гидрохлорида изопропилового эфира глицина и после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)10°С на водно-соляной бане. Далее вносят 5.24 мл (38 мМ) изо-бутилхлорформиата, и в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 8.9 мл (81 мМ) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают 1 час на ледяной бане, затем постепенно доводят температуру до комнатной. Через 10 ч отфильтровывают выпавший осадок гидрохлорида N-метилморфолина, упаривают раствор в вакууме при температуре 50°С. Маслообразный остаток растворяют в 160 мл хлороформа и оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой (3×100 мл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, 2 раза экстрагируют хлороформом, водный раствор упаривают в вакууме до объема 50 мл. Полученный раствор пропускают через колонку размером 30×250 мм, заполненную сорбентом Dowex 1×8 в ацетатной форме, в воде. Элюент - вода, скорость элюирования - 2 мл/мин. Колонку промывают водой, контролируя pH элюата. Фракции с рН=7 (pH воды = 5) собирают, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, прибавляют уксусную кислоту и упаривают. Остаток кристаллизуют из 20 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок ацетата изо-пропилового эфира креатинилглицина отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Полученный продукт растворяют в 30 мл этилового спирта, выдерживают 20 ч при температуре (-)10°С, раствор отфильтровывают, этиловый спирт удаляют в вакууме, остаток кристаллизуют из диэтилового эфира.

Выход C₉H₁₈N ₄O₃·C₂H₄O₂ - креатинилглицин изо-пропилового эфира ацетата - 2.3 г (21%). Масс-спектр, найдено: m/z: 290.29. Вычислено: М 290.32. Содержание креатинилглицина изо-пропилового эфира ацетата по данным неводного титрования - 97.7 мас.%, содержание примеси креатинина - 1.5 мас.%.

Пример 2. Получение креатинилглицилглицин этилового эфира ацетата.

В одногорлую круглодонную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 4.77 г (32 мМ) креатина моногидрата в 40 мл N-метилпирролидона, при перемешивании прибавляют 5.02 г (35 мМ) безводной n-толуолсульфокислоты - приблизительно через 5 мин креатин полностью растворяется. Затем прибавляют 4.33 г (22 мМ) гидрохлорида этилового эфира диглицина и после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)10°С на водно-соляной бане. Далее вносят 4.51 мл (33 мМ) изо-бутилхлорформиата и в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 5.1 мл (54 мМ) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают 1 ч на ледяной бане, затем температуру постепенно доводят до комнатной. Через 10 ч отфильтровывают выпавший осадок гидрохлорида N-метилморфолина и упаривают растворитель в вакууме при 50°С. Маслообразный остаток растворяют в 100 мл хлороформа и оставляют на 10 ч в холодильнике при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают и экстрагируют водой (3×100 мл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, два раза экстрагируют хлороформом и упаривают в вакууме до объема 50 мл.

Выделение целевого продукта осуществляют по методике, описанной в примере 1. Выход С₁₀Н ₁₉N₆О₄·C₂H₄ O₂ - 1.05 г (14.6%). Масс-спектр, найдено: m/z: 333.29. Вычислено: М 333.29. Содержание креатинилглицилглицин изо-пропилового эфира ацетата по данным неводного титрования - 98.5 мас.%, содержание примеси креатинина - 1.3 мас.%.

Пример 3. Получение креатинилглицин метилового эфира гидрохлорида.

В одногорлую круглодонную колбу на 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 2.98 г (20 мМ) креатина моногидрата в 20 мл диметилацетамида, при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 3.99 г (21 мМ) моногидрата n-толуолсульфокислоты - приблизительно через 5 мин осадок полностью растворяется. Затем прибавляют 2.64 г (21 мМ) гидрохлорида метилового эфира глицина и после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)10°С на водно-соляной бане. Далее вносят 2.8 мл (20 мМ) изо-бутилхлорформиата и в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 4.4 мл (40 мМ) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают 1 ч на ледяной бане, затем температуру постепенно доводят до комнатной. Через 7 час отфильтровывают выпавший осадок гидрохлорида N-метилморфолина, осаждают продукт гексаном, отделяют маслообразный осадок. Осадок растворяют в 80 мл хлороформа и оставляют на 10 ч в холодильнике при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают и экстрагируют водой (3×100 мл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, экстрагируют хлороформом (2×80 мл) и упаривают в вакууме до объема 50 мл. Очистку целевого продукта проводят в условиях примера 1, за исключением того, что фракции с pH=7 (pH воды = 5).собирают, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, прибавляют соляную кислоту и упаривают.

Выход C₇ H₁₄N₄O₃·HCl - 1.52 г (30%). Масс-спектр, найдено: m/z: 238.65 Вычислено: М 238.67. Содержание креатинилглицин метилового эфира гидрохлорида по данным неводного титрования - 98.3 мас.%, содержание примеси креатинина - 1.5 мас.%.

Пример 4. Получение креатинилглицин этиламида тартрата из безводного креатина.

В одногорлую круглодонную колбу на 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 2.62 г (20 мМ) креатина в 20 мл диметилформамида и при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 3.83 г (20.11 мМ) моногидрата n-толуолсульфокислоты - приблизительно через 10 мин осадок полностью растворяется. Затем прибавляют 4.77 г (22 мМ) трифторацетата этиламида глицина и после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)10°С на водно-соляной бане. Далее вносят 2.8 мл (20 мМ) изо-бутилхлорформиата и в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 4.7 мл (43 мМ) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают 1 час на ледяной бане, затем температуру постепенно доводят до комнатной. Через 20 ч выпавший осадок отфильтровывают, растворитель упаривают в вакууме при 50°С. Маслообразный остаток растворяют в 80 мл хлороформа и оставляют на 20 ч в холодильнике при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой (3×100 мл), объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, экстрагируют хлороформом (2×80 мл) и упаривают в вакууме до объема 50 мл. Полученный продукт выделяют по способу, приведенному в примере 1, за исключением того, что используют заполненную сорбентом Dowex 1×8 в тартратной форме. Фракции, содержащие целевой продукт, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, упаривают.

Выход [C₈H₁₇N ₅O₂]₂·C₄H₆ O₆ - 3.7 г (32%). Масс-спектр, найдено: m/z: 583.62. Вычислено: М 583.61. Содержание основного вещества - креатинилглицин этиламида тартрата - по данным неводного титрования - 98.9 мас.%, содержание примеси креатинина - 0.7 мас.%.

Пример 5. Получение N -карбобензокси-N -креатиниллизин этилового эфира диацетата.

В одногорлую круглодонную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 3 г (20.5 мМ) креатина моногидрата в 40 мл диметилформамида и при перемешивании прибавляют 3.81 г (20.5 мМ) моногидрата n-толуолсульфокислоты. Затем через 10 мин прибавляют 7 г (20.5 мМ) гидрохлорида этилового эфира -карбобензокси-L-лизина, после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)10°С на водно-соляной бане. Далее вносят 2.8 мл (20.5 мМ) изо-бутилхлорформиата и в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 4.4 мл (20.5 мМ) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают 1 час на ледяной бане, затем температуру постепенно доводят до комнатной. Через 10 час суспензию фильтруют, упаривают растворитель в вакууме при температуре 50°С. Маслообразный остаток растворяют в 150 мл н-бутанола, 4 раза промывают 5% раствором NaHCO₃ , 2 раза - водой. Далее н-бутанол упаривают, к остатку прибавляют 30 мл воды и наносят полученную суспензию на колонку с сорбентом YMC*Gel ODS 22.5×150, уравновешенным в 0.2% уксусной кислоте, колонку промывают 0.2% раствором уксусной кислоты, далее элюируют в режиме линейного градиента до 10% изо-пропилового спирта в 0.2% растворе уксусной кислоты. Фракции анализируют с помощью качественных реакций и ВЭЖХ; объединяют, упаривают. Остаток кристаллизуют из 5 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают в вакууме.

Выход C₂₀H₃₁N₅O ₅·C₂H₄O₂ - N -карбобензокси-N -креатиниллизин этилового эфира ацетата - 1.5 г (18%). Масс-спектр, найдено: m/z: 481.77. Вычислено: М 481.77. Содержание основного вещества - N -карбобензокси-N -креатиниллизин этилового эфира ацетата - по данным неводного титрования - 98.9 мас.%, содержание примеси креатинина - 1.0 мас.%.

1.0 г полученного N -карбобензокси-N -креатиниллизин этилового эфира ацетата растворяют в 10 мл метанола и гидрируют над Pd чернью в течение 3 ч. Полноту удаления карбобензоксигруппы контролируют с помощью ТСХ в системе ацетонитрил: вода: уксусная кислота 6:1:1. Катализатор отфильтровывают, к фильтрату добавляют 1 мл уксусной кислоты и упаривают. Остаток кристаллизуют из 10 мл ацетонитрила. Продукт отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, эфиром и высушивают в вакууме.

Выход C₁₀H₂₁N₅O ₃·2C₂H₄O₂ - N -креатиниллизин этилового эфира диацетата - 0.4 г (84%). Масс-спектр, найдено: m/z: 379.41. Вычислено: М 379.41. Содержание основного вещества - N -креатиниллизин этилового эфира диацетата - по данным неводного титрования - 99.2 мас.%, содержание примеси креатинина - 0.5 мас.%.

Пример 6. Получение креатинилфенилаланин этиламида гидрохлорида из безводного креатина.

В одногорлую круглодонную колбу на 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 2.62 г (20 мМ) креатина в 20 мл диметилсульфоксида, при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 3.83 г (20.11 мМ) моногидрата n-толуолсульфокислоты - приблизительно через 10 мин осадок полностью растворяется. Затем прибавляют 6.71 г (20 мМ) трифторацетата этиламида фенилаланина, после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)10°С на водно-соляной бане. Далее вносят 2.8 мл (20 мМ) изо-бутилхлорформиата, в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 4.65 мл (43 мМ) морфолина. Реакционную смесь перемешивают 1 час на ледяной бане, затем температуру постепенно доводят до комнатной. Через 20 час выпавший осадок отфильтровывают, растворитель упаривают в вакууме при 50°С. Маслообразный остаток растворяют в 80 мл хлороформа и оставляют на 20 час при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой (3×100 мл), объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, экстрагируют хлороформом (2×80 мл) и упаривают в вакууме до объема 50 мл. Полученный продукт выделяют по способу, приведенному в примере 1, за исключением того, что фракции с pH=7 (pH воды = 5) собирают, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, прибавляют 1 М раствора соляной кислоты и упаривают.

Выход C₁₅ H₂₃N₅O₂·HCl - креатинилфенилаланин этиламида гидрохлорида - 3.7 г (32%). Масс-спектр, найдено: m/z: 341.87. Вычислено: М 341.84. Содержание основного вещества - креатинилфенилаланин этиламида гидрохлорида по данным неводного титрования - 99.3 мас.%, содержание примеси креатинина - 0.5 мас.%.

Пример 7. Получение креатинилглицилаланин этилового эфира гемисукцината.

В одногорлую круглодонную колбу объемом 100 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 2 г (13.4 мМ) креатина моногидрата в 10 мл диметилформамида, и при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 2.54 г (13.4 мМ) моногидрата n-толуолсульфокислоты и далее - 1.41 г (6.7 мМ) гидрохлорида этилового эфира глицилаланина, 1.38 г (6.7 мМ) дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диметилформамида. Затем в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 1.14 мл (6.7 мМ) диизопропилэтиламина. Реакционную смесь оставляют на 20 ч при комнатной температуре, отфильтровывают осадок гидрохлоридов диизопропилэтиламина и дициклогексилмочевины, маточник упаривают при температуре 50°С. Маслообразный остаток растворяют в 100 мл хлороформа и экстрагируют водой (3×100 мл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, дважды экстрагируют хлороформом и упаривают на роторном испарителе до объема 20 мл.

Полученный раствор пропускают через колонку 30×150 мм, заполненную Dowex 2×8 в сукцинатной форме, элюируют водой. Скорость элюирования - 2 мл/мин. Колонку промывают водой, контролируя pH элюата. Фракции с pH=6÷7 собирают, объединяют, упаривают. Остаток кристаллизуют из 10 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С, в течение 5 часов. Осадок креатинилглицилаланин этилового эфира гемисукцината отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают. Выход неочищенного продукта - 1.8 г.

Продукт растворяют в 15 мл этилового спирта, выдерживают 10 ч при температуре (-)10°С, раствор фильтруют. Маточник упаривают, остаток растворяют в 5 мл воды и наносят на колонку с YMC*Gel ODS 22.5×150, уравновешенную в 0.05% янтарной кислоте в воде. Элюируют 0.02% янтарной кислотой, фракции анализируют с помощью ВЭЖХ. Объединяют фракции, содержащие целевой продукт с чистотой не менее 95%, упаривают.

Остаток высушивают отгонкой с изо-пропиловым спиртом и кристаллизуют из диэтилового эфира.

Выход C₁₁H ₂₁N₅O₄*0.5C₄H₆ O₄ - креатинилглицилаланин этилового эфира гемисукцината - 0.56 г (24%). Масс-спектр, найдено: m/z: 346.33. Вычислено: М 346.36. Содержание основного вещества креатинилглицилаланин этилового эфира гемисукцината по данным неводного титрования - 99.4 мас.%, содержание примеси креатинина по данным ВЭЖХ - 0.8 мас.%.

Пример 8. Получение креатинил- -аминомасляной кислоты этилового эфира ацетата.

В одногорлую круглодонную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 4.20 г (32 мМ) креатина в 40 мл диметилформамида, при перемешивании прибавляют 5.02 г (35 мМ) n-толуолсульфокислоты, 5.36 г (32 мМ) -аминомасляной кислоты этилового эфира гидрохлорида, после его растворения охлаждают реакционную смесь до температуры (-)10°С на водно-соляной бане. Далее вносят 3.2 мл (33 мМ) этилхлорформиата, в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 5.1 мл (54 мМ) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивают 1 ч на ледяной бане, затем температуру постепенно доводят до комнатной. Через 10 час отфильтровывают осадок гидрохлорида N-метилморфолина, маточник упаривают в вакууме при 50°С. Остаток перекристаллизовывают из изо-пропилового спирта, очищают с помощью ионообменной хроматографии на колонке, заполненной Сефадексом SE C25, в пиридин-ацетатном буфере. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, упаривают.

Выход C₁₀H₂₀N₄O ₃*C₂H₄O₂ - креатинил- -аминомасляной кислоты этилового эфира ацетата - 1.95 г (25.0%). Масс-спектр, найдено: m/z: 304.34. Вычислено: М 304.35. Содержание основного вещества - креатинил- -аминомасляной кислоты этилового эфира ацетата по данным неводного титрования - 98.7 мас.%, содержание примеси креатинина по данным ВЭЖХ - 1.2 мас.%.

Пример 9. Получение креатинилаланин этилового эфира ацетата.

В одногорлую круглодонную колбу объемом 100 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 2 г (13.4 мМ) креатина моногидрата в 10 мл диметилформамида и при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 2.54 г (13.4 мМ) моногидрата n-толуолсульфокислоты и далее - 1.01 г (6.7 мМ) гидрохлорида этилового эфира аланина, 0.85 г (6.7 мМ) диизопропилкарбодиимида в 2 мл диметилформамида. Затем в течение 10 мин из капельной воронки прибавляют 0.94 мл (6.7 мМ) триэтиламина. Реакционную смесь оставляют на 20 ч при комнатной температуре, отфильтровывают выпавший осадок гидрохлоридов диизопропилэтиламина и диизопропилмочевины, маточник упаривают при температуре 50°С. Маслообразный остаток растворяют в 100 мл хлороформа и экстрагируют водой (3×100 мл). Объединенную водную вытяжку, содержащую целевой продукт, дважды экстрагируют хлороформом и упаривают на роторном испарителе до объема 20 мл.

Полученный раствор пропускают через колонку 30×150 мм, заполненную Dowex 2×8 в ацетатной форме, элюируют водой. Скорость элюирования - 2 мл/мин. Колонку промывают водой, контролируя pH элюата. Фракции с pH=6-7 собирают, объединяют, упаривают. Остаток кристаллизуют из 10 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С, в течение 5 ч. Осадок креатинилаланин этилового эфира ацетата отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход C₉H₁₈N₄O ₃*C₂H₄O₂ - креатинилаланин этилового эфира ацетата - 0.56 г (24%). Масс-спектр, найдено: m/z: 290.35. Вычислено: М 290.31. Содержание основного вещества - креатинилаланин этилового эфира ацетата по данным неводного титрования - 99.1 мас.%, содержание примеси креатинина по данным ВЭЖХ - 0.9 мас.%.

Пример 10. Получение креатинилфенилаланин этилового эфира ацетата.

В одногорлую круглодонную колбу объемом 250 мл, снабженную капельной воронкой с компенсатором, закрытой хлоркальциевой трубкой, помещают суспензию 11.3 г (86 мМ) креатина в 80 мл диметилформамида и при перемешивании на магнитной мешалке добавляют 16 г (86 мМ) моногидрата n -толуолсульфокислоты - приблизительно через 5 минут осадок полностью растворяется. Затем добавляют 11.5 г (50 мМ) фенилаланина этилового эфира гидрохлорида и 7.75 мл (45 мМ) диизопропилкарбодиимида. Далее в течение 10 минут из капельной воронки прибавляют 8.6 мл (50 мМ) диизопропилэтиламина. Реакционную смесь оставляют на 20 ч при комнатной температуре, далее добавляют 10 мл воды, отфильтровывают выпавший осадок диизопропилмочевины, и анализируют полученный раствор с помощью ВЭЖХ. По данным анализа реакция прошла на 50%.

Полученный продукт выделяют по способу, приведенному в примере 1, за исключением того, что фракции с pH=7 (pH воды = 5) собирают, анализируют методом ОФ ВЭЖХ, объединяют, добавляют 1 М раствор уксусной кислоты и упаривают.

Выход C₁₅H₂₂N₄O₃*C ₂H₄O₂ - креатинилфенилаланин этилового эфира ацетата - 7.9 г (25%). Масс-спектр, найдено: m/z: 366.37. Вычислено: М 366.41. Содержание основного вещества - креатинилфенилаланин этилового эфира ацетата по данным неводного титрования - 99.4 мас.%, содержание примеси креатинина - 0.7 мас.%.

Изучение нейропротекторной активности амидов креатина

Исследования здесь и далее проводили с использованием следующих амидов креатина, полученных по заявляемому способу:

1. Креатинилглицин изо-пропиловый эфир ацетат

2. Креатинилглицилглицин этиловый эфир ацетат

3. Креатинилглицин этиламид тартрат

4. N -карбобензокси-N -креатиниллизин этиловый эфир ацетат

5. Креатинилфенилаланин этиламид гидрохлорид

6. Креатинил- -аминомасляной кислоты этиловый эфир ацетат

Исследование нейропротекторного действия амидов креатина проведено на моделях фокальной ишемии на крысах-самцах Вистар, возраст 12-14 недель, масса 220-240 г. Анестезия выполнялась тиопенталом натрия в дозе 60 мг/кг. В первой группе животным за 45 мин до ишемии вводили внутривенно (в/в) раствор амида креатина в физрастворе, контрольной группе - физраствор, во второй - за сутки до ишемии животным трижды в день внутрижелудочно (per os) зондом вводили раствор амида креатина в физрастворе, контрольной группе - физраствор.

Эндоваскулярная окклюзия средней мозговой артерии проводилась по методике Koizumi, J, et al. (1986), в модификации Longa, E.Z., et al. (1989) и Belayev L, et al. (1999). Стандартные сроки ишемии составляли 39 мин, реперфузии - 48 ч. Для оценки размеров повреждения головного мозга животных умерщвляли, получали фронтальные срезы толщиной 2 мм. Площадь зоны повреждения определялась путем окрашивания фенилтетразолия хлоридом и последующего получения и анализа цифровых фотографий окрашенного среза. Вычислялся коэффициент повреждения головного мозга - отношение площади повреждения ко всей поверхности среза (таблица 1).

Таблица 1.
Влияние амидов креатина на повреждение головного мозга крыс-самцов Вистар при экспериментальной ишемии/реперфузии (p<0.05).
Препарат	Способ введения, доза (n=5)	Коэффициент повреждения мозга, %
Препарат 1	в/в; 150 мг/кг	11.2±2.3
Препарат 2	в/в; 200 мг/кг	12.1±2.0
Препарат 3	в/в; 100 мг/кг	12.0±1.7
Препарат 4	в/в; 100 мг/кг	11.3±3.2
Препарат 5	в/в; 50 мг/кг	14.0±1.1
Препарат 6	в/в; 45 мг/кг	13.1±1.0
Физраствор	в/в	19.4±5.3
Препарат 1	per os; 3×150 мг/кг	14.2±3.0
Препарат 3	per os; 3×150 мг/кг	13.9±3.3
Препарат 4	per os; 3×100 мг/кг	15.2±2.9
Физраствор	per os;	21.4±4.7

Исследование влияния амидов креатина на сохранение когнитивных функций при ишемии головного мозга

Ишемия головного мозга воспроизводилась по вышеописанной методике. Раствор амида креатина или физраствор животным вводился внутривенно. Для оценки неврологического дефицита при фокальном ишемическом и реперфузионном повреждении головного мозга использовалась шкала Garcia et al. (1955). Тестирование животных проводилось перед ишемией, на вторые и третьи сутки после ишемии/реперфузии в фиксированное время для исключения изменений поведения за счет циркадного ритма. Оценивались: спонтанная активность, симметричность движений конечностей, подъем по вертикальной сетчатой стенке, проприорецепция тела, реакции на прикосновение к вибриссам. Максимальный балл по данной шкале - 18 (отсутствие неврологического дефицита), минимальный - 3 (тяжелый неврологический дефицит). Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2.
Неврологическое состояние крыс по шкале Garcia на 2-е и 3-и сутки после ишемии (p<0.05).
Препарат, доза	Баллы неврологического состояния по шкале Garcia (n=5)
За сутки до ишемии	2-е сутки после ишемии	3-и сутки после ишемии
Препарат 1; 150 мг/кг	18±0	10±2	15±2
Препарат 3; 100 мг/кг	18±0	11±2	16±1
Препарат 4; 100 мг/кг	18±0	14±1	17±2
Препарат 5; 50 мг/кг	18±0	11±1	14±1
Препарат 6; 45 мг/кг	18±0	14±0	16.0±1.1
Физраствор	18±0	6±1	9±2

Исследование стабильности амидов креатина в искусственном желудочном соке и плазме крови человека

Для исследования стабильности амидов креатина 10 мг амида креатина растворяли в 20 мл искусственного желудочного сока, аликвоту раствора помещали в виалу для хроматографа. Затем виалу с раствором помещали в автосамплер хроматографа при температуре 37°С. Методом ВЭЖХ определяли начальную концентрацию амида креатина и ее относительное изменение в желудочном соке при указанной температуре (таблица 3).

Таблица 3.
Стабильность амидов креатина в искусственном желудочном соке при температуре 37°С.
Препарат	Стабильность, %
0 ч	1 ч	3 ч	5 ч
Препарат 1	100	100	99	97
Препарат 2	100	100	98	98
Препарат 3	100	100	97	98
Препарат 4	100	100	98	97
Препарат 5	100	100	98	99
Препарат 6	100	100	99	99

Стабильность амидов креатина в плазме крови человека оценивали по относительному изменению концентрации амида креатина в плазме. Смешивали 1 мл плазмы с 0.2 мл водного раствора амида креатина с концентрацией 5 мг/мл, выдерживали смесь при температуре 37°С, через фиксированные промежутки времени отбирали аликвоту объемом 0.2 мл, смешивали с 0.02 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, через 15 мин осадок центрифугировали при 300 g в течение 20 мин. В супернатанте определяли концентрацию амида креатина методом ВЭЖХ (таблица 4).

Таблица 4.
Стабильность амидов креатина в плазме крови человека при температуре 37°С.
Препарат	Стабильность, %
0 ч	0.25 ч	0.5 ч	1 ч
Препарат 1	100	100	99	91
Препарат 2	100	100	97	90
Препарат 3	100	100	95	90
Препарат 4	100	100	100	89
Препарат 5	100	100	97	87

Приведенные результаты показали, что при использовании заявляемого способа удается получить амиды креатина по более простой технологии, при сокращении стадий синтеза с 7 и более до 4, исключения наиболее дорогих реактивов - трифторуксусной кислоты и производных гуанидина, из дешевого сырья (в 2 и более раз по сравнению с аналогами), в частности креатин-гидрата. Изменение технологии позволило снизить себестоимость конечного продукта с 50000 долл./кг до 4000-5000 долл./кг. Полученные амиды креатина представляют интерес для применения в медицине, т.к. обладают нейропротекторным действием.