питательная среда для культивирования клеточной культуры saussurea orgaadayi v. khan. et krasnob

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования каллусной культуры Saussurea orgaadayi V Khan. Et Krasnob., имеющая следующее соотношение компонентов, мг/л:

KNO3	1900
NH4 NO3	1650
CaCl2 6H2O	440
MgSO4 7H2O	370
KH2 PO4	170
FeSO4 7H2O	27,8
Na2 ЭДТА2H2O	37,3
H 3BO3	6,2
MnSO 44H2O	22,3
ZnSO 47H2O	8,6
KI	0,83
Na2MoO42H2O	0,25
CuSO 45H2O	0,025
CoCl 26H2O	0,025
никотиновая кислота	0,50-0,10
тиамин	0,50-0,10
пиридоксин	0,50-0,10
2,4-Д	0,5-0,1
БАП	0,2-0,8
сахароза	30000
агар-агар	0,1-6700
вода	до 1 л

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. Область применения - фармацевтическая промышленность, получение нового вида сырья в качестве источника биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения.

В доступных отечественных и зарубежных источниках не заявлена питательная среда для получения и культивирования Saussurea orgaadayi (сем. Asteraceae).

Известны опубликованные работы зарубежных авторов по исследованию и культивированию других видов рода Saussurea.

Виды рода Saussurea обладают широким спектром фармакологической активности и применяются в народной медицине в качестве антибактериальных, гемостатических, общеукрепляющих средств, оказывают противовоспалительное, жаропонижающее и др. действия. Saussurea orgaadayi в отличие от других видов этого рода является также очень редким, ограниченным своим местообитанием эндемиком, и введение данного вида в культуру in vitro может стать перспективной возможностью решения этой проблемы.

Известна питательная среда для выращивания Saussurea medusa. В работе авторы (Chun-Xiang Fu. Cellular aggregate size as the critical factor for flavanoid production by suspension cultures of Saussurea medusa / Chun-xiang Fu, De-Xio Zhao, Yan Huang, Feng-Snan Ma // Biotechnology Letters. 2005. C.91-95.) культивировали каллусную культуру S.medusa на среде MS (Мурасиге и Скуга), содержащей глюкозу (10 г/л), миоинозитол (100 мг/л), НУК (2 мг/л), 6-бензиладенин (0,5 мг/л), в условиях освещения (60 µmol m^-2s^-1) при 25±2°C в течение 9 дней.

Недостатками питательной среды для культивирования клеточной культуры Saussurea medusa является использование, кроме регуляторов роста, дополнительных компонентов, таких как глюкоза и миоинозитол, а в качестве одного из гормонов роста используют синтетический аналог ауксина (НУК) в высоких концентрациях (до 2 мг/л), что делает питательную среду экономично невыгодной.

Известна питательная среда для выращивания Saussurea obvallata. В работе авторы (Uppeandra Dhar. Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea obvallata (DC.) Edgew. (Asteraceae): effect of explant type, age and plant growth regulators / Uppeandra Dhar, Mitali Joshi // Plant Cell Rep (2005) 24:195-200) получили каллусную культуру S.obvallata на среде MS, содержащей бензиладенин (2,5 µМ) в комбинации с НУК (1,0 µM) в течение 30 дней.

Недостатками питательной среды для культивирования клеточной культуры Saussurea obvallata является то, что в качестве гормонов роста используют высокие концентрации бензиладенина (до 2,5 мг/л).

Известна питательная среда для выращивания Saussurea involucrate, выбранная в качестве прототипа. В работе авторы (Jing Ming JIA. Antiinflammatory and Analgesic Activities of the Tissue Culture of Saussurea involucrate // Jing Ming JIA, Chun Fu WU, Wen LIU, Hai YU, Yue HAO, Jian Hua ZHENG, and Yu Rong JI // Biol. Pharm. Bull. (2005) 28(9):1612-1614) получили каллусную культуру S.involucrate от стеблевых и листовых эксплантов на среде MS, содержащей НУК (2,0 мг/л), 6-бензиламинопурин (0,5 мг/л) в условиях 12-часового освещения (58,4 µmol m^-2s^-1) при 24±1°C в течение 4-х недель.

Недостатком питательной среды для культивирования клеточной культуры Saussurea involucrate является то, что в качестве одного из гормонов роста используют синтетический аналог ауксина (НУК) в высоких концентрациях (до 2 мг/л).

Недостатком известных аналогов является их направленность на культивирование видов растений рода Saussurea, отличных от изучаемого: Saussurea orgaadayi, который был впервые введен в клеточную культуру на заявленной питательной среде.

Задачей настоящего изобретения является разработка качественного и количественного состава питательной среды для получения клеточной культуры Saussurea orgaadayi Khan. Et Krasnob. Поставленная задача решается тем, что питательная среда для культивирования каллусной культуры Saussurea orgaadayi Khan. Et Krasnob. характеризуется тем, что она содержит компоненты в следующем количественном соотношении, мг/л:

KNO₃ - 1900

NH ₄NO₃ - 1650

CaCl₂6H ₂O - 440

MgSO₄7H₂O - 370

KН₂РО₄ - 170

FeSO₄7H₂O - 27,8

Na ₂ЭДTA2H₂O - 37,3

H₃ BO₃ - 6,2

MnSO₄4H₂ O - 22,3

ZnSO₄7H₂O - 8,6

KI - 0,83

Na₂MoO₄ 2H₂O - 0,25

CuSO₄5H ₂O - 0,025

CoCl₂6H₂ O - 0,025

Никотиновая кислота - 0,50-0,10

Тиамин - 0,50-0,10

Пиридоксин - 0,50-0,10

2,4-Д - 0,5-1,0

БАП - 0,2-0,8

Сахароза - 30000

Агар-агар - 0,1-6700

Вода - до 1 л.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, хелата железа, витаминов. Макро- и микросоли, хелат железа, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 2,4-Д, БАП, сахарозу и агар и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. Все сосуды с питательными средами закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, скальпель, пинцет стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160°C. Питательные среды после из стерилизации помещают в сосуды для культивирования клеточной культуры в стерильных условиях ламинарного бокса. Клеточную культуру высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 25-27°C и 70%-ной влажности воздуха в условиях непрерывной темноты.

Ниже представлен пример осуществления изобретения.

Пример

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄7H ₂O - 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄4H₂O - 22,3 мг/л, ZnSO ₄7H₂O - 8,6 мг/л, KI - 0,83 мг/л, Na₂ MoO₄2H₂O - 0,25 мг/л, CuSO₄5H ₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂6H₂O - 0,025 мг/л), хелата железа (FeSO₄7H₂O - 27,8 мг/л, Na₂ЭДTA2H₂O - 37,3 мг/л), CaCl ₂ (CaCl₂6H₂O - 440 мг/л), витаминов (никотиновая кислота - 0,50 мг/л, тиамин - 0,50 мг/л, пиридоксин - 0,50 мг/л). Макро- и микросоли, хелат железа, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют БАП (0,5 мг/л) и 2,4-Д (0,8 мг/л), сахарозу (30000 мг/л), агар (6700 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. Все сосуды (колбы) с питательными средами закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, скальпель, пинцет заворачивают в бумагу, сосуды для культивирования (пробирки, флаконы) закрывают фольгой и стерилизуют в течение 2,5 ч в сухожаровом шкафу при 160°C. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса размещают по культуральным сосудам в условиях ламинарного бокса. Культивирование каллусной культуры проводится при 25-27°C и 70%-ной влажности воздуха в условиях непрерывной темноты. Для сбора биомассы и дальнейшего субкультивирования используется культура 30 суток.

В настоящем изобретении для получения и культивирования клеточной культуры Saussurea orgaadayi Khan. Et Krasnob. применяют среду Мурасиге-Скуга (МС), модифицированную добавлением гормонов роста: 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и БАП (6-бензиламинопурин). Преимущества такого сочетания компонентов в питательной среде таковы, что в качестве оного из гормонов роста - ауксина - используется его синтетический аналог 2,4-Д, который является наиболее сильным по сравнению с другими часто используемыми аналогами (ИУК, НУК), что позволяет добавлять его в довольно небольших количествах. Второй применяемый гормон роста (БАП) также берется в низких концентрациях, что в целом делает питательную среду экономично более выгодной. Именно такой качественный и количественный состав позволил впервые успешно получить и культивировать клеточную культуру Saussurea orgaadayi.