способ дифференциальной диагностики ремиттирующего и вторично-прогрессирующего типа течения рассеянного склероза

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики ремиттирующего и вторично-прогрессирующего типа течения рассеянного склероза, характеризующийся тем, что при превышении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов, страдающих рассеянным склерозом, на 80% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируют ремиттирующий тип течения рассеянного склероза, а при снижении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с рассеянным склерозом на 25% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируют вторично-прогрессирующий тип течения рассеянного склероза.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, конкретно к неврологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики ремиттирующего и вторично-прогрессирующего типа течения рассеянного склероза (PC).

Клиническая диагностика PC нередко представляет большие трудности в связи с отсутствием патогномоничных признаков болезни. На современном уровне знаний только клинические данные положены в основу как классификации этого заболевания, так и определения типов его течения, степени активности процесса. PC относится к хроническим прогрессирующим заболеваниям. Течение PC индивидуально. Нет двух больных с одинаковыми клиническими проявлениями патологического процесса, у каждого из них свой индивидуальный набор симптомов и их сочетание. Ключевыми показателями течения PC являются присутствие и частота клинически отчетливых обострений (экзацербаций) и темп нарастания неврологического дефицита. Появление новой неврологической симптоматики, выявляемой при клиническом обследовании и сохраняющейся не менее 24 часов, считают обострением.

Невозможно сегодня предсказать длительность ремиссий и частоту обострений, степень восстановления функций и скорость прогрессирования необратимых нарушений. С увеличением продолжительности болезни сумма неврологического дефицита нарастает. В настоящее время не принято выделение клинических форм PC, основанных на ведущих проявлениях заболевания, - оптической, цереброспинальной, мозжечковой и др., так как данные нейровизуализации и электрофизиологических методов исследования свидетельствуют о наличии очагов в различных отделах ЦНС при любой из этих форм.

Учитывая стадийный характер клинической картины PC, различают следующие основные типы (варианты) течения PC [1]:

- ремиттирующее - (РРС), когда обострение сменяется ремиссией;

- первично-прогрессирующее - (ППРС), с самого начала заболевания наблюдается неуклонное прогрессирование, без четких периодов обострений и ремиссий;

- вторично-прогрессирующее - (ВПРС), когда после обострений и ремиссий в анамнезе наступает стадия хронического прогрессирования с периодами стабилизации, но с остаточной неврологической симптоматикой.

РРС характеризуется эпизодическими обострениями с полным или неполным клиническим восстановлением и фазой стабилизации клинической картины между экзацербациями. В 75-85% случаев заболевание вначале течет именно так. Клинические ремиссии не свидетельствуют о затухании патологического процесса, так как его активность может сохраняться и при отсутствии клинических проявлений, о чем убедительно свидетельствуют данные нейровизуальных методов исследования.

ВПРС характеризуется постепенным нарастанием неврологических расстройств с периодами обострений в течение заболевания или без них у пациентов, ранее имевших РРС. Более чем у половины больных РРС через 10 лет болезнь трансформируется в ВПРС, а через 25 лет почти все пациенты данной группы имеют ВПРС, эффективность терапии при котором невысока. Поэтому одной из важнейших задач лечения больных РРС является предупреждение такой трансформации течения заболевания.

С типом течения РРС или ВПРС протекают 85% всех случаев PC. Типы течения РРС и ВПРС отличаются стадиями заболевания. Обострение и ремиссия наблюдается при РРС. ВПРС характеризуется выраженной скоростью прогрессии и глубиной инвалидизации. Частота обострений у больных с ВПРС ниже, чем при РРС, что, вероятнее всего, связано с естественной трансформацией заболевания у пациентов с ВПРС. В связи с вышесказанным является важным разработать дополнительный к клиническому методу способ дифференциальной диагностики РРС и ВПРС.

Известен способ определения характера течения PC [2], согласно которому на основании определения активности Na⁺, К⁺-АТФ-азы в эритроцитах крови в зависимости от концентрации АТФ при температуре 35°С прогнозируют обострение PC при значениях константы Михаэлиса (КМ), равной 1,07·10 ^-5±4,55·10^-7 М АТФ, а при значениях КМ, равных 0,83·10^-5±3,57·10^-7 М АТФ, - ремиссию. Однако данный способ дает прогноз только стадии обострения заболевания и не позволяет дифференцировать тип течения PC.

Адекватного прототипа предложенного изобретения, позволяющего дифференцировать РРС и ВПРС, в проанализированной литературе не обнаружено. Совершенствование стандартного набора диагностических критериев с использованием лабораторных и инструментальных методов, четкая осведомленность и широкое внедрение в практическую деятельность неврологов единых критериев диагностики PC позволит более точно на ранних этапах устанавливать диагноз, проводить дифференциальную диагностику и определять соответствующую тактику ведения больных.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности дифференциальной диагностики РРС и ВПРС.

Поставленная задача достигается путем дополнительного определения биологических показателей, а именно - определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с PC. При повышении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов, страдающих PC, на 80% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируют РРС. При снижении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с PC на 25% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируют ВПРС.

Предлагаемый способ прост в исполнении и на основании определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с PC можно дифференцировать РРС и ВПРС до терапии и целенаправленно проводить как лечение, так и реабилитационные фармакологические мероприятия.

Новым в предлагаемом способе является использование показателей активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с PC для дифференциальной диагностики РРС и ВПРС и критерии дифференциальной диагностики.

Исследование глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы было выбрано в связи с особым значением этого фермента в энергетическом метаболизме. Один из этапов окисления глюкозы в эритроцитах катализируется глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой с участием НАДФ - никотинамид-динуклеотид-фосфата. Именно в результате этой каталитической реакции красные клетки крови обеспечиваются необходимым количеством восстановленного никотинамид-динуклеотид-фосфата (НАДФН), используемого для восстановления глутатиона, что имеет весьма важное значение в эффективности антиоксидантной системы.

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, входящей в ферментативное звено глутатион-зависимой антиоксидантной системы, в эритроцитах значительно выше, чем в других клетках крови и плазме. Основной мишенью повреждающих перекисных факторов являются клеточные и цитоплазматические мембраны. Эритроциты, обладающие в полной мере комплексом данных мембранных компонентов, могут служить адекватной моделью для оценки активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы клеток всего организма. На глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе был остановлен выбор еще и в связи с тем, что уровень активности этого фермента определяет степень функционирования эндогенной антиоксидантной системы, являющейся неспецифическим механизмом в патогенезе PC.

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе. Данный способ может быть использован в здравоохранении для повышения точности дифференциальной диагностики.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Предлагаемые критерии - при превышении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов с PC на 80% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируется РРС, а при снижении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах периферической крови у пациентов, страдающих PC, на 25% и более относительно показателей для здоровых лиц диагностируется ВПРС - были получены в результате комплексного клинико-лабораторного обследования пациентов с PC.

Исследование выполнено на базе неврологической клиники, кафедры неврологии и нейрохирургии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», а также на базе лаборатории клеточных и молекулярно-биологических исследований исследований НИИ психического здоровья СО РАМН в период с 2005-2008 гг.

В исследование были включены 60 человек. Группу исследования больных с верифицированным диагнозом рассеянный склероз составили 29 пациентов, проживающих на территории Томской области. Соотношение мужчин и женщин в группе пациентов 1:1,72. Диагноз PC устанавливался в соответствии с международными диагностическими критериями по Мак-Дональду (2001, 2005). Период наблюдения за пациентами составил 3 года. Распределение пациентов в зависимости от типа течения патологического процесса было следующим:

- РРС, характеризующийся наличием периодов обострений и ремиссий (20 человек - 68,9%).

- ВПРС, при котором на фоне нарастания симптомов неврологической дисфункции наблюдаются обострения PC без последующих ремиссий (9 человек - 31,1%).

Группа сравнения состояла из 31 практически здоровых лиц того же возраста, проживающих в г.Томске, средний возраст - аналогичный возрасту пациентов с PC.

Клиническое обследование пациентов проводили по общепринятой схеме, применяемой в неврологических клиниках, с использованием клинических данных и результатов дополнительных исследований согласно с критериями Мак-Дональда (2001, 2005). В ходе клинического обследования больных с PC учитывались возраст, пол, первые симптомы заболевания, общая длительность болезни.

В целом все обследованные больные были охарактеризованы с использованием ряда стандартных показателей клинического течения демиелинизирующих заболеваний нервной системы и получены средние значения клинико-демографических характеристик всей группы больных PC. У всех пациентов проводилась магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга, при необходимости - спинного мозга. Всем пациентам выполнялось исследование неврологического статуса в динамике, объем лабораторных исследований включал исследование общего анализа крови, мочи, биохимическое исследование крови (в том числе белковые фракции), осмотры-консультации терапевта, офтальмолога.

Возраст пациентов с PC варьировал от 15 до 58 лет, большую часть составили лица молодого трудоспособного возраста от 25 до 45 лет. Средний возраст обследованных лиц составил 36 лет.

У всех больных были проанализированы клинические характеристики (РРС и ВПРС) типов течения заболевания, выраженность неврологического дефицита.

Сравнительное исследование активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах у пациентов, страдающих РРС и ВПРС, а также у здоровых лиц проводили в гемолизатах эритроцитов. Для биологических исследований кровь брали из локтевой вены, утром (между 8 и 9 часами) натощак, стабилизировали гепарином, центрифугировали, осаждая эритроциты. Эритроциты трижды отмывали центрифугированием по 10 минут при 1500 об./мин с помощью физиологического раствора, pH 7,4.

Отмытые эритроциты подвергались гемолизу дистиллированной водой в соотношении 1:10. Образцы гемолизированных эритроцитов вносили в 50 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; содержащий 1 мМ ЭДТА и 1% тритона Х-100 из расчета 1:10 на ледяной бане при 4°С, и затем центрифугировали при 16000 об/мин в течение 90 мин при 4°С. В полученной надосадочной жидкости спектрофотометрически определяли активность фермента и концентрацию белка.

Принцип измерения каталитической активности основан на регистрации образующейся в реакции восстановленной формы кофермента - НАДФН (коэффициент молярного поглощения НАДФН при длине волны 340 нм - равен 6,22 мкМ^-1 см^-1). В процессе окисления глюкозо-6-фосфата происходит восстановление НАДФ. Количество образовавшегося восстановленного НАДФН (в молях) равно количеству глюкозо-6-фосфата, вступившего в реакцию. За ходом реакции следили спектрофотометрически. Зная величину оптической плотности при 340 нм в начале и в конце реакции, определяли, сколько образовалось восстановленного НАДФН и, следовательно, сколько окислилось глюкозо-6-фосфата за счет действия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [3].

Реактивы:

1. Фосфатный буфер pH 7,5 и pH 6,0 (для приготовления фосфатного буфера с pH 7,5 смешивали 84,0 мл 0,2 М Na₂HPO₄ и 16,0 мл 0,2 М NaH₂ PO₄ и доводили дистиллированной водой до 200 мл; для приготовления фосфатного буфера с pH 6,0 смешивали соли: 0,2 М Na₂HPO₄ и 0,2 М NaH₂PO ₄ в количестве 12,3 мл и 87,7 мл соответственно и доводили Дистиллированной водой до 200 мл).

2. Хлористый магний - 0,1 М раствор.

3. Глюкозо-6-фосфат натриевая соль - 0,2 М раствор.

Водный раствор готовили непосредственно перед работой таким образом, чтобы в 1,0 мл содержалось 0,2-0,8 единиц активности. Растворы фермента и НАДФ в процессе работы находились в бане со льдом. Остальные растворы - при комнатной температуре.

4. НАДФ растворяли в бидистилированной воде, доводили pH до 6,0 и добавляли воды до нужного объема. В таком виде НАДФ может храниться в холодильнике несколько дней.

В кювету помещали 2,0 мл бидистиллированной воды; 0,25 мл фосфатного буфера; 0,2 мл хлористого магния; 0,1 мл раствора НАДФ; 0,4 мл раствора глюкозо-6-фосфата и 0,05 мл соответствующим образом разведенного раствора глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Содержимое кюветы быстро перемешивали и измеряли величину оптической плотности при 340 нм с интервалами в 1 мин в течение 5-8 мин против кюветы с водой. Единица ферментативной активности (U) соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин при 25 С° [3]. Расчет удельной активности фермента производили на мг белка. Содержание белка в исследуемом образце определяли по методу Лоури (Lowry O.H., 1951).

Брали 0,2 мл пробы и добавляли к ней 2,0 мл раствора Bs-7 (для приготовления раствора Bs-7 брали 0,18 г CuSO₄·5H₂O; 3,75 г NaOH; 0,125 г безводной Na₂CO₃ и 0,75 г K,Na-виннокислого (тартрата) и разбавляли в 1 л дистиллированной воды). Пробирки встряхивали и оставляли на 10 минут. Затем во все пробирки добавляли по 0,2 мл реактива Фолина. Спустя 20-30 мин спектрофотометрически измеряли оптическую плотность при длине волны 750 нм (Ohnishi S.T., Barr J.R., 1978).

Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica, версия 6.0 для Windows (StatSoft. Inc., 2001). Достоверность различий определяли с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при достигнутом уровне значимости р<0,05.

Отличительной особенностью ферментативной активности в эритроцитах периферической крови у пациентов с PC при разных типах течения заболевания является разнонаправленность изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы: повышение при РРС на 81,1% и снижение при ВПРС на 26,7%.

Таблица
Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах у больных PC в U/ мг белка
Показатель	PPC n=20	ВПРС n=9	Здоровые лица n=31
Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа	8,55±1,89	3,46±0,29	4,72±1,38

Увеличение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов периферической крови у пациентов при РРС относительно показателей для здоровых лиц можно расценивать как механизм компенсации повышенного расхода НАДФН на активацию эндогенной антиоксидантной системы, а также на биосинтетические процессы, обеспечивающие миелинизацию поврежденных нервных волокон.

Снижение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах у больных с ВПРС, в сравнении с больными РРС и здоровыми людьми, говорит о наличии недостатка этого фермента только у пациентов с ВПРС. Не исключено, что этот дефицит фермента обусловливает более тяжелое течение данного типа PC, так как глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа является основным поставщиком восстановленного НАДФН, необходимого для нормального функционирования окислительно-восстановительной системы клетки [4].

В качестве иллюстрации приводим клинические примеры:

Пример 1. Пациентка В., 23 года, поступила для обследования в клинику нервных болезней СибГМУ осенью 2003 года. Жалобы при поступлении на слабость в правой ноге, шаткость и неуверенность при ходьбе, двоение.

Анамнез. Известно, что 2 года назад перенесла ретробульбарный неврит слева, затем онемение правой нижней конечности, длительностью около суток. Состояние пациентки самостоятельно нормализовалось через месяц. За неделю до поступления в неврологическую клинику отмечала появление неуверенности при ходьбе, слабость в правой ноге, диффузную головную боль ноющего характера в течение нескольких суток, возникновение выраженной общей слабости вечером.

В детстве росла и развивалась соответственно полу и возрасту, у близких родственников заболевания нервной системы отрицает.

Неврологический статус. На момент осмотра выявлены: слабость правой ноги при ходьбе (сила мышц снижена до 4 баллов), неустойчивость в позе Ромберга, диплопия, горизонтальный среднеразмашистый нистагм при взгляде влево, асимметрия носогубных складок, положительные назолабиальный и хоботковый рефлексы, оживление и асимметрия сухожильных рефлексов с нижних конечностей, клоноид надколенников и стоп (больше слева).

Исследование глазного дна выявило битемпоральную атрофию дисков зрительных нервов больше слева. На МРТ головного мозга визуализировались очаги демиелинизации перивентрикулярно и в области ствола мозга. Другие паракли-нические исследования патологии не выявили. Пациентке диагностирован рассеянный склероз, цереброспинальная форма, ремиттирующее течение, стадия обострения.

Согласно шкале EDSS состояние больной соответствовало 3,0 баллам.

Лабораторное обследование: уровень активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах - 9,22 U/мг белка, который превышает норму на 93,2%, и диагностируется РРС.

После проведенного лечения метилпреднизолоном и сосудисто-метаболическими препаратами достигнуто значительное улучшение, и пациентка выписана для дальнейшего амбулаторного наблюдения невролога.

Пример 2. Пациентка Р., 49 лет, поступившая в неврологическую клинику СибГМУ в октябре 2007 года. При поступлении больная предъявляла жалобы на усиление слабости в правых конечностях - больше в руке, усиление шаткости при ходьбе, потребность в посторонней поддержке, чувство усталости вечером. Отмечала также ухудшение памяти, внимания, императивные позывы к мочеиспусканию.

Анамнез. Известно, что болеет с 1984 года, когда впервые после перенесенной за 2 недели инфекции почувствовала слабость в ногах больше справа, затем возникла слабость верхних конечностей. Первоначально пациентке диагностирован рассеянный энцефаломиелит, и после курса терапии преднизолоном состояние нормализовалось. Спустя 7 лет вновь появилась слабость правых конечностей, присоединилась диплопия и нарушение мочеиспускания. После проведения больной МРТ головного мозга в 1998 году выставлен рассеянный склероз. После лечения преднизолоном состояние пациентки несколько улучшилось, однако сохранились дисфункция конечностей и мочеиспускания, прогрессировали координаторные расстройства. Последнее ухудшение отмечала с сентября 2007 года, когда возникли вышеуказанные жалобы.

Неврологический статус. На момент поступления в неврологическую клинику СибГМУ выявлена спастико-атактическая походка, неустойчивость в позе Ромберга, дистальный тремор в руках больше слева, вертикальный нистагм с обеих сторон, дизартрия и снижение глоточного рефлекса. В верхних конечностях снижение тонуса и наличие патологических кистевых рефлексов больше справа. Отмечалось повышение мышечного тонуса по спастическому типу в ногах, высокие сухожильные рефлексы с акцентом справа, наличие симптома Бабинского с обеих сторон и левосторонней гемигиперестезии.

Балл инвалидизации у данной пациентки по шкале EDSS соответствовал 3,5.

Лабораторное обследование: уровень активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах - 2,41 U/мг белка - снижен на 27,7%; поэтому диагностируется ВПРС.

Данной больной диагностирован рассеянный склероз, вторично прогредиентное течение, центральный рефлекторный тетрапарез больше справа, дисфункция тазовых органов по центральному типу, мозжечковые и стволовые нарушения.

С целью купирования обострения пациентке назначена «пульс-терапия» метилпреднизолоном. Показано дальнейшее лечение бета-интерфероном.

Пример 3. Пациент Г., также страдающий ВПРС, 47 лет, являющийся инвалидом первой группы, находился на лечении в неврологической клинике СибГМУ в ноябре 2008 года. Больной постоянно пользовался инвалидной коляской с 2006 года. Пациент жаловался на выраженную слабость в ногах, снижение памяти, скорости мышления, быструю утомляемость, чувство онемения и слабости в конечностях, снижение зрения, затруднение глотания, постоянное системное головокружение и императивные позывы к мочеиспусканию.

Анамнез. Выяснено, что впервые имело место кратковременное нарушение зрения в возрасте 12 лет, затем повторилось в 18 лет (1976 г.). В 1994 году вновь ухудшилось зрение с периодичностью 3-4 раза за год.

Возникновение слабости в правых конечностях отмечает в 1995-1996 годах, усиление слабости конечностей, присоединение шаткости при ходьбе и нарушение мочеиспускания в 1997 году. Неоднократно лечился в неврологической клинике СибГМУ, состояние постепенно ухудшалось, улучшения не отмечал, принимал ребиф.

Исследование глазного дна выявило битемпоральную атрофию дисков зрительных нервов, на МРТ определялось множество очагов демиелинизации в различных структурах головного мозга. При беседе с пациентом продуктивный контакт затруднен вследствие мнестических нарушений, эмоциональной лабильности, дизартрии.

Неврологический статус. Неврологический осмотр больного продемонстрировал наличие грубого интенционного тремора, невозможность выполнения координационных проб, диплопию и горизонтальный нистагм, симптомы орального автоматизма. При осмотре выявлены выраженный парез в ногах, значительное повышение мышечного тонуса по спастическому типу преимущественно справа, оживление сухожильных рефлексов с акцентом справа, наличие всех патологических кистевых и стопных знаков, клонус стоп.

Согласно шкале инвалидизации EDSS состояние данного больного оценено в 7,0 баллов.

Лабораторное обследование: уровень активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах - 2,49 U/мг белка - снижен на 47,2%; поэтому диагностируется ВПРС.

Пациенту поставлен диагноз: Рассеянный склероз, вторично-прогрессирующее течение, выраженный спастический парапарез, нарушение функции тазовых органов по центральному типу, псевдобульбарный синдром. Назначена терапия метилпреднизолоном.

Способ несложен в осуществлении и на основе определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов в периферической крови у пациентов, страдающих PC, позволяет установить тип течения PC. Определяя тактику лечения больного PC, невролог должен четко представлять, какой тип патологического процесса у каждого больного, определить достоверный диагноз заболевания, чтобы быть уверенным в назначении той или иной терапии как оптимальной для данного типа течения PC, прогнозировать эффективность предполагаемой терапии и целенаправленно проводить реабилитационные фармакологические мероприятия.

Литература

1. Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н. Рассеянный склероз. - М.: Медицина - 2003. - С.22-24.

2. Патент РФ № 2034299; Способ диагностики характера течения рассеянного склероза. Куницын В.Г.; Иерусалимский А.П.; Некрасова М.Ф.; Предтеченская А.В., опубликован 30.04.1995. G01N 33/50.

3. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа. 1971. - С.57-58; С.60-61; С.80-81; С.238-239.

4. Луцкий М.А., Земсков A.M., Разинкин К.А. К вопросу ранней диагностики рассеянного склероза. Медицина труда и промышленная экология, 2001. - № 7 - С.40-43.