косметическая комбинация микроорганизма и производного фитосфингозина

Формула изобретения

1. Косметическая композиция, применяемая для ухода и/или макияжа кератиновых материалов, содержащая по меньшей мере одно производное салицилата фитосфингозина формулы (I)



где R и R² представляют собой соответственно атом водорода, и R¹ представляет собой насыщенный линейный алкильный радикал, и по меньшей мере один лизат по меньшей мере одного микроорганизма Bifidobacterium longum в физиологически приемлемой среде.

2. Композиция по п.1, в которой указанный лизат применяют в количестве по меньшей мере 0,001% (в пересчете на массу сухого вещества), в частности в количестве от 0,01 до 20%, и в более частном случае в количестве от 0,1 до 15 мас.% сухого активного вещества по отношению к общей массе композиции.

3. Композиция по п.1, в которой производное салицилата фитосфингозина представляет собой:



или его соль.

4. Композиция по п.1, в которой производное салицилата фитосфингозина применяют в количестве по меньшей мере 0,0001% (в пересчете на массу сухого вещества), в частности в количестве от 0,001 до 20%, и в более частном случае в количестве от 0,05 до 2 мас.% сухого активного вещества по отношению к общей массе композиции.

5. Композиция по п.1, где указанная композиция предназначена для местного применения.

6. Композиция по п.5, отличающаяся тем, что она находится в виде водного, водно-спиртового или масляного раствора, дисперсии типа раствора или дисперсии типа лосьона или сыворотки, эмульсии жидкой или полужидкой консистенции типа молока, получаемой диспергированием жирной фазы в водной фазе (Ж/В) или наоборот (В/Ж), или суспензии или эмульсии мягкой, полутвердой или твердой консистенции типа крема, водного или безводного геля или микроэмульсии, микрокапсул, микрочастиц или везикулярных дисперсий ионного и/или неионного типа.

7. Косметическое применение комбинации, содержащей по меньшей мере один лизат по меньшей мере одного микроорганизма Bifidobacterium longum и по меньшей мере одно производное салицилата фитосфингозина формулы I:



где R и R² представляют собой соответственно атом водорода, и R¹ представляет собой насыщенный линейный алкильный радикал для стимуляции экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из генов KRTB6, KRT10 и гена инволюкрина, у индивида, подверженного старению кожи.

8. Способ косметической обработки, содержащий по меньшей мере введение индивиду, подверженному старению кожи, по меньшей мере одной комбинации, как описано в п.7.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение направлено на разработку особенно эффективной комбинации для предотвращения и/или борьбы со старением кожи.

Эпидермис представляет собой эпителий, который традиционно делят на базальный слой, содержащий кератиноциты, в частности стволовые клетки кожи, и представляющий собой герминативный слой эпидермиса; шиповатый слой, образованный несколькими слоями многогранных клеток, помещенных на базальный слой; зернистый слой, включающий от одного до трех слоев из так называемых плоских клеток, содержащих различные цитоплазматические включения, зерна кератогиалина; и, наконец, ряд верхних слоев, называемых роговым слоем (или stratum corneum), состоящий из кератиноцитов на последней стадии их дифференциации, называемых корнеоцитами.

Роговой слой или stratum corneum является поверхностным слоем эпидермиса, расположенным на границе между организмом и окружающей средой. Он образован корнеоцитами, которые являются безъядерными клетками, образующимися в результате дифференциации эпидермальных кератиноцитов. Корнеоциты богаты кератинами и окружены непроницаемым липидным матриксом. Благодаря содержащимся в нем белкам и липидным композициям роговой слой играет существенную роль в барьерной функции кожи. Он препятствует внедрению микробиологических агентов и позволяет сохранять гидратацию кожи и, следовательно, тела в целом.

При старении кожи, помимо известных результатов воздействия старения на рельеф кожи, пожилые люди сообщают о многих формах дискомфорта. Эти формы дискомфорта вызваны ухудшением барьерной функции и эпидермального гомеостаза их кожи. Таким образом, роговой слой возрастной кожи имеет уменьшенное содержание межклеточных липидов по сравнению с молодой кожей, особенно в зимний период. Это изменение в составе рогового слоя отрицательно воздействует на барьерные физико-химические свойства кожи. Наконец, скорость восстановления барьерной функции после повреждения рогового слоя замедляется с возрастом, как следствие приводя к дисфункции гомеостатической функции эпидермиса (Denda, М., 2002; Ghadially, R. et al, 1995; Leveque, J.L., 2001). Компания-заявитель дополнительно отметила, что в тех же самых обстоятельствах в ответ на физическое или химическое воздействие на роговой слой специфические гены показывают кинетику модуляции, которая существенно различается в зависимости от возраста человека. В особенности было обнаружено, что индукция экспрессии определенных генов в возрастной коже замедляется по сравнению с молодой кожей.

Среди этих генов, экспрессия которых особенно замедляется у пожилых людей, подвергаемых стрессу, в частности находится ген кератина 6В (KRT6B), который, кроме того, характеризуется как особенно эффективный с точки зрения участия в процессах заживления и регенерации эпидермиса.

Более того, гомеостаз кожи и в особенности эпидермиса является следствием точно отрегулированного равновесия процессов пролиферации и дифференциации клеток кожи. Эти процессы пролиферации и дифференциации хорошо регулируются: они участвуют в заживлении и/или регенерации кожи и приводят к поддержанию постоянной толщины кожи и, в частности, постоянной толщины эпидермиса. Этот гомеостаз кожи также участвует в поддержании механических свойств кожи.

Однако на этот гомеостаз кожи могут оказать отрицательное воздействие определенные физиологические факторы (возраст, менопауза, гормоны и т.д.) или факторы окружающей среды (воздействие ультрафиолета, загрязнение, окислительный стресс, реакция на раздражители и т.д.). Регенеративный потенциал эпидермиса становится меньше: клетки базального слоя делятся менее активно, что приводит, в частности, к замедлению и/или уменьшению обновления эпидермиса. Следовательно, обновление клеток больше не компенсирует потерю клеток, удаленных с поверхности, что приводит к атрофии эпидермиса и/или к уменьшению толщины кожи и/или к потере эластичности и/или прочности кожи.

Изменения в эпидермальном гомеостазе также выражаются в проявлении вялости кожи и/или плохом визуальном состоянии кожи.

Это явление может усиливаться при менопаузе: женщины жалуются на стягивание и сухость кожи или даже на патологическую сухость кожи. Дефицит гормонов, связанный с менопаузой, сопровождается, в частности, снижением метаболической активности, что может привести к уменьшению пролиферации кератиноцитов и увеличению эпидермальной дифференциации.

Поэтому предпочтительно также иметь доступные композиции, которые могут способствовать гомеостазу кожи, чтобы поддержать и/или увеличить толщину кожи, и таким образом поддержать и/или улучшить механические свойства кожи и/или способствовать сияющему цвету кожи.

В особенности настоящее изобретение появилось благодаря наблюдению, сделанному авторами изобретения, что определенная, точно найденная комбинация эффективно отвечает этим требованиям и, в частности, через стимулирующее действие на экспрессию определенных генов. Преимущественно, это позволяет компенсировать замедление экспрессии определенных генов, в частности, наблюдаемое при старении кожи, как в случае KRT6B.

Следовательно, согласно первому своему аспекту, настоящее изобретение относится к косметической композиции, применяемой для ухода и/или макияжа кератиновых материалов, содержащей по меньшей мере одно производное салицилата фитосфингозина и по меньшей мере один лизат по меньшей мере одного микроорганизма рода Bifidobacterium species в физиологически приемлемой среде.

Согласно другому своему аспекту, оно также относится к применению, в частности косметическому применению, комбинации, содержащей по меньшей мере один лизат по меньшей мере одного микроорганизма рода Bifidobacterium species и по меньшей мере одно производное салицилата фитосфингозина для стимуляции экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из генов KRT6B или KRT10 и гена инволюкрина.

В частности, настоящее изобретение относится к применению, а именно косметическому применению, комбинации, содержащей по меньшей мере один лизат по меньшей мере одного микроорганизма рода Bifidobacterium species и по меньшей мере одно производное салицилата фитосфингозина, для стимуляции экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из генов KRTB6, KRT10 и гена инволюкрина, индивидом, подверженным старению кожи.

Таким образом, было обнаружено, что рассматриваемая комбинация согласно изобретению является особенно эффективной для предотвращения и/или компенсирования уменьшения экспрессии, наблюдаемого с возрастом для гена KRT6B.

Применение лизата микроорганизмов из рода Bifidobacterium species, например лизата Repair Complex CLR, является общеизвестным из ЕР 0043128, но только для восстановления ДНК клеток кожи.

С другой стороны, в нижеперечисленных документах предлагается применение микроорганизмов, в частности пробиотических микроорганизмов, в основном для ухода за сухой и/или чувствительной кожей и связанными состояниями кожи, но в форме отличной от лизата.

Так, в документе WO 02/28402 указано, что пробиотические микроорганизмы могут оказывать благоприятное воздействие при регулировании реакций гиперчувствительности кожи, например воспалительных и аллергических реакций, которые являются результатом иммунологического процесса. В документах ЕР 1609463, ЕР 1642570, ЕР 1731137 и FR 2876029 описаны композиции для ухода за чувствительной кожей, сочетающие один или более пробиотических микроорганизмов с неорганическим катионом. Что касается документа PCT/FR2006/050768, в нем предлагается комбинация пробиотического микроорганизма с полиненасыщенной жирной кислотой и/или эфиром полиненасыщенной жирной кислоты для ухода за чувствительной кожей в сочетании с сухостью кожи. Следовательно, ни в одном из этих документов не описано применение лизата микроорганизма из рода Bifidobacterium species, рассматриваемое в настоящем изобретении, и тем более в комбинированной форме.

Что касается фитосфингозина и его солей и, в частности, гидрохлорида фитосфингозина, их уже предлагали в области дерматологии. Фактически фитосфингозин прежде всего известен благодаря своей антимикробной активности. Так, фитосфингозин благодаря указанной активности и благодаря ингибирующему действию на развитие микроорганизмов на коже уже эффективно применяется при лечении угрей (US 5,326,565 и ЕР 0919226). Недавно сфинголипидные производные, и, в частности, производные типа салицилата фитосфингозина были описаны как проявляющие способность регулировать дифференциацию кератиноцитов (G Paragh et al; Exp Dermatol. 2008 Dec; 17(12):1004-16). В документе US 5,882,665, в свою очередь, предлагаются новые производные салицилата фитосфингозина, описанные как эффективные средства от угрей, антибактериальные средства, средства от морщин, а также средства для отбеливания кожи.

Однако насколько это известно авторам изобретения, еще никогда не отмечалось благотворное действие или даже синергический эффект, проявляемые композицией из производного салицилата фитосфингозина и лизата микроорганизма рода Bifidobacterium species на экспрессию определенных генов.

Как показано далее в примерах, комбинация согласно изобретению однозначно стимулирует экспрессию не только гена KRT6B, но и KRT10 и гена инволюкрина. Это действие было, в частности, подтверждено с помощью метода qRT-PCR с использованием модели воссозданной кожи Episkin®.

В отношении данного изобретения эффект, демонстрируемый данной комбинацией, определяют как синергический, так как он оказывается больше чем эффект, ожидаемый от простого сложения соответствующих эффектов производного салицилата фитосфингозина и лизата микроорганизма из рода Bifidobacterium species.

Согласно другому своему аспекту, настоящее изобретение относится к применению комбинации, рассматриваемой выше, для усиления способности эпителия, особенно эпидермиса, в частности зрелого эпидермиса к заживлению и регенерации.

Согласно еще одному своему аспекту, настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного лизата по меньшей мере одного микроорганизма рода Bifidobacterium species в комбинации по меньшей мере с одним производным салицилата фитосфингозина, для получения композиции для усиления способности эпителия, особенно эпидермиса, в частности зрелого эпидермиса к заживлению и регенерации.

На основании вышеупомянутого этот эффект, в частности, достигается стимуляцией экспрессии гена или генов, замедленной в ходе естественного старения кожи, и, в частности, стимуляцией экспрессии KRT6B.

Согласно одному из своих аспектов, настоящее изобретение относится к применению, а именно косметическому применению комбинации, содержащей по меньшей мере один лизат по меньшей мере одного микроорганизма рода Bifidobacterium species и по меньшей мере одно производное салицилата фитосфингозина для стимуляции экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из генов KRTB6, KRT10 и гена инволюкрина, для усиления способности эпителия, особенно эпидермиса, в частности зрелого эпидермиса к заживлению и регенерации.

Согласно еще одному своему аспекту, настоящее изобретение относится к способу ухода, в частности косметического ухода, включающему по меньшей мере введение комбинации, обсуждаемой выше, индивиду, подверженному старению кожи.

Данное введение можно осуществлять, в частности, перорально или местно.

Изобретение также относится к косметическому применению, в частности, в составе композиции, содержащей физиологически приемлемую среду и предназначенной для местного нанесения на кожу, комбинации по изобретению для увеличения толщины кожи, придания сияющего цвета коже, стимулирования и/или улучшения механических свойств кожи и/или стимулирования и/или улучшения эластичности и/или прочности кожи.

Микроорганизмы рода Bifidobacterium species

Как указано выше, микроорганизмы рода Bifidobacterium species, применяемые в качестве активных агентов согласно изобретению, применяют в форме лизата.

Лизат обычно обозначает материал, полученный после деструкции или растворения биологических клеток путем явления, которое называют лизисом клетки, вызывающего таким образом высвобождение внутриклеточных биологических компонентов, в естественных условиях содержавшихся в клетках рассматриваемого микроорганизма.

В контексте настоящего изобретения термин "лизат" применяют без различия для обозначения всего лизата, полученного путем лизиса рассматриваемого микроорганизма, или только его фракции.

Таким образом, изобретение относится к применению лизата Bifidobacterium species и/или его фракции.

Применяемый лизат поэтому полностью или частично образован внутриклеточными биологическими компонентами и компонентами клеточных стенок и клеточных мембран.

Конкретнее, он содержит цитоплазматическую клеточную фракцию, содержащую ферменты, например дегидрогеназу молочной кислоты, фосфатазы, фосфокетолазы и трансальдолазы, а также метаболиты. В качестве примера компоненты клеточной стенки представляют собой, в частности, пептидогликан, муреин или мукопептид и тейхоевую кислоту, а компоненты клеточной мембраны образованы глицерофосфолипидом.

Этот лизис клетки может осуществляться с помощью различных способов, таких как, например, осмотический шок, тепловой шок, ультразвук, или при механическом воздействии, таком как центрифугирование.

В частности, этот лизат можно получать согласно способу, описанному в патенте US 4,464,362, и, в частности, согласно нижеследующему протоколу.

Микроорганизм рассматриваемого рода Bifidobacterium species культивируют анаэробно в подходящей культуральной среде, например, согласно условиям, описанным в документах US 4,464,362 и ЕР 0043128. При достижении стационарной фазы развития культуральную среду можно инактивировать пастеризацией, например, при температуре от 60 до 65°С в течение 30 мин. Затем микроорганизмы извлекают с помощью обычно применяемой техники разделения, например путем мембранной фильтрации, центрифугируют и ресуспендируют в стерильном растворе NaCl в физиологической концентрации. Лизат может быть получен путем дезинтеграции такой среды с помощью ультразвука, чтобы высвободить из нее цитоплазматические фракции, фрагменты клеточной стенки и продукты метаболизма. Затем все компоненты в их естественном распределении последовательно стабилизируют в слабокислом водном растворе.

Так обычно получают лизат с концентрацией активного вещества(в) порядка от 0,1% до 50%, в частности от 1% до 20%, и особенно приблизительно 5 масс.% по отношению к общей массе лизата.

Лизат может применяться в различных формах - в форме раствора или в порошкообразной форме.

Микроорганизм, главным образом применяемый в настоящем изобретении, принадлежит к роду Bifidobacterium species и выбран из видов: Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis или Bifidobacterium pseudocatenulatum и их смесей.

Вид Bifidobacterium longum, в частности, наиболее применим для настоящего изобретения.

Лизат может преимущественно представлять собой лизат, зарегистрированный в Международной номенклатуре косметических ингредиентов (INCI) под названием "Bifidat ferment Lysate", в Европейском реестре существующих товарных химических веществ (EINECS) под названием "Bifidobacterium longum", под номером EINECS 306-168-4 и зарегистрированный под номером Химической реферативной службы (CAS) 96507-89-0.

Продукт, реализуемый компанией К. Richter GmbH под названием Repair Complex CLR® и который образуется из инактивированного лизата вида Bifidobacterium longum, находится в пределах контекста изобретения.

Лизат, применяемый по настоящему изобретению, представляет собой лизат, например, как определено выше.

Производное салицилата фитосфингозина

В природе фитосфингозин, присутствующий в роговом слое, соответствует одному из трех сфингоидных оснований, присутствующих в коже в естественных условиях.

В контексте настоящего изобретения рассматриваемые более подробно производные фитосфингозина представляют собой производные типа салицилата фитосфингозина, то есть соединения, получаемые путем ковалентного связывания по меньшей мере одной молекулы фитосфингозина по меньшей мере с одной молекулой салициловой кислоты. Это связывание может быть эфирного или амидного типа и предпочтительно представляет собой связывание амидного типа.

В контексте настоящего изобретения, эти производные салицилата фитосфингозина включают различные ионные формы соответствующих соединений.

Такое производное преимущественно соответствует следующей структурной формуле:

где - R представляет собой:

- атом водорода,

- насыщенный или ненасыщенный, линейный или разветвленный C₁-C₄₉ алифатический радикал, замещенный, где уместно, гидроксильным радикалом, или

- группу Y-O(C_aH_b)_m -,

причем а представляет собой целое число от 7 до 50, b - целое число от 10 до 100, m - 0 или 1 и Y представляет собой Н или C₁₄-C₂₂ жирную кислоту следующей формулы: -CO-(C_xH_yZ_z)CH ₃, причем Z представляет собой - ОН или эпоксидный атом кислорода, х - целое число от 12 до 20, y - целое число от 20 до 40, и z представляет собой 0 или целое число от 1 до 4;

- R¹ представляет собой насыщенный или ненасыщенный, линейный или разветвленный С₈-С ₂₈, в частности С₁₀-С₂₀, особенно C₁₂-C₁₈, алифатический радикал, замещенный, где уместно, гидроксильным радикалом, и

- R ² представляет собой Н, фосфатный радикал, сульфатный радикал или сахар.

Такие производные более детально описаны в документе ЕР 919226.

Наиболее подходящим для изобретения является производное формулы I, где R¹ и R² представляют собой соответственно атом водорода, и R¹ представляет собой линейный и насыщенный, в частности C₁₄, алкильный радикал.

Это производное соответствует следующей формуле:

Такое производное, в частности, предлагается к продаже компанией Evonick Goldschmidt под названием Phytosphingosine SLC.

Производное салицилата фитосфингозина, которое применяют согласно настоящему изобретению, представляет собой производное, как определено выше.

Соответствующие количества производного салицилата фитосфингозина и лизата, образующие комбинацию по настоящему изобретению, которые могут применяться, также называемые "эффективные количества", зависят, конечно, от желаемого эффекта и поэтому могут изменяться в значительной степени.

В контексте настоящего изобретения выражение "эффективное количество" предназначено для обозначения минимального количества, необходимого для наблюдения ожидаемого эффекта, а именно косметического эффекта или терапевтического эффекта, причем понимают, что эффективные количества, необходимые для достижения косметического эффекта или терапевтического эффекта в зависимости от ситуации могут быть идентичными или различными.

Для определения порядка величины каждое из двух соединений по изобретению может присутствовать в количестве от 0,0001% до 50% от общей массы композиции, в частности в количестве от 0,001% до 10% от общей массы композиции.

В частности, в композиции по настоящему изобретению активный агент, образующий лизат и принадлежащий к роду Bifidobacterium species, может применяться в количестве по меньшей мере 0,001% (в пересчете на массу сухого вещества), в частности в количестве от 0,01% до 20%, и в более частном случае в количестве от 0,01% до 15 масс.% сухого активного вещества по отношению к общей массе подложки или композиции, содержащей его.

Производное салицилата фитосфингозина в композиции по настоящему изобретению, со своей стороны, может быть получено в количестве по меньшей мере от 0,0001% (в пересчете на массу сухого вещества), в частности в количестве от 0,001% до 20%, и в более частном случае в количестве от 0,05% до 2 масс.% сухого активного материала по отношению к полной общей массе подложки или композиции, его содержащей.

Композиция по изобретению

Рассматриваемые композиции по изобретению могут быть косметическими или фармацевтическими, в частности дерматологическими.

В контексте настоящего изобретения выражение "предотвращение состояния" предназначено для обозначения замедления возникновения состояний, связанных со старением кожи, в частности, как определено выше.

Само собой разумеется, что во всех рассматриваемых композициях по изобретению применяется физиологически приемлемая среда.

В контексте настоящего изобретения термин "физиологически приемлемая среда" предназначен для обозначения среды, подходящей для нанесения композиции на кератиновый материал, в частности на кожу.

Согласно одному конкретному примеру осуществления изобретения, композиция по изобретению может также включать по меньшей мере один дополнительный агент, который является активным на коже.

Количества различных компонентов, которые могут быть добавлены в комбинацию по изобретению, являются традиционно применяемыми в рассматриваемых областях.

Дополнительные активные агенты

В качестве примеров дополнительных активных агентов, которые могут применяться в контексте настоящего изобретения, можно упомянуть активные агенты для улучшения состояния кожи, например гидратирующие или увлажняющие активные агенты, или активные агенты для улучшения естественного липидного барьера, например керамиды, сульфаты холестерина и/или жирные кислоты, а также их смеси.

Можно также применять ферменты, воздействующие на кожу, например протеазы, липазы, цереброзидазы, амидазы и/или меланазы, а также их смеси.

Также можно применять активные агенты из микроорганизмов, в частности из пробиотического микроорганизма, например такие как описано в заявках WO 2006/000992 и WO 2006/037922.

В контексте настоящего изобретения термин "пробиотический микроорганизм" предназначен для обозначения живого микроорганизма, который при употреблении в соответствующем количестве оказывает положительное воздействие на здоровье хозяина согласно публикации "Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotic in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, 6 October 2001", и который может, в частности, улучшать кишечный микробный баланс.

Микроорганизмы, применяемые согласно изобретению, могут быть выбраны, в частности, из аскомицетов, таких как Saccharomyces, Yarrowia, Kluyveromyces, Torulaspora, Schizosaccharomyces pombe, Debaromyces, Candida, Pichia, Aspergillus и Peniciltium, бактерий рода Bifidobacterium, Bacteroides, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Enterococcus, Lactococcus, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus и Lactobacillus, а также их смесей.

В качестве аскомицетов, наиболее применимых для настоящего изобретения, можно упомянуть, в частности, Yarrowia lipolitica и Kluyveromyces lactis, равно как Saccharomyces cereviseae, Torulaspora, Schizosaccharamyces pombe, Candida и Pichia.

Конкретные примеры пробиотических микроорганизмов представляют собой Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Lacfobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii subsp.Lactis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus GG), Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Staphylococccus carnosus и Staphylococcus xylosus, a также их смеси.

В более частном случае указанные микроорганизмы представляют собой пробиотические микроорганизмы, полученные из группы молочнокислых бактерий, таких как, в частности, Lactobacillus и/или Bifidobacterium. В качестве примера этих молочнокислых бактерий можно упомянуть, в частности, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis или Bifidobacterium pseudocatenulatum, а также их смеси.

Штамм Bifidobacterium lactis можно получить от компании Hansen (Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Alle, P.O. Box 407, DK-2970 Hoersholm, Denmark) под названием Bb 12.

Микроорганизм(ы) могут содержаться в композиции по изобретению в живой, полуактивной или инактивированной, мертвой форме.

Он (они) могут также содержаться в виде фракций компонентов клетки или в форме метаболитов. Микроорганизм(ы), метаболит(ы) или фракцию(и) можно также вводить в форме лиофилизированного порошка, супернатанта культуральной жидкости и/или, в случае необходимости, в концентрированной форме.

В конкретном случае композиций для местного применения может оказаться эффективным применение этих микроорганизмов в инактивированной или даже мертвой форме.

Что касается пробиотических микроорганизмов, обычно применяют следующее роды бактерий и дрожжей:

- Молочнокислые бактерии, продуцирующие сахар из молочной кислоты путем ферментации. Они разделяются на две группы согласно морфологии:

- Lactobacillus species: acidophilus (LC1, NCFB 1748); amylovorus, casei (Shirota), rhamnosus (штамм GG), brevis, crispatus, delbrueckii (subsp bulgaricus, lactis), fermemtum, helveticus, gallinarum, gasseri, lohnsonii, paracasei, plantarum, reuteri, rhamnosus, salivarius),

- Gocci: Enterocossus (faecalis, faeciul), Lactococcus lactis (subspp lactis или cremoris), Leuconstoc mesenteroides subsp dextranicum, Pediococcus acidilactici (корм для животных), Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus salvarius subsp.Thermophilus,

- Бифидобактерии или bifidobacterium species: Bifidobacterium adolescentis; animalis, bifidum, breve, lactis, longum, infantis,

- Дрожжи: Saccharomyces (cerevisiae или boulardii),

- Другие спорообразующие бактерии: Bacillus (cereus var toyo или subtilis), Bacillus coagulans, B. licheniformis, Escherichia coli strain nissle,

Propionibacterium freudenreichii.

Наиболее часто применяемыми пробиотиками являются молочнокислые бактерии и бифидобактерии.

Конкретными примерами пробиотических микроорганизмов, наиболее применимых для изобретения, являются Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei subsp. Casei, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii subsp. Lactis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus GG), Lactobacillus sake, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Staphylococccus carnosus и Staphylococcus xylosus, a также их смеси.

В более частном случае они представляют собой пробиотические микроорганизмы, полученные из группы молочнокислых бактерий, таких как, в частности, Lactobacillus и/или Bifidobacterium. В качестве примера этих молочнокислых бактерий особо можно упомянуть Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei или Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis или Bifidobacterium pseudocatenulatum, а также их смеси.

Наиболее применимыми видами являются Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium longum и Bifidobacterum Lactis NCC 2818 (также обозначаемый как Bb12 АТСС 27536), соответственно депонируемые согласно Будапештскому договору с Институтом Пастера (28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cedex 15) от 30/06/92, 12/01/99, 15/04/99, 15/04/99 и 07/06/05 под следующими ссылками: CNCM I-1225, CNCM I-2116, CNCM I-2168 и CNCM I-2170 и CNCM I-3446, а также род Bifidobacterium longum (BB536). Штамм Bifidobacterium lactis CNCM I-3446 можно получить от компании Hansen (Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Alle, P.O. Box 407, DK-2970 Hoersholm, Denmark).

Другие примеры активных агентов, пригодных для применения в настоящем изобретении, включают: анальгезирующие активные агенты, противодрожжевые активные агенты, антибактериальные активные агенты, противопаразитарные активные агенты, противогрибковые активные агенты, противовирусные активные агенты, стероидные противовоспалительные активные агенты, анестезирующие активные агенты, противозудные активные агенты, кератолитические активные агенты, активные агенты - ловушки свободных радикалов, антисеборейные активные агенты, активные агенты против перхоти, противоугревые активные агенты, активные агенты, нацеленные на предотвращение старения кожи и/или на улучшение состояния кожи, активные агенты против старения, антидерматитные активные агенты, активные агенты против раздражения, иммуномодулирующие активные агенты, активные агенты для ухода за сухой кожей, активные агенты против пота, противопсориазные активные агенты, антигистаминные активные агенты, заживляющие активные агенты, активные агенты для искусственного загара, антиоксиданты, например зеленый чай или его активные фракции, глицерин, лапонит, кофеин, ароматические эфирные масла, депигментирующие активные агенты, активные агенты - скрабы, регуляторы липидного обмена, смягчающие, освежающие, дезодорирующие, уменьшающие чувствительность, отбеливающие или питательные активные агенты и активные агенты для уменьшения дифференциации и/или пролиферации и/или пигментации клеток кожи, а также смеси этих агентов.

Дополнительные активные агенты могут также быть выбраны из агентов, улучшающих барьерную функцию, агентов препятствующих стягиванию кожи, антигликирующих агентов, агентов, стимулирующих синтез дермальных и/или эпидермальных макромолекул и/или предотвращающих их распад, агентов, стимулирующих пролиферацию фибробластов или кератиноцитов и/или дифференциацию кератиноцитов, агентов, способствующих созреванию роговой оболочки, ингибиторов NO-синтазы, антагонистов периферийного бензодиазепинового рецептора (ПБР), агентов, увеличивающих активность сальных желез, агентов, стимулирующих энергетический метаболизм клеток, растягивающих агентов, агентов для реструктуризации жиров, агентов, способствующих похудению, агентов, способствующих капиллярному кровообращению в коже, успокаивающих средств, агентов, регулирующих образование кожного сала, или антисеборейных агентов, вяжущих средств, противовоспалительных средств и агентов против угрей.

Среди активных агентов и, в частности, активных агентов, замедляющих старение, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, можно упомянуть посредством неограничивающих примеров: экстракты белков соевых бобов, например продукт, предлагаемый компанией Silab под торговой маркой Raffermine®, аденозин или синтетический аденозин, например продукт, предлагаемый компанией Pharma Waldoff, про-ксилан, экстракт семян ржи, например продукт, предлагаемый компанией Silab под названием Coheliss, экстракты люцерны, например, предлагаемые компанией Silab под названием Vitanol, тетрапептид (N-ацетил-Gln-ASP-VAL-HIS), например продукт, предлагаемый компанией Cognis под названием Dermican LS 9745, трипептиды и дипептиды риса, например, предлагаемые компанией Silab под названием Nutriskin, экстракты семян Vigna aconitifolia, например, предлагаемые компанией Cognis под названиями Vitoptine LS 9529 и Vit-A-Like LS9737, экстракты Euglena gracilis, например, поставляемые компанией Sederma под названием Chronodyn, аминокислоты пшеницы, связанные с пальмитиновой кислотой, предлагаемые компанией Seppic под названием Deepline PVB (Lipacide PVB), экстракты черники, например, Herbasol Myrtille Extract от компании Cosmetochem, экстракты корней имбиря, водные экстракты шиитаке (Lentinus edodes), например, Fermiskin от компании Silab и антарктицин, предлагаемый компанией Lipotec, экстракты Punica granatum, аргирелин SC36 (гексапептид (ацетил-Glu-Glu-Mefh-Glu-Arg-Arg-амид)) от компании Lipotec, экстракт овса, например продукт, предлагаемый компанией Silab под названием Reductine, экстракт пурпурного риса, например, от компании Oryza, дисперсии клеток цветков винограда, например цветков винограда Fiber Booster Sequoia от компании Naolys, феруловая кислота, например Oryzaferulix от компании Oryza Oil and Fat, экстракты Voandzeia subterranea (бамбара), например Filadyn LS 9397 от компании Cognis, экстракты соевых бобов, например продукт Elhibin, предлагаемый компанией Pentapharm, гидролизованный экстракт фрукта Prunus domestica, например, под названием Clairju от компании Ichimaru Pharco.

В частности, среди других агентов, которые активны на коже и применимы для изобретения, можно упомянуть гидратирующие и/или отшелушивающие активные агенты, например гликоль, мочевину или их производные, ХЕПЕС (HEPES), хелатирующие агенты, детергенты и производные жасмоновой кислоты, а также их смеси.

Специалист в данной области техники выберет указанный активный агент(ы) в соответствии с желаемым воздействием на кератиновые материалы.

Галеновые формы

Для перорального введения композиция по изобретению может находиться в любой из подходящих форм, в частности, в виде раствора для перорального применения, сиропа, таблетки, таблетки, покрытой сахаром, гелевой капсулы, капсулы или пищевого продукта или пищевой добавки.

Композиция по изобретению может также включать по меньшей мере один соответствующий эксципиент, применимый для перорального приема.

Рассматриваемую комбинацию по изобретению можно эффективно применять местно таким же образом, как и любую композицию, содержащую ее.

Композиция, предназначенная для местного применения, может находиться, в частности, в виде водного, водно-спиртового или масляного раствора, дисперсии типа раствора или дисперсии типа лосьона или сыворотки, эмульсии жидкой или полужидкой консистенции типа молока, полученной диспергированием жирной фазы в водной фазе (ж/в) или наоборот (в/ж), или суспензии или эмульсии мягкой, полутвердой или твердой консистенции типа крема, водного или безводного геля, или же микроэмульсии, микрокапсул, микрочастиц или везикулярной дисперсии ионного и/или неионного типа.

Значение рН композиции по изобретению в случае когда она включает по меньшей мере одну водную фазу (например, водные растворы, эмульсии и т.д.) составляет предпочтительно от 4 до 9, предпочтительно от 4 до 7, преимущественно от 5 до 6, и, в частности, значение рН составляет 5,5.

Композиции по изобретению может быть более или менее жидкой и иметь вид белого или окрашенного крема, мази, молочка, лосьона, сыворотки, пасты или пены. Ее необязательно можно наносить на кожу в виде аэрозоля. Она может также находиться в твердой форме и, например, в форме карандаша. Ее можно применять в качестве продукта для ухода, а также как туалетный продукт и/или косметический продукт.

Эта композиция может представлять собой маску, очищающий, защитный, лечебный или ухаживающий крем для лица, для рук, для ног или для тела (например, дневной крем, ночной крем, крем для снятия макияжа, крем-основу, солнцезащитный крем), молочко для снятия макияжа или лосьон для ухода за кожей, гель или пену, например очищающий лосьон.

В общем, любую композицию по изобретению можно наносить на кожу (на любую область кожи тела) или на слизистые мембраны (ротовой полости, скул, десен, половых органов, конъюнктивальные и т.д.).

Косметическая композиция может также содержать известные адъюванты, которые являются общепринятыми в области косметики, например гидрофильные или липофильные гелеобразующие агенты, гидрофильные или липофильные добавки, консерванты, антиоксиданты, растворители, отдушки, наполнители, средства, защищающие от УФ (солнца), поглотители запахов и красители. Содержание и природа компонентов, применяемых в композициях согласно изобретению, подбираются специалистами в данной области, чтобы существенно не повлиять на действие рассматриваемой комбинации согласно изобретению.

Комбинация согласно изобретению может оказаться, в частности, эффективной для улучшения увлажнения, гомеостаза кожи и, в частности, эпидермиса, барьерной функции кожи, предотвращения и/или лечения признаков старения эпидермиса, например морщин, мимических морщинок, потери прочности, эластичности, плотности и/или тонуса эпидермиса.

Состояниями кожи, для которых в более частном случае предназначено настоящее изобретение, могут быть сухая и очень сухая кожа, и кожа, имеющая возрастные проявления, в частности кожа у женщин, которым более 45 лет и/или в постменопаузальный период, или даже у очень пожилых женщин.

Как описано выше, настоящее изобретение также относится к способу, в частности косметическому способу, содержащему по меньшей мере введение по меньшей мере одной комбинации по изобретению индивиду, подверженному старению кожи.

Такой способ лечения можно осуществлять, в частности, путем местного или перорального введения рассматриваемой комбинации по изобретению, например, ежедневно.

Способ по изобретению может включать единственное введение.

Согласно другому примеру осуществления изобретения, применение повторяют, например, 2-3 раза в день в течение одного дня или больше, и в основном в течение длительного периода, равного по меньшей мере 4 неделям или даже 4-15 неделям, с одним или более периодами прерывания в соответствующих случаях.

В описании и в следующих примерах, если не указано другое, проценты представляют собой массовые проценты и диапазоны значений, сформулированные в виде "от до " включают указанные нижние и верхние пределы.

Представленные далее примеры и фигура представляют собой неограничивающую иллюстрацию области изобретения.

Пример 1

В этом примере в качестве лизата применяли продукт, предлагаемый компанией К. RICHTER GmbH под названием Repair Complex CLR^® и который образуется из инактивированного лизата вида Bifidobacterium longum, и производное салицилата фитосфингозина, представляющее собой продукт, предлагаемый компанией Evonick Goldschmidt под названием Phytosphingosine SLC.

Проверяли действие следующих четырех композиций на дифференциацию клеток воссозданного эпидермиса Episkin^®.

А: основа рецептуры (этиловый спирт (3%) и вода (97%)),

Б: лизат (этиловый спирт (3%), вода (87%), лизат (10%)),

В: салицилат фитосфингозина (этиловый спирт (3%), вода

(96,998%), салицилат фитосфингозина (0,002%)), и

Г: комбинация по изобретению = (0,002% салицилата фитосфингозина + 10% лизата + этиловый спирт (3%) + вода (86,998%)).

Воссозданный эпидермис J6 Episkin^® помещали в 12-луночные планшеты, содержащие 2 мл поддерживающей среды, и культивировали при 37°С и 5% СO₂ в течение 24 часов. После инкубирования на эпидермис наносили местно испытывамые композиции (50 мкл/восстановленный эпидермис) и инкубировали в течение 6 часов.

Действие определяли путем анализа экспрессии генов цитокератина 6В (К6В), цитокератина 10 (К10) и инволюкрина (INV), с использованием метода ПЦР в реальном времени (количественная ПЦР, qPCR) через 6 часов после обработки.

1 - Применяемые протоколы

а) Анализ дифференциальной экспрессии

Экспрессию выбранных маркеров оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) по информационной РНК, извлеченной из воссозданного эпидермиса Episkin^® для случаев обработки каждой из композиций (дубликаты объединяли перед извлечением РНК) через 6, 24 и 48 часов после обработки.

б) Обратная транскрипция

- Всю РНК извлекали из каждого образца с использованием TRI-реагента.

- Потенциально загрязняющие следы ДНК удаляли путем обработки системой, свободной от ДНК (Ambion ref, 1906). РНК количественно определяли с использованием Nanovue (Amersham).

- Реакцию обратной транскрипции и РНК проводили в присутствии олиго(dT) праймера и фермента Superscript II (Gibco).

- Образующуюся кДНК определяли количественно с использованием Nanovue (Amersham), и концентрацию кДНК корректировали до значения 10 нг/мкл.

в) Количественная ПЦР

ПЦР реакции (полимеразные цепные реакции) проводили в виде количественной ПЦР с помощью системы "Light Cycler" (Roche Molecular Systems Inc.) Эта аналитическая система делает возможным проведение быстрых и эффективных ПЦР реакции вместо предварительного установления аналитических условий для различных праймеров. Она состоит из двух основных компонентов:

- оптимизированного термоциклера, позволяющего осуществлять чрезвычайно быстрый перенос тепла;

- флуориметра, позволяющего осуществлять продолжительное измерение интенсивности флуоресценции метки, объединяющейся с ДНК (детектирование при 521 нм).

Применяли пары проб, специфичных для изучаемых генов, что позволяет осуществлять амплификацию следующих специфичных фрагментов:

Название гена (кодируемый белок)	Аббревиатура	Банк генов	кДНК, п.о.
Глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа печени	G3PDH	NM 002046	269
Цитокератин 6 В	К6В	NM 005555	277
Цитокератин 10	К10	NM 000421	236
Инволюкрин	INV	NM 005547	251

Реакционная смесь (конечный объем 10 мкл) для каждого образца содержит следующее:

- 2,5 мкг кДНК.

- Праймеры для различных применяемых маркеров.

- Реакционную смесь (Roche), содержащую фермент ДНК-полимеразу Taq, метку SR Green I (флуорофор, который объединяется с двухцепочечной ДНК на стадии удлинения) и MgCl₂.

г) Обработка данных количественной ПЦР.

Флуоресценцию, встраивающуюся в амплифицированную ДНК, измеряют непрерывно в течение циклов ПЦР. Эта система позволяет получать кривые измерения флуоресценции как функции циклов ПЦР и таким образом оценивать значение относительной экспрессии для каждого маркера.

Число циклов определяют на основе точек "выхода" кривых флуоресценции. Для отдельного анализируемого маркера чем позже выходит образец (большое число циклов), тем меньше начальное число копий иРНК.

Величину относительной экспрессии выражают в произвольных единицах измерения согласно следующей формуле:

(1/2 ^{число циклов})×10⁶.

д) Стандартизация эффектов, наблюдаемых при экспрессии гена

Для стандартизованной интерпретации применяли следующую схему классификации:

Относительная экспрессия по сравнению с контролем, %	Классификация наблюдаемого эффекта
>150% и <200%	Умеренная стимуляция, требует подтверждения
>200%	Отчетливая стимуляция
>300%	Сильная стимуляция
<65% и >50%	Умеренное ингибирование
<50% и >30%	Отчетливое ингибирование
<30%	Сильное ингибирование

2 - Результаты

Кинетика экспрессии для трех исследований, относящихся к маркерам, представлена в таблице далее и проиллюстрирована на чертеже.

Данные результаты относятся к количеству иРНК G3PDH (референсный ген) и выражены в % от необработанного контроля.

Обработка	К6В	К10	INV
6 часов	Контроль	100	100	100
Композиция А	117	121	176
Композиция Б (лизат)	176	102	153
Композиция В (фитосфингозин)	158	122	146
Композиция Г (комбинация)	207	147	265

В условиях эксперимента этого теста оказалось, что через 6 часов экспрессию генов, кодирующих цитокератин 6 В, цитокератин 10 и инволюкрин, увеличивает только комбинация по настоящему изобретению.

Пример 2

В зависимости от случая данные соединения представляют собой соединения, указанные путем химических названий или по названиям CTFA (Ассоциации по парфюмерно-косметическим товарам и душистым веществам) (Международный словарь и указатель косметических ингредиентов).

Композиция для ухода за кожей лица в виде водного геля:

	масс.%
Фитосфингозин-SLC ®	0,002%
Repair Complex CLR®	10%
Натрия гиалуронат	0,4%
Ксантановая камедь	0,1%
1,2-Октандиол	0,3%
Этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль	0,099%
Глицерин	5%
Лимонная кислота	0,015%
Этиловый спирт	4,6%
4-(2-Гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота	1%
Жирные вещества	0,016%
Эмульгатор	0,099%
Наполнитель	0,2%
Консерванты	0,55%
Растворитель	1%
Ароматизатор	0,005%
Вода	достаточное количество до 100%