вакцинация менингококковыми конъюгатами

Формула изобретения

1. Способ иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, предусматривающий стадию введения пациенту композиции, содержащей, по меньшей мере, два из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) столбнячного анатоксина; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) столбнячного анатоксина; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) столбнячного анатоксина; и (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) столбнячного анатоксина, причем пациент предварительно иммунизирован (а) столбнячным анатоксином и/или (b) конъюгатом (i) капсульного сахарида микроорганизма, отличного от N.meningitidis, и (ii) столбнячного анатоксина.

2. Способ по п.1, в котором композиция содержит все четыре (а), (b), (с) и (d).

3. Способ по п.1, в котором пациент предварительно иммунизирован вакциной, содержащей столбнячный анатоксин.

4. Способ по п.1, в котором пациент предварительно иммунизирован вакциной, содержащей конъюгат Hib.

5. Способ по п.1, в котором пациент предварительно иммунизирован вакциной, содержащей по меньшей мере один пневмококковый коньюгат.

6. Способ по п.1, в котором пациент предварительно иммунизирован, по меньшей мере, за шесть месяцев до осуществления способа.

7. Способ по п.6, в котором пациент предварительно иммунизирован, по меньшей мере, за 8 лет до осуществления способа.

8. Способ по п.1, в котором предварительная иммунизация имела место в течение 1 года после рождения пациента.

9. Способ по п.1, в котором конъюгаты (a)-(d) менингококковых сахаридов содержат деполимеризованный(ые) капсульный(ые) сахарид(ы), который(ые) короче, чем нативные капсульные сахариды, содержащиеся в менингококках.

10. Способ по п.1, в котором конъюгаты менингококковых сахаридов содержат столбнячный анатоксин в качестве носителя и адипатный линкер.

11. Способ по п.1, предусматривающий использование не более 60 мкг столбнячного анатоксина в качестве носителя.

12. Способ по п.1, в котором композиция дополнительно содержит конъюгированный капсульный сахарид Streptococcus pneumoniae.

13. Способ по п.1, в котором композиция дополнительно содержит конъюгированный капсульный сахарид Haemophilus influenzae типа В.

14. Способ по п.1, в котором композиция дополнительно содержит белковый антиген Neisseria meningitidis серогруппы В.

15. Способ по п.1, в котором композиция содержит адъювант на основе гидроксида алюминия и/или адъювант на основе фосфата алюминия.

16. Способ по любому из пп.1-15, в котором заболевание, вызываемое Neisseria meningitidis, представляет собой менингококковый менингит.

17. Способ по п.2, в котором (а), (b), (с) и (d) присутствуют в соотношении 1:1:1:1 по отношению к массе сахарида.

18. Способ по любому из пп.1 и 2, 17, в котором композиция содержит между 2 и 10 мкг каждого капсульного сахарида.

19. Способ по п.9, в котором конъюгаты содержат деполимеризованный(ые) капсульный(ые) сахарид(ы), который(ые) короче, чем нативный капсульный сахарид.

20. Способ по п.2, в котором конъюгаты смешиваются с получением соотношения 1:1:1:1 (в расчете на массу сахарида).

21. Способ по п.1, в котором каждый менингококковый антиген на дозу составляет от 2 до 10 мкг на серогруппу (в расчете на сахарид).

22. Способ по п.2, в котором каждый менингококковый антиген на дозу составляет от 2 до 10 мкг на серогруппу (в расчете на сахарид).

23. Способ по п.20, в котором каждый менингококковый антиген на дозу составляет от 2 до 10 мкг на серогруппу (в расчете на сахарид).

24. Применение композиции, содержащей, по меньшей мере, два из (а), (b), (с) и (d), выбранных из группы, состоящей из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) столбнячного анатоксина; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) столбнячного анатоксина; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) столбнячного анатоксина; и (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) столбнячного анатоксина, в производстве лекарственного препарата для предотвращения заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis у пациента, причем пациент предварительно иммунизирован (а) столбнячным анатоксином и/или (b) конъюгатом (i) капсульного сахарида микроорганизма, отличного от N.meningitidis, и (ii) столбнячного анатоксина.

25. Применение по п.24, причем применяют все четыре (а), (b), (с) и (d).

26. Применение по п.24, в котором пациент предварительно иммунизирован, по меньшей мере, за шесть месяцев до применения.

27. Применение по п.26, в котором пациент предварительно иммунизирован, по меньшей мере, за 8 лет до применения.

28. Применение по п.24, в котором предварительная иммунизация имела место в течение 1 года после рождения пациента.

29. Применение по п.24, в котором конъюгаты (a)-(d) менингококковых сахаридов содержат деполимеризованный(ые) капсульный(ые) сахарид(ы), который(ые) короче, чем нативные капсульные сахариды, содержащиеся в менингококках.

30. Применение по п.24, в котором конъюгаты менингококковых сахаридов содержат столбнячный анатоксин в качестве носителя и адипатный линкер.

31. Применение по п.24, предусматривающее использование не более 60 мкг столбнячного анатоксина в качестве носителя.

32. Применение по п.24, в котором лекарственный препарат дополнительно содержит конъюгированный капсульный сахарид Streptococcus pneumoniae.

33. Применение по п.24, в котором лекарственный препарат дополнительно содержит конъюгированный капсульный сахарид Haemophilus influenzae типа В.

34. Применение по п.24, в котором лекарственный препарат дополнительно содержит белковый антиген Neisseria meningitidis серогруппы В.

35. Применение по п.24, в котором лекарственный препарат содержит адъювант на основе гидроксида алюминия и/или адъювант на основе фосфата алюминия.

36. Применение по любому из пп.24-35, в котором заболевание, вызываемое Neisseria meningitidis, представляет собой менингококковый менингит.

37. Применение по п.25, где (а), (b), (с) и (d) присутствуют в соотношении 1:1:1:1 по отношению к массе сахарида.

38. Применение по любому из пп.24 и 25, 37, в котором композиция содержит между 2 и 10 мкг каждого капсульного сахарида.

39. Применение по п.24, в котором конъюгаты содержат деполимеризованный(ые) капсульный(ые) сахарид(ы), который(ые) короче, чем нативный капсульный сахарид.

40. Применение по п.25, в котором конъюгаты смешиваются с получением соотношения 1:1:1:1 (в расчете на массу сахарида).

41. Применение по п.24, в котором каждый менингококковый антиген на дозу составляет от 2 до 10 мкг на серогруппу (в расчете на сахарид).

42. Применение по п.25, в котором каждый менингококковый антиген на дозу составляет от 2 до 10 мкг на серогруппу (в расчете на сахарид).

43. Применение по п.40, в котором каждый менингококковый антиген на дозу составляет от 2 до 10 мкг на серогруппу (в расчете на сахарид).

Описание изобретения к патенту

Все цитируемые здесь документы включены в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки.

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к вакцинам против Neisseria meningitidis. В частности, оно относится к вакцинам на основе конъюгированных капсульных сахаридов из множества серогрупп менингококков.

Предшествующий уровень техники изобретения

На основании различий капсульных полисахаридов микроорганизмов было выделено двенадцать серогрупп N.meningitidis (А, В, С, Н, I, К, L, 29E, W135, X, Y и Z). Группа А включает в себя патогены, чаще всего вызывающие эпидемические заболевания в странах, расположенных южнее Сахары. Патогены серогрупп В и С ответственны за подавляющее большинство случаев заболевания в США и большей части развитых стран. За остальные случаи заболевания в США и развитых странах ответственны патогены серогрупп W135 и Y.

Тетравалентная вакцина на основе капсульных полисахаридов менингококков серогрупп А, С, Y и W135 известна в течение многих лет [1, 2]. Несмотря на эффективность у подростков и взрослых она индуцирует слабый иммунный ответ и кратковременную защиту и не может быть использована у детей первого года жизни [например, ссылка 3], поскольку полисахариды являются Т-независимыми антигенами, которые индуцируют слабый иммунный ответ, который не может быть усилен с помощью вторичной иммунизации. Полисахариды в составе этой вакцины не конъюгированы [4].

Конъюгированные вакцины против менингококков серогруппы С были одобрены для введения человеку и включают в себя Menjugate [5], Meningitec и NeisVac-C . Также известны смеси конъюгатов сахаридов серогрупп А+С [6-8], и сообщалось о смесях конъюгатов сахаридов серогрупп A+C+W135+Y [9-13].

Хотя конъюгаты менингококковых сахаридов хорошо известны, они до сих пор не встроены в существующие педиатрические схемы иммунизации, которые в развитых странах, как правило, предусматривают введение вакцины против гепатита В при рождении; и, начиная с 2 месяцев, вакцины против дифтерии/столбняка/коклюша (D-T-P), конъюгата Н.influenzae типа b (Hib), инактивированного полиовируса и конъюгатов пневмококковых сахаридов.

Однако при введении конъюгированных вакцин в существующие схемы иммунизации следует решать проблему индуцируемой носителем супрессии эпитопов (или так называемой "супрессии носителем"), особенно супрессии, возникающей в результате прайминга носителем. "Супрессия носителем" представляет собой явление, при котором предварительная иммунизация животного белком-носителем предотвращает последующее индуцирование у него иммунного ответа против нового антигенного эпитопа, содержащегося в этом носителе [14].

Как сообщалось в ссылке 15, если несколько антигенов вакцины содержат одинаковый белковый компонент (используемый в качестве иммуногена и/или белка-носителя в составе конъюгата), существует возможность возникновения между этими антигенами интерференции. Описанный в ссылке 15 иммунный ответ на антиген, конъюгированный с носителем в виде столбнячного анатоксина (Tt), подавлялся предсуществующим иммунитетом против Tt.

В ссылке 16 описан неблагоприятный результат сочетания вакцины D-T-P с конъюгированной вакциной против Hib при использовании носителя в составе конъюгата Hib, совпадающего со столбнячным антигеном вакцины D-T-P. Авторы пришли к заключению, что такое явление "супрессии носителем", возникающее вследствие интерференции, создаваемой общим белком-носителем, должно приниматься во внимание при введении вакцин, содержащих множество конъюгатов.

В отличие от ссылок 15 и 16 в ссылке 17 сообщалось, что прайминг столбнячным анатоксином не оказывал отрицательного влияния на иммунный ответ на вводимый впоследствии конъюгат Hib-Tt, а супрессия наблюдалась у пациентов, получивших антитела против Tt от матери. Однако в ссылке 18 сообщалось об эффекте "супрессии эпитопов" в отношении пептидного конъюгата на основе Tt у пациентов, имеющих существующие антитела против Tt в результате противостолбнячной вакцинации.

В ссылке 19 высказано предположение о том, что конъюгат, содержащий в качестве носителя CRM197 (детоксифицированный мутант дифтерийного токсина), может оказаться неэффективным у детей, которые ранее не получали дифтерийный токсин в виде части вакцины (например, в виде части вакцины D-T-P или D-T). Эта работа получила дальнейшее развитие в ссылке 20, в которой было отмечено сохранение эффекта прайминга носителем в результате иммунизации D-T при дальнейшей иммунизации конъюгатами Hib.

Авторы ссылки 21 обнаружили, что предварительная иммунизация белком-носителем в виде дифтерийного или столбнячного анатоксина снижала рост содержания антител против Hib после последующей иммунизации капсульным сахаридом Hib, конъюгированным с указанными носителями, причем влияние оказывалось в равной мере на содержание и IgG1, и IgG2. Также подавлялись ответы на несущие элементы конъюгатов. Кроме того, наблюдалась более общая эпитопнеспецифичная супрессия, поскольку наблюдалось влияние предварительной иммунизации одним конъюгатом на иммунные ответы как на несущие, так и на сахаридные элементы второго конъюгата, вводимого четыре недели спустя.

В ссылке 22 описано использование различных белков-носителей в одной мультивалентной вакцине на основе пневмококковых конъюгатов, причем множество носителей использовалось во избежание супрессии носителем. Авторы предположили, что они использовали максимальную нагрузку белка-носителя, которая может применяться в составе мультивалентной конъюгированной вакцины без индуцирования отрицательной интерференции. В ссылке 23 сообщалось, что вакцины на основе пневмококковых конъюгатов, содержащие смешанные белки-носители, помимо антипневмококкового ответа, индуцируют побочные бустерные реакции на носители.

В ходе описанного в ссылке 24 исследования возможности введения вторично иммунизирующих доз противодифтерийной и противостолбнячной вакцин с моновалентными конъюгатами сахаридов менингококков серогруппы С выяснили, что титры антител против конъюгата менингококкового сахарида были снижены, если носителем являлся столбнячный анатоксин, а пациент ранее был иммунизирован содержащей столбнячный анатоксин вакциной.

Наконец, в ссылке 25 сообщалось, что "предварительный контакт с белком-носителем может либо усилить, либо подавить гуморальный ответ на полисахариды, введенные в составе сахаридно-белковых конъюгатов". Конъюгаты, использованные в соответствии со ссылкой 25, содержали в качестве белка-носителя столбнячный анатоксин или мутант CRM197.

Таким образом, ситуация, касающаяся прайминга и/или супрессии носителем, запутана, и остается неясным, будет ли иммунизирующее действие какого-либо конкретного конъюгата подвергаться отрицательному влиянию эффекта супрессии носителем или положительному влиянию усиления в результате прайминга носителем. До тех пор пока эта проблема не решена, конъюгированные вакцины на основе менингококковых сахаридов не могут быть встроены или добавлены к существующим педиатрическим схемам иммунизации. Кроме того, поскольку конъюгаты менингококковых сахаридов должны вводиться в виде тетравалентных смесей (т.е. четырех различных конъюгатов), риск возникновения супрессии носителем повышается еще больше.

Помимо проблемы прайминга носителем, оказывающего отрицательное влияние на иммунные ответы против конъюгатов сахаридов, возможна и обратная ситуация, т.е. иммунизация конъюгатом может оказывать отрицательное влияние на иммунные ответы против носителя [26].

Раскрытие настоящего изобретения

В ссылке 27 высказано предположение о том, что с супрессией носителем в вакцинах на основе конъюгатов менингококковых сахаридов следует бороться путем использования более одного типа белка-носителя. В частности, в ссылке 27 высказано предположение, что в качестве белка-носителя для конъюгатов менингококковых сахаридов должен использоваться белок D H.influenzae, причем альтернативой может также являться столбнячный анатоксин (Tt). Во избежание супрессии эпитопов в качестве альтернативного носителя в ссылке 28 также указан белок D. Аналогично, в ссылке 29 высказано предположение о том, что во избежание супрессии эпитопов в мультивалентных конъюгированных вакцинах в качестве носителя должны использоваться фимбрии Bordetella pertussis. Напротив, в соответствии с изобретением в качестве носителя для смешанных конъюгатов менингококковых сахаридов используют столбнячный анатоксин (Tt).

Более того, в ссылке 27 также содержится предположение о том, что вакцины на основе конъюгатов менингококковых сахаридов должны вводиться одновременно с вакцинами D-T-P-Hib (см., например, пример 3) с тем, чтобы отсутствовал предварительный контакт с белком-носителем из конъюгатов менингококковых сахаридов. Напротив, теперь выяснено, что конъюгаты менингококковых сахаридов могут быть введены пациентам, даже если они уже получали белок-носитель либо в качестве ранее введенного иммуногена (например, при иммунизации D-T-P или D-T), либо в качестве ранее введенного белка-носителя (например, в составе конъюгата Hib или вакцины на основе пневмококковых конъюгатов). В более раннем исследовании индуцируемой носителем супрессии эпитопов в моновалентных вакцинах на основе конъюгатов сахаридов серогруппы С [24] внимания эффекту какого-либо предшествующего введения конъюгатов не уделялось.

Отличаясь от ссылки 27, данные о способности пациента формировать иммунный ответ на конъюгат менингококкового сахарида, даже если он уже получал отличный конъюгат, также контрастируют и со ссылкой 21.

Таким образом, изобретение относится к способу иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, предусматривающему стадию введения пациенту композиции, содержащей, по меньшей мере, два из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) столбнячного анатоксина; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) столбнячного анатоксина; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) столбнячного анатоксина и (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) столбнячного анатоксина, причем пациент предварительно иммунизирован (а) столбнячным анатоксином и/или (b) конъюгатом (i) капсульного сахарида микроорганизма, отличного от N.meningitidis, и (ii) столбнячного анатоксина.

Изобретение также относится к применению, по меньшей мере, двух из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) столбнячного анатоксина; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) столбнячного анатоксина; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) столбнячного анатоксина и (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) столбнячного анатоксина, в производстве лекарственного препарата для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, причем пациент предварительно иммунизирован (а) столбнячным анатоксином и/или (b) конъюгатом (i) капсульного сахарида микроорганизма, отличного от N.meningitidis, и (ii) столбнячного анатоксина.

Заболевание, вызываемое менингококками, предпочтительно представляет собой менингит, более предпочтительно бактериальный менингит и наиболее предпочтительно менингит, вызываемый менингококками. Таким образом, изобретение может обеспечивать защиту от менингококковых инфекций, вызывающих менингит.

Предварительно иммунизированный пациент

Подлежащий иммунизации пациент предварительно иммунизирован: (а) столбнячным анатоксином и/или (b) конъюгатом (i) капсульного сахарида микроорганизма, отличного от Neisseria meningitidis, и (ii) столбнячного анатоксина. В типичной предварительной иммунизации используют антиген столбнячного анатоксина; конъюгат капсульного сахарида Hib, содержащий носитель в виде столбнячного анатоксина, и/или конъюгат пневмококкового капсульного сахарида, содержащий носитель в виде столбнячного анатоксина.

Пациент получал, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3 или более) дозу преиммунизирующего(их) антигена(ов), и указанную дозу (или первую из множества доз) вводили пациенту, по меньшей мере, за шесть (например, за 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 36, 48, 60, 120, 180, 240, 300 или более) месяцев до иммунизации конъюгатами менингококковыми сахаридами по изобретению. В предпочтительной группе пациентов предварительная иммунизация имела место в течение 3 лет после рождения, например в течение 2 лет после рождения, в течение 1 года после рождения, в течение 6 месяцев после рождения или даже в течение 3 месяцев, 2 месяцев или 1 месяца после рождения.

Подлежащий в соответствии с изобретением иммунизации пациент, как правило, является человеком. Человек, как правило, находится в возрасте, по меньшей мере, 1 месяца, например, по меньшей мере, 2 месяцев, по меньшей мере, 3 месяцев, по меньшей мере, 4 месяцев, по меньшей мере, 6 месяцев, по меньшей мере, 2 лет, по меньшей мере, 5 лет, по меньшей мере, 11 лет, по меньшей мере, 17 лет, по меньшей мере, 40 лет, по меньшей мере, 55 лет и т.д. В предпочтительную выборку пациентов входят пациенты в возрасте, по меньшей мере, 6 месяцев. Другая предпочтительная выборка пациентов входит в возрастную группу 2-55 лет, а другая предпочтительная выборка пациентов входит в возрастную группу 11-55 лет. В еще одну предпочтительную выборку пациентов входят пациенты в возрасте менее 11 лет, например в возрасте 2-11 лет. Однако во всех случаях независимо от возраста пациент предварительно иммунизирован, как описано в настоящем описании.

Пациент, как правило, получает столбнячный анатоксин в виде антигена 'Т' в ходе предварительной иммунизации D-T-P или D-T. Такие иммунизации, как правило, проводят у новорожденных детей в возрасте 2, 3 и 4 месяцев. Если для иммунизации используют противококлюшную вакцину, эта вакцина может представлять собой цельноклеточную, или клеточную, противококлюшную вакцину ( Pw ), но предпочтительно представляет собой бесклеточную противококлюшную вакцину ( Ра ). Преиммунизационные вакцины Ра, как правило, содержат один, два или три из следующих широко известных и хорошо охарактеризованных антигенов В.pertussis: (1) коклюшного анатоксина ( РТ ), детоксифицированного либо химическими средствами, либо с помощью сайт-специфического мутагенеза, например, мутанта 9K/129G [30]; (2) волокнистого гемагглютинина ( FHA ); (3) пертактина (также известного как белок внешней мембраны массой 69 килодальтон). Бесклеточные противококлюшные вакцины также могут содержать агглютиноген-2 и/или агглютиноген-3. Антиген D , используемый в предварительной иммунизации D-Т-Р, как правило, представляет собой дифтерийный анатоксин.

Пациент также может получить или, альтернативно, получает столбнячный анатоксин в виде белка-носителя в составе белково-сахаридного конъюгата. Такие конъюгаты включают в себя конъюгат PRP-T Hib [см. таблицу 14-7 из ссылки 31], например продукты ActHIB , OmniHIB и HIBERIX . Пациент также может быть предварительно иммунизирован конъюгатом менингококкового сахарида серогруппы С ( MenC ). Конъюгаты MenC, в которых в качестве носителя используют столбнячный анатоксин, включают в себя продукт NeisVac-C . Однако предпочтительно, чтобы пациент был предварительно иммунизирован конъюгатом Hib и/или пневмококковым конъюгатом, а не конъюгатом MenC. Если пациент был предварительно иммунизирован конъюгатом MenC, то вводимая в соответствии с изобретением вакцина может содержать или не содержать конъюгат сахаридов серогруппы С.

Если предварительная иммунизация проведена конъюгированным антигеном, пациент почти неизбежно также получил и малое количество свободного столбнячного анатоксина в результате слабой загрязненности конъюгата (например, вызванной гидролизом конъюгата при хранении), но это малое количество, как правило, таково, что обеспечивает значимый иммунный ответ.

Столбнячный анатоксин представляет собой широко известный и хорошо охарактеризованный белок [см., например, главу 13 из ссылки 31], который может быть получен путем инактивации эндопептидазы (столбнячного токсина), продуцируемой Clostridium tetani. Токсин может быть обработан с получением анатоксина, который утрачивает токсичность, но остается антигенным и способен после введения стимулировать продукцию специфичных антител против токсина. Предпочтительными столбнячными анатоксинами являются анатоксины, полученные путем обработки формальдегидом. Столбнячный анатоксин может быть получен путем культивирования С.tetani в ростовой среде (например, в среде Latham, приготовленной на основе казеина крупного рогатого скота) с последующими обработкой формальдегидом, ультрафильтрацией и осаждением. Вещество может быть затем обработано в соответствии с методикой, предусматривающей стерильное фильтрование и/или диализ. Используемый в настоящем описании термин "столбнячный анатоксин" включает в себя производные столбнячного анатоксина, сохраняющие иммунную перекрестную реактивность со столбнячным токсином.

Результатом предварительной иммунизации является контакт иммунной системы пациента с преиммунизирующими антигенами. Это, как правило, означает, что у пациента индуцируется гуморальный ответ против Tt (как правило, с получением титра антител против Tt>0,01 МЕ/мл) и появляются В- и/или Т-лимфоциты памяти, специфичные в отношении Tt, т.е. предварительная иммунизация, как правило, обеспечивает индукцию у пациента иммунного ответа против Tt при вторичной иммунизации. Предварительная иммунизация, при которой Tt (или его производное) является носителем сахарида в составе конъюгата, индуцирует ответ против сахарида, и у пациента появляются В- и/или Т-лимфоциты памяти, специфичные в отношении сахарида, т.е. предварительная иммунизация, как правило, обеспечивает индукцию у пациента иммунного ответа против сахарида при вторичной иммунизации. Предпочтительно предварительная иммунизация обеспечивает индукцию у пациента защитного иммунитета, например, против столбняка или против сахаридсодержащего микроорганизма соответственно.

Таким образом, подлежащие в соответствии с изобретением иммунизации пациенты отличаются от пациентов вообще тем, что они являются членами подгруппы общей популяции, чья иммунная система уже выработала иммунный ответ на преиммунизирующие антигены таким образом, что иммунизация в соответствии с изобретением конъюгатом менингококкового сахарида, содержащим носитель в виде столбнячного анатоксина, индуцирует в этой подгруппе иммунный ответ, отличный от такового у пациентов, у которых иммунный ответ на преиммунизационные антигены ранее не индуцировался. Предпочтительными являются пациенты, предварительно иммунизированные Tt (или его производным), использованным в качестве носителя в составе конъюгата (особенно конъюгата Hib). Особенно предпочтительные пациенты предварительно иммунизированы Tt (или его производным), использованным в качестве носителя в составе конъюгата, а также Tt в качестве неконъюгированного иммуногена.

Помимо предварительной иммунизации столбнячным анатоксином в конъюгированной или неконъюгированной формах пациент может быть предварительно иммунизирован другими антигенами. Такие антигены включают в себя без ограничения коклюшный(ые) антиген(ы) - см. выше; дифтерийный анатоксин - см. выше; Haemophilus influenzae типа В - см. выше; поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg); полиовирус, такой как вакцина на основе инактивированного полиовируса (IPV); Streptococcus pneumoniae - см. выше; вирус гриппа; BCG; антигены вируса гепатита А; вирус кори; вирус эпидемического паротита; вирус краснухи; вирус ветряной оспы и т.д.

Пациент может быть предварительно иммунизирован или не иммунизирован одним или несколькими конъюгатами менингококковых сахаридов. В соответствии с одними предпочтительными вариантами выполнения на момент первичного введения конъюгата менингококкового сахарида пациенты уже предварительно иммунизированы Tt (или его производным). В соответствии с другими вариантами выполнения конъюгат менингококкового сахарида вводят пациенту, предварительно иммунизированному как (i) Tt или его производным, так и (ii) конъюгатом менингококкового сахарида.

Конъюгаты

В соответствии с изобретением пациентов иммунизируют конъюгированными сахаридами. Конъюгирование применяют для повышения иммуногенности сахаридов, поскольку оно позволяет перевести их из разряда Т-независимых антигенов в разряд Т-зависимых антигенов, обеспечивая таким образом прайминг с созданием иммунной памяти. Конъюгирование особенно применимо для создания педиатрических вакцин [например, ссылка 32] и представляет собой хорошо известный метод [обзор приводится, например, в ссылках 33-41].

Композиция, используемая в соответствии с изобретением, содержит, по меньшей мере, два конъюгата менингококковых сахаридов, причем каждый конъюгат содержит белок-носитель в виде столбнячного анатоксина (или его производного) и капсульный сахарид. Капсульные сахариды выбирают из серогрупп менингококков А, С, W135 и Y таким образом, что композиции содержат сахариды из 2, 3 или всех 4 из этих четырех серогрупп. Конкретные композиции содержат сахариды из серогрупп А и С; серогрупп А и W135; серогрупп А и Y; серогрупп С и W135; серогрупп С и Y; серогрупп W135 и Y; серогрупп А и С и W135; серогрупп А и С и Y; серогрупп А и W135 и Y; серогрупп С и W135 и Y; серогрупп А и С и W135 и Y. Наиболее предпочтительными являются композиции, содержащие сахариды всех четырех серогрупп.

Капсульные сахариды каждой из этих четырех серогрупп подробно описаны. Капсульный сахарид менингококка серогруппы А представляет собой гомополимер ( 1 6)-связанного N-ацетил-D-маннозамин-1-фосфата с частичным О-ацетилированием по положениям С3 и С4. Ацетильные группы могут быть заменены блокирующими группами во избежание гидролиза [42], но такие модифицированные сахариды по-прежнему будут являться сахаридами серогруппы А для целей настоящего изобретения. Капсульный сахарид серогруппы С представляет собой гомополимер ( 2 9)-связанной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, или NeuNAc ). Большинство штаммов серогруппы С содержат О-ацетильные группы в положениях С-7 и/или С-8 остатков сиаловой кислоты, но примерно у 15% клинических штаммов эти О-ацетильные группы отсутствуют [43, 44]. Структура сахарида записывается как 9)-NeuрNAc 7/8 ОАс-( 2 . Сахарид серогруппы W135 представляет собой полимер, состоящий из дисахаридных звеньев сиаловая кислота - галактоза. Как и сахарид серогруппы С, он характеризуется вариабельным О-ацетилированием, но в положениях 7 и 9 сиаловой кислоты [45]. Его структура записывается как 4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)- -(2 6)-D-Gal- -(1 . Сахарид серогруппы Y схож с сахаридом серогруппы W135 за исключением того, что его дисахаридное повторяющееся звено содержит глюкозу вместо галактозы. Как и сахарид серогруппы W135, он характеризуется вариабельным О-ацетилированием в положениях 7 и 9 сиаловой кислоты [45]. Структура сахарида серогруппы Y записывается как 4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)- -(2 6)-D-Glc- -(1 .

Сахариды, используемые в соответствии с изобретением, могут быть О-ацетилированными, как описано выше (например, характеризоваться таким же профилем О-ацетилирования, что и нативные капсульные сахариды), или они могут быть частично или полностью дез-О-ацетилированными по одному или нескольким положениям сахаридных циклов, или они могут быть гипер-О-ацетилированными по сравнению с нативными капсульными сахаридами.

Сахариды, используемые в соответствии с изобретением, предпочтительно короче, чем нативные капсульные сахариды, содержащиеся в бактериях. Таким образом, сахариды предпочтительно деполимеризованы, причем деполимеризация происходит после очистки, но до конъюгирования. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Предпочтительный метод деполимеризации предусматривает использование пероксида водорода [9]. Пероксид водорода добавляют к сахариду (например, с получением конечной концентрации Н₂О₂ 1%) и смесь затем инкубируют (например, примерно при 55°С) до тех пор, пока не достигается желаемый уровень сокращения длины цепи. Другой метод деполимеризации предусматривает кислотный гидролиз [10]. Специалистам в данной области техники известны и другие методы деполимеризации. Сахариды, используемые для получения конъюгатов для применения в соответствии с изобретением, могут быть получены в соответствии с любым из этих методов деполимеризации. Деполимеризация может быть использована для обеспечения оптимальной длины цепи для иммуногенности и/или для уменьшения длины цепи для облегчения физического манипулирования сахаридами.

Типичными белками-носителями для использования в конъюгатах являются бактериальные токсины или анатоксины, такие как дифтерийный токсин (или его мутант CRM₁₉₇) и столбнячный токсин. Другие известные белки-носители включают в себя белок внешней мембраны N.meningitidis, синтетические пептиды, белки теплового шока, белки возбудителя коклюша, цитокины, лимфокины, гормоны, факторы роста, искусственные белки, содержащие множественные эпитопы человеческих CD4⁺ Т-клеток из антигенов различных патогенов, белок D H.influenzae, поверхностный белок PspA пневмококков, железосвязывающие белки, токсин А или В С.difficile и т.д. Однако в соответствии с изобретением конъюгаты менингококковых сахаридов содержат белок-носитель в виде столбнячного анатоксина. Предпочтительным является ковалентное конъюгирование.

В композициях могут быть использованы более одного белка-носителя. Так, различные белки-носители могут быть использованы для сахаридов различных серогрупп, например сахариды серогруппы А могут быть конъюгированы с Tt, тогда как сахариды серогруппы С могут быть конъюгированы с Dt. Также более одного белка-носителя могут быть использованы для каждого конкретного сахаридного антигена, например сахариды серогруппы А могут быть подразделены на две группы, причем некоторые из них конъюгированы с Tt, a другие конъюгированы с Dt. Однако вообще предпочтительно использовать одинаковый белок-носитель для всех менингококковых сахаридов в композиции, а более предпочтительно для всех сахаридов (т.е. включая любые конъюгаты неменингококковых сахаридов, которые могут присутствовать).

Предпочтительно, чтобы композиции по изобретению не содержали никакого белка-носителя в виде дифтерийного анатоксина.

Один белок-носитель может нести более одного сахаридного антигена [46]. Например, один белок-носитель может быть конъюгирован с сахаридами серогрупп А и С. Для достижения этой цели сахариды могут быть смешаны перед проведением реакции конъюгирования. Однако, как правило, для каждой серогруппы предпочтительно получать отдельные конъюгаты. Конъюгаты предпочтительно смешивают с получением по существу отношения 1:1:1:1 (в расчете на массу сахарида), например значения массы сахаридов каждой серогруппы колеблются в пределах ±10% друг от друга. Обычное количество менингококкового антигена на серогруппу в композиции составляет от 1 мкг до 20 мкг, например от 2 до 10 мкг на серогруппу, или около 4 мкг. Альтернативно отношению 1:1:1:1 может использоваться двойная доза сахарида серогруппы А (2:1:1:1).

Предпочтительными являются конъюгаты с массовым отношением сахарид:белок от 1:15 (т.е. с избытком белка) до 15:1 (т.е. с избытком сахарида), предпочтительно от 1:10 до 10:1, более предпочтительно от 1:5 до 5:1. Избыток белка-носителя предпочтителен. Предпочтительными являются конъюгаты с отношением сахарид:белок около 1:12, или около 1:6, или около 1:3.

Конъюгаты могут быть использованы в сочетании со свободным белком-носителем [47]. Однако, если данный белок-носитель находится как в связанной, так и в конъюгированной формах в составе композиции по изобретению, количество неконъюгированной формы составляет предпочтительно не более 5% от общего количества белка-носителя в составе композиции в целом, а более предпочтительно составляет не более 2% по массе. Аналогично, масса неконъюгированного сахарида предпочтительно составляет не более 15% от общей массы сахарида.

Может использоваться любая подходящая реакция конъюгирования с применением по необходимости любого подходящего линкера.

Как правило, перед конъюгированием сахарид активируют или функционализируют. Активация может быть проведена, например, с помощью цианилирующих агентов, таких как CDAP (например, тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния [48, 49 и т.д.]). В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU; см. также введение в ссылке 39).

Связи через линкерную группу могут быть установлены в соответствии с любой известной методикой, например в соответствии с методиками, описанными в ссылках 50 и 51. Образование одного типа связи предусматривает восстановительное аминирование полисахарида, связывание полученной аминогруппы с одним концом адипатной линкерной группы с последующим связыванием белка с другим концом адипатной линкерной группы [37, 52, 53]. Другие линкеры включают в себя -пропионамидо [54], нитрофенилэтиламин [55], галогенацилгалогениды [56], гликозидные связи [57], 6-аминокапроновую кислоту [58], ADH [59], фрагменты С₄-С₁₂ [60] и т.д. Альтернативно использованию линкера может использоваться непосредственная связь. Образование непосредственных связей с белком может предусматривать окисление полисахарида с последующим восстановительным аминированием с белком, как описано, например, в ссылках 61 и 62.

Предпочтительная методика конъюгирования предусматривает введение аминогрупп в сахарид (например, путем замены концевых групп =O на -NH₂) с последующими образованием производного диэфира адипиновой кислоты (например, диэфира N-гидроксисукцинимида адипиновой кислоты) и взаимодействием с белком-носителем.

В одной предпочтительной методике конъюгирования сахарид взаимодействует с дигидразидом адипиновой кислоты. Что касается сахарида серогруппы А, на этой стадии также может быть добавлен карбодиимид. По завершении реакции добавляют цианоборгидрид натрия. Производное сахарида может затем быть выделено, например, путем ультрафильтрации. Производное сахарида затем смешивают с белком-носителем (например, со столбнячным анатоксином) и добавляют карбодиимид. По завершении реакции может быть выделен конъюгат. С дальнейшими подробностями этого метода конъюгирования можно ознакомиться в ссылке 10. Конъюгаты, получаемые в соответствии с этой методикой, например конъюгаты, содержащие носитель-столбнячный анатоксин и адипатный линкер, являются предпочтительными конъюгатами для использования для целей настоящего изобретения.

Предпочтительно конъюгаты получают по отдельности и затем смешивают. После смешивания концентрация смешанных конъюгатов может быть доведена, например, с помощью апирогенного фосфатно-буферного раствора. Перед смешиванием каждый конъюгат предпочтительно содержит не более 15 мкг носителя.

Результатом введения конъюгатов менингококковых сахаридов по изобретению предпочтительно является то, что на введенный сахарид каждой серогруппы у пациента развивается сывороточный бактерицидный гуморальный (SBA) ответ с повышением SBA титра (по сравнению с предварительно иммунизированным пациентом до получения смешанных конъюгатов менингококковых сахаридов), который, по меньшей мере, в 4 раза больше и предпочтительно в 8 раз больше. SBA тест является стандартным анализом коррелирующих параметров для определения уровня защиты от менингококков. Более подробно серологические коррелирующие параметры менингококковых вакцин обсуждаются в ссылке 63.

Дополнительные антигенные компоненты композиций, применяемые в соответствии с изобретением

Помимо конъюгатов менингококковых сахаридов композиции, применимые в соответствии с изобретением, могут при необходимости содержать 1, 2 или 3 из следующих дополнительных антигенов:

1. Конъюгированный капсульный сахарид S.pneumoniae [например, глава 23 ссылки 31; ссылки 64-66].

Предпочтительным является включение в состав сахаридов более одного серотипа S.pneumoniae. Например, широко используются смеси полисахаридов 23 различных серотипов, а также конъюгированные вакцины на основе полисахаридов 5-11 различных серотипов [67]. Например, PrevNar [68] содержит антигены семи серотипов (4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F), причем каждый сахарид индивидуально конъюгирован с CRM197 восстановительным аминированием в концентрации 2 мкг каждого сахарида на дозу объемом 0,5 мл (4 мкг серотипа 6В) и конъюгаты адсорбированы на адъюванте на основе фосфата алюминия. Если для применения в соответствии с изобретением в композицию включены пневмококковые конъюгаты, композиция предпочтительно содержит, по меньшей мере, серотипы 6В, 14, 19F и 23F.

2. Конъюгированный капсульный сахарид Н.influenzae типа В [например, глава 14 ссылки 31].

Белком-носителем для конъюгата может являться CRM197, Dt, столбнячный анатоксин или комплекс внешней мембраны N.meningitidis. Сахаридный остаток конъюгата может представлять собой полисахарид (например, полноразмерный полирибозилрибитолфосфат (PRP)), но предпочтительно деполимеризовать капсульные полисахариды с образованием олигосахаридов (например, с М.м. ~1-~5 кДа). Предпочтительный конъюгат Hib содержит олигосахарид, ковалентно связанный с CRM197 или Tt через адипатный линкер [69, 70]. Введение антигена Hib предпочтительно приводит к созданию концентрации анти-PRP антитела, составляющей >0,15 мкг/мл и более предпочтительно >1 мкг/мл. Если композиция содержит сахаридный антиген Hib, она также предпочтительно не содержит адъювант на основе гидроксида алюминия. Если композиция содержит адъювант на основе фосфата алюминия, антиген Hib может быть адсорбирован на адъювант [71] или может оставаться неадсорбированным [27]. Предотвращение адсорбции может быть достигнуто путем выбора нужного значения рН во время смешивания антигена/адъюванта, адъюванта с подходящей точкой нулевого заряда и подходящего порядка смешивания для разнообразных антигенов в композицию [72].

3. Белковый антиген Neisseria meningitidis серогруппы В [например, ссылка 73].

Композиция может содержать один или несколько из указанных дополнительных антигенов.

Такие антигены могут быть адсорбированы или не адсорбированы на соли алюминия.

Если конъюгаты менингококковых сахаридов вводят в виде многократных доз, ни одна, некоторые или все дозы могут содержать указанные дополнительные антигены.

Композиции, содержащие конъюгаты менингококковых сахаридов, предпочтительно не содержат дифтерийный анатоксин. Предпочтительно они не содержат коклюшные антигены. Предпочтительно они не содержат поверхностный антиген вируса гепатита В. Предпочтительно они не содержат полиовирус. Композиция предпочтительно содержит не более 50 мкг столбнячного анатоксина на один конъюгат менингококкового сахарида и более предпочтительно не более 50 мкг столбнячного анатоксина на конъюгаты всех менингококковых сахаридов в совокупности.

Состав композиции

Композиция, применимая в соответствии с изобретением, как правило, содержит фармацевтически приемлемый носитель. Такие носители включают в себя любой носитель, который сам по себе не индуцирует выработку антител, вредных для субъекта, получающего композицию. Подходящие носители, как правило, представляют собой крупные медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, сахароза, трегалоза, лактоза и агрегаты липидов (такие, как масляные капли или липосомы). Такие носители хорошо известны средним специалистам в данной области техники. Вакцины также могут содержать разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин и т.д. Кроме того, могут содержаться вспомогательные вещества, такие как увлажняющие вещества или эмульгаторы, рН-буферные вещества и т.п. Типичный носитель представляет собой стерильный апирогенный фосфатно-буферный физиологический раствор. С подробным обсуждением фармацевтически приемлемых носителей и наполнителей можно ознакомиться в ссылке 74.

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать антимикробное вещество, особенно если они упакованы в форму, содержащую множество доз.

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать поверхностно-активное вещество, например Tween (полисорбат), такой как Tween 80. Поверхностно-активные вещества, как правило, содержатся в низких концентрациях, например <0,01%.

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать соли натрия (например, хлорид натрия и/или фосфат натрия). Эти соли могут быть использованы для обеспечения изотоничности. Типичная концентрация NaCl составляет 10±2 мг/мл, например 8,8 мг/мл. Типичная концентрация фосфата натрия составляет 1,2 мг/мл.

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, как правило, содержат буфер, например фосфатный буфер.

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать сахарный спирт (например, маннит) или дисахарид (например, сахарозу или трегалозу), например, в концентрации около 15-30 мг/мл (например, 25 мг/мл), особенно если композиции подлежат лиофилизации или если они содержат вещество, восстановленное из лиофилизированного вещества. Однако предпочтительные композиции не лиофилизированы, т.е. все конъюгаты менингококковых сахаридов находятся в водной форме от стадии упаковки до стадии введения.

Как правило, композиции вводят пациенту непосредственно. Непосредственная доставка может быть осуществлена с помощью парентеральной инъекции (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно или в интерстициальное пространство ткани) или путем ректального, перорального, вагинального, местного, чрескожного, интраназального, глазного, ушного, легочного или иного чресслизистого введения. Предпочтительным является внутримышечное введение (например, в бедро или плечо). Инъекция может быть проведена с помощью иглы (например, иглы для подкожных инъекций), но альтернативно может быть применена безыгольная инъекция. Типичная доза при внутримышечном введении составляет 0,5 мл.

Конъюгаты менингококковых сахаридов множества серогрупп вводят в смеси в составе единой композиции. Композиция может быть введена в виде однократной дозы или может быть введена более одного раза по схеме многократного дозирования. Многократные введения могут быть использованы в ходе первичной иммунизации и/или в ходе вторичной иммунизации. За выполнением протокола первичной иммунизации может следовать протокол вторичной иммунизации конъюгатами менингококковых сахаридов. Надлежащие временные промежутки между первично иммунизирующими дозами (например, 4-16 недель) и между первичной и вторичной иммунизациями могут быть определены в соответствии с рутинными методиками. Конъюгаты могут быть удобно введены одновременно с другими вакцинами, например одновременно с вакциной D-T-P, или одновременно с вакциной на основе пневмококковых конъюгатов, или одновременно с вакциной против гриппа, или одновременно с вакциной MMR или MMRV. Эти вакцины, как правило, вводят раздельно, но в течение одного посещения врача.

Бактериальные инфекции способны поражать различные отделы организма, и, соответственно, композиции могут быть приготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть приготовлены в виде препаратов для инъекций либо в форме истинных растворов, либо суспензий. Также могут быть приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед введением (например, лиофилизированная композиция). Может быть приготовлена композиция для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Может быть приготовлена композиция для перорального введения, например, в форме таблетки или капсулы или в виде сиропа (при необходимости дополненного корригентами). Может быть приготовлена композиция для легочного введения, например, в форме ингалятора, содержащего мелкодисперсный порошок или спрей. Может быть приготовлена композиция в форме суппозитория или пессария. Может быть приготовлена композиция для назального, ушного или глазного введения, например, в форме спрея, капель, геля или порошка [например, ссылки 75 и 76]. Однако, как правило, конъюгаты менингококковых сахаридов включают в состав препаратов для внутримышечных инъекций.

Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать или не содержать вакцинный адъювант. Адъюванты, которые могут быть использованы в композициях по изобретению, включают в себя без ограничения:

А. Минералсодержащие композиции

Минералсодержащие композиции, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция. Изобретение предусматривает использование минеральных солей, таких как гидроксиды (например, оксигидроксиды), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [см., например, главы 8 и 9 ссылки 77], или смесей различных минеральных соединений, причем указанные соединения принимают любую подходящую форму (например, геля, кристаллического вещества, аморфного вещества и т.д.), и причем адсорбция является предпочтительной. Минералсодержащие композиции также могут быть приготовлены в форме частиц солей металлов [78].

Особенно предпочтительны фосфаты алюминия, а типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением РО₄/Al, составляющим от 0,84 до 0,92, содержащийся в концентрации около 0,6 мг Al ³⁺/мл. Может быть использована адсорбция на малом количестве фосфата алюминия, например от 50 до 100 мкг Al³⁺ на конъюгат на дозу. Если в композиции содержатся конъюгаты сахаридов множества видов бактерий, адсорбция всех конъюгатов необязательна.

B. Масляные эмульсии

Композиции в форме масляной эмульсии, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат эмульсии сквалена-воды, такие как MF59 [глава 10 ссылки 77; см. также ссылку 79] (5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85, приготовленные в виде субмикронных частиц с помощью микрофлуидайзера). Также могут быть использованы полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA).

C. Сапонинсодержащие составы [глава 22 ссылки 77]

В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы сапонинсодержащие составы. Сапонины представляют собой разнородную группу стероидных гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые содержатся в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветках широкого круга видов растений. В качестве адъюванта был хорошо исследован сапонин из коры мыльного дерева Quillaia saponaria Molina. Сапонин также может быть промышленно получен из Smilax ornata (сарсапарели), Gypsophilla paniculata (гипсофилы ползучей) и Saponaria officinalis (мыльного корня). Сапонинсодержащие адъювантные составы включают в себя очищенные составы, такие как QS21, равно как и липидные составы, такие как ISCOM. QS21 распространяется на рынке под наименованием Stimulon .

Сапонинсодержащие композиции очищали по методу ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. С помощью этих методов были выделены конкретные очищенные фракции, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B и QH-C. Предпочтительно сапонин представляет собой QS21. Методика получения QS21 описана в ссылке 80. Сапонинсодержащие составы также могут содержать стерин, такой как холестерин [81].

Сочетания сапонинов и холестеринов могут быть использованы для формирования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) [глава 23 ссылки 77]. ISCOM, как правило, также содержат фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. Для получения ISCOM может быть использован любой известный сапонин. Предпочтительно ISCOM содержит один или несколько из QuilA, QHA и QHC. ISCOM более подробно описаны в ссылках 81-83. При необходимости ISCOM могут не содержать дополнительных поверхностно-активных веществ [84].

С обзором разработки адъювантов на основе сапонинов можно ознакомиться в ссылках 85 и 86.

D. Виросомы и вирусоподобные частицы

Виросомы и вирусоподобные частицы (VLP) также могут быть использованы в качестве адъювантов в соответствии с изобретением. Эти структуры, как правило, содержат один или несколько вирусных белков, при необходимости объединенных или включенных в композицию с фосфолипидом. Как правило, они не патогенны, не способны к репликации и не содержат каких-либо частей нативного вирусного генома. Вирусные белки могут быть получены в соответствии с рекомбинантными методиками или выделены из цельных вирусов. Такие вирусные белки, пригодные для использования в получении виросом или VLP, включают в себя белки, полученные из вируса гриппа (такие, как НА или NA), вируса гепатита В (такие, как коровые или капсидные белки), вируса гепатита Е, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса ящура, ретровируса, вируса Норуолк, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-фагов, Q -фага (такие, как белки оболочки), GA-фага, fr-фага, фага АР205 и Ту (такие, как белок р1 ретротранспозона Ту). VLP более подробно обсуждаются в ссылках 87-92. Виросомы более подробно обсуждаются, например, в ссылке 93.

Е. Бактериальные или микробные производные

Адъюванты, пригодные для использования в соответствии с изобретением, включают в себя бактериальные или микробные производные, такие как нетоксичные производные энтеробактериального липополисахарида (LPS), производные липида А, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и АДФ-рибозилирующие токсины и их обезвреженные производные.

Нетоксичные производные LPS включают в себя монофосфорил-липид A (MPL) и 3-О-дезацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3-дез-О-ацилированного монофосфорил-липида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительная форма 3-дез-О-ацилированного монофосфорил-липида А в виде "мелких частиц" описана в ссылке 94. Такие "мелкие частицы" 3dMPL достаточно малы для того, чтобы стерильно фильтроваться через мембрану с размером ячеи 0,22 мкм [94]. Другие нетоксичные производные LPS включают в себя миметики монофосфорил-липида А, такие как производные аминоалкилглюкозаминидфосфата, например RC-529 [95, 96].

Производные липида А включают в себя производные липида А из Escherichia coli, такие как ОМ-174. ОМ-174 описан, например, в ссылках 97 и 98.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя нуклеотидные последовательности, содержащие мотив CpG (динуклеотидную последовательность, состоящую из неметилированного цитозина, связанного фосфатной связью с гуанозином). Также был продемонстрирован иммуностимулирующий эффект двухцепочечных РНК и олигонуклеотидов, содержащих палиндромные или поли(dG) последовательности.

CpG могут содержать нуклеотидные модификации/аналоги, такие как фосфоротиоатные модификации, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. В ссылках 99, 100 и 101 описаны возможные аналогичные замены, например замена гуанозина 2 -дезокси-7-дезазагуанозином. Адъювантный эффект олигонуклеотидов CpG более подробно обсуждается в ссылках 102-107.

Последовательность CpG, такая как мотив GTCGTT или TTCGTT, может быть направлена на TLR9 [108]. Последовательность CpG, такая как CpG-A ODN, может специфично индуцировать Th1-зависимый иммунный ответ, или последовательность CpG, такая как CpG-B ODN, может более специфично индуцировать В-клеточный ответ. CpG-A и CpG-B ODN обсуждаются в ссылках 109-111. Предпочтительно CpG представляет собой CpG-A ODN.

Олигонуклеотид CpG предпочтительно конструируют таким образом, что 5 -конец доступен для распознавания рецептора. При необходимости две олигонуклеотидные последовательности CpG могут быть соединены своими 3 -концами с образованием "иммуномеров". См., например, ссылки 108 и 112-114.

В качестве адъювантов в соответствии с изобретением могут быть использованы бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины и их детоксифицированные производные. Белок предпочтительно происходит из Е.coli (из термолабильного энтеротоксина Е.coli "LT"), возбудителя холеры ("СТ") или возбудителя коклюша ("РТ"). Использование детоксифицированных АДФ-рибозилирующих токсинов в качестве мукозальных адъювантов описано в ссылке 115, а в качестве парентеральных адъювантов - в ссылке 116. Токсин или анатоксин предпочтительно находятся в виде голотоксина, содержащего как субъединицу А, так и субъединицу В. Субъединица А предпочтительно содержит детоксифицирующую мутацию; субъединица В предпочтительно не содержит мутаций. Предпочтительно адъювант представляет собой детоксифицированный мутант LT, такой как LT-K63, LT-R72 и LT-G192. Использование АДФ-рибозилирующих токсинов и их детоксифицированных производных, в частности LT-K63 и LT-R72, в качестве адъювантов описан в ссылках 117-124. Численные обозначения аминокислотных замен предпочтительно основаны на результатах выравнивания субъединиц А и В АДФ-рибозилирующих токсинов, приведенных в ссылке 125, конкретно включенном в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.

F. Иммуномодуляторы человека

Иммуномодуляторы человека, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [126] и т.д.) [127], интерфероны (например, -интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор и фактор некроза опухоли.

G. Биоадгезивные и мукоадгезивные вещества

Биоадгезивные и мукоадгезивные вещества также могут быть использованы в качестве адъювантов в соответствии с изобретением. Подходящие биоадгезивные вещества включают в себя микросферы этерифицированной гиалуроновой кислоты [128] или мукоадгезивные вещества, такие как сшитые производные полиакриловой кислоты, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисахариды и карбоксиметилцеллюлоза. В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы хитозан и его производные [129].

Н. Микрочастицы

В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы микрочастицы. Предпочтительными являются микрочастицы (т.е. частица ~100 нм - ~150 мкм в диаметре, более предпочтительно ~200 нм - ~30 мкм в диаметре и наиболее предпочтительно ~500 нм - ~10 мкм в диаметре), образованные биоразлагаемыми и нетоксичными веществами (например, поли( -гидроксикислотой), полигидроксимасляной кислотой, сложным полиортоэфиром, полиангидридом, поликапролактоном и т.д.), причем предпочтительным является поли(лактидсогликолид), при необходимости обработанный с образованием отрицательно заряженной поверхности (например, SDS) или положительно заряженной поверхности (например, катионным поверхностно-активным веществом, таким как СТАВ).

I. Липосомы (главы 13 и 14 ссылки 77)

Примеры липосомных составов, пригодных для использования в качестве адъювантов, описаны в ссылках 130-132.

J. Составы на основе полиоксиэтиленовых эфиров и сложных полиоксиэтиленовых эфиров

Адъюванты, пригодные для использования в соответствии с изобретением, включают в себя полиоксиэтиленовые эфиры и сложные полиоксиэтиленовые эфиры [133]. Такие составы дополнительно включают в себя поверхностно-активные полиоксиэтиленсорбитановые сложные эфиры в сочетании с октоксинолом [134], равно как и поверхностно-активные полиоксиэтиленалкильные эфиры или сложные эфиры в сочетании, по меньшей мере, с одним дополнительным неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [135]. Предпочтительные полиоксиэтиленовые эфиры выбирают из следующей группы: полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (лаурет-9), полиоксиэтилен-9-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-8-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир.

К. Мурамилпептиды

Примеры мурамилпептидов, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (нор-MDP) и N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1 ,2 -дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин МТР-РЕ).

L. Полифосфазен (РСРР)

РСРР составы описаны, например, в ссылках 136 и 137.

М. Имидазохинолоновые соединения

Примеры имидазохинолоновых соединений, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя Imiquamod и его гомологи (например, "Resiquimod 3M"), более подробно описанные в ссылках 138 и 139.

N. Тиосемикарбазоновые соединения

Примеры тиосемикарбазоновых соединений, равно как и методы получения, производства и скрининга соединений, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя таковые, описанные в ссылке 140. Тиосемикарбазоны особенно применимы для стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови человека для продукции цитокинов, таких как TNF- .

О. Триптантриновые соединения

Примеры триптантриновых соединений, равно как и методы получения, производства и скрининга соединений, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя таковые, описанные в ссылке 141. Триптантриновые соединения особенно применимы для стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови человека для продукции цитокинов, таких как TNF- .

Изобретение также может предусматривать использование сочетаний компонентов одного или нескольких адъювантов, описанных выше. Например, в соответствии с изобретением могут быть использованы следующие адъювантные композиции: (1) сапонин и эмульсия "масло-в-воде" [142]; (2) сапонин (например, QS21)+нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) [143]; (3) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL)+холестерин; (4) сапонин (например, QS21) + 3dMPL + IL-12 (при необходимости+стерин) [144]; (5) сочетания 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями "масло-в-воде" [145]; (6) SAF, содержащий 10% сквалан, 0,4% Tween 80 , 5% Pluronic-блок-сополимер L121 и thr-MDP, либо микрофлуидизированный в субмикронную эмульсию, либо встряхиваемый до образования эмульсии с большим размером частиц; (7) адъювантная система Ribi (RAS) (Ribi Immunochem), содержащая 2% сквален, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки, выбранных из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detox ); (8) одна или несколько минеральных солей (таких, как соль алюминия)+нетоксичное производное LPS (такое, как 3dMPL), и (9) одна или несколько минеральных солей (таких, как соль алюминия)+иммуностимулирующий олигонуклеотид (такой, как нуклеотидная последовательность, содержащая мотив CpG).

Другие вещества, действующие как иммуностимулирующие агенты, описаны в главе 7 ссылки 77.

Особенно предпочтительным является использование адъюванта на основе гидроксида алюминия или фосфата алюминия, и конъюгаты, как правило, адсорбированы на этих солях [например, примеры 7 и 8 ссылки 9; пример J ссылки 10]. Также возможно смешивание с солями алюминия без адсорбции [27, 72]. Другим предпочтительным адъювантом является фосфат кальция. Конъюгаты могут быть смешаны (и при необходимости адсорбированы) с адъювантами по отдельности, а затем конъюгаты могут быть смешаны вместе, или конъюгаты могут быть смешаны вместе, а затем смешаны с адъювантом.

Значение рН композиций, используемых в соответствии с изобретением, предпочтительно составляет от 6 до 8, предпочтительно около 7. Стабильное значение рН может поддерживаться путем использования буфера. Если композиция содержит гидроксид алюминия, предпочтительно использовать гистидиновый буфер [146]. Композиция может быть стерильной и/или апирогенной. Композиции могут быть изотоничны по отношению к физиологическим средам человека.

Композиции могут содержать консервант (например, тиомерсал, 2-феноксиэтанол) или могут не содержать консервантов. Предпочтительные композиции по изобретению не содержат каких-либо ртутьсодержащих веществ, например они не содержат тиомерсал.

Во избежание интерференции между антигенами, особенно конъюгированными антигенами, в состав может быть включен полианионный полимер, такой как поли-L-глутаминовая кислота [147].

Композиции могут содержаться в ампулах, или они могут содержаться в шприц-тюбиках. Шприцы могут поставляться с иглами или без них. Шприц должен содержать однократную дозу композиции, тогда как ампула может содержать однократную дозу или многократные дозы. Композиции для инъекций, как правило, представляют собой жидкие растворы или суспензии. Альтернативно, они могут поставляться в твердой форме (например, лиофилизированной) для растворения или суспендирования в жидких носителях перед введением.

Композиции могут быть упакованы в однократные дозированные формы или в многократные дозированные формы. Для многократных дозированных форм ампулы предпочтительны по сравнению со шприц-тюбиками. Объемы эффективных доз могут быть определены в соответствии с рутинными процедурами, но типичная доза композиции для введения человеку имеет объем 0,5 мл.

Если композиция должна быть приготовлена экстемпорально перед использованием (например, если компонент находится в лиофилизированной форме) и поставляется в виде набора, набор может содержать две ампулы, либо он может содержать один шприц-тюбик и одну ампулу, причем содержимое шприца используют для реактивации содержимого ампулы перед инъекцией. В композициях, содержащих капсульный сахарид серогруппы А, указанный сахарид серогруппы А может быть лиофилизирован, тогда как сахарид(ы) другой(их) серогруппы(серогрупп) может(могут) находиться в жидкой форме.

Композиции должны содержать иммунологически эффективное количество конъюгатов менингококковых сахаридов, а также при необходимости любых других компонентов. Под термином "иммунологически эффективное количество" подразумевается, что введение такого количества субъекту либо однократной дозой, либо в качестве части курса индуцирует у пациентов протективный иммунный ответ против менингококков. Это количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния подлежащего лечению субъекта, возраста, таксономической группы подлежащего лечению субъекта (например, нечеловекообразный примат, примат и т.д.), способности иммунной системы субъекта синтезировать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, суждения лечащего врача о клинической ситуации и других влияющих факторов. Ожидается, что количество будет разниться в относительно широких пределах, которые могут быть определены в соответствии с рутинными процедурами, а типичное количество каждого менингококкового антигена на дозу составляет от 1 мкг до 20 мкг на серогруппу (в расчете на сахарид), например от 2 до 10 мкг на серогруппу. Предпочтительной является доза около 4 мкг на серогруппу (т.е. всего 16 мкг в тетравалентной вакцине).

Общее количество белка-носителя в композиции предпочтительно не превышает 100 мкг на дозу, например оно составляет 90 мкг на дозу, 80 мкг на дозу, 70 мкг на дозу, 60 мкг на дозу, 50 мкг на дозу и т.д. Общее количество белка-носителя в композиции, как правило, составляет, по меньшей мере, 10 мкг на дозу.

Общие определения

Термин "содержащий" охватывает термин "включающий в себя", равно как и "состоящий из", например композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из X или может включать в себя что-либо отличное, например X+Y.

Термин "около" применительно к численному значению х означает, например, х±10%.

Словосочетание "по существу" не исключает значения "полностью" или "абсолютно", например композиция, "по существу не содержащая" Y, может абсолютно не содержать Y. При необходимости словосочетание "по существу" может быть опущено из определения по изобретению.

Способы осуществления изобретения

Отсутствие супрессии носителем при использовании тетравалентной смеси конъюгатов A/C/W135/Y

Смеси конъюгатов менингококковых сахаридов серогрупп А+С, C+W+Y или A+C+W+Y могут быть приготовлены, как описано в ссылках 9 и 10. При желании они могут быть смешаны с адъювантами на основе гидроксида алюминия или фосфата алюминия, что также описано в ссылках 9 и 10. Эти вакцины содержат в качестве белка-носителя столбнячный анатоксин (Tt) [147], ковалентно связанный с сахаридами.

Пациентов, прошедших педиатрическую вакцинацию D-T-P (либо D-T-Pa, либо D-T-Pw), включая получавших вакцины, содержащие D-T-P и другие антигены (например, тетравалентную вакцину D-T-P-Hib, тетравалентную вакцину D-T-P-HBsAg, пентавалентную вакцину D-T-P-Hib-HBsAg, гексавалентную вакцину D-T-P-Hib-HBsAg-IPV и т.д.), отбирали для введения смеси конъюгатов, содержащих в качестве носителя Tt.

Отбирали контрольную группу пациентов для введения одной из двух смесей конъюгатов. Контрольные пациенты ранее не получали столбнячный анатоксин ни в виде отдельного антигена, ни в виде белка-носителя в составе конъюгата.

Оценивали способность тетравалентных конъюгатов индуцировать у пациентов иммунный ответ. Результаты свидетельствовали о супрессии носителем, если в испытуемых группах наблюдались значительно ослабленные иммунные ответы против менингококков по сравнению с таковыми у контрольных пациентов и, в частности, если конъюгаты не могли индуцировать у пациентов SBA ответ приемлемой силы.

В ходе клинического испытания V59P2, проведенного в Финляндии и Германии на 620 субъектах в возрасте 12-16 месяцев, были испытаны пять препаратов. В вакцинах использовались CRM197 в качестве носителя и фосфат алюминия в качестве адъюванта [10]. Дозы сахарида каждой серогруппы, выраженные как мкг сахарида на 0,5 мл дозы, принимали следующие значения:

Группа	MenA	MenC	MenW135	MenY
1	10	10	10	10
2	0	10	10	10
3	10	5	5	5
4	5	5	5	5
5	2,5	2,5	2,5	2,5

Субъекты получали инъекцию в нулевой момент времени, а 25% субъектов затем получали вторую дозу вакцины через 4 недели.

Образцы сыворотки пациентов собирали через 1 месяц после введения вакцины и исследовали в анализе SBA против N.meningitidis каждой серогруппы с использованием человеческого комплемента. Оценивали рост титра SBA относительно показателей сывороток в нулевой момент времени с критериями, составляющими 1:4 и 1:8. Также для каждой серогруппы измеряли титры антител против капсульных сахаридов (GMT). Результаты приведены ниже в таблице 1.

Таким образом, и тривалентная, и тетравалентная вакцины проявляли иммуногенность у детей от 1 до 2 лет. Конъюгаты демонстрируют иммуногенность при дозах сахаридов 2,5 мкг на конъюгат. Иммунный ответ может быть усилен вторичной иммунизацией с большим ростом титра SBA после введения второй дозы. В этом испытании супрессии носителем не наблюдалось.

Следует понимать, что изобретение описано выше исключительно в качестве примера и могут быть сделаны модификации, подпадающие под объем и сущность изобретения.

Таблица 1
Результаты испытания V59P2
Группа	А	С	W135	Y
	GMT (1 месяц после 1 дозы)
1	3,9	6,4	7,1	8,9
2	2	6,1	8,3	8,5
3	5,7	5,2	6,9	12
4	3,8	4,5	7,0	9,6
5	3,9	5,3	7,0	12
	GMT (1 месяц после 2 доз)
1	27	89	22	37
2	2	80	20	57
3	29	76	28	58
4	14	47	20	35
5	17	71	23	52
	% пациентов с SBA 1:4 (1 месяц после 1 дозы)
1	33	56	57	58
2	0	57	60	61
3	55	49	53	70
4	37	42	54	64
5	40	51	57	67
	% пациентов с SBA 1:4 (1 месяц после 2 доз)
1	100	100	96	96
2	0	100	73	92
3	91	96	95	95
4	84	96	88	96
5	80	100	80	92
	% пациентов с SBA 1:8 (1 месяц после 1 дозы)
1	25	44	46	48
2	0	40	50	49
3	39	34	45	64
4	23	30	44	51
5	26	35	40	60
	% пациентов с SBA 1:8 (месяц после 2 доз)
1	92	100	85	93
2	0	100	64	92
3	87	96	95	82
4	60	92	77	92
5	72	92	72	88

Источники информации

1. Armand et al. (1982) J.Biol. Stand. 10:335-339.

2. Cadoz et al. (1985) Vaccine 3:340-342.

3. MMWR (1997) 46(RR-5) 1-10.

4. Baklaic et al. (1983) Infect. Immun. 42:599-604.

5. Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49.

6. Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-8.

7. Lieberman et al. (1996) JAMA 275:1499-503.

8. WO 2005/000345.

9. WO 02/058737.

10. WO 03/007985.

11. Rennels et al. (2002) Pediatr Infect Dis J 21:978-979.

12. WO 2004/013400.

13. Campbell et al. (2002) J Infect Dis 186:1848-1851.

14. Herzenberg et al. (1980) Nature 285: 664-667.

15. Schutze et al. (1985) J Immunol 135:2319-2322.

16. Dagan et al. (1998) Infect Immun 66:2093-2098.

17. Barington et al. (1994) Infect Immun 62:9-14.

18. Di John et al. (1989) Lancet2(8677): 1415-8.

19. Granoff et al. (1993) Vaccine SuppM: S46-51.

20. Granoff et al. (1994) JAMA 272:1116-1121.

21. Barington et al. (1993) Infect Immun 61:432-438.

22. Патент Австралии № 748716 (выданный по WO 98/51339).

23. Olander et al. (2001) Vaccine 20:336-341.

24. Burrage et al. (2002) Infect Immun 70:4946-4954.

25. Peeters et al. (1999) Infect Immun 59:3504-3510.

26. Hoppenbrouwers et al. (1999) Vaccine 17:2588-98.

27. WO 02/00249.

28. WO 00/56360.

29. Reddin et al. (2001) FEMS Immunol Med Microbiol 31:153-162.

30. Podda et al. (1991) Vaccine 9:741-745.

31. Vaccines (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0.

32. Ramsay et al. (2001) Lancet357(9251): 195-196.

33. Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36.

34. Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163-168.

35. Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-33, vii.

36. Goldblatt (1998) J.Med. Microbiol. 47:563-567.

37. Европейский патент № 0477508.

38. Патент США № 5,306,492.

39. WO 98/42721.

40. Dick et al. in Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, 10:48-114.

41. Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) ISBN: 0123423368.

42. WO 03/080678.

43. Glode et al. (1979) J Infect Dis 139:52-56

44. WO 94/05325; Патент США № 5,425,946.

45. Заявка на выдачу патента Великобритании № 0323103.2.

46. WO 99/42130.

47. WO 96/40242.

48. Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198.

49. WO 95/08348.

50. Патент США № 4,882,317.

51. Патент США № 4,695,624.

52. Porro et al. (1985) Mol Immunol 22:907-919.

53. EP-A-0208375.

54. WO 00/10599.

55. Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165: 171-288 (1979).

56. Патент США № 4,057,685.

57. Патенты США № 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700.

58. Патент США № 4,459,286.

59. Патент США № 4,965,338.

60. Патент США № 4,663,160.

61. Патент США № 4,761,283.

62. Патент США № 4,356,170.

63. Balmer & Borrow (2004) Expert Rev Vaccines 3:77-87.

64. Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

65. Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.

66. Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

67. Zielen et al. (2000) Infect. Immun. 68:1435-1440.

68. Darkes & Plosker (2002) Paediatr Drugs 4:609-630.

69. Kanra et al. (1999) The Turkish Journal of Paediatrics 42:421-427.

70. Ravenscroft et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:35-47.

71. WO 97/00697.

72. WO 96/37222; US patent 6,333,036.

73. WO 2004/032958.

74. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th ed.

ISBN: 0683306472.

75. Almeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 3:455-467.

76. Agarwal & Mishra (1999) Indian J Exp Biol 37:6-16.

77. Vaccine Design (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.

78. WO 00/23105.

79. WO 90/14837.

80. Патент США № 5,057,540.

81. WO 96/33739.

82. EP-A-0109942.

83. WO 96/11711.

84. WO 00/07621.

85. Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.

86. Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.

87. Niikura et al. (2002) Virology 293:273-280.

88. Lenz et al. (2001) J Immunol 166:5346-5355.

89. Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188:327-338.

90. Gerber et al. (2001) Virol 75:4752-4760.