способ получения каллусной ткани лотоса орехоносного

Формула изобретения

Способ получения каллусной ткани лотоса орехоносного, включающий культивирование листовых эксплантов на жидкой питательной среде, представляющей собой модифицированную питательную среду Мурасиге и Скугу, где модификации представляют собой изменение концентрации NH₄NO₃ до 3300 мг/л, FeSO₄·7H ₂O до 27,8 мг/л, тиамина-HCl до 0,1 мг/л, замену метаборной кислоты на ортоборную в концентрации 6,2 мг/л, добавление Na ₂ЭДТА·2 H₂O в концентрации 37,3 мг/л, мезоинозита - 100 мг/л, сахарозы - 3000 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты - 10 мг/л, индолилуксусной кислоты - 0,8 мг/л, кинетина - 0,5 мг/л, цефотаксима - 100-300 мг/л, при этом плотность посева составляет 104-105 протопластов в 1 мл среды, а сахарозу исключают после регенерации клеточной стенки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к способам получения биомассы растений для получения сырья и создания новых фармакологических препаратов, а также может быть использовано в пищевой или косметической промышленности.

Наиболее близким по технической сущности является способ культивирования тканей женьшеня - продуцента биологически активных веществ, включающем посадку инокулюма на питательную среду, культивирование, съем биомассы и сохранение части ее для дальнейшего культивирования, в питательную среду дополнительно вносят крахмал при следующем соотношении компонентов, мг/л: KNO ₃ 1500-2300, NH₄NO₃ 350-450, CaCl ₂·2H₂O 400-480, MgSO₄·7H ₂O 350-400, KH₂PO₄ 150-190, Н ₃ВО₃ 4,2-8,0, MnSO₄·4Н₂ O 15,6-26,7, СоСl₂·2Н₂O 0,02-0,03, CuSO₄·5Н₂O 0,02-0,03, ZnSO₄ ·7H₂O 6,0-10,3, Na₂MoO₄ ·2H₂O 0,2-0,3, KI 0,53-0,9, FeSO₄·7H ₂O 25,3-30,6, Na₂ ЕДТА·2H₂O 33,6-41,0, тиамина гидрохлорид 0,15-0,25, пиридоксина гидрохлорид 0,4-0,6, никотиновая кислота 0,4-0,6, мезоинозит 80-120, казеина гидролизат 80-120, 4-хлорфеноксиуксусная кислота (4СРА) 0,35-0,45, сахароза 15500-20000, агар 2000-4000, крахмал 20000-30000, дистиллированная вода до 1 л (Альшевская Е.К., Булгаков В.П. и др. Заявка РФ 4953399/13 на изобретение «СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ЖЕНЬШЕНЯ». Решение о выдаче патента РФ от 20.05.1991). Однако из-за видовых различий этот способ не может быть применим для культивирования тканей лотоса орехоносного.

В Астраханской области ведется разработка косметических средств на основе Лотоса орехоносного. Ткани лотоса идут на получение косметических средств и медицинских препаратов. Для промышленного внедрения и выхода на рынок необходима сырьевая база тканей лотоса орехоносного. Промышленное производство косметики на основе экстрактов лотоса требует большого объема сырья.

Использование природного материала недопустимо по ряду причин:

- ограниченное произрастание лотоса орехоносного;

- лотос орехоносный является уникальным, реликтовым растением;

- растение находится под охраной и его промышленный сбор запрещен;

- в изготовлении косметических средств и медицинских препаратов нежелательно использование дикорастущих форм из-за адсорбирующих свойств растений.

Одним из путей получения экстрактов тканей лотоса орехоносного это культивирование фитомассы, что является более технологичным и экологически безопасным процессом. Известно, что изолированная растительная клетка сохраняет генетическую информацию родительского растения (тотипотентность). При определенных условиях, например при благоприятном температурном и световом режиме, при подборе необходимых фитогормонов делящаяся клетка in vitro дает аморфное образование - клеточную культуру, или каллус, состоящую, в основном, из недифференцированных клеток.

Способы получения и культивирования каллусной ткани лотоса орехоносного в доступных патентных и литературных источниках не обнаружены.

Получение эксплантов.

Семена растений лотоса орехоносного обрабатывают гибберелловой кислотой, скарифицируют и помещают в стеклянную емкость с температурой воды 28-29°С, воду ежедневно меняют или используют искусственную аэрацию. Емкость должна находиться на хорошо освещаемом месте. Если это невозможно применяют искусственное освещение. Длина светового дня должна соответствовать 10-12 часам. После появление первого и второго листьев необходимо регулировать объем воды в емкости, так что бы было полное покрытие листьев водой. В противном случае листья засохнут. Это связано с тем, что при культивировании растения in vitro в условиях Астраханской области воздух в помещениях слишком сухой. При достижении листьями длины 20-30 см их изолируют от растения и стерилизуют в течение 30 с в 70° спирте, а затем в течение 10 мин в 3% растворе гипохлорида натрия. После промывания листьев стерильной водой у них удаляют нижний эпидермис и разрезают на мелкие части. Нарезанные фрагменты листьев помещают в чашки Петри в смесь ферментов пектиназы и целлюлазы (0,5% пектиназы +2% целлюлазы +13% сорбитола, рН=5,4). Инкубируют фрагменты листьев в ферментной смеси в темноте или при рассеянном свете до 15-18 часов при t=27°С. После этого следует очистка протопластов от эпидермиса и листовых жилок посредством фильтрации через капроновую ткань. Отмывание протопластов от ферментов производится при последующем трехкратном центрифугировании при 170 g в течение 2 мин. Отмытые протопласты ресуспендируют в культуральной среде, содержащей 13% маннитола, до концентрации 104-105 протопластов в 1 мл. Суспензию протопластов переносят в колбы с адаптированной жидкой питательной средой с добавлением антибиотика цефотаксима, в концентрации 100-300 мг/л. Культивирование проводят при t=26-28°С в темноте или при рассеянном свете.

Образовавшиеся клеточные колонии помещают в чашки Петри с модифицированной питательной средой по Мурасиге и Скугу с добавлением антибиотика цефотаксима, с ауксинами и осмотиками (приведена в таблице 1). В качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, индолилуксусную кислоту и кинетин в концентрации 0,5-10 мг/л. До того как протопласты синтезируют клеточную стенку, необходимо обеспечить в среде соответствующий уровень осмотического давления для поддержания стабильности протопластов. Для этого в питательную среду добавляют сахарозу в концентрации 3000 мг/л. После регенерации клеточной стенки и развития клеточных колоний осмотики из среды исключают. Другой важный фактор успешного культивирования протопластов лотоса орехоносного - плотность их посева, которая должна составлять 104-105 протопластов в 1 мл среды.

Таблица 1.
Состав питательной среды для выращивания клеточных колоний лотоса орехоносного
Компоненты среды Мурасиге и Скуга	Содержание компонентов, мг/л
NH4NO3	3300
KNO 3	1900
CaCl2·2H 2O	440
MgSO4·7H 2O	370
KH2PO 4	170
Н3ВО 3	6,2
MnSO4·4H 2O	22,3
СоСl2 ·6H2O	0,025
ZnSO 4·7H2O	8,6
Na 2MoO4·2H2O	0,25
KI	0,83
CuSO4·5H2O	0,025
FeSO 4·7H2O	27,8
Nа 2ЭДТА·2H2O	37,3
Тиамин-HCl	0,1
Пиридоксин-HCl	0,5
Никотиновая кислота	0,5
Мезоинозит	100
Глицин	2
Сахароза	3000
pH	5,4
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота	10
Индолилуксусная кислота	0,8
Кинетин	0,5
Цефотаксим	100-300

Заявляемые пределы концентрации цефотаксима определяются следующим образом. Использование концентрации ниже 120 мг/л не стимулирует процесс регенерации, а при использовании концентрации выше 250 мг/л подавляется регенерационная способность клеточных колоний.

Изобретение обеспечивает получение фитомассы лотоса орехоносного in vitro в необходимых для промышленного использования объемах. Обеспечивает регулируемость и контролируемость процесса регенерации, а также достигает стабильности в воспроизводимости результатов при улучшении его технологичности.

Использование вместо интактных растений лотоса орехоносного их клеточных культур имеет ряд преимуществ, среди которых - радикальное решение проблемы дефицита исходного сырья, возможность получения фитомассы, полностью свободной от поллютантов (гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и т.п.), открытие новых веществ, не синтезируемых обычно в растениях, индустриализация и удешевление производства, возможность управления процессом биосинтеза целевых продуктов. Помимо этого выращивание клеточной культуры растений не требует сложного оборудования и не зависит от сезонности сельскохозяйственных работ, а масштабы культивирования гарантируют доступность рекомбинантного препарата в количествах, достаточных для клинических испытаний и использования в косметической и фармакологической промышленности.

Культивирование фитомассы лотоса орехоносного позволит в лабораторных условиях получать экспланты без необходимости выращивания растений в целом в искусственно созданных парниковых условиях. При этом нет необходимости выращивать целое растение, можно культивировать только те ткани, которые необходимы в производстве. Использование растительных гормонов или их аналогов позволяет изменять нормальную "программу" развития организма и добиваться необходимых изменений исходного фенотипа растения.

Таким образом, целью изобретения является разработка технологии культивирования тканей лотоса орехоносного с использованием адаптированной питательной среды.