способ коррекции нейроиммунных нарушений при экспериментальной иммунопатологии

Формула изобретения

Способ коррекции нейроиммунных нарушений при иммунопатологических состояниях, заключающийся в применении ноотропных препаратов, отличающийся тем, что в качестве корректора применяется фенибут, который вводят мышам линии СВА и белым нелинейным крысам однократно внутрибрюшинно в дозах 12,5-100 мг/кг или перорально в дозе 25 мг/кг курсом 14 дней.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и фармакологии, и может быть использовано для устранения и профилактики у животных и человека иммунопатологических состояний, развивающихся в условиях воздействия циклофосфамида (и др. иммуносупрессоров), антигенной нагрузки, гипериммунизации, сопровождающихся нарушениями иммунологических функций и изменениями в психоэмоциональной сфере.

Иммунная и нервная системы являются адаптивными системами организма, взаимодействуя посредством цитокинов, нейромедиаторов, они поддерживают постоянство внутренней среды организма. Основываясь на экспериментальных и клинических данных о двунаправленных межсистемных связях иммунной и нервной систем в физиологических и ряде патофизиологических состояний (Полетаев А.Б., Морозов С.Г., Ковалев И.Е. Регуляторная метасистема (нейроиммуноэндокринная регуляция гомеостаза). - М.: Медицина, 2002. - 168 с.), доказано, что признаки невротических и/или психических нарушений сопровождаются изменением функции иммунной системы, как и патологические сдвиги в рамках иммунной системы, могут приводить к дисбалансу активности ЦНС (Ветлугина Т.П., Семке В.Я. Клиническая психонейроиммунология на современном этапе // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2003. - № 1. - С.34-36). Отсюда необходимость поиска фармакологических средств коррекции нарушений функции центральной нервной и иммунной систем, возникающих на фоне развития иммунопатологических состояний.

Из практической медицины известен способ-прототип коррекции нейроиммунных нарушений, состоящий в использовании церебролизина, представляющего собой ноотропный пептидэргический препарат, способный оказывать органоспецифический поливалентный эффект на нервную систему, проявляя эффективность при неврологической патологии и развивающихся вследствие расстройств нервной регуляции иммунных нарушений (Сотникова Н.Ю., Громова О.А., Новикова Е.А. Нейроиммуномодулирующие свойства церебролизина // Цитокины и воспаление. - 2004. - № 2. - С.34-39). Однако данный способ эффективен при нейроиммунных нарушениях, развивающихся лишь при нейропсихических расстройствах, не проявляя нейроиммуномодулирующей активности при иммуноопосредованных патологических процессах. Кроме того, церебролизин, представляя собой белковый гидролизат вещества мозга (свиньи), способен провоцировать тяжелые аллергические реакции. Важно отметить, что проявление нейроиммуномодулирующего эффекта препарата наблюдается не ранее чем через 10 дней применения при парентеральном пути введения, что также является ограничивающим фактором в широком применении препарата, особенно при нетяжелых формах патологических процессов.

Задачей предлагаемого способа является расширение спектра фармакологической коррекции известного способа.

Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Поставленная задача решается в изобретении тем, что в качестве корректора нейроиммунных нарушений при иммунопатологических состояниях применяется фенибут, который вводят мышам линии СВА и белым нелинейным крысам однократно внутрибрюшинно в дозах 12,5-100 мг/кг или перорально в дозе 25 мг/кг курсом 14 дней.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что авторы впервые для коррекции иммунного дисбаланса и нарушений в психоэмоциональной сфере, возникающих на фоне иммунодепрессии и иммунного стресса, использовали фенибут в соответствующих пределах дозировки, определив степень эффективности каждой из доз в эксперименте.

Предлагаемый способ позволяет обеспечить значимый нейроиммунопротективный эффект при иммунопатологии с применением небольших доз фенибута короткими курсами, что практически исключает возникновение побочных негативных эффектов при длительном его применении, что способствует повышению коррекционной эффективности по сравнению со способом-прототипом.

Для исследования используют белых нелинейных крыс разного пола в возрасте 5-7 мес и мышей линии СВА. В каждой серии животных разбивали на следующие группы (n=10): 1-я группа получала в качестве «плацебо» физиологический раствор (контроль 1), 2-я группа представлена животными с моделью иммунопатологии (контроль 2), 3-я группа - животные с иммунопатологией получали фенибут согласно схеме в каждой серии эксперимента (опыт). В качестве антигенного стимула использовали эритроциты барана (ЭБ). Иммунопатологию моделировали следующим образом: иммунологическую недостаточность - внутрибрюшинным введением циклофосфамида в дозе 150 мг/кг; «иммунный стресс» (гипериммунизация) - внутрибрюшинным введением липополисахарида (ЛПС) Pseudomonas aeruginosa в дозе 100 мкг/кг (1 раз в сутки, 3 дня).

Иммунный статус организма изучали на основании реакции гиперчувствительности замедленного типа с определением индекса реакции (ИР ГЗТ), реакции пассивной гемагглютинации (РИГА) с определением титра антител, латексного теста по изучению фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови с определением фагоцитарного числа (ФЧ) и фагоцитарного индекса (ФИ), оценки изменений лейкоцитарной формулы, лимфопролиферативных процессов в тимусе и селезенке (Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебров А.И. Методические указания по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ (под ред. Р.У.Хабриева) - М., 2005. - С.501-514).

Психоэмоциональное состояние животных оценивали в стандартных поведенческих тестах: «Открытое поле», «Приподнятый крестообразный лабиринт» (Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: ИИА «Ремедиум», 2000. - С.153-161; Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: ИИА «Ремедиум», 2000. - С.126-130), «Суок-тест» (Калуев А.В., Туохимаа П. Суок-тест - новая поведенческая модель тревоги // Нейронауки. - 2005. - № 1. - С.17-23).

Исследования во всех сериях проводили в осенне-зимний период, все животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и синхронизированы по питанию при свободном доступе к воде. По завершении экспериментов животных забивали декапитацией под хлороформным наркозом.

Все манипуляции с животными проводят согласно Международным правилам GLP. Все полученные данные обработаны статистически с применением t-критерия Стьюдента.

Предлагаемый способ апробирован на 510 мышах линии СВА 3-4 мес и 60 белых нелинейных крысах 5-6 мес на кафедре фармакогнозии с курсом фармацевтической технологии и биотехнологии Астраханской государственной медицинской академии, кафедре фармакологии и биофармации Волгоградского государственного медицинского университета и кафедре физиологии и морфологии человека и животных Астраханского государственного университета с 2007 г. по 2010 г.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1.

Исследовалась иммунокорригирующая активность фенибута при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 12,5 мг/кг на модели иммунодепрессии.

Эксперимент проводился на мышах линии СВА по описанной ранее схеме. Животные опытной группы на фоне циклофосфамидной иммунодепрессии получали фенибут однократно внутрибрюшинно в дозе 12,5 мг/кг. Полученные результаты отражены в таблице № 1.

Как видно из представленной таблицы, однократно внутрибрюшинное введение фенибута в дозе 12,5 мг/кг животным с экспериментальной иммунодепрессией сопровождается активацией гуморального и неспецифического звеньев иммуногенеза: титр гемагглютининов в РПГА практически достигает значений «нормы» в контроле № 1, фагоцитарный индекс и фагоцитарное число достоверно превышают показатели у животных с патологией.

Пример 2.

Исследовалась иммунокорригирующая активность фенибута при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 25 мг/кг при экспериментальном иммунодефиците.

Эксперимент проводился на мышах линии СВА по описанной ранее схеме. Животные опытной группы на фоне циклофосфамидной иммунодепрессии получали фенибут однократно внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг. Полученные результаты отражены в таблице № 2.

Установлено, что фенибут при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 25 мг/кг не только восстанавливает, но и оказывает значимый стимулирующий эффект: индекс реакции ГЗТ у опытных животных превышает показатель более чем на 60% по сравнению с группой мышей с моделью иммуносупрессии (р ₂<0,05) и более чем на 40% в сравнении с контролем «плацебо» (р₁<0,05). Оценка гуморальной иммунореактивности показала, что под действием фенибута в условиях циклофосфамидной недостаточности напряженность антителообразования нарастает: введение веществ приводит к устранению иммунодепрессивного действия цитостатика (р₂<0,05) и значения достигают уровня животных, получавших физ. раствор (p₁>0,05). Фенибут вызывает также изменения морфометрических показателей органов иммунной системы у лабораторных животных с иммунной недостаточностью, а именно устраняет инволюцию иммунокомпетентных органов. Наблюдается существенное увеличение массы и количества спленоцитов и тимоцитов в сравнении как с иммунодепрессированными животными в контроле № 2 (р₂<0,05), так и с интактным контролем (статистически достоверным является стимулирующий эффект в отношении массы и клеточности тимуса, p₁<0,05).

Пример 3.

Исследовалась иммунокорригирующая активность фенибута при внутрибрюшинном введении в дозе 50 мг/кг на модели иммунодепрессии.

Эксперимент проводился на мышах линии СВА по описанной ранее схеме. Животные опытной группы на фоне циклофосфамидной иммунодепрессии получали фенибут однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. Полученные результаты отражены в таблице № 3.

Однократное внутрибрюшинное применение фенибута в дозе 50 мг/кг сопровождается увеличением показателей иммунореактивности более чем на 80% в сравнении со значениями в группе животных с моделью иммунопатологии (контроль № 2) и более чем на 20% по сравнению с контролем № 1, что свидетельствует о проявлении фенибутом в указанной дозе иммуностимулирующих свойств. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови под влиянием фенибута в данной дозе достигает показателей «нормы» в контроле № 1.

Пример 4.

Исследовалась иммунокорригирующая активность фенибута при внутрибрюшинном введении в дозе 100 мг/кг на модели иммунодепрессии.

Эксперимент проводился на мышах линии СВА по описанной ранее схеме. Животные опытной группы на фоне циклофосфамидной иммунодепрессии получали фенибут однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг. Полученные результаты отражены в таблице № 4.

Однократное внутрибрюшинное введение фенибута в дозе 100 мг/кг способствует устранению супрессорного действия циклофосфамида на формирование специфического иммунного ответа на ЭБ: титр антител в РПГА и ИР ГЗТ практически достигают фоновых значений в контроле «плацебо». В отношении показателей неспецифической резистентности (ФЧ и ФИ) доза фенибута - 100 мг/кг - малоэффективна.

Таким образом, фенибут при однократном внутрибрюшинном введении во всех изучаемых дозах (12,5 мг/кг, 25 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг) проявляет иммунотропную активность, но именно в дозе 25 мг/кг препарат демонстрирует стимулирующие свойства в отношении всех звеньев иммуногенеза, что позволяет рекомендовать ее как наиболее активную.

Пример 5.

Исследовались иммунокорригирующие свойства фенибута при курсовом 14-дневном пероральном введении в дозе 25 мг/кг.

Эксперимент проводился на мышах линии СВА по описанной ранее схеме. Животные с иммунодепрессией в опытной группе наряду с циклофосфамидом (150 мг/кг, внутрибрюшинно) получали фенибут (25 мг/кг, per os, 14 дней). Полученные результаты отражены в таблице № 5.

Применение фенибута per os в дозе 25 мг/кг в течение 14-ти дней способствует восстановлению параметров иммунореактивности мышей с индуцированной иммунодепрессией: титр антиэритроцитарных антител, показатели фагоцитарной активности нейтрофилов в опытной группе приравниваются к показателям в группе животных с фоновыми значениями; индекс местной реакции иммунитета превышает контрольные значения группы «плацебо» более чем на 20% (табл.5).

Таким образом, фенибут при пероральном введении в дозе 25 мг/кг в течение 14-ти дней также проявляет выраженные иммуномодулирующие свойства.

Пример 6.

Проводилось изучение иммуномодулирующей активности фенибута в аспекте «время-эффект», а именно при внутрибрюшинном введении (в дозе 25 мг/кг, 3 дня) с интервалом в 3 дня до и после индукции иммунодепрессии.

Эксперимент проводился на мышах линии СВА по описанной ранее схеме. Животные с иммунодепрессией в опытных группах наряду с циклофосфамидом (150 мг/кг, внутрибрюшинно, одновременно с иммунизацией ЭБ) получали фенибут (в дозе 25 мг/кг, 3 дня) за 3 дня до индукции иммунодепрессии (опыт № 1), одновременно с индукцией иммунодепрессии (опыт № 2) и через 3 дня после индукции иммунодепрессии (опыт № 3). Полученные результаты отражены в таблице № 6.

Представленные в таблице № 6 результаты свидетельствуют о способности препарата устранять иммуносупрессивный эффект циклофосфамида при введении в индуктивную фазу иммуногенеза и одновременно с индукцией иммунопатологии: показатели иммунореактивности мышей увеличены по сравнению с группой иммунодепрессированных животных более чем в 2 раза, превышают фоновые значения в контроле № 1. В отношении гуморального звена иммуногенеза и неспецифической резистентности фенибут проявляет иммунопротективный и иммунотерапевтический эффекты: при профилактическом введении вещества (за три дня до индукции иммунопатологии) и при введении в продуктивную фазу иммуногенеза (через три дня после иммунизации и индукции иммунопатологии) уровень антител и показатели фагоцитоза достоверно увеличиваются по сравнению с показателями в контроле № 2.

Таким образом, фенибут при внутрибрюшинном введении в дозе 25 мг/кг (3 дня) способен проявлять и иммунопротективный и иммунотерапевтический эффекты.

Пример 7.

Проводилось изучение иммуномодулирующей активности фенибута при применении в условиях интенсивной липополисахаридной нагрузки («иммунного стресса»).

Эксперимент проводился на мышах линии СВА по описанной ранее схеме. Животные опытной группы наряду с липополисахаридом Pseudomonas aeruginosa (100 мкг/кг, 1 раз в сутки, 3 дня) получали фенибут (внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг, в течение 7 дней). Результаты представлены в таблице № 7.

Из таблицы видно, что фенибут при внутрибрюшинном введении в дозе 25 мг/кг в течение 5 дней устраняет явления гиперреактивности клеточного звена иммунитета, что проявляется достоверным снижением ИР ГЗТ более чем на 70% по сравнению с группой животных с иммунопатологией. Установлено иммуномодулирующее действие фенибута в отношении неспецифической иммунореактивности: параметры, отражающие интенсивность фагоцитоза (фагоцитарное число) и количество клеток, участвующих в фагоцитозе (фагоцитарный индекс), у животных с иммунным стрессом на фоне введения фенибута, восстанавливаются, снижаясь в сравнении с контролем 2 более чем на 50% и достигая фоновых показателей в контроле 1. Восстановления гуморальной иммунореактивности у животных с иммунным стрессом под влиянием фенибута не наблюдается: титр антител остается на уровне значений в группе животных с ЛПС-индуцированной патологией.

Таким образом, фенибут, при применении в условиях ЛПС-индуцированного иммунного стресса, проявляет корригирующее действие, устраняя явления гиперреактивности клеточного звена иммунитета, а также восстанавливая фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови.

Пример 8.

Проводилось изучение психомодулирующих свойств фенибута при внутрибрюшинном введении в дозе 25 мг/кг в течение 7 дней на модели циклофосфамидной иммунодепрессии и липополисахаридного иммунного стресса.

Эксперимент проводился на крысах линии Wistar по описанной ранее схеме. Поведенческие реакции животных с иммунопатологией изучали в тестах: «Суок-тест» и «Приподнятый крестообразный лабиринт».

Как видно из представленных в таблицах 8 и 9 результатов, фенибут проявляет способность корректировать изменения поведенческих реакций в Суок-тесте, развивающиеся на фоне экспериментальной иммунной патологии. Под влиянием фенибута отмечается статистически достоверное восстановление горизонтальной и направленной исследовательской активности; уменьшение дефекации и груминга, продолжительности фризинга и остановок внутри отсеков и на границе, латентного периода выхода из центра; увеличение продолжительности пребывания в светлом (аверсивном) отсеке и количества переходов через центральную зону аллеи. На фоне введения фенибута уменьшаются проявления стресс-индуцированной мотосенсорной дезинтеграции («соскальзывания» задних лап).

Под влиянием фенибута в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» у животных с иммунопатологией отмечено достоверное увеличение времени и числа посещений аверсивных рукавов; уменьшение времени посещения более безопасной темной зоны лабиринта; увеличение исследовательских «выглядываний» из темных отсеков и «свешиваний» с рукавов лабиринта, а также уменьшение продолжительности фризинга и числа актов кратковременного груминга по сравнению с группой животных с моделью иммунных нарушений (табл.10 и 11).

Таким образом, фенибут устраняет возникающие в результате иммунопатологии изменения поведенческих реакций, что свидетельствует о наличии у препарата психомодулирующих свойств.

Анализ приведенных примеров показывает, что фенибут, при однократном внутрибрюшинном (в дозах 12,5-100 мг/кг) и курсовом (14 дней) пероральном (в дозе 25 мг/кг) введении 1 раз в сутки обеспечивает стабилизацию иммунного и психоэмоционального статусов организма, проявляя психоиммуномодулирующую активность и корректируя нейроиммунные нарушения, развивающиеся на фоне циклофосфамид- и липополисахаридиндуцированной иммунопатологии.

Предлагаемым способом достигается повышение коррекционной эффективности способа коррекции нейроиммунных нарушений, возникающих на фоне развития циклофосфамидиндуцированной иммунной недостаточности и липополисахарид-индуцированного иммунного стресса. Повышение эффективности заключается в том, что при введении фенибута одновременно с введением веществ, способных вызвать иммунный дисбаланс и, как следствие, психоэмоциональные нарушения, в дозах 12,5-100 мг/кг предотвращается развитие нейроиммунной патологии. Показатели клеточной, гуморальной иммунореактивности и неспецифической резистентности, а также двигательная, ориентировочно-исследовательская активность и уровень эмоциональности при осуществлении предложенного способа поддерживаются на уровне контрольных значений или достигают 85-90% от контрольного, в то время как у особей с индуцированной иммунопатологией без указанного способа коррекции показатели снижены более чем на 30%.

Предложенный способ в отличие от способа-прототипа предлагает:

- осуществление коррекции непродолжительными курсами фенибута в небольших дозах, что позволяет избежать или снизить риск развития негативных эффектов;

- диапазон доз от 12,5 мг/кг до 100 мг/кг позволяет предпринимать индивидуальный подход при коррекции;

- способ позволяет осуществлять коррекцию нарушений и иммунного статуса и психоэмоциональных расстройств, развивающихся на фоне иммунологического дисбаланса, что доказывает возможность его применения при патологических состояниях, сопровождающихся нарушением стабильности единой гомеостатической нейроиммунной системы.

Предлагаемый способ может быть рекомендован для использования в экспериментальных научных лабораториях медицинского и биологического профиля. На основании предлагаемого способа может быть разработан способ коррекции нейроиммунных нарушений для клинического использования в иммунологии, неврологии, психиатрии (для устранения нарушений, развивающихся при заболеваниях центральной нервной системы) и онкологии (для устранения нарушений, вызываемых цитостатиками-иммунодепрессантами).