способ выделения гонадотропина из сыворотки крови жерёбых кобыл

Формула изобретения

Способ выделения гонадотропина из сыворотки крови жерёбых кобыл (СЖК), включающий фракционное осаждение балластных веществ, гормонально активной фракции СЖК, диализ против воды, отличающийся тем, что осаждение балластных веществ и выделение гормонально активной фракции СЖК производится изопропанолом, причем для осаждения балластных веществ при концентрации растворимости гонадотропина СЖК, а для выделения гормонально активной фракции СЖК при концентрации нерастворимости гонадотропина, выделенный препарат гонадотропина СЖК консервируют в растворе этанола при концентрации последнего, обеспечивающей стерильность препарата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам получения очищенного от балластных веществ гонадотропного препарата из крови жерёбых кобыл.

Известен способ получения гонадотропного препарата из сыворотки крови жерёбых кобыл (СЖК) путем последовательного осаждения балластных веществ раствором риванола и охлажденным ацетоном, выделения гонадотропина СЖК (ГСЖК) ацетоном, выдерживания смеси в течение 30-60 мин при комнатной температуре, промывки и лиофилизации (Авт. свид. СССР № 619188, А61К 37/38, 1975). Недостаток способа - загрязнение препарата риванолом.

Известен способ получения препарата ГСЖК, включающий фракционное осаждение гормонального вещества из СЖК этиловым спиртом, смешивание осажденной фракции с 0,28-0,32%-ным раствором агара и последующее денатурирование препарата этиловым спиртом (Авт. свид. СССР № 1012913, А61К 37/38, 1983).

Известен способ получения ГСЖК, предусматривающий фракционное осаждение балластных веществ этанолом в кислой среде, их промывку, осаждение из надосадочной жидкости гормонально активного вещества этанолом, лиофилизацию полученного осадка, последующую его очистку экстрагированием водой, обессоливание фильтрацией через молекулярные сита и повторную обработку первой фракции органическим растворителем. Фильтрацию проводят пропусканием раствора через колонку, наполненную сефадексом G-25, уравновешенным водой (Авт. свид. СССР № 296373, А61К 35/14, 1970). Применение молекулярных сит приводит к удорожанию препарата и ограничивает возможность использования способа. Высокая степень очистки, обеспечиваемая данным способом, нерентабельна и нецелесообразна для сельскохозяйственного производства.

Известен способ выделения гонадотропина из СЖК, взятый в качестве прототипа, включающий фракционное осаждение балластных веществ метафосфорной кислотой и этанолом в концентрации 50%, осаждение гормонально активной фракции этанолом в концентрации 75%, диализ фракции против воды и последующую тонкую очистку препарата гель-фильтрацией через Se-phadex G-100 с элюцией раствором хлористого натрия, забуференного фосфатным буфером, и через sulfoethyl-Sephadex G-50 с использованием ацетатного, фосфатного и аммоний ацетатного буферов. (Gospodaarowicz D., Papkoff H. A simple method for isolation of pregnant mare serum gonadotropin. Endocrinology. 1967, v.80, n.1, p.699-702).

Способ позволяет получать достаточно очищенный от балластных аллергенов препарат с активностью 638 (530-825) ИЕ/мг сухого вещества уже на этапе грубой очистки, предшествующей гель-фильтрации, исключающей проявление анафилактического шока при использовании на сельскохозяйственных животных. Следовательно, такой препарат может быть использован для гормональной коррекции у животных и поэтому исключается необходимость тонкой очистки гель-фильтрацией.

Однако способ требует использования большого количества дорогого этанола.

Техническая задача изобретения заключалась в разработке способа получения гонадотропина из сыворотки крови жерёбых кобыл с заменой этанола более дешевым заменителем, обладающим его свойствами по отношению к ГСЖК, то есть имеющим порог концентраций в жидкой фракции, разделяющий растворимость и нерастворимость гонадотропина и коагулирующий балластные вещества при концентрации растворимости гонадотропина.

В процессе выделения ГСЖК применить более дешевый способ консервации готового продукта без утраты его гормональной активности.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ выделения гонадотропина из СЖК, предусматривающий фракционное осаждение балластных веществ, гормонально активной фракции СЖК, ее диализ против воды, отличающийся тем, что осаждение балластных веществ и выделение гормонально активной фракции производят изопропанолом, причем осаждение балластных веществ осуществляют при его концентрации растворимости ГСЖК, а для выделения гормонально активной фракции СЖК при концентрации нерастворимости гонадотропина. При этом для консервации выделенного препарата ГСЖК используют растворение и сохранение препарата в растворе этанола при концентрации последнего, обеспечивающей стерильность препарата.

Пример. На первоначальном этапе основную массу балластных веществ из СЖК удаляют выведением в осадок путем добавления к СЖК 0,5М раствора свежеприготовленной метафосфорной кислоты (НРО₃) до достижения рН 3,0.

Чтобы приготовить 0,5М раствор НРО₃, берут 3,6 г пятиокиси фосфора (Р₂О₅) и растворяют в 100 мл воды. Пятиокись фосфора на воздухе очень энергично притягивает воду, в связи с этим трудно точно взвесить необходимое количество сухого вещества, поэтому работают очень быстро. При соединении пятиокиси фосфора с водой выделяется очень большое количество тепла и раствор сильно разогревается, растворение может проявиться в виде взрыва, поэтому пятиокись фосфора вносить в воду нужно небольшими порциями. Все это требует очень осторожного обращения и мер защиты (защитные очки, резиновые перчатки, спецодежда). 0,5М раствор НРО₃ готовят непосредственно перед использованием и не сохраняют.

В связи с тем, что пятиокись фосфора энергично притягивает воду из воздуха, ее сохраняют в герметично закрытом сосуде (эксикаторе) рядом с концентрированной серной кислотой или другими активными влагопоглотителями.

Осаждение балластных веществ метафосфорной кислотой проводят при температуре окружающей среды 0 +5°C с охлажденными до этой температуры реактивами и приборами. СЖК с гормональной активностью не менее 100 ИЕ/мл подкисляют 0,5М раствором НРО₃ под постоянным контролем рН при постоянном перемешивании. По достижении рН 3 добавление 0,5М раствора НРО₃ прекращают, суспензию взбалтывают в течение 5 мин. Выпавший осадок отделяют фильтрацией через мембранный фильтр или центрифугированием.

Реакцию фильтрата (супернатанта), полученного в предыдущей процедуре, доводят до рН 4,5, медленно по каплям добавляя 1N раствор NaOH, охлаждают и добавляют предварительно охлажденный (до -20°С) изопропанол в объеме до конечной объемной концентрации 25%. После выдержки на холоду (0 +5°С) в течение 2-х часов образовавшийся осадок отделяют и выбрасывают.

К фильтрату (супернатанту) снова добавляют охлажденный изопропанол до конечной объемной концентрации 50%, переводящей гонадотропин СЖК в осадок. Смесь отстаивают на холоду (0 +5°С) в течение двух часов, осадок отделяют, фильтрат (супернатант) выбрасывают. Осадок растворяют в воде в объеме, составляющем 1/500 часть (× 0,002) исходного объема СЖК. Раствор подвергают диализу в течение суток против воды при 0 +5°С. Диализная мембрана должна задерживать полимеры выше 50 kD. Иммуноферментным (ИФА) методом определяют гормональную активность полученного раствора препарата.

Объем диализата 1% раствором хлористого натрия доводят до значения, при котором концентрация ГСЖК составляет 20000 ИЕ/мл. Расчет ведут по следующей формуле:

V_кон=V _исх*С_исх/20000,

где V_кон - конечный объем в мл, до которого необходимо довести раствор 1% хлоридом натрия;

V_исх - исходный объем в мл раствора препарата;

С_исх - активность ГСЖК в препарате, ИЕ/мл.

Консервация препарата ГСЖК. К полученному раствору ГСЖК добавляют в равном объеме 96° этанол. Раствор препарата разливают по флаконам - по 0,1 мл, что составляет 1000 ИЕ ГСЖК/флакон. Флаконы закрывают пробками и закатывают алюминиевыми колпачками.

Использование препарата. Перед использованием к содержимому флакона добавляют 5 мл стерильного 1% раствора хлористого натрия. Для этого, соблюдая правила асептики, во флакон шприцем через инъекционную иглу вливают раствор хлористого натрия, хорошо взбалтывают. Содержимое набирают обратно в шприц и производят внутримышечную инъекцию.

Изобретение может быть использовано при производстве очищенного гонадотропина из сыворотки крови жерёбых кобыл на биофабриках и других предприятиях по производству гормональных препаратов.