варианты эритропоэтина

Формула изобретения

1. Полинуклеотид, кодирующий вариант эритропоэтина (ЕРО), обладающий активностью, связанной с защитой клетки, и, в частности нейрозащитной активностью, но, по существу, не обладающий гемопоэтической активностью, выбранный из группы, состоящей из

(a) полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере зрелую форму полипептидов, названных hs3 и hs4 и имеющих расшифрованную аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2 и 10, соответственно;

(b) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по (а), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное обладает активностью, связанной с защитой клетки, и, в частности нейрозащитной активностью, но, по существу, не обладает гемопоэтической активностью.

2. Комплементарная цепь полинуклеотида по п.1.

3. Полинуклеотид, кодирующий вариант эритропоэтина (ЕРО), обладающий активностью, связанной с защитой клетки, и, в частности нейрозащитной активностью, но, по существу, не обладающий гемопоэтической активностью, выбранный из группы, состоящей из

(а) полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, названные hA, hAmA, hAmE, hA-10 и hA - последовательностями без лидера и имеющие расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:50, 51, 52, 53 и 61, соответственно;

(b) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по (а), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное обладает активностью, связанной с защитой клетки, и, в частности нейрозащитной активностью, но, по существу, не обладает гемопоэтической активностью.

4. Комплементарная цепь полинуклеотида по п.3.

5. Полинуклеотид по любому из пп.1 или 3, который является ДНК, геномной ДНК или РНК.

6. Полинуклеотид по любому из пп.2 или 4, который является ДНК, геномной ДНК или РНК.

7. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп.1-6, в котором указанный полинуклеотид функционально связан с регуляторными последовательностями экспрессии, делающими возможной экспрессию в прокариотических и/или эукариотических клетках-хозяевах.

8. Клетка-хозяин, генетически сконструированная с полинуклеотидом по любому из пп.1-6 или вектором по п.7, позволяющая экспрессию варианта эритропоэтина (ЕРО), кодируемого полинуклеотидом по любому из пп.1, 3 и 5.

9. Способ получения полипептида варианта ЕРО, кодируемого полинуклеотидом по любому из пп.1, 3 и 5, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.8 и извлечение полипептида, кодируемого указанным полинуклеотидом.

10. Способ получения клеток, способных экспрессировать один из вариантов ЕРО, предусматривающий генетическое конструирование клеток in vitro с вектором по п.7, где указанный полипептид варианта ЕРО кодируется полинуклеотидом по любому из пп.1, 3 и 5.

11. Полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом по любому из пп.1, 3 и 5 или получаемую способом по п.9.

12. Полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом по любому из пп.1, 3 и 5, где указанный полипептид модифицирован с целью повышения времени полужизни этого полипептида, где модификация выбрана из группы, состоящей из окисления, сульфатирования, фосфорилирования, добавления олигосахаридов или их комбинаций.

13. Фармацевтическая композиция для защиты или усиления ЕРО-чувствительных клеток, содержащая полипептид по п.11 или 12.

14. Применение полипептида по п.11 или 12 для приготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, связанного с повреждением ткани вследствие смерти клеток.

15. Применение по п.14, где указанная смерть клеток индуцирована ишемией, гипоксией, бактериальной инфекцией, вирусной инфекцией, индуцирована аутоиммунологическим, травматическим, химическим образом или индуцирована излучением.

16. Применение по п.14 или 15, где указанное состояние является острым или хроническим нейродегенеративным и/или нейровоспалительным нарушением, острым или хроническим нарушением сердца, легкого, почки, печени или поджелудочной железы, или указанное состояние связано с трансплантацией органа или клеток.

17. Применение по п.16, где указанное острое нейродегенеративное и/или нейровоспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из церебральной ишемии или инфаркта, в том числе эмболической окклюзии и тромботической окклюзии, реперфузии после острой ишемии, перинатального гипоксического-ишемического повреждения, остановки сердца, внутричерепного кровоизлияния, субарахноидального кровоизлияния и внутричерепных повреждений, повреждений спинного мозга, внутрипозвоночных повреждений, «whiplash shaken» - синдрома младенцев, инфекционного энцефалита, менингита, головной боли.

18. Применение по п.17, где указанное острое нейродегенеративное и/или нейровоспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из деменций, болезни Пика, болезни диффузных телец Леви, прогрессирующего супрануклеарного паралича (синдрома Стила-Ричардсона), рассеянного склероза, множественной системной атрофии, хронических эпилептических состояний, связанных с нейродегенерацией, заболеваний двигательных нейронов, дегенеративных атаксий, кортикальной базофильной дегенерации, комплекса Гуама амиотрофического бокового склероза (ALS)-деменции Паркинсона, подострого склерозирующего панэнцефалита, болезни Хангтингтона, болезни Паркинсона, синуклеинопатий, первичной прогрессирующей афазии, стриатонигральной дегенерации, заболевания Махадо-Джозефа/спинально-церебеллярной атаксии типа 3 и оливомостомозжечковых дегенерации, синдрома Жилля де ла Туретта, бульбарного и псевдобульбарного паралича, спинномозговой и спинально-бульбарной мышечной атрофии (болезни Кеннеди), первичного бокового склероза, семейной спастической параплегии, болезни Верднига-Хоффмана, болезни Кугельберга-Веландера, болезни Тея-Сакса, болезни Зандхоффа, семейной спастической болезни, спастического парапареза, прогрессирующей многоочаговой лейкоэнцефалопатии, семейной вегетативной дисфункции (синдрома Райля-Дея), полиневропатий, вызываемых прионами заболеваний, привыкания, аффективных нарушений, шизофренических нарушений, синдрома хронической усталости, хронической боли.

19. Применение по п.14 или 15, где указанным состоянием является старение.

20. Применение по любому из пп.14, 15, 17 и 18, где указанное лекарственное средство вводят до или после возникновения указанного состояния.

21. Применение по п.16, где указанное лекарственное средство вводят до или после возникновения указанного состояния.

22. Применение по п.19, где указанное лекарственное средство вводят до или после возникновения указанного состояния.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новым эндогенным вариантам эритропоэтина (EPO) и их применению для лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с повреждением ткани вследствие смерти клеток (апоптоза, некроза) и воспалением, в частности, для нейрозащиты, например, лечения острого (например, инсульта) и хронического заболевания (например, амиотрофического бокового склероза, ALS) нервной системы.

Уровень техники

Апоплексический удар (инсульт) является нарушающим трудоспособность заболеванием, которое поражает более чем 400000 человек в год в Соединенных Штатах и является третьей наиболее распространенной причиной смерти в Соединенных Штатах. Кроме того, половина неврологических стационарных пациентов имеет связанные с инсультом проблемы. Предполагается, что при существующих тенденциях это количество повысится до одного миллиона в год к 2050 году. При суммарном рассмотрении непосредственных расходов (по уходу и лечению) и косвенных расходов (в связи с потерей трудоспособности) в случае апоплексических ударов, апоплексические удары создали бремя 43,3 миллиарда долларов в год только для населения Соединенных Штатов. Приблизительно 1/3 пациентов умирает в первые три месяца, 1/3 остается с тяжелыми нарушениями трудоспособности, и только 1/3 выздоравливает с приемлемым исходом. В 1990 году цереброваскулярные заболевания были второй основной причиной смерти во всем мире, убивающей более 4,3 миллионов людей во всем мире. Таким образом, на основании перспективы здоровья общества апоплексический удар (инсульт) является одним из наиболее заслуживающих внимания заболеваний.

Апоплексический удар характеризуется неожиданной потерей кровоснабжения зоны головного мозга, приводящей к соответствующей потере неврологической функции. Также называемый цереброваскулярным приступом (инсультом) или синдромом удара, апоплексический удар является неспецифическим термином, включающим в себя гетерогенную группу патофизиологических причин, в том числе тромбоз, эмболию и кровоизлияние. Апоплексические удары классифицируются в настоящее время как геморрагические или ишемические. Острый ишемический апоплексический удар относится к ударам, вызываемым тромбозом или эмболией, и является причиной 80% всех апоплексических ударов.

Ишемические апоплексические удары происходят из-за блокады артерий, которые снабжают кровью головной мозг, наиболее часто в разветвлениях внутренних сонных артерий. Такая блокада обычно происходит, когда часть сгустка крови (тромба) или отложения жиров (атеромы) вследствие атеросклероза отрывается (становясь эмболом), перемещается с кровотока и откладывается в артерии, которая снабжает кровью головной мозг. Сгустки крови могут образовываться при разрывании отложения жиров в стенке артерии. Разрывание такого отложения жиров может также происходить при замедлении кровотока большим отложением жиров, уменьшающим протекание крови. Кровь, которая течет медленно, имеет большую вероятность коагуляции. Таким образом, риск образования тромбов и блокирования суженной артерии является высоким. Сгустки крови могут также образовываться в других зонах, например, в сердце или на клапане сердца. Апоплексические удары, вызванные такими сгустками крови, являются наиболее частыми вскоре после операции на сердце и среди людей, которые имеют нарушение клапана сердца или аномальный ритм сердца (аритмию), в частности, фибрилляцию предсердий. При некоторых нарушениях, таких как избыток эритроцитов (полицитемия), риск сгустков крови также увеличивается, так как кровь загущается.

Ишемический инсульт может также происходить, если кровоток к головному мозгу уменьшается, как это может происходить, когда человек теряет много крови или имеет очень высокое кровяное давление. Изредка ишемический инсульт встречается, когда кровоток к головному мозгу нормальный, но кровь не содержит достаточного количества кислорода. Нарушения, которые уменьшают содержание кислорода в крови, включают в себя тяжелую анемию (недостаточность эритроцитов), асфиксию и отравление монооксидом углерода. Обычно повреждение головного мозга в таких случаях распространяется (диффундирует), и возникает кома. Ишемический инсульт может встречаться, если воспаление или инфекция сужает кровеносные сосуды, снабжающие головной мозг. Подобным образом, такие лекарственные средства как кокаин и амфетамины, могут вызвать спазм артерий, который может привести к сужению артерий, снабжающих головной мозг, до такой степени, что возникает апоплексический удар (инсульт).

Головной мозг требует глюкозы и кислорода для поддержания метаболизма и функции нейронов. Недостаточная доставка кислорода к головному мозгу приводит к гипоксии, а ишемия происходит из недостаточного мозгового кровообращения. Последствия церебральной ишемии зависят от степени и продолжительности уменьшенного мозгового кровообращения. Нейроны могут переносить ишемию в течение 30-60 минут. Если кровоток в ишемическую зону не восстанавливается, происходит ряд метаболических процессов. Нейроны становятся истощенными в отношении АТФ и переключаются на анаэробный гликолиз, гораздо менее эффективный путь. Накапливается лактат, и внутриклеточный рН уменьшается. Без достаточной подачи АТФ ионные насосы в плазматической мембране нарушаются. Полученный приток натрия, воды и кальция в клетку вызывает быстрое набухание нейронов и глиальных клеток. Деполяризация мембраны также стимулирует массивное высвобождение аминокислот глутамата и аспартата, обе из которых действуют в качестве возбуждающих нейротрансмиттеров в головном мозге. Глутамат дополнительно активирует натриевые и кальциевые ионные каналы в мембране нейронных клеток, а именно, хорошо охарактеризованный N-метил-D-аспартатный (NMDA) кальциевый канал. Избыточный приток кальция в клетку вызывает нарушенную активацию большого диапазона ферментных систем (протеаз, липаз и нуклеаз). Эти ферменты и продукты их метаболизма, такие как свободные радикалы кислорода, повреждают мембраны клеток, генетический материал и структурные белки в нейронах, приводя, в конечном счете, к смерти клеток нейронов (Dirnagl, U. et al. (1999) Trends Neurosci. 22: 391-397).

Апоплексические удары начинаются неожиданно, развиваются быстро и вызывают смерть ткани головного мозга в пределах минут - дней. В ишемическом головном мозге обычно различают два объема тканей: сердцевину повреждения (инфаркта) и окружающую зону, известную как ишемическая полутень - недостаточно перфузируемую и метаболически нарушенную границу, окружающую безвозвратно поврежденную сердцевину. Сердцевина и полутень характеризуются двумя различными типами смерти клеток: некрозом и апоптозом (который называют также запрограммированной смертью клеток или задержанной смертью нейронных клеток). Тяжелый дефицит перфузии (кровотока) в сердцевине вызывает распад метаболических процессов, клеточной подачи энергии и гомеостаза ионов, что заставляет клетки терять их целостность в пределах минут. Таким образом, острый некроз клеток и тканей преобладает в сердцевине. В полутени некоторая остаточная перфузия сохраняется в коллатеральных сосудах, которые могут быть не способны поддерживать полный функциональный метаболизм, но предотвращают немедленную структурную дезинтеграцию. Однако со временем (часы - несколько дней) изменение клеточного гомеостаза заставляет умирать все больше и больше клеток, и объем инфаркта увеличивается. Таким образом, полутень должна рассматриваться как ткань, связанная с риском во время созревания инфаркта. В этой области каскады сигналов апоптоза и воспалительных сигналов играют важную роль. Полутень может первоначально составлять 50% объема, который будет заканчиваться в виде инфаркта. Механизмы, которые приводят к задержанной смерти клеток, обеспечивают мишени для специфической нейрозащитной терапии в областях головного мозга, пораженных ишемией, но все еще являющихся жизнеспособными.

Терапевтические возможности пока являются крайне неутешительными: тромболиз при помощи rtPA, единственная терапия с доказанной эффективностью в большом клиническом испытании (NINDS) является эффективным только во временном окне 3 часов, что ограничивает его применение только небольшим количеством пациентов с ишемическим инсультом. Другими словами, наряду с базовой поддерживающей терапией, в настоящее время более чем 95% инсультов не могут лечиться конкретно. Это находится в резком противоречии с нашим знанием в отношении базовой патофизиологии этого заболевания, которое возникло на протяжении последнего десятилетия. В частности, экстенсивное знание было накоплено по механизму паренхимного повреждения головного мозга и эндогенной нейрозащиты, а также функциональной и структурной реорганизации.

Недавно внимание было сфокусировано на потенциальной терапевтической роли эндогенных белков головного мозга, обладающих нейрозащитными свойствами. ЕРО, гликопротеиновый гормон, продуцируемый первично клетками эндотелия перитубулярных капилляров почки, который является членом семейства гормонов роста/пролактоновых цитокинов (Zhu Y. аnd D'Andrea A.D.: (1994) Curr. Opin. Hematol. 1: 113-118), является подающим надежды кандидатом. Хотя ЕРО был сначала охарактеризован и широко известен теперь в связи с его ролью в качестве гемопоэтического гормона, детектирование ЕРО и его рецептора (EPOR) в ткани головного мозга грызунов и человека, а также в культивируемых нейронах и астроцитах, расширило поиск в отношении других биологических функций ЕРО.

В головном мозге паракринная ЕРО/(Еро-R)₂ -система существует независимо от эндокринной системы зрелого эритропоэза; нейроны экспрессируют (Epo-R)₂, а астроциты продуцируют ЕРО (Ruscher et al. (2002) J. Neurosci. 22, 10291-301; Prass et al. (2003) Stroke 34, 1981-1986). Было продемонстрировано in vitro и in vivo, что ЕРО является сильным ингибитором нейронного апоптоза, индуцируемого ишемией и гипоксией (Ruscher et al. (2002) J. Neurosci. 22, 10291-301; Bernaudin, M., et al. (1999) J Cereb Blood Flow Metab. 19: 643-51; Morishita, E., et al. (1997) Neuroscince, 76: 105-16). Несколькими группами сообщалось, что добавление ЕРО к нейронным культурам защищает против гипоксии и токсичности глутаминовой кислоты (Henn F.A: and Braus D.F. (1999) Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249: 48-56, Vogeley K. et al. (2000) Am. J. Psychiatry 157: 34-39) и уменьшает неврологическую дисфункцию в моделях инсульта грызунов (Brines M.L. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 10526-10531 и Bernaudin et al. (1999) J. Cereb. Blood Flow Metab. 10: 643-651). Многообещающие результаты этих экспериментов были подтверждены в исследованиях на человеке, в которых было показано, что ЕРО-терапия для острого инсульта является безопасной и может быть полезной (Eherenreich H. et al. (2002) Mol. Medicine 8: 495-505) и WO 00/35475 А2. Эти клеточные и, более конкретно, нейрозащитные свойства ЕРО привели к дополнительному исследованию в этой области для подтверждения этих открытий в большем испытании, и применение ЕРО в настоящее время предложено также и в другом показании, в том числе, например, в случае шизофрении (Ehrenreich H et al. (2004) Molecular Psychiatry 9: 42-54 и WO 02/20031 А2).

Для применения ЕРО с целью предотвращения повреждения ткани гемопоэтическая активность часто не требуется и может быть вредной, если вводят большие количества ЕРО для лечения или уменьшения эффектов индуцированного гипоксией или ишемией повреждения тканей. Таким образом, были предприняты попытки создания вариантов ЕРО, которые проявляют только клеткозащитное свойство, но не гемопоэтические свойства. US 2003/0130197 описывает пептидные миметики ЕРО для лечения нейродегенеративных нарушений, которые не имеют гомологию последовательности с природно-встречающимся ЕРО или его фрагментами. US 6531121 описывает асиалоэритропоэтин, который генерируют полным десиалилированием рекомбинантного ЕРО, который показал увеличенную способность пересечения барьера эндотелиальных клеток и имел уменьшенную гемопоэтическую активность. Было также показано, что карбамилированный эритропоэтин (СЕРО) также обнаруживает тканезащитное действие, но не имеет эритропоэтического действия (Leist et al. (2004) Science 305: 239-242 и WO 2005/025606 А1.

Наконец, было показано, что 17-мерный пептид ЕРО ингибировал смерть клеток двух нейронных клеточных линий, SK-N-MC и NS20Y (Campana W.M. et al. (1998) Int. J. Mol. Medicine 1: 235-241), не имея в то же самое время гемопоэтической активности. Однако требовался 1 нг/мл этого пептида ЕРО для индукции того же самого антиапоптотического эффекта, который вызывали 100 пг/мл рекомбинантного ЕРО (rhEPO) в клетках NS20Y и 400 пг/мл rhEPO в клетках SK-N-MC. При кажущейся средней молекулярной массе rhEPO приблизительно 66000 г/моль (рассчитанная молекулярная масса равна приблизительно 33000 г/моль, но не включает в себя массу олигосахаридных остатков, содержащихся в rhEPO) и приблизительно 1900 г/моль пептида ЕРО, концентрации 1,52 пмоль/л и 6,06 пмоль/л, соответственно, rhEPO и 1 нмоль/л пептида ЕРО индуцировали одинаковый уровень защитного для клеток действия. Таким образом, пептид ЕРО является в 650-165 раз менее активным, чем rhEPO в предупреждении смерти клеток. Из этих цифр видно, что область ЕРО, содержащаяся в этом 17-мере, не играет главную роль в функции защиты клеток ЕРО. Таким образом, все варианты ЕРО, которые имеют уменьшенную гемопоэтическую активность, известные в предыдущем уровне техники, страдают от недостатка, заключающегося в том, что они не являются природно-встречающимися, так как они либо потеряли их природное гликозилирование, либо являются искусственными укорочениями и/или они имеют значительно уменьшенную клеткозащитную активность в сравнении с rhEPO. Таким образом, существует потребность в известном уровне техники в обеспечении производного ЕРО, которое является близким к природно-встречающемуся ЕРО и которое имеет такую же или лучшую тканезащитную активность, что и rhEPO, но меньшую гемопоэтическую, в частности, эритропоэтическую активность или полной отсутствие этой активности.

Эта проблема решена обеспечением новых вариантов ЕРО, которые, как было обнаружено, встречаются в природе в ткани человека и мыши (в головном мозге, в почке) и которые обнаруживают клеткозащитную активность, сходную или лучшую относительно rhEPO, но которые не проявляют какой-либо значимой гемопоэтической активности.

Сущность изобретения

В одном аспекте данное изобретение относится к кодирующему вариант ЕРО полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере зрелую форму полипептидов, названных hs3, h1-4, h1-5, hs4, h1-1, h2-1, mS, mG3, mG5, m301 и mK3, имеющих расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22, соответственно;

(b) полинуклеотидов, имеющих кодирующую последовательность, показанную в SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21, кодирующую по меньшей мере зрелую форму этого полипептида;

(c) полинуклеотида, кодирующего гуманизированную версию полипептидов mS, mG3, mG5, m301 и mK3, имеющую расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:14, 16, 18, 20 и 22;

(d) полинуклеотидов, кодирующих полипептид, содержащий слияние аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:24, 26, 28 и 30, на N-конце аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:32, 34, 36 и 38;

(е) полинуклеотидов, содержащих слияние полинуклеотидных последовательностей, выбранных из группы полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:23, 25, 27 и 29, 5' (слева) относительно полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:31, 33, 35 и 37;

(f) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(е), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(g) полинуклеотидов, кодирующих фрагмент полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(f), где в указанном фрагменте 1-10 аминокислотных остатков делетированы на N-конце и/или С-конце и/или 1-10 аминокислот делетированы на N-конце и/или С-конце границы сплайсинга в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(h) полинуклеотидов, которые являются по меньшей мере на 50% идентичными полинуклеотиду по любому из (а)-(g) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности; и

(i) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(h) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

Следующим аспектом данного изобретения является гомолог кодирующего вариант эритропоэтина (ЕРО) полинуклеотида, из других высших эукариотических видов.

Следующим аспектом данного изобретения является кодирующий вариант ЕРО полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих полипептид варианта ЕРО, который содержит N-концевую часть полноразмерного ЕРО, в том числе спираль А, и который лишен по меньшей мере одного фрагмента из следующих:

(i) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот между спиралью А и спиралью В;

(ii) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 аминокислот спирали В;

(iii) фрагмента из по меньшей мере 2 аминокислот, предпочтительно 3, 4, 5 или 6 аминокислот между спиралью В и спиралью С;

(iv) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 аминокислот спирали С;

(v) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 аминокислот между спиралью С и спиралью D; и/или

(vi) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 спирали D;

где указанный вариант имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(b) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(с) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(b) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

В предпочтительном аспекте полинуклеотидом данного изобретения является ДНК, геномная ДНК или РНК.

В другом аспекте данное изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид данного изобретения. Предпочтительно, полинуклеотид, содержащийся в этом векторе, функционально связан с регуляторными последовательностями экспрессии, делающими возможной экспрессию в прокариотических и/или эукариотических клетках-хозяевах.

Другим аспектом этого изобретения является клетка-хозяин, генетически сконструированная с полинуклеотидом данного изобретения или вектором данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является трансгенное животное, не являющееся человеком, содержащее полинуклеотид данного изобретения, вектор данного изобретения и/или клетку-хозяина данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является способ получения полипептида варианта ЕРО, кодируемого полинуклеотидом данного изобретения, предусматривающий: культивирование клетки-хозяина данного изобретения и извлечение полипептида, кодируемого указанным полинуклеотидом.

В предпочтительном варианте осуществления способ данного изобретения дополнительно предусматривает стадию модификации указанного варианта ЕРО, где эта модификация выбрана из группы, состоящей из окисления, сульфатирования, фосфорилирования, добавления олигосахаридов или их комбинаций.

Другим аспектом этого изобретения является способ получения клеток, способных экспрессировать по меньшей мере один из вариантов ЕРО, предусматривающий генетическое конструирование клеток in vitro с вектором данного изобретения, где указанный полипептид (указанные полипептиды) варианта ЕРО кодируется (кодируются) полинуклеотидом данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом данного изобретения или получаемую по способу данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является антитело, специфически связывающееся с полипептидом данного изобретения.

Другим аспектом этого изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая полинуклеотид данного изобретения, вектор данного изобретения, клетку-хозяина данного изобретения, полипептид данного изобретения и/или антитело данного изобретения и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

Другим аспектом этого изобретения является применение полинуклеотида данного изобретения, вектора данного изобретения, клетки-хозяина данного изобретения, полипептида данного изобретения для приготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, связанного с повреждением ткани вследствие смерти клеток, например, апоптоза или некроза, а также воспалением.

В предпочтительном применении данного изобретения смерть клеток индуцирована ишемией, гипоксией, бактериальной инфекцией, вирусной инфекцией, индуцирована аутоиммунологическим, травматическим, химическим (например, метаболическим, токсическим) образом или индуцирована излучением.

В предпочтительном применении данного изобретения этим состоянием является острое нейродегенеративное/нейровоспалительное нарушение или хроническое нейродегенеративное/нейровоспалительное нарушение, острое или хроническое нарушение сердца (например, инфаркт миокарда), легкого (например, астма, хроническая обструктивная болезнь легких), почки (например, гломерулонефрит), печени (например, хроническая печеночная недостаточность) или поджелудочной железы (например, панкреатит) или указанное состояние ассоциировано с трансплантацией органа (например, почки или печени) или клеток (например, стволовых клеток).

Предпочтительно, острое нейродегенеративное и/или нейровоспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из церебральной ишемии или инфаркта, в том числе эмболической окклюзии и тромботической окклюзии, реперфузии после острой ишемии, перинатального гипоксического-ишемического повреждения, остановки сердца, внутричерепного кровоизлияния, субарахноидального кровоизлияния и внутричерепных повреждений (например, травмы ЦНС), повреждений спинного мозга, внутрипозвоночных повреждений, «whiplash shaken» - синдрома младенцев, инфекционного энцефалита (например, герпетического энцефалита), менингита (например, бактериального), головной боли (например, мигрени).

Предпочтительно, хроническое нейродегенеративное/нейровоспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из деменций (например, болезни Альцгеймера, сосудистых деменций), болезни Пика, диффузного заболевания организма Леви, прогрессирующего супрануклеарного паралича (синдрома Стила-Ричардсона), рассеянного склероза, множественной системной атрофии (в том числе синдрома Шай-Драгера), хронических эпилептических состояний, ассоциированных с нейродегенерацией, заболеваний двигательных нейронов, дегенеративных атаксий, кортикальной базофильной дегенерации, комплекса Гуама амиотрофического бокового склероза (ALS)-деменции Паркинсона, подострого склерозирующего панэнцефалита, болезни Хангтингтона, болезни Паркинсона, синуклеинопатий, первичной прогрессирующей афазии, стриатонигральной дегенерации, заболевания Махадо-Джозефа/спинально-церебеллярной атаксии типа 3 и оливомостомозжечковых дегенераций, болезни Жиля де ла Туретта, бульбарного и псевдобульбарного паралича, спинномозговой и спинально-бульбарной мышечной атрофии (болезни Кеннеди), первичного бокового склероза, семейной спастической параплегии, болезни Верднига-Хоффмана, болезни Кугельберга-Веландера, болезни Тея-Сакса, болезни Зандхоффа, семейной спастической болезни, спастического парапареза, прогрессирующей многоочаговой лейкоэнцефалопатии, семейной вегетативной дисфункции (синдрома Райля-Дея), полиневропатий (например, диабетической, алкогольной-токсической полиневропатии, синдрома Гийена-Барре, хронической воспалительной димиелинизирующей полиневропатии), вызываемых прионами заболеваний, привыкания, аффективных нарушений (например, депрессии), шизофренических нарушений, синдрома хронической усталости, хронической боли (например, боли нижней части спины).

В предпочтительном применении данного изобретения этим состоянием является старение.

В предпочтительном применении данного изобретения лекарственное средство вводят до или после возникновения указанного состояния.

Подробное описание изобретения

Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, обычно понимаемое специалистом с обычной квалификацией в области, к которой относится данное изобретение. В случае противоречия, будут предпочтительными определения данного изобретения. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя в применении на практике или в испытании данного изобретения могут быть также использованы способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылки в их полном объеме. Материалы, способы и примеры, описанные здесь, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Данное изобретение основано на неожиданном наблюдении, что в нейронной ткани экспрессируются варианты ЕРО, и определении, что эти варианты защищали нейроны от повреждения, индуцированного лишением кислорода и глюкозы, но не обнаруживали гемопоэтической активности. Это поведение делает их подходящими для применения в качестве терапевтических веществ в ситуациях, в которых гемопоэтическая функция ЕРО не требуется или является вредной. Таким образом, первым аспектом данного изобретения является кодирующий вариант ЕРО полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере зрелую форму полипептидов, названных hs3, h1-4, h1-5, hs4, h1-1, h2-1, mS, mG3, mG5, m301 и mK3, имеющих расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22, соответственно;

(b) полинуклеотидов, имеющих кодирующую последовательность, показанную в SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21, кодирующую по меньшей мере зрелую форму этого полипептида;

(c) полинуклеотида, кодирующего гуманизированную версию полипептидов mS, mG3, mG5, m301 и mK3, имеющую расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:14, 16, 18, 20 и 22;

(d) полинуклеотидов, кодирующих полипептид, содержащий слияние аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:24, 26, 28 и 30, на N-конце, предпочтительно непосредственно, т.е. без каких-либо промежуточных аминокислот, аминокислотной последовательности, выбранной из группы аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:32, 34, 36 и 38;

(е) полинуклеотидов, содержащих слияние полинуклеотидных последовательностей, выбранных из группы полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:23, 25, 27 и 29, 5' (слева), предпочтительно непосредственно 5' (слева), т.е. без каких-либо промежуточных полинуклеотидов, относительно полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы полинуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:31, 33, 35 и 37;

(f) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(е), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(g) полинуклеотидов, кодирующих фрагмент полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(f), где в указанном фрагменте 1-10 аминокислотных остатков делетированы на N-конце и/или С-конце и/или 1-10 аминокислот делетированы на N-конце и/или С-конце границы сплайсинга в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(h) полинуклеотидов, которые являются по меньшей мере на 50% идентичными полинуклеотиду по любому из (а)-(g) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности; и

(i) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(h) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

Данное изобретение относится также к кодирующему пептид варианта ЕРО полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, названные ha, hAma, hAmE, hA-10 и ha-транспортной последовательностью, имеющих расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:50, 51, 52, 53 и 61, соответственно;

(b) полинуклеотидов, имеющих кодирующую последовательность, показанную в SEQ ID NO:55, 56, 57, 58 и 60, кодирующую по меньшей мере зрелую форму этого полипептида;

(c) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(b), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(d) полинуклеотидов, кодирующих фрагмент полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(b), где в указанном фрагменте 1-10 аминокислотных остатков делетированы на N-конце и/или С-конце и/или 1-10 аминокислот делетированы на N-конце и/или С-конце границы сплайсинга в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(е) полинуклеотидов, которые являются по меньшей мере на 50% идентичными полинуклеотиду по любому из (а)-(b) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности; и

(i) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(b) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

В следующем аспекте полинуклеотиды данного изобретения содержат гомологи вариантов ЕРО данного изобретения, полученные из других высших эукариотических видов, в частности, из млекопитающих, более предпочтительно, из приматов, не являющихся человеком; из грызунов, например, крысы или морской свинки; жвачных, например, коровы; или овцы; лошади; свиньи; кролика; собаки или кошки, которые имеют клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеют гемопоэтической активности. В данном контексте, термин гомолог относится к полинуклеотиду, кодирующему вариант ЕРО, происходящий из другого вида, который содержит по существу такую же делецию, что и полинуклеотиды, соответствующие SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 55, 56, 57, 58 или 60. Предполагается, что делеция полинуклеотида является по существу той же самой, если она включает в себя делецию полинуклеотидов, кодирующих полипептид, который является гомологичным соответственно делетированным полипептидам в полипептидах варианта ЕРО, соответствующих SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 50, 52, 53 или 61. Критерии для определения гомологии между двумя пептидными последовательностями являются хорошо установленными. Для этой цели могут использоваться такие программы, как BLAST. Предполагается, что делеция является по существу той же самой, если она включает в себя на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 55, 56, 57, 58 или 61 больше или меньше нуклеотидов, чем соответствующая делеция в SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21, которые также изображены на фиг. 2 и 3.

Следующим аспектом данного изобретения является кодирующий вариант ЕРО полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотидов, кодирующих полипептид варианта ЕРО, который содержит N-концевую часть полноразмерного ЕРО, в том числе спираль А, и который лишен по меньшей мере одного фрагмента из следующих:

(i) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот между спиралью А и спиралью В;

(ii) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 аминокислот спирали В;

(iii) фрагмента из по меньшей мере 2 аминокислот, предпочтительно 3, 4, 5 или 6 аминокислот между спиралью В и спиралью С;

(iv) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 аминокислот спирали С;

(v) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 аминокислот между спиралью С и спиралью D; и/или

(vi) фрагмента из по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 спирали D;

где указанный вариант имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(b) полинуклеотидов, кодирующих производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а), где в указанном производном 1-10 аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанное производное имеет клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеет гемопоэтической активности;

(с) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом по любому из (а)-(b) и которые кодируют полипептид, имеющий клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеющий гемопоэтической активности;

или комплементарной цепи такого полинуклеотида.

В этом контексте, спирали А, В, С и D полипептида ЕРО являются районами, гомологичными соответствующим районам спиралей А, В, С и D полноразмерного ЕРО из мыши и человека, представленных на фиг.4. В данной области хорошо известно, как определить гомологии между двумя полипептидными последовательностями, и любой квалифицированный в данной области специалист будет способен сопоставить конкретную полипептидную последовательность ЕРО, например, из другого вида, и определить соответствующее положение спиралей А, В, С и D в этом полипептиде ЕРО. Предпочтительно, полинуклеотид варианта ЕРО получен из высшего эукариотного организма, в частности, млекопитающего или птицы. Предпочтительными млекопитающими являются люди, приматы, не являющиеся человеком; грызуны, например, крыса, морская свинка; жвачные, например, корова; или овца; лошадь; свинья; кролик; собака или кошка. Известны большое количество таких кодирующих полноразмерный ЕРО полинуклеотидов из различных видов, в том числе, без ограничения, кошки (Gene Bank Acc. L10606), свиньи (Gene Bank Acc. 10607), овцы (Gene Bank Acc. 10610), собаки (Gene Bank Acc. L13027), макака (Gene Bank Acc. М18189), макака резуса (Gene Bank Acc. L10609), мыши (Gene Bank Acc. 12930), крысы (Gene Bank Acc. L10608), человека (Gene Bank Acc. М11319), Bos taurus (Gene Bank Acc. U44762) и Bos indicus (Gene Bank Acc. L41354).

Предпочтительно, полинуклеотиды, кодирующие полипептид варианта ЕРО, лишены следующего: (i); (ii); (iii); (iv); (v); (vi); (i) и (ii); (i) и (iii); (i) и (iv); (i) и (v); (i) и (vi); (ii) и (iii); (ii) и (iv); (ii) и (v); (ii) и (vi); (iii) и (iv); (iii) и (v); (iii) и (vi); (iv) и (v); (iv) и (vi); (v) и (vi); (i), (ii) и (iii); (i), (ii) и (iv); (i), (ii) и (v), (i), (ii), (vi), (i), (iii) и (iv); (i), (iii) и (v); (i), (iii) и (vi); (i), (iv) и (v); (i), (iv) и (iv); (i), (v) и (vi); (ii), (iii) и (iv); (ii), (iii) и (v); (ii), (iii) и (vi); (ii), (iv) и (v); (ii), (iv) и (vi); (ii), (v) и (vi); (iii), (iv) и (v); (iii), (iv) и (vi); (iii), (v) и (vi); или (iv), (v) и (vi).

Полипептидом, который проявляет клеткозащитную активность, является полипептид, который имеет по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99,5% или 100% или даже более) способности соответствующего варианта ЕРО защищать нейроны от повреждения посредством апоптоза, где апоптоз индуцирован лишением кислорода или глюкозы, химическим или радиационным воздействием или вирусной или бактериальной инфекцией. Анализы для определения повреждения клеток, в частности, нейронных клеток, известны в данной области. Подходящим анализом является анализ лишения кислорода - глюкозы, описанный здесь ниже. В описанном анализе считываемым показателем является лактатдегидрогеназная активность (LDH). Однако существуют различные другие способы, которые позволяют оценивать повреждение, индуцированное в клетке, и в частности, количество смертей клеток (например, апоптоза, некроза). Эти анализы включают в себя, без ограничения, анализы Tunel (опосредованное трансферазой мечение концов фрагментированной ДНК), МТТ-анализ, анализ жизнь/смерть с использованием окрашивания (например, окрашивания бромидом этидия и окрашивания акридиновым оранжевым красителем), анализ каспаз, электронную микроскопию, ДНК-лэддеринг (на основе регулярного (в виде лестницы) расположения размеров олигонуклеотидов в гелях при электрофорезе в случае апоптотических клеток), которые хорошо известны в данной области.

Полипептидом варианта ЕРО, который по существу не проявляет гемопоэтической активности, является полипептид, которые индуцирует в анализах образования колоний, известных в данной области, пример которых описан ниже, при той же самой молярной концентрации rhEPO и wt mEPO, соответственно, менее чем 10% КОЕ-Э (колониеобразующих единиц-эритробластов), предпочтительно менее чем 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%. Соответствующие количества КОЕ-Э рассчитывают для конкретного rhEPO, wt mEPO или варианта ЕРО вычитанием из каждой величины количества КОЕ-Э, наблюдаемых в контрольной реакции (без wt или варианта ЕРО).

В контексте полипептидов данного изобретения термин «граница сплайсинга» ( junction ) относится к сайту, в котором друг за другом следуют две аминокислоты, которые не являются последовательными в rhEPO или wt mEPO и которые потенциально приводят к событиям сплайсинга или другим реаранжировкам в мРНК ЕРО. Соответствующая граница сплайсинга вариантов ЕРО данного изобретения может быть получена из фиг.4, например, ENIT | VGQQ для hS3, VGQQ | ALLV для h1-4, VNFY | ALLV для h1-5, KRME | PWEP для hS4, ITVP | GPVG для h1-1, LNEN | NHC для h2-1, KRME | KELM для mS, LLAN | FLRG для mG3, DTFC | RRGD для mG5, KVNF | LRGK для m301 или LSEA | VHGR для mK3.

Полинуклеотидные молекулы данного изобретения могут быть синтезированы in vitro (например, синтезом на основе фосфорамидита) или могут быть получены из клетки, например, клетки млекопитающего.

Варианты ЕРО, названные mS, mG3, mG5, m301 и mK3, имеющие расшифрованную аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:14, 16, 18, 20 и 22, соответственно, выделяли из мыши. Эта мышиная последовательность является высокогомологичной этой последовательности человека. Сопоставление аминокислотных последовательностей ЕРО, полученных из человека и мыши, представлено на фиг.4. Как можно видеть, последовательность мыши отличается от последовательности человека отсутствием остатка аланина в положении 8 и следующими 39 заменами (нумерация соответствует соответствующему положению аминокислоты в ЕРО человека, первая указанная аминокислота является аминокислотой человека в этом положении, а вторая аминокислота является соответствующей аминокислотой мыши): ⁴Н ⁴Р, ⁶C ⁶R, ⁹W ⁹Т; ¹¹W ¹¹L, ¹⁸S ¹⁸L; ¹⁹L ¹⁹I; ²⁷G ²⁷C; ⁴³L ⁴³I; ⁵²I ⁵²V; ⁵⁴T ⁵⁴M; ⁶⁰H ⁶⁰G; ⁶¹C ⁶¹Р; ⁶²S ⁶²R; ⁶⁴N ⁶⁴S; ⁸⁴G ⁸⁴E; ⁸⁵Q ⁸⁵Е; ⁹⁵A ⁹⁵S; ¹⁰¹V ¹⁰¹I; ¹⁰³R ¹⁰³Q; ¹⁰⁴G ¹⁰⁴A; ¹⁰⁹V ¹⁰⁹A; ¹¹⁵W ¹¹⁵P; ¹¹⁷P ¹¹⁷T; ¹²²V ¹²²I; ¹²⁶V ¹²⁶I; ¹³⁴T ¹³⁴S; ¹³⁸A ¹³⁸V; ¹⁴⁵A ¹⁴⁵L; ¹⁴⁶I ¹⁴⁶М; ¹⁵¹A ¹⁵¹T; ¹⁵²A ¹⁵²T; ¹⁵³S ¹⁵³Р; ¹⁵⁴A ¹⁵⁴P; ¹⁶⁰I ¹⁶⁰L; ¹⁶²A ¹⁶²V; ¹⁶⁶R ¹⁶⁶C; ¹⁷³S ¹⁷³A; ¹⁸⁷A ¹⁸⁷V и ¹⁹⁰Т ¹⁹⁰R. Гуманизированный mS, mG3, mG5, m301 или mK3 несет дополнительный остаток аланина в положении 8 и/или в одном или нескольких положениях предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или 37 аминокислотной последовательности человека, а не мышиной аминокислотной последовательности. Особенно предпочтительно, mS, mG3, mG5, m301 и mK3 являются полностью гуманизированными, т.е. каждая аминокислота в вышеуказанных положениях, в случае, когда они присутствуют в соответствующем варианте, является аминокислотой последовательности человека, а не последовательности мыши. Ожидается, что гуманизация мышиных вариантов будет уменьшать иммунологические проблемы, которые могут встречаться при применении в лечении людей.

Молекулами нуклеиновых кислот вариантов ЕРО данного изобретения могут быть ДНК, кДНК, геномная ДНК, синтетическая ДНК или РНК, и они могут быть двухцепочечными или одноцепочечными, смысловой и/или антисмысловой цепью. Эти молекулы могут быть получены, например, полимеразной цепной реакцией (ПЦР) или генерированы обработкой одной или несколькими рестрикционными эндонуклеазами. Молекула рибонуклеиновой кислоты может быть получена транскрипцией in vitro.

Полинуклеотидные молекулы данного изобретения могут содержать природно-встречающиеся последовательности или последовательности, которые отличаются от природно-встречающихся последовательностей, но, вследствие вырожденности генетического кода, кодируют тот же самый полипептид, т.е. полипептиды с SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22. Кроме того, эти молекулы нуклеиновых кислот не ограничиваются кодирующими последовательностями, например, они могут включать в себя некоторую часть или все из некодирующих последовательностей, которые лежат слева или справа от кодирующей последовательности.

Кроме того, выделенные молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут включать в себя сегменты, которые не обнаружены, как таковые, в природном состоянии. Так, данное изобретение включает в себя рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, включенные в вектор (например, плазмидный или вирусный вектор) или в геном гетерологичной клетки (или в геном гомологичной клетки в положении, другом, чем природное местоположение в хромосоме). Таким образом, рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот и их применения обсуждаются дополнительно ниже.

В предпочтительных вариантах осуществления полинуклеотиды данного изобретения содержат также молекулы нуклеиновых кислот, которые являются по меньшей мере на 50%, предпочтительно 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными: (а) молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 50, 51, 52, 53 или 60, и (b) нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 55, 56, 57, 58 или 61, соответственно, и которые имеют одновременно клеткозащитную и, в частности, нейрозащитную активность, но по существу не имеют гемопоэтической активности.

Определение процентной идентичности между двумя последовательностями выполняют с использованием математического алгоритма Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Такой алгоритм включен в программы BLASTN и BLASTP Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Поиски нуклеотидов BLAST выполняют с использованием программы BLASTN, оценка = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных кодирующим полипептид вариантам ЕРО нуклеиновых кислот. Поиск белков BLAST выполняют с использованием программы BLASTP, оценка = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных полипептиду варианта ЕРО, соответственно. Для получения имеющих гэпы сопоставлений для сравнительных целей используют Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST используют параметры по умолчанию соответствующих программ.

Гибридизация может быть также использована как мера гомологии между двумя последовательностями нуклеиновых кислот. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая любой из описанных здесь вариантов ЕРО или его производное или фрагмент, может быть использована в качестве гибридизационного зонда в соответствии со стандартными способами гибридизации. Гибридизация зонда варианта ЕРО с ДНК или РНК из тест-источника (например, клетки млекопитающего) является указанием на присутствие релевантной ДНК или РНК ЕРО в этом тест-источнике. Условия гибридизации известны специалистам с квалификацией в данной области и могут быть найдены в Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. Строгие условия определяются как эквивалентные гибридизации в 6Х хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при 45 ^оС с последующей промывкой в 0,2Х SSC, 0,1% ДСН при 65°С. При выборе зонда, специфического в отношении варианта, несущего внутреннюю делецию, предпочтительно, чтобы зонд, используемый для детектирования гомологичных нуклеиновых кислот, перекрывал границы этой делеции, например, hs3, h1-4, h1-5, hS4, mS, mG3, mG5 или m301. В случаях, когда сплайсинг приводит к другому С-концу этого белка, например, h1-1, h2-1 или mK3, предпочтительно, чтобы зонд, используемый для детектирования гомологичных ДНК-последовательностей, перекрывал границы между известной последовательностью ЕРО и другим С-концом. Например, мог бы быть сконструирован зонд, который содержит 10 комплементарных оснований 5' (слева) от сайта сплайсинга и 10 комплементарных оснований 3' (справа) от сайта сплайсинга.

«Выделенной ДНК» является либо (1) ДНК, которая содержит последовательность, неидентичную последовательности любой из природно-встречающихся последовательностей, либо (2) в контексте ДНК с природно-встречающейся последовательностью (например, кДНК или геномной ДНК), ДНК, не содержащая по меньшей мере одного из генов, которые фланкируют ген, содержащий представляющую интерес ДНК, в геноме организма, в котором природно встречается ген, содержащий представляющую интерес ДНК. Этот термин, следовательно, включает в себя рекомбинантную ДНК, включенную в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота. Этот термин включает в себя также выделенную молекулу, такую как кДНК, где соответствующая ДНК имеет интроны и, следовательно, отличающуюся последовательность; геномный фрагмент, который лишен по меньшей мере одного из фланкирующих генов; фрагмент кДНК или геномной ДНК, полученный полимеразной цепной реакцией (ПЦР), который лишен по меньшей мере одного из фланкирующих генов; фрагмент рестрикции, который лишен по меньшей мере одного из фланкирующих генов; ДНК, кодирующую не встречающийся природно белок, такой как слитый (гибридный) белок, мутеин или фрагмент этого белка; и нуклеиновую кислоту, которая является вырожденным вариантом кДНК или природно-встречающейся нуклеиновой кислоты. Кроме того, он включает в себя рекомбинантную нуклеотидную последовательность, которая является частью гибридного гена, кодирующего не встречающийся в природе слитый (гибридный) белок. Из предыдущего описания должно быть понятно, что выделенная ДНК не означает ДНК, присутствующую среди сотен - миллионов других молекул ДНК, например, в библиотеках кДНК или геномной ДНК или в продуктах расщепления геномной ДНК рестриктазами, например, в реакционной смеси продукта рестрикции или в кусочке электрофоретического геля.

Следующим аспектом данного изобретения является вектор, содержащий полинуклеотид (полинуклеотиды) данного изобретения, или белок, кодируемый полинуклеотидом данного изобретения. Термин «вектор» относится к белку или полинуклеотиду или их смеси, которая способна вводиться или вводить белки и/или нуклеиновую кислоту, содержащиеся в ней, в клетку. Предпочтительно, белки, кодируемые введенным полинуклеотидом, экспрессируются в клетке при введении этого вектора.

В предпочтительном варианте осуществления вектор данного изобретения содержит плазмиды, фагмиды, фаги, космиды, искусственные хромосомы млекопитающих, конструкции с нокаутом гена или с введенным геном, вирусы, в частности, аденовирусы, вирусы коровьей оспы, аттенуированные вирусы коровьей оспы, поксвирусы канарейки, лентивирус (Chang, L.J. and Gay, E.E. (2001) Curr. Gene Therap. 1:237-251), герпесвирусы, в частности, вирус простого герпеса (HSV-1, Carlezon, W.A. (2000) Crit. Rev. Neurobiol.), бакуловирус, ретровирус, аденоассоциированный вирус (AAV, Carter, P.J. and Samulski, R.J. (2002) J. Mol. Med. 6:17-27), риновирус, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), филовирус и его сконструированные версии (см., например, Cobinger G.P. et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:225-30), виросомы, липосомы с «голой» ДНК и покрытые нуклеиновыми кислотами частицы, в частности, золотые шарики. Особенно предпочтительными являются вирусные векторы, такие как аденовирусные векторы и ретровирусные векторы (Lindemann et al. (1997) Mol. Med. 3:466-76 и Springer et al. (1988) Mol. Cell. 2:549-58). Липосомы являются обычно небольшими однослойными или многослойными пузырьками, изготовленными из катионных, нейтральных и/или анионных липидов, например, обработкой ультразвуком липосомных суспензий. ДНК может быть, например, ионно связана с поверхностью этих липосом или заключена внутрь липосомы. Подходящие липидные смеси известны в данной области и содержат, например, DOTMA (1,2-диолеилоксипропил-3-триметиламмонийбромид) и DPOE (диолеилфосфатидилэтаноламин), оба из которых были использованы на различных клеточных линиях.

Покрытые нуклеиновой кислотой частицы являются другим средством для введения нуклеиновых кислот в клетки с использованием так называемых «генных пистолетов», которые делают возможным механическое введение частиц в клетки. Предпочтительно, сами эти частицы являются инертными и, следовательно, в предпочтительном варианте осуществления изготовлены из золотых шариков.

В следующем аспекте полинуклеотид данного изобретения функционально связан с регуляторными последовательностями экспрессии, делающими возможной экспрессию в прокариотических и/или эукариотических клетках-хозяевах. Эти транскрипционные/трансляционные регуляторные элементы, указанные выше, включают в себя, но не ограничиваются ими, индуцируемые и неиндуцируемые, конститутивные, регулируемые клеточным циклом, метаболически регулируемые промоторы, энхансеры, операторы, сайленсеры, репрессоры и другие элементы, которые известны специалистам с квалификацией в данной области и которые запускают или иным образом регулируют экспрессию генов. Такие регуляторные элементы включают в себя, но не ограничиваются ими, регуляторные элементы, управляющие конститутивной экспрессией, такие как, например, промоторы, транскрибируемые РНК-полимеразой III, такие как, например, промоторы для гена snRNA U6 или гена scRNA 7SK, промотор немедленного раннего гена цитомегаловируса человека (hCMV), ранний или поздний промоторы аденовируса SV40, вирусные промоторные и активаторные последовательности, произведенные, например, из NBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, MMTV или НIV (ВИЧ); которые делают возможной индуцируемую экспрессию, такие как, например, промотор CUP-1, tet-репрессор, используемый, например, в системах tet-on или tet-off, система lac, система trp; регуляторные элементы, регулирующие тканеспецифическую экспрессию, предпочтительно специфическую в отношении нервных клеток экспрессию, например, промотор Thy-1,2, NSE, легкой цепи II миозина, тирозингидроксилазы, промотор CAMKIIalpha, бета-цепь полученного из тромбоцитов фактора роста (PDGF), допамин-бета-гидроксилазы, Tau, регуляторные элементы (например, NRSE/RE-1; ограниченный нейронами элемент сайленсинга/репрессорный элемент 1), регулирующие специфическую в отношении клеточного цикла экспрессию, такие как, например, cdc2, cdc25C или циклин А; или система TAC , система TRC, основные операторные и промоторные районы фага А, регуляторные районы белка оболочки fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы, промоторы кислой фосфатазы и промоторы факторов или а спаривания дрожжей.

В данном контексте, «функционально связанные» обозначает: включенные в генетическую конструкцию таким образом, что регуляторные последовательности экспрессии эффективно регулируют экспрессию представляющей интерес кодирующей последовательности.

Подобным образом, полинуклеотиды данного изобретения могут образовывать часть гибридного гена, кодирующую дополнительные полипептидные последовательности, например, последовательность, которая кодирует белок, функционирующий в качестве маркера или репортера. Этот гибридный ген может приводить к образованию слитого белка, или две или более частей могут быть разделены внутренней последовательностью вхождения рибосом (IRES), которые приводят к экспрессии двух или более отдельных белков. Примеры маркерных или репортерных генов включают в себя гены -лактамазы, хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ), аденозиндезаминазы (ADA), аминогликозидфосфотрансферазы (neo^r, G418 ^r), дигидрофолатредуктазы (DHFR), гигромицин-В-фосфотрансферазы (НРН), тимидинкиназы (ТК), lacZ (кодирующего -галактозидазу), зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его вариантов и ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (XGPRT). Как и в случае других стандартных процедур, связанных с применением на практике этого изобретения, квалифицированным в данной области специалистам будут известны дополнительные применимые реагенты, например, дополнительные последовательности, которые могут служить в качестве маркера или репортера. Если экспрессия гибридного гена приводит к одному полипептиду, гибридный полипептид будет обычно включать в себя первую часть и вторую часть; причем первой частью является полипептид варианта ЕРО, а второй частью является, например, описанный выше репортер или константная область Ig или часть константной области Ig, например, домены СН2 и СН3 тяжелой цепи IgG2а. Другие гибриды могли бы включать в себя гетерологичную пептидную последовательность для облегчения очистки и/или детектирования, например, антигенную метку, такую как, например, myc-метка или метку с предпочтительным связыванием с некоторым районом, например, хитиновую метку или His-метку. Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот могут также содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид варианта ЕРО, функционально связанную с гетерологичной сигнальной последовательностью. Такие сигнальные последовательности могут направлять белок в различные компартменты в клетке, и они известны специалисту с квалификацией в данной области. Предпочтительной сигнальной последовательностью является последовательность, которая способствует секреции полученного белка. Предпочтительно, эти сигнальные последовательности и/или последовательности-метки сконструированы таким образом, что они могут быть отщеплены от варианта ЕРО после очистки для обеспечения по существу чистого белка без слишком большого количества аминокислот, предпочтительно не более чем с 10 дополнительными аминокислотами относительно конечного ЕРО. Такие сайты расщепления хорошо известны в данной области и содержат, например, сайты расщепления эндопептидазой и сайты расщепления интеином.

Другим аспектом данного изобретения является клетка-хозяин, генетически сконструированная с использованием полинуклеотида или вектора, как описано выше. Клетки-хозяева, которые могут быть использованы для целей данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, прокариотические клетки, такие как бактерии (например, E. coli и B. subtilis), которые могут быть трансформированы, например, такими экспрессирующими векторами, как рекомбинантная ДНК бактериофага, плазмидная ДНК или космидная ДНК, содержащими полинуклеотидные молекулы данного изобретения; простые эукариотические клетки, такие как дрожжи (например, Saccharomyces и Pichia), которые могут быть трансформированы, например, рекомбинантными дрожжевыми экспрессирующими векторами, содержащими полинуклеотидную молекулу данного изобретения; системы клеток насекомых, такие как, например, клетки Sf9 или Hi5, которые могут быть инфицированы, например, рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом), содержащими полинуклеотидные молекулы данного изобретения; ооциты Xenopus, которые могут быть инъецированы, например, плазмидами; системы клеток растений, которые могут быть инъецированы, например, рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаичной болезни цветной капусты (CaMV) или вирусом мозаичной болезни табака (TMV)) или трансформированы рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Ti-плазмидой), содержащими нуклеотидную последовательность варианта ЕРО; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS, СНО, ВНК, НЕК293, VERO, HeLa, MDCK, Wi38, Swiss 3T3 и NIH 3T3), которые могут быть трансформированы рекомбинантными экспрессирующими конструкциями, содержащими, например, промоторы, произведенные, например, из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина), из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса, CMV IE и промотор 7,5К вируса коровьей оспы) или из бактериальных клеток (например, связывание tet-репрессора используют в системах tet-on и tet-off). В качестве клеток-хозяев применимы также первичные и вторичные клетки, полученные непосредственно из млекопитающего и трансфицированные плазмидным вектором или инфицированные вирусным вектором. В зависимости от клетки-хозяина и соответствующего вектора, используемого для введения полинуклеотида данного изобретения, этот полинуклеотид может интегрироваться, например, в хромосому или митохондриальную ДНК или может сохраняться внехромосомно, например, эписомно, или может только транзиторно содержаться в этих клетках.

Поскольку ЕРО трудно гликозилировать in vivo, желательно выбрать систему экспрессии, которая обеспечивает правильное гликозилирование этого белка. Таким образом, предпочтительно вводить полинуклеотиды, кодирующие сплайсинговые варианты ЕРО данного изобретения, в высшие эукариотические клетки, в частности, клетки млекопитающих, например, в клетки COS, СНО, ВНК, НЕК293, VERO, HeLa, MDCK, Wi38, Swiss 3T3 и NIH 3T3.

Следующим аспектом данного изобретения является трансгенное животное, не являющееся человеком, содержащее полинуклеотид, вектор и/или клетку-хозяина, описанные выше. Это животное может быть мозаичным животным, что означает, что только часть клеток, составляющих этот организм, содержат полинуклеотиды, векторы и/или клетки данного изобретения, или это животное может быть трансгенным животным, что означает, что все клетки этого животного содержат полинуклеотиды и/или векторы данного изобретения или произведены из клетки данного изобретения. Мозаичные или трансгенные животные могут быть либо гомо-, либо гетерозиготными в отношении полинуклеотидов данного изобретения, содержащихся в клетке. В предпочтительном варианте осуществления эти трансгенные животные являются либо гомо-, либо гетерозиготными имеющими удаленный ген или введенный ген (knock-out или knock-in гена) в отношении генов, которые кодируют белки данного изобретения. Эти животные могут быть в принципе любым животным, но предпочтительно этим животным является млекопитающее, выбранное из группы, состоящей из примата не человека, лошади, коровы, овцы, козы, свиньи, собаки, кошки, кролика, мыши, крысы, морской свинки, хомячка или песчанки.

Другим аспектом данного изобретения является способ получения полипептида варианта ЕРО, кодируемого полинуклеотидом данного изобретения, предусматривающий: культивирование описанной выше клетки-хозяина и извлечение полипептида, кодируемого указанным полинуклеотидом. Предпочтительные комбинации клеток-хозяев и векторов описаны в общих чертах выше и дополнительная комбинация будет вполне очевидна лицу с квалификацией в данной области. В зависимости от предполагаемого более позднего использования извлеченного пептида может быть выбран подходящий тип клеток. Как описано в общих чертах выше, предпочтительно выбирают эукариотические клетки, если желательно, чтобы белки, продуцируемые этими клетками, проявляли по существу природный характер гликозилирования, и выбирают прокариотические клетки, если, например, гликозилирование или другие модификации, которые обычно вводятся в белки только в эукариотических клетках, являются нежелательными или не требующимися.

В предыдущем уровне техники известно, что фармакокинетика белковых лекарственных средств может значительно изменяться модификацией белка. Для полноразмерного ЕРО было описано, что гликозилирование, в частности, присутствие остатков сиаловых кислот в конце боковых цепей олигосахаридов способствует пролонгированию времени циркуляции (WO 95/05465) и что удаление групп сиаловых кислот обнажает остатки галактозы, что увеличивает клиренс печенью. Таким образом, одним подходом, предпринятым для увеличения времени циркуляции ЕРО, было увеличение остатков сиаловых кислот. Таким образом, несколько подходов включают в себя обеспечение дополнительных сайтов гликозилирования (см., например, WO 91/05867, WO 94/0957 и WO 01/81405). Такие модифицированные аналоги ЕРО могут иметь по меньшей мере одну дополнительную N-связанную и/или О-связанную углеводную цепь. Другие попытки улучшения периода полу-жизни ЕРО в организме включают в себя добавление остатков полиэтиленгликоля (ПЭГ) варьирующей длины к аминокислотному скелету (см., например, WO 00/32772, WO 01/02017, WO 03/029291). Другая попытка использовала модификацию молекул ЕРО по меньшей мере одним N-связанным и/или О-связанным олигосахаридом, которые дополнительно модифицировали окислением, сульфатированием, фосфорилированием, ПЭГилированием или их комбинациями (см. WO 2005/025606). Все эти подходы могут быть равным образом использованы для продления периода полу-жизни вариантов ЕРО данного изобретения, и согласно предпочтительному варианту осуществления описанный выше способ дополнительно предусматривает стадию модификации варианта ЕРО, где эта модификация выбрана из группы, состоящей из окисления, сульфатирования, фосфорилирования, добавления олигосахаридов или их комбинаций. Если желательным является дополнительное добавление N-связанных или О-связанных олигонуклеотидов, их можно вводить введением дополнительных сайтов гликозилирования, как было описано в предыдущем уровне техники, например, в положениях 30, 51, 57, 69, 88, 89 и/или 138, если соответствующее положение присутствует в варианте данного изобретения (см. WO 01/81405).

Следующим аспектом данного изобретения является способ получения клеток, способных экспрессировать по меньшей мере один из вариантов ЕРО, содержащих генетически сконструированные клетки, in vitro с вектором по п. 3 или 4, где указанный полипептид (полипептиды) варианта ЕРО кодируется (кодируются) полинуклеотидом данного изобретения.

Другим аспектом данного изобретения является полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом данного изобретения или получаемую по вышеуказанному способу. Полипептиды данного изобретения включают в себя все полипептиды, описанные здесь, и фрагменты этих полипептидов, которые несут 1-10 N- и/или С-концевых делеций. Предпочтительно, эти делеции содержат менее чем 10, менее чем 9, менее чем 8, менее чем 7, менее чем 6, менее чем 5 аминокислот, менее чем 4, менее чем 3, менее чем 2 аминокислоты, менее чем 1 аминокислоту. Полипептиды, охватываемые данным изобретением, включают в себя также слитые белки, которые содержат либо сплайсинговый вариант ЕРО, показанный в SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и 22, либо гуманизированную версию 14, 16, 18, 20 и 22 или ее фрагмент, определенные выше, слитые с неродственной аминокислотной последовательностью. Эти неродственные последовательности могут содержать дополнительные функциональные домены или сигнальные пептиды. Сигнальные пептиды описаны более подробно и приведены в виде примеров ниже.

Этими полипептидами могут быть любые из полипептидов, описанных выше, но не более чем с 10 (например, не более чем с десятью, девятью, восемью, семью, шестью, пятью, четырьмя, тремя, двумя или одной) консервативными заменами. Консервативные замены известны в данной области и обычно включают в себя замену, например, одной полярной аминокислоты другой полярной аминокислотой и одной кислотной аминокислоты другой кислотной аминокислотой. Таким образом, консервативные замены предпочтительно включают в себя замены в пределах следующих групп аминокислот: глицин, аланин, валин, пролин, изолейцин и лейцин (неполярные, алифатическая боковая цепь); аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота (отрицательно заряженная боковая цепь); аспарагин, глутамин, метионин, цистеин, серин и треонин (полярная незаряженная боковая цепь); лизин, гистидин и аргинин; и фенилаланин, триптофан и тирозин (ароматическая боковая цепь); и лизин, аргинин и гистидин (положительно заряженная боковая цепь). В данной области хорошо известно, как определить действие конкретной замены, например, по pK_I и т.д. Все, что требуется от полипептида, имеющего одну или несколько консервативных замен, это то, чтобы он имел по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере: 55%; 60%; 65%; 70%, 75%, 80%, 85%, 90%; 95%; 98%; 99%; 99,5% или 100% или более) способности неизмененного варианта ЕРО защищать нейроны от повреждения/смерти клеток (например, посредством апоптоза или некроза), причем смерть клеток индуцируется путем лишения кислорода и/или глюкозы, токсического, химического, физического, механического воздействия, или под действием воспаления или радиации или вирусной или бактериальной инфекции.

Как полипептиды, так и пептиды могут быть получены стандартными методами рекомбинантных ДНК in vitro и переносом генов in vivo (трансгеноз) с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих подходящие полипептиды и пептиды. Для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих релевантные кодирующие последовательности и соответствующие регуляторные сигналы транскрипции/трансляции, могут быть использованы методы, хорошо известные специалистам в данном области. См., например, способы, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Ed.) [Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989] и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology [Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989].

Полипептиды и фрагменты данного изобретения включают в себя также полипептиды и фрагменты, описанные выше, но модифицированные для применения in vivo добавлением, на амино- и/или карбоксил-концевых сторонах блокирующих агентов для облегчения выживания релевантного полипептида in vivo. Это может быть полезным в ситуациях, в которых концы пептида имеют тенденцию к деградации протеазами перед клеточным поглощением. Такие блокирующие агенты могут включать в себя, без ограничения, дополнительные родственные или неродственные пептидные последовательности, которые могут быть присоединены к амино- и/или карбоксил-концевым остаткам вводимого пептида. Это может выполняться либо химическим путем во время синтеза этого пептида, либо технологией рекомбинантных ДНК посредством способов, известных специалистам с обычной с квалификацией в данной области.

Альтернативно, блокирующие агенты, такие как пироглутаминовая кислота или другие молекулы, известные в данной области, могут быть присоединены к амино- и/или карбоксил-концевым остаткам, или аминогруппа на амино-конце или карбоксильная группа на карбоксильном конце может быть заменена отличающейся группой. Подобным образом, эти пептиды могут быть ковалентно или нековалентно связаны с фармацевтически приемлемыми белками-«носителями» перед введением.

Термин «выделенный» полипептид или пептидный фрагмент относится в данном контексте к полипептиду или пептидному фрагменту, который либо не имеет природно-встречающейся копии, либо был отделен или очищен от компонентов, которые в природе сопутствуют ему, например, в тканях, таких как язык, поджелудочная железа, печень, селезенка, яичник, яичко, мышца, ткань сустава, невральная ткань, желудочно-кишечная ткань или опухолевая ткань, или жидкости тела, такие как кровь, сыворотка или моча. Обычно, полипептид или пептидный фрагмент считается «выделенным», когда он по меньшей мере на 70%, в расчете на сухую массу, свободен от белков и других природно-встречающихся органических молекул, с которыми он природно ассоциирован. Предпочтительно, препарат полипептида (или его пептидного фрагмента) данного изобретения составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, в расчете на сухую массу, полипептида (или его пептидного фрагмента), соответственно, данного изобретения. Таким образом, например, препарат полипептида х составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, в расчете на сухую массу, полипептида х. Поскольку полипептид, который синтезирован химически, по его природе, отделен от компонентов, которые ему сопутствуют в природе, синтетический полипептид является «выделенным».

Выделенный полипептид (или пептидный фрагмент) согласно изобретению может быть получен, например, путем экстракции из природного источника (например, из тканей или жидкостей тела); экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид или химического синтеза. Полипептид, который продуцируется в клеточной системе, отличающейся от источника, из которого он происходит в природе, является «выделенным», так как он будет обязательно свободен от компонентов, которые сопутствуют ему в природе. Степень выделения или чистоты может быть измерена любым подходящим способом, например, колоночной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле или ВЭЖХ-анализом.

Дополнительным аспектом данного изобретения является антитело, которое специфически связывается с полипептидом варианта ЕРО, кодируемым полинуклеотидами данного изобретения или получаемым вышеуказанным способом. Термин «антитело» включает в себя моноклональные и поликлональные антитела и их связывающие фрагменты, в частности, Fc-фрагменты, а также так называемые «одноцепочечные антитела» (Bird R.E. et al. (1988) Science 242:423-6), химерные, гуманизированные, в частности, CDR-привитые антитела, и диа- или тетратела (Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-8). В изобретение включены также иммуноглобулин-подобные белки, которые отбирают с использованием способов, включающих в себя, например, фаговый дисплей, для специфического связывания с полипептидами данного изобретения. В этом контексте, термин «специфическое связывание» относится к антителам, индуцированным против пептидов, полученных из границ сплайсинга или границ, создаваемых другими процессами, например, ENIT | VGQQ для hS3, VGQQ | ALLV для h1-4, VNFY | ALLV для h1-5, KRME | PWEP для hS4, ITVP | GPVG для h1-1, LNEN | NHC для h2-1, KRME | KELM для mS, LLAN | FLRG для mG3, DTFC | RRGD для mG5, KVNF | LRGK для m301 или LSEA | VHGR для mK3. Такие пептиды могут содержать дополнительно или содержать меньше N- или С-концевых аминокислот. Антитело считается специфическим в отношении варианта ЕРО, если его аффинность в отношении этого варианта является по меньшей мере в 50 раз более высокой, предпочтительно в 100 раз более высокой, более предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз более высокой, чем в отношении полноразмерного ЕРО человека или мыши. Предпочтительно, специфические антитела данного изобретения не связываются или по существу не связываются с полноразмерным ЕРО человека или мыши. В данной области хорошо известно, как получать антитела и отбирать антитела с конкретной специфичностью.

Следующий аспект данного изобретения касается применения полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или полипептида данного изобретения для приготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения состояния, ассоциированного с повреждением ткани вследствие смерти клеток (например, апоптоза или некроза). Апоптоз или некроз ведут к деструкции клеток, которая может быть предотвращена или уменьшена с использованием полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или полипептида данного изобретения. Смерть клеток может быть индуцирована многими различными внутренними и наружными стимулами, которые включают в себя предпочтительно ишемию, гипоксию, бактериальную или вирусную инфекции, излучение, или индуцирована метаболическими, токсическими, химическими, аутоиммунологическими или травматическими стимулами. В данной области хорошо известно, как детектировать смерть клеток, например, с использованием морфологических критериев, анализа Tunel (опосредованного трансферазой мечения концов фрагментированной ДНК), МТТ-анализа, анализа жизнь/смерть с использованием окрашивания (например, окрашивания бромидом этидия и окрашивания акридиновым оранжевым красителем), анализа каспаз, электронной микроскопии, ДНК-лэддеринга (на основе регулярного (в виде лестницы) расположения размеров олигонуклеотидов в гелях при электрофорезе в случае апоптотических клеток), или анализа высвобождения LDH, описанного ниже. Например, апоптоз характеризуется фрагментацией хроматина, экстравазацией клеточного содержимого и в конечном счете смертью клетки. Считается, что он играет роль во многих острых или хронических патологических процессах. Таким образом, предпочтительное применение данного изобретения предусматривает введение полинуклеотидов, векторов, клеток-хозяев или полипептидов данного изобретения для предупреждения, лечения или ослабления острых и хронических нейродегенеративных или нейровоспалительных нарушений, острого или хронического нарушений сердца (например, инфаркта миокарда), легкого (например, астмы, хронической обструктивной болезни легких), почки (например, гломерулонефрита), печени (например, хронической печеночной недостаточности) или поджелудочной железы (например, панкреатита), а также состояний, связанных с трансплантацией клеток (например, стволовых клеток) или органа (например, почки или печени). В этом отношении предполагается также, что варианты ЕРО данного изобретения могут быть включены в растворы для хранения, используемые для хранения органов или конечностей для транспортировки и/или после травматического повреждения.

Острые нейродегенеративные нарушения включают в себя, но не ограничиваются ими, различные типы острых нейродегенеративных нарушений, связанных со смертью нейронных клеток, в том числе цереброваскулярную недостаточность, очаговую или диффузную травмы головного мозга, диффузное повреждение головного мозга и повреждение спинного мозга. Примерами острых нейродегенеративных нарушений являются: церебральная ишемия или инфаркт, включающие в себя эмболическую окклюзию и тромботическую окклюзию, реперфузию после острой ишемии, перинатальное гипоксическое-ишемическое повреждение, остановку сердца, а также внутричерепное кровоизлияние любого типа (такое как эпидуральное, субдуральное, субарахноидальное и интрацеребральное кровоизлияния), и внутричерепные и внутрипозвоночные повреждения (такие как контузия, пенетрация, порез, сдавление и разрыв), «whiplash shaken» - синдром младенцев, инфекционный энцефалит (например, герпетический энцефалит), менингит (например, бактериальный), головная боль (например, мигрень).

Хронические нейродегенеративные нарушения, которые могут лечиться вариантами ЕРО данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, деменции (например, болезнь Альцгеймера, сосудистые деменции), болезнь Пика, болезнь диффузных телец Леви, прогрессирующий супрануклеарный паралич (синдрома Стила-Ричардсона), рассеянный склероз, множественную системную атрофию (в том числе синдром Шай-Драгера), хронические эпилептические состояния, ассоциированные с нейродегенерацией, заболевания двигательных нейронов, дегенеративные атаксии, кортикальную базофильную дегенерацию, комплекс Гуама амиотрофического бокового склероза (ALS)-деменции Паркинсона, подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Хангтингтона, болезнь Паркинсона, синуклеинопатии, первичную прогрессирующую афазию, стриатонигральную дегенерацию, заболевание Махадо-Джозефа/спинально-церебеллярную атаксию типа 3 и оливомостомозжечковые дегенерации, болезнь Жилля де ла Туретта, бульбарный и псевдобульбарный паралич, спинномозговую и спинально-бульбарную мышечные атрофии (болезнь Кеннеди), первичный боковой склероз, семейную спастическую параплегию, болезнь Верднига-Гоффмана, болезнь Кугельберга-Веландера, болезнь Тея-Сакса, болезнь Зандхоффа, семейную спастическую болезнь, спастический парапарез, прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию, семейную вегетативную дисфункцию (синдром Райля-Дея), вызываемые прионами заболевания (в том числе, но не только, болезнь Гройтцфелдта-Якоба, болезнь Герстманна-Штрусслера-Шайнкера, куру и фатальную семейную бессонницу), полиневропатии (например, диабетическую, алкогольную-токсическую полиневропатию, синдром Гийена-Барре, хроническую воспалительную димиелинизирующую полиневропатию), вызываемые прионами заболевания, привыкание, аффективные нарушения (например, депрессию), шизофренические нарушения, синдром хронической усталости, хроническую боль (например, боль нижней части спины).

Следующий аспект данного изобретения относится к применению полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или полипептида данного изобретения для приготовления лекарственного средства против старения. Основой для этого применения вариантов ЕРО данного изобретения является тот факт, что прогрессирующая деградация большинства функций тела, которая сопровождает старение, ассоциировалась со смертью клеток, и, следовательно, предполагается, что варианты ЕРО данного изобретения, которые только обеспечивают полезное клеткозащитное действие, могут приниматься непрерывно, без вызывания побочных действий, обычно связанных с непрерывным введением ЕРО, что может быть, однако, приписано эритропоэтическому эффекту ЕРО.

Авторы данного изобретения неожиданным образом обнаружили, что нуклеиновые кислоты и белки согласно данному изобретению обладают удивительными противовоспалительными свойствами (см. фигуры и эксперименты). Таким образом, варианты ЕРО применимы в лечении воспалительных и дегенеративных заболеваний. Воспалительными заболеваниями являются заболевания, такие как (но не только) рассеянный склероз, вирусные и бактериальные инфекции или сепсис. Дегенеративными заболеваниями являются заболевания, такие как (но не только) инсульт, инфаркты миокарда.

Данное изобретение относится также ко всем типам форм экспрессии in vivo нуклеиновых кислот согласно данному изобретению. Оно относится также к трансформированным клеткам, в частности, стволовым клеткам, которые используют в качестве терапевтических агентов. Такие клетки могут быть стабильно трансформированы нуклеиновой кислотой по данному изобретению. Эта нуклеиновая кислота может находиться в кассете, где она функционально связана с промотором. Этот промотор может быть способен запускать экспрессию только в конкретных тканях, таких как, но не только, нейронная ткань или головной мозг или ткань, которая обнаруживает воспаление или дегенерацию. Соответствующее описание может быть найдено в WO 97/14307.

Активность (в единицах) полипептида ЕРО традиционно определяют на основе его эффективности в стимуляции продуцирования эритроцитов в моделях грызунов (и в соответствии с международными стандартами ЕРО). Одна единица (Е) обычного ЕРО (молекулярная масса (MW) приблизительно 34000) равна приблизительно 10 нг белка (1 мг белка соответствует приблизительно 100000 Е). Однако, как упоминалось, данное изобретение включает в себя применение негемопоэтических форм эритропоэтина, и, как таковое, это определение, основанное на гемопоэтической активности, является неподходящим. Таким образом, в данном контексте, единица активности варианта ЕРО определяется как количество белка, необходимое для индукции той же самой активности в невральных или других чувствительных к эритропоэтину клеточных системах, какая индуцируется нативным ЕРО в той же самой системе. Квалифицированный в данной области специалист легко определит единицы негемопоэтического ЕРО после этого указания.

В следующем аспекте данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую полинуклеотид, вектор, клетку-хозяина, полипептид и/или антитело данного изобретения и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

В практике одного аспекта данного изобретения фармацевтическая композиция, описанная выше, может быть введена млекопитающему любым способом, который обеспечивает достаточный уровень варианта эритропоэтина. Он может вводиться системно или локально. Такое введение может быть парентеральным, трансмукозным, например, пероральным, назальным, ректальным, интравагинальным, сублингвальным, субмукозным или трансдермальным способами. Предпочтительно, введение является парентеральным, например, посредством внутривенной или внутрибрюшинной инъекции, и также включающим в себя, но не ограничивающимся ими, внутриартериальным, внутримышечным, интрадермальным и подкожным введениями. Если фармацевтическую композицию данного изобретения вводят локально, она может быть инъецирована непосредственно в орган или ткань, которые подлежат лечению. В случае лечения нервной системы этот способ введения включает в себя, но не ограничивается ими, интрацеребральный, интравентрикулярный, интрацеребровентрикулярный, интратекальный, интрацистернальный, интраспинальный и/или периспинальный способы введения, которые могут использовать интракраниальные и интравертебральные иглы и катетеры с насосными устройствами или без насосных устройств.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит полипептид варианта ЕРО в дозированной унифицированной дозированной форме, приспособленной для защиты или усиления ЕРО-чувствительных клеток, тканей или органов, которая содержит на дозированную единицу эффективное нетоксичное количество в диапазоне приблизительно 0,5 мг - 5 мг вариантов ЕРО; 0,6-5 мг вариантов ЕРО; 0,7 мг - 5 мг вариантов ЕРО; 0,8 мг - 5 мг вариантов ЕРО; 0,9 мг - 5 мг вариантов ЕРО; 1-5 мг вариантов ЕРО; 1,5-5 мг вариантов ЕРО; 2-5 мг вариантов ЕРО; 2,5-5 мг вариантов ЕРО; 3,5-5 мг вариантов ЕРО; 4 мг - 5 мг вариантов ЕРО или 4,5-5 мг вариантов ЕРО и фармацевтически приемлемый носитель.

В предпочтительном варианте осуществления, полипептид варианта ЕРО может быть введен системно в дозе 100 нанограммов - приблизительно 50 микрограммов на кг массы тела, предпочтительно приблизительно 20 микрограммов - приблизительно 50 микрограммов на кг массы тела. Такие сывороточные уровни могут быть достигнуты при приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 часах после введения. Такие дозы могут вводиться повторно при необходимости. Например, введение может повторяться ежедневно или каждый второй, третий, четвертый, пятый, шестой или седьмой дни, пока это клинически необходимо, или после подходящего интервала, например, каждые 1-12 недель, предпочтительно каждые 3-8 недель. В одном варианте осуществления, эффективное количество варианта ЕРО и его фармацевтически приемлемого носителя может быть упаковано в однодозовом флаконе или другом контейнере. В зависимости от соответственно подвергаемого лечению заболевания или состояния вариант ЕРО может вводиться однократно, в течение заданного периода времени или непрерывно. При лечении острого состояния или заболевания может быть достаточно однократного введения пациенту варианта ЕРО или введения в течение периода, например, 2 дней - 12 месяцев, предпочтительно 1 недели - 6 месяцев, более предпочтительно 2 недель - 3 месяцев. При лечении хронического заболевания или состояния или применения варианта ЕРО для предупреждения или уменьшения деградации, связанной со старением, вариант ЕРО может вводиться непрерывно. Если вариант ЕРО данного изобретения вводят в течение конкретного периода времени или непрерывно, его вводят предпочтительно с интервалами, и предпочтительные интервалы указаны выше. Эти необходимые интервалы будут зависеть отчасти от сывороточного уровня варианта ЕРО, необходимого для лечения или уменьшения симптомов соответствующего заболевания и от фармакокинетики соответствующего варианта ЕРО, которая отчасти будет зависеть от модификаций ЕРО, например, с использованием ПЭГ. Практикующий врач будет по своему усмотрению определять точные продолжительность, дозу и тип варианта ЕРО с учетом, например, состояния проходящего лечение пациента, тяжести этого состояния и т.д.

Для других способов введения, таких как применение перфузата, инъекции в орган или другого локального введения, будет обеспечена фармацевтическая композиция, которая приводит к уровням варианта ЕРО, сходным с описанными выше уровнями. Желательным является уровень приблизительно 10 пг/мл - приблизительно 1000 нг/мл.

Фармацевтическая композиция данного изобретения может содержать терапевтически эффективное количество соединения, например, полинуклеотида, полипептида, клетки или вектора, и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте осуществления, термин «фармацевтически приемлемое» означает одобренное регулирующим ведомством Федерального правительства или правительства штата или находящееся в Перечне Фармакопеи Соединенных Штатов или другой общепризнанной фармкопеи для применения на животных и, более конкретно, на человеке. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, с которым вводят этот терапевтический агент. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как солевые растворы в воде и маслах, в том числе произведенных из нефти, животного, растений или синтетического происхождения, таких как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Солевой раствор является предпочтительным носителем при внутривенном введении этой фармацевтической композиции. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина могут быть также использованы в качестве жидких носителей, особенно для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое сепарированное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Эта композиция, если желательно, может также содержать минорные количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или рН-забуферивающих агентов. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, форм пролонгированного высвобождения и т.п. Эта композиция может быть приготовлена в виде суппозитория, с общепринятыми связывающими агентами и носителями, такими как триглицериды. Соединения данного изобретения могут быть приготовлены в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли, образованные со свободными аминогруппами, например, соли, образованные из хлористоводородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.п., и соли, образованные со свободными карбоксильными группами, например, соли, образованные из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов трехвалентного железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences» E. W. Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество соединения, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя, достаточным для обеспечения формы для правильного введения пациенту. Эта готовая форма должна соответствовать способу введения.

Фармацевтические композиции, приспособленные для перорального введения, могут быть обеспечены в виде капсул или таблеток; в виде порошков или гранул; в виде растворов, сиропов или суспензий (в водных или неводных жидкостях); в виде годных в пищу пен и взбитых масс; или в виде эмульсий. Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут содержать лактозу, крахмал или их производные, стеарат магния, натрий-сахарин, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислоту или ее соли. Мягкие желатиновые капсулы могут содержать растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д. Растворы и сиропы могут содержать воду, полиолы и сахара.

Активный агент, предназначенный для перорального введения, может быть покрыт или смешан с материалом, который задерживает дезинтеграцию и/или абсорбцию активного агента в желудочно-кишечном тракте (например, может быть использован глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат). Так, пролонгированное высвобождение активного агента может быть достигнуто на протяжении многих часов и, если необходимо, активный агент может быть защищен от разложения в желудке. Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть приготовлены для облегчения высвобождения активного агента в конкретном местоположении в желудочно-кишечном тракте вследствие специфического рН или ферментативных условий.

Фармацевтические композиции, приспособленные для трансдермального введения, могут быть обеспечены в виде отдельных пластырей, предназначенных для того, чтобы оставаться в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение пролонгированного периода времени. Фармацевтические композиции, приспособленные для местного введения, могут быть обеспечены в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. Для местного введения на кожу, рот, глаз или другие наружные ткани предпочтительно использовать мазь или крем для локального введения. При приготовлении в виде мази активный ингредиент может быть использован либо в парафиновой, либо в смешивающейся с водой основе. Альтернативно, активный ингредиент может быть приготовлен в виде крема с основой в виде эмульсии типа масло-в-воде, либо с основой в виде эмульсии типа вода-в-масле. Фармацевтические композиции, приспособленные для локального введения в глаз, включают в себя глазные капли. В этих композициях, активный ингредиент может быть растворен или суспендирован в подходящем носителе, например, в водном растворителе. Фармацевтические композиции, приспособленные для локального введения в рот, включают в себя лепешки, пастилки и жидкости для полоскания рта.

Фармацевтические композиции, приспособленные для назального введения, могут содержать твердые носители, такие как порошки (предпочтительно имеющие размер частиц в диапазоне 20-500 микрон). Порошки могут вводиться вдыханием через нос, т.е. быстрой ингаляцией порошка через нос из контейнера, удерживаемого близко к носу. Альтернативно, композиции, приспособленные для назального введения, могут содержать жидкие носители, например, назальные спреи или капли для носа. Эти композиции могут содержать водные или масляные растворы активного ингредиента. Композиции для введения ингаляцией могут поставляться в специально приспособленных устройствах, в том числе, но не только, находящихся под давлением аэрозолях, распылителях или инсуффляторах, которые сконструированы таким образом, чтобы обеспечивать заранее определенные дозы активного ингредиента. В предпочтительном варианте осуществления, фармацевтические композиции данного изобретения вводят через полость носа в легкие.

Фармацевтические композиции, приспособленные для ректального введения, могут быть обеспечены в виде суппозиториев и клизм. Фармацевтические композиции, приспособленные для вагинального введения, могут быть обеспечены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев.

Фармацевтические композиции, приспособленные для парентерального введения, включают в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы или суспензии, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают эти композиции по существу изотоничными с кровью предполагаемого реципиента. Другие компоненты, которые могут присутствовать в таких композициях, включают в себя, например, воду, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Фармацевтические композиции, приспособленные для парентерального введения, могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, например, запаянных ампулах и герметично закрытых флаконах, и могут храниться в высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, требуя только добавления стерильного жидкого носителя, например, стерильного солевого раствора для инъекций, непосредственно перед использованием. Разнообразные инъекционные растворы и суспензии могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток. В одном варианте осуществления, может быть обеспечен автоинъектор, содержащий инъекционный раствор варианта ЕРО для неотложного применения автомобилями скорой медицинской помощи, кабинетами неотложной помощи и в ситуациях поля боя, и даже для самовведения в домашней обстановке, в частности, когда может возникнуть возможность травматической ампутации, например, вследствие неосторожного использования газонокосилки. Вероятность того, что клетки и ткани в отрезанной стопе или пальце стопы выживут после повторного присоединения, может быть увеличена введением варианта ЕРО во множественные места в отрезанной части, как можно скорее, даже до прибытия медицинского персонала на место или прибытия пострадавшего индивидуума с отрезанным пальцем в кабинет неотложной помощи.

В предпочтительном варианте осуществления, эту композицию готовят в соответствии с рутинными процедурами в виде фармацевтической композиции, приспособленной для внутривенного введения людям. Обычно, композиции для внутривенного введения являются растворами в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости эта композиция может также включать в себя солюбилизирующий агент и местный анестезирующий агент, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Обычно, ингредиенты поставляют либо по отдельности, либо в виде смеси в унифицированной дозированной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметично заделанном контейнере, таком как ампула или мешочек, с указанием количества активного агента. Если композиция должна вводиться инфузией, она может быть помещена в инфузионную склянку, содержащую стерильную воду или стерильный солевой раствор фармацевтической категории. Если композицию вводят инъекцией, может быть обеспечена ампула стерильного солевого раствора, так что ингредиенты могут быть смешаны перед введением.

Суппозитории обычно содержат активный ингредиент в диапазоне 0,5 мас.% - 10 мас.%; пероральные готовые формы предпочтительно содержат 10-95% активный ингредиент.

Может быть обеспечена композиция перфузата для применения в банях для трансплантируемых органов, для перфузии in situ или для введения в сосудистую сеть донора органа перед взятием органа.

Такие фармацевтические композиции могут содержать уровни варианта ЕРО или формы варианта ЕРО, не подходящие для острого или продолжительного, локального или системного введения индивидууму, но будут служить функциям, предполагаемым здесь, в ванне для трупа, бане для органа, перфузате для органа или перфузате in situ перед удалением или уменьшением уровней варианта ЕРО, содержащегося в них, перед обнажением или возвращением обработанного органа или ткани к нормальному кровотоку.

Данное изобретение обеспечивает также фармацевтическую упаковку или набор, содержащий один или несколько контейнеров, наполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций данного изобретения. Такой контейнер может необязательно иметь уведомление в форме, предписываемой правительственным ведомством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, причем это уведомление отражает санкционирование этим ведомством производства, применения или продажи для введения человеку.

В другом варианте осуществления, вариант ЕРО, может, например, доставляться в системе регулируемого высвобождения. Например, этот полипептид может вводиться с использованием внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. В одном варианте осуществления, может быть использован насос (см. Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al. (1989) N. Eng. J. Med. 321: 574). В другом варианте осуществления, это соединение может доставляться в носителе, в частности, в липосоме (см. Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., 353-365; WO 91/04014; US 4704355). В другом варианте осуществления, могут быть использованы полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release (1974) Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen and Ball (eds.), Wiley: N.Y.; Ranger and Peppas (1953) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; см. также Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105).

Еще в одном варианте осуществления, система регулируемого высвобождения может быть помещена вблизи терапевтической мишени, т.е. клеток-мишеней, ткани-мишени или органа-мишени, причем требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson (1984) 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol.2). Другие системы регулируемого высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (1990, Science 249: 1527-1533).

В другом варианте осуществления, вариант ЕРО, при приготовлении должным образом, может вводиться назальным, пероральным, ректальным, вагинальным или сублингвальным введениями.

В конкретном варианте осуществления, может быть желательным введение фармацевтических композиций данного изобретения локально в зону, нуждающуюся в лечении; это может быть достигнуто, например, без ограничения, локальной инфузией во время хирургии, местным нанесением, например, вместе с раневой повязкой после хирургии, инъекцией, посредством катетера, посредством суппозитория или посредством имлантата, причем указанный имплантат является пористым, непористым или гелеобразным материалом, включающим в себя мембраны, например, мембраны из силастика, или волокна.

Выбор предпочтительной эффективной дозы будет определяться квалифицированным в данной области специалистом на основе учета нескольких факторов, которые будут известны специалисту с обычной квалификацией в данной области. Такие факторы включают в себя конкретную форму фармацевтической композиции, например, полипептида или вектора, и ее фармацевтические параметры, такие как биодоступность, метаболизм, периода полу-жизни в организме и т.д., которые будут установлены во время обычных процедур разработки, обычно используемых в получении санкционирования регулирующими органами в отношении фармацевтического соединения. Дополнительные факторы в рассмотрении дозы включают в себя состояние или заболевание, подлежащее лечению, или пользу, которая должна быть достигнута в здоровом индивидууме, массу тела пациента, способ введения, является ли введение острым или продолжительным, сопутствующие лекарственные средства и другие факторы, о которых известно, что они влияют на эффективность вводимых фармацевтических агентов. Таким образом, точная доза должна быть определена в соответствии с оценкой лечащего врача и обстоятельствами каждого пациента, например, в зависимости от состояния и иммунного статуса отдельного пациента, в соответствии со стандартными клиническими способами.

В другом аспекте данного изобретения, обеспечен перфузат или перфузионный раствор для перфузии и хранения органов для трансплантата, причем этот перфузионный раствор включает в себя некоторое количество фармацевтических композиций, эффективное для защиты чувствительных к варианту ЕРО клеток и ассоциированных клеток, тканей или органов.

Трансплантация включает в себя, но не ограничивается ею, ксенотрансплантацию, где орган (в том числе клетки, ткань или другая часть тела) берут из одного донора и трансплантируют в другого субъекта, реципиента; и аутотрансплантацию, где орган берут из одной части тела и заменяют в другой, в том числе лабораторной хирургической процедуре, в которой орган может быть удален и, пока он находится ex vivo, резецирован, восстановлен или подвергнут другим манипуляциям, таким как удаление опухоли, и затем возвращен в исходное местоположение. В одном варианте осуществления, перфузионным раствором является раствор Висконсинского Университета (UW) (US 4798824), который содержит приблизительно 1 - приблизительно 25 Е/мл эритропоэтина, 5% гидроксиэтилкрахмал (имеющий молекулярную массу приблизительно 200000 - приблизительно 300000 и по существу не содержащий этиленгликоля, этиленхлоргидрина, хлорида натрия и ацетона); 25 мМ КН₂РО₄ , 3 мМ глутатион; 5 мМ аденозин; 10 мМ глюкозу; 10 мМ HEPES-буфер; 5 мМ глюконат магния; 1,5 М CaCl₂; 105 мМ глюконат натрия; 200000 единиц пенициллина; 40 единиц инсулина; 16 мг дексаметазона; 12 мг Фенолового красного красителя; и имеет рН 7,4-7,5 и осмоляльность приблизительно 320 мОсм/л. Этот раствор используют для поддержания почек и поджелудочных желез трупа перед трансплантацией. С использованием этого раствора консервирование может быть пролонгировано за пределы 30 часов, рекомендуемых для консервирования почки трупа. Этот конкретный перфузат является только иллюстрацией ряда подобных растворов, которые могут быть приспособлены для этого применения включением эффективного количества этой фармацевтической композиции. В следующем варианте осуществления, раствор перфузата содержит эквивалент приблизительно 5 - приблизительно 35 Е/мл эритропоэтина или приблизительно 10 - приблизительно 30 Е/мл эритропоэтина.

Хотя предпочтительным реципиентом варианта ЕРО для всех описанных здесь целей является человек, описанные здесь способы относятся равным образом к другим млекопитающим, в частности, домашним животным, домашнему скоту, животным-компаньонам и животным зоопарков. Однако данное изобретение не ограничивается ими и может быть применено к любому млекопитающему.

Если известно, что субъект имеет риск развития инсульта, возможно профилактическое введение фармацевтической композиции данного изобретения. В этих случаях фармацевтическую композицию, в частности, полипептид варианта ЕРО, предпочтительно вводят в вышеуказанных предпочтительных и особенно предпочтительных дозах в расчете на день. Предпочтительно, вводят 100 нанограммов - приблизительно 50 микрограммов на кг массы тела, предпочтительно приблизительно 20 микрограммов - приблизительно 50 микрограммов на кг массы тела. Это введение может продолжаться, пока не уменьшится риск развития инсульта. Однако в большинстве случаев фармацевтическая композиция будет вводиться, как только был диагностирован инсульт. В этих случаях предпочтительно ввести первую дозу этой фармацевтической композиции в первый раз в пределах 24 часов после наблюдения первых симптомов инсульта, предпочтительно в пределах 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 часов, 1 часа или менее. Предпочтительно это введение затем продолжают в течение предпочтительно по меньшей мере 7, более предпочтительно по меньшей мере 14 дней и более предпочтительно в течение по меньшей мере 21 дня. Дозы вводят предпочтительно один раз в день и предпочтительно используют вышеуказанные дозы.

Краткое описание фигур и графического материала

Фиг.1: Сравнение ПЦР-продуктов ЕРО: Панель А изображает ДНК-продукты различных реакций ПЦР, выполняемых либо с чистой плазмидой, содержащей различные варианты мышиного ЕРО или кДНК из головного мозга или почки мыши, которые разделены на 1,2% агарозном геле. Дорожки слева направо содержат: маркер молекулярной массы 1 т.п.н., продукт чистого mK3, чистого mG3, чистого m301, чистого mS, чистого mWT, кДНК головного мозга, кДНК почки. Панель В изображает ДНК-продукт ПЦР, выполняемой с кДНК из головного мозга человека. Слева направо дорожки содержат стандарт молекулярной массы 1 т.п.н. и продукт ПЦР кДНК головного мозга человека.

Фиг.2: Сопоставление нуклеотидных последовательностей вариантов ЕРО, идентифицированных в кДНК мышиного головного мозга и мышиного ЕРО «дикого типа», т.е. последовательности ранее описанного ЕРО.

Фиг.3: Сопоставление нуклеотидных последовательностей вариантов ЕРО, идентифицированных в кДНК головного мозга человека и ЕРО «дикого типа» человека.

Фиг.4: Сопоставление аминокислотных последовательностей вариантов ЕРО, идентифицированных в мыши и человеке с соответствующим ЕРО «дикого типа».

Фиг.5: Гемопоэтическая активность ЕРО и вариантов ЕРО мыши и человека данного изобретения. Панель А изображает результаты анализа образования колоний для ЕРО и вариантов ЕРО мыши, а панель В изображает анализ образования колоний ЕРО и вариантов ЕРО человека.

Фиг.6: Экспериментальная схема для анализов нейрозащиты с rhEPO и изомерами ЕРО.

Фиг.7: Панель А показывает эксперимент с лишением кислорода-глюкозы (OGD) с продолжительностью 1 ч 40 мин и 1 ч 50 мин. В обеих временных точках наблюдали степень защиты 40-50% для нейрозащитных агентов, но не наблюдали защиты с mEPO и rhЕРО. Панель В показывает эксперимент с двумя различными временными точками (продолжительность OGD между двумя экспериментами варьируется в соответствии с плотностью нейронов). При 2 ч 45 мин достигается только слабая защита с wtЕРО (20-30%) в сравнении с нейрозащитными агентами (60-70%). Полная функциональная активность защиты rhЕРО наблюдается только при более высоких уровнях повреждения (3 ч 15 мин).

Фиг.8: Панель А показывает эксперимент с длиной OGD 2 ч 00 мин, 2 ч 15 мин и 2 ч 20 мин с концентрацией белка, равной 100 Е/л hЕРО. При всех трех временных точках степень защиты 40-50% наблюдали для ЕРО человека, но не было защиты с mЕРО и rhЕРО. Панель В показывает эксперимент с двумя различными временными точками (продолжительнрость OGD между двумя экспериментами варьируется в соответствии с плотностью нейронов). При 2 ч 45 мин достигается только слабая защита с wtЕРО (20-30%) в сравнении с нейрозащитными агентами (60-70%). Полная функциональная активность защиты ЕРО наблюдается только при более высоких уровнях повреждения (3 ч 15 мин).

Фиг.9: Панель А показывает Вестерн-блот из среды клеток НЕК 293, трансфицированных pcDNA3.1-V5/His-hEPO, pcDNA3.1-V5/His-hS3 или pcDNA3.1-V5/His-hS4, соответственно. Эти среды использовали для экспериментов, показанных на фиг.8. Концентрация hEPO, количественно определенная при помощи ELISA для ЕРО мыши (R&D), была 2 Е/мл. rhЕРО (на гель наносили 2,5 нг), hEPO (на гель наносили 0,4 нг), hS3 и hS4: в каждом случае 20 мкл среды (собранной спустя 2 дня после трансфекции). Маркер = 5 мкл BenchMark His-меченый белковый стандарт (Invitrogen). Панель В показывает Вестерн-блот меченного His-меткой ЕРО мыши дикого типа (mЕРО), вариантов ЕРО человека hS3 и hS4. mЕРО определяли количественно при помощи ELISA для ЕРО мыши. 130 пг mЕРО наносили на гель (первичное антитело: кроличье анти rhЕРО-антитело; Santa-Cruz).

Фиг.10: Сопоставление аминокислотных последовательностей вариантов ЕРО, созданных рекомбинантным способом (мутантов альфа-спирали) и идентифицированных in vivo. Здесь SEQ ID NO:50 является последовательностью альфа-спирали дикого типа человека; SEQ ID NO:51 является hAmA (точковая мутация аланин); SEQ ID NO:52 является hAmE (точковая мутация глутаминовая кислота); SEQ ID NO:53 является hA-10 (делеционный мутант) и SEQ ID NO:54 является hA-20 (делеционный мутант).

Фиг.11: hEPO и hS3 опосредовали цитозащиту в модели ишемии, состоящей из лишения сыворотки и гипоксии в сердечных миобластах Н9с2. Клетки Н9с2 инкубировали в бессывороточной среде DMEM в нормоксических или гипоксических условиях в течение 24 часов. Апоптоз оценивали спустя 24 часа при помощи анализа LDH. Данные нормализовали принятием дельта-высвобождения LDH необработанных клеток в нормоксических и гипоксических условиях за 100%. А: Диаграмма в виде столбцов, представляющая средние величины нормализованного высвобождения LDH. В: Данные представлены диаграммой-графиком в виде блоков, показывающих медиану (линию поперек блока), 25-й процентиль (нижний стержень), 75-й процентиль (верхний стержень), максимальную величину и минимальную величину. Число экспериментов n=7. Р*<0,001 (ANOVA).

Фиг.12: Иммунопреципитация вариантов ЕРО с использованием анти-mЕРО-антитела из R&D (козьего, меченного биотином); А: Детектирование второй изоформы ЕРО (30 кДа) в экстракте белка почек обработанных CoCl₂ мышей (129S6). В: Блокирование взаимодействия антитело-антиген Дарбпоэтином А.

Фиг.13: Нейрозащита, опосредованная альфа-спиралью эритропоэтина (hA; n=4). hA 100 Е/л: 30 пМ; hA 50 Е/л: 15 пМ; hEPO: 30 пМ=100 Е/л; Р*<0,05; ANOVA1 против контроля.

Фиг.14: Нейрозащита, опосредованная несколькими изоформами ЕРО человека (n=6). Р*<0,05; ANOVA1 против контроля.

Фиг.15: Нейрозащита, опосредованная делеционными вариантами альфа-спирали эритропоэтина (n=6) Р*<0,05; ANOVA1 против контроля. А: диаграмма в виде столбцов, показывающая средние величины нормализованного высвобождения LDH. В: Блок-диаграмма, показывающая величины медиан и процентилей (25%, 75%) нормализованного высвобождения LDH.

Фиг.16. Действия вариантов ЕРО человека и полноразмерного ЕРО человека на LPS-индуцированное продуцирование цитокинов макрофагами человека. Очищенные моноциты человека дифференцировались в макрофаги в присутствии rhu M-CSF (59 нг/мл) в течение 6 дней. Макрофаги (1×10⁶ /мл) прединкубировали с hS4, hS3 или hEPO (3000 мЕ/мл каждый) в течение 3 часов и затем стимулировали 10 нг/мл эндотоксином (LPS из E. coli 0127:В8) в течение 4 часов. Концентрацию цитокина в супернатантах определяли при помощи ELISA (Cytometric Beads Array, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). Данные показаны в виде среднего ± SD (среднее отклонение). **Результаты отличались от контрольной (ЗФР) группы (р<0,01; U-критерий Манна-Уитни; n=3-9 на группу).

Фиг.17: Сопоставление последовательностей нуклеиновых кислот делеционных вариантов ЕРО.

Фиг.18: ДНК-последовательности мутантов и делеционных вариантов, созданных рекомбинантно, а также спираль А дикого типа (спираль А hWT-EPO). Здесь SEQ ID NO:55 является hA (спиралью А дикого типа), SEQ ID NO:56 является hAmA (делеционным мутантом с аланином), SEQ ID NO:57 является hAmE (делеционным мутантом с глутаминовой кислотой), SEQ ID NO:58 является hA-10 (спиралью А делеционного мутанта минус 10 аминокислот) и SEQ ID NO:59 является hA-20 (спиралью А делеционного мутанта минус 20 аминокислот).

Фиг.19: Предпочтительный вариант, в котором лидерные транспортные последовательности делетированы. А показывает последовательность ДНК hA без лидера, показанную в SEQ ID NO:60. Это зрелый экспортируемый белок. А показывает также лидерную последовательность (SEQ ID NO:63). В показывает аминокислотную последовательность hA без лидера в виде SEQ ID NO:61 и аминокислотную последовательность лидерной последовательности в виде SEQ ID NO:62.

Примеры

Синтез кДНК мышиного ЕРО

РНК выделяли из почек мышей C57BL/6 или SV129S6 дикого типа или из головного мозга двух других мышей (спустя 1 час после инсульта) экстракцией тризолом. РНК осаждали хлороформом и изопропанолом и затем растворяли в DEPC-Н₂О. ДНК расщепляли согласно протоколу RQ1 RNase-free DNase из Promega. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл смеси фенол/хлороформ/изопропиловый спирт (25/24/1) к реакционной смеси и центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин и 10^оС. Супернатант смешивали с 200 мкл смеси хлороформ/изопропиловый спирт (24/1) и центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин и 10°С. К этому супернатанту добавляли 20 мкл 8 М хлорида лития и 550 мкл абсолютного этанола. Затем эту смесь инкубировали в течение 1 часа при -70°С и затем осаждали в течение 30 минут центрифугированием при 11000 об/мин и 0°С. Полученный осадок промывали 600 мкл 75% этанола, центрифугировали при 8000 об/мин (4°С, 10 минут) и сушили при комнатной температуре. РНК растворяли в 20 мкл DEPC-Н ₂О.

Обратную транскриптазу вируса мышиного лейкоза Молони (MuLV, RNase H minus, купленную в Promega) использовали в синтезе первой цепи кДНК в реакционном объеме 15 мкл с DEPC-Н ₂О, содержащей 3 мкг РНК и 3 мкл случайного гексамерного праймера (10 мкМ). Обратную транскрипцию проводили с 6 мкл реакционного буфера M-MuLV (5х), 2 мкл dNTP (2,5 мМ каждый), 1 мкл ингибитора РНКазы (1 Е/мкл), 1 мкл обратной транскриптазы M-MuLV и 5 мкл DEPC-Н₂О в ПЦР-приборе, работающем при следующей программе: 5 минут при 21°С; 1 час при 37°С; 5 минут при 95°С.

Полученный пул кДНК использовали для амплификации полной кДНК ЕРО с использованием подхода ПЦР «футлярного» типа (разновидности ПЦР, использующей последовательно два набора праймеров: пару «наружных» праймеров и пару «внутренних» праймеров, причем во втором раунде ПЦР матрицей является часть продукта, полученного в первом раунде). Используемые в первой стадии праймеры лежат снаружи от кодирующего района гена ЕРО (genepo_sense (SEQ ID NO:39): gaa ctt cca agg atg aag act tgc agc и genepo_antisense (SEQ ID NO:40): gtg gca gca gca tgt cac ctg tc). Вторая стадия использовала праймеры, предназначенные для амплификации гена от стартового кодона до стоп-кодона, с присоединенными сайтами расщепления BamHI для последующего клонирования (epo_sense (SEQ ID NO:41): tat gga tcc atg ggg gtg ccc gaa cgt ccc ac и epo_antisense (SEQ ID NO:42): tat gga tcc tca cct gtg ccc tct cct gca gac). Все праймеры были из MWG-Biotech AG. ПЦР футлярного типа выполняли в приборе Hybaid PCR в двух стадиях, первая ПЦР (3 мин при 95°С; 35 циклов: 30 сек при 65°С, 1 мин при 72°С, 30 сек при 95°С; 10 мин при 72°С; 4°С выдерживание) и вторая ПЦР (3 мин при 95°С; 5 циклов: 30 сек при 67°С, 1 мин при 72°С, 30 сек при 95°С; 15 циклов: 30 сек при 70°С, 1 мин при 72°С, 30 сек при 95°С; 10 мин при 72°С; 4°С).

В обеих ПЦР использовали ДНК-полимеразу Pfu Turbo Hotstart (Stratagene) в соответствии с протоколом изготовителя. Продукт ПЦР первой стадии разбавляли 1:50 для второй ПЦР. Протокол второго синтеза кДНК выполняли с использованием системы Access RT-PCR (Invitrogen) со следующими параметрами: 49°С 5 мин; 94°С 2 мин; 40 циклов: 94°С 30 сек, 65°С 1 мин, 70°С 2 мин; 70°С 7 мин; 4°С. Вторую ПЦР выполняли, как описано выше.

Амплифицированную полноразмерную кДНК ЕРО и изомеры ЕРО разделяли на 1,2% ТАЕ-агарозном геле. Картина различных продуктов ПЦР показана на фиг.1а. Затем эти фрагменты очищали с использованием системы очистки Wizard SV-Gel-Cleanup (Promega) или набора для экстракции гелей (Qiagen, Hilden, Germany). Поскольку полимераза Pfu генерирует продукты с тупыми концами, эту кДНК субклонировали в векторе pCR-Blunt II-TOPO с использованием химически компетентных клеток Top10 One Shot Cells (в каждом случае из Invitrogen).

Плазмидную ДНК выделяли из отдельных колоний с использованием набора Qiagen QIA prep Kit. Инсерты секвенировали на ДНК-секвенаторе ALFexpress (Pharmacia Biotexh) с использованием набора для секвенировани Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences). Праймеры M13FWDCY (SEQ ID NO:43: gtc gtg act ggg aaa acc ctg gcg) и M13REVCY (SEQ ID NO:44: agc gga taa caa ttt cac aca gga) метили Cy5. Параметрами секвенирования были: t=900 минут; Т=55°С; 800 В; 55 мА и 30 Вт. Анализ последовательности выявил существование нового варианта ЕРО, лишенного экзона 4, и три делетированных внутри варианта. Эти нуклеотидные последовательности изображены на фиг.2а и фиг.2b, а кодируемые пептидные последовательности изображены на фиг.4. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО mS соответствуют SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14, соответственно. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО mG3 соответствуют SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16, соответственно. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО mG5 соответствуют SEQ ID NO:17 и SEQ ID NO:18, соответственно. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО m301 соответствуют SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20, соответственно. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО mK3 соответствуют SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:23, соответственно.

Синтез кДНК ЕРО человека

Поли А+ РНК почки взрослого человека (мужчины) и фетального головного мозга (мужского пола) покупали из Stratagene. кДНК генерировали из 250 нг РНК почки или 200 нг РНК головного мозга в соответствии с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (MuLV, RNase H minus), как описано выше. Полученный пул кДНК использовали для амплификации полной кДНК ЕРО с использованием полимеразы Pfu (Stratagene) со следующими праймерами: Hepo_sense (SEQ ID NO:45): gat ggg ggt gca cga atg tgg tgc и Hepo_antisense (SEQ ID NO:46): cac acc tgg tca tct gtc ccc tgt c.

ПЦР выполняли в приборе ПЦР из Invitrogen (3 мин при 95°С; 35 циклов: 30 сек при 65°С, 1 мин при 72°С, 30 сек при 95°С; 10 мин при 72°С). В случае кДНК фетального головного мозга использовали подход ПЦР «футлярного» типа, с выполнением второй стадии амплификации на продукте ПЦР из 20 циклов. Амплифицированные продукты ПЦР разделяли на 1,2% ТАЕ-агарозном геле (фиг.1b) и очищали с использованием набора для экстракции гелей (Qiagen, Hilden, Germany). Эту очищенную кДНК субклонировали в векторе pCR-Blunt II-TOPO с использованием химически компетентных клеток Top10 One Shot Cells (в каждом случае из Invitrogen). Плазмидную ДНК выделяли из отдельных колоний с использованием набора Qiagen QIA prep Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Инсерты секвенировали на ДНК-секвенаторе ALFexpress (Pharmacia Biotexh) с использованием набора для секвенирования Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences). Праймеры M13FWDCY (SEQ ID NO:43) и M13REVCY (SEQ ID NO:44) метили Cy5. Параметрами для секвенирования были: t=900 минут; Т=55°С; 800 В; 55 мА и 30 Вт. Анализ последовательности выявил существование двух новых вариантов ЕРО человека, лишенных экзона 3 и первой половины экзона 4, соответственно, и ряд вариантов, которые следуют правилу повторяемых тримеров или гексамеров, обнаруженному в мыши. Эти нуклеотидные последовательности изображены на фиг.3а и фиг.3b, а кодируемые пептидные последовательности изображены на фиг.4. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО hS3 соответствуют SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО h1-4 соответствуют SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, соответственно. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО h1-5 соответствуют SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, соответственно. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО hS4 соответствуют SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, соответственно. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО h1-1 соответствуют SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, соответственно. Нуклеотидная и пептидная последовательности варианта ЕРО h2-1 соответствуют SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, соответственно.

Экспрессия His-меченых белков в клетках НЕК

Сайты рестрикции BamHI и EcoRI для клонирования добавляли как к мышиному варианту ЕРО, так и варианту ЕРО человека с использованием имеющих выступающие концы смысловых праймеров и имеющих выступающие концы антисмысловых праймеров без стоп-кодона (для вариантов мыши: epo_sense (SEQ ID NO:41) и epoeco_antisense (SEQ ID NO:47): aaa gaa ttc cct gtc ccc tct cct gca gac ctc; для вариантов человека: hepobam_se (SEQ ID NO:48): tat gga tcc atg ggg gtg cac gaa tgt cc, hepoeco_as (SEQ ID NO:49): aga gaa ttc tct gtc ccc tgt cct gca g). Продукты ПЦР клонировали в pcDNA-3.1-HIS/V5 A (Invitrogen) с использованием сайтов рестрикции BamHI и EcoRI. Плазмиды амплифицировали в компетентных клетках XL-1 Blue (recA1 endA1 gyrA96 thi1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lac ^qZ М15 Tn10 (Tet^R)]) (Stratagene). Протокол трансформации компетентных клеток XL-1 Blue выполняли без -меркаптоэтанола и с пролонгированным импульсом нагревания 60 секунд. Плазмидную ДНК экстрагировали с использованием набора QIA prep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Для трансфекции в клетки млекопитающих ДНК экстрагировали с использованием набора EndoFree Plasmid Maxi (Qiagen, Hilden, Germany). Клетки НЕК 293 (BD biosciences) выращивали в течение 18 дней в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM; Biochrom, Berlin, 1 г/л глюкоза, 3,7 г/л NaHCO₃; дополненная 10% фетальной телячьей сывороткой GOLD, 1% пенициллином/стрептавидином и 1% L-глутамином) в колбах для культуры ткани (25 см²) при 37°С и 5% СО₂. Клетки разделяли каждые 2-3 дня после достижения 80-90% конфлюентности. При разделении 18 120000 клеток высевали на лунку в 12-луночной чашке, содержащую модифицированную Дульбекко среду Игла без антибиотиков. Клетки выращивали в течение приблизительно 48 часов до 50% конфлюентности. Трансфекцию выполняли с Липофектамином 2000 (Invitrogen) для адаптации обеспеченного протокола к клеткам НЕК.

Среду для посева НЕК-клеток заменяли за 10 минут перед трансфекцией бессывороточной средой DMEM без антибиотиков. Клетки инкубировали в течение 5 часов при 37°С с комплексами ДНК-Липофектамин. Затем среду заменяли свежей содержащей сыворотку DMEM без антибиотиков. При разделении 2 клетки разделяли и высевали в модифицированную Дульбекко среду Игла с антибиотиками.

Экспрессия и очистка His-меченых вариантов ЕРО

His-меченые белки транзиторно экспрессировали в НЕК-клетках. Среду из клеток НЕК 293 собирали спустя 2-6 дней после трансфекции конструкциями pcDNA-3.1-HIS/V5 A. Остатки клеток (дебрис) осаждали при 3500 об/мин, 4°С в течение 15 минут. Смолу BD TALON Metal Affinity Resin (BD Biosciences) использовали для очистки His-меченых белков. Все стадии (уравновешивание, промывку и элюцию) выполняли при рН 7,1. Обеспеченный протокол модифицировали для пролонгированной стадии связывания в течение ночи при 4°С. Элюат собирали в виде фракций 500 мкл. Фракции анализировали Вестерн-блоттингом с использованием анти-rhEPO-антитела из Santa-Cruz или набора для ELISA мышиного ЕРО (R&D). Имидазол удаляли из белоксодержащих фракций с использованием обессоливающих колонок HiTrap (5 мл) из Amersham Biosciences в соответствии с протоколом изготовителя. Это включало в себя замену буфера на ЗФР.

Вестерн-блот

16% ДСН-гель готовили с использованием стандартных протоколов и электрофорез проводили при 110 В. Блоттинг выполняли на нитроцеллюлозных мембранах в течение 45 минут при 200 мА. Блот блокировали в течение по меньшей мере одного часа в блокирующем буфере, содержащем 5% порошок обезжиренного сухого молока в 0,1% Твине-20. Инкубацию с первым антителом (ЕРО (Н162) (кроличьим поликлональным IgG sc-7956, Santa-Cruz, 1:500) выполняли в течение ночи при 4°С. Второе антитело (козье антитело против кроличьего IgG-HRP; 1:1000) добавляли в течение 2 часов при комнатной температуре. Этот блот визуализировали с использованием Люминола; фотографии экспонировали в течение 2 минут. Мембраны окрашивали красителем Ponceau Red. ЕРО-специфическое антитело было способно детектировать все варианты ЕРО.

Анализ образования колоний эритроидов

Клетки костного мозга собирали из большеберцовой кости и бедренной кости мышей C57BL/6 (8-11-недельных) и ресуспендировали в -среде (дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой GOLD, 1% пенициллином/стрептавидином и 1% L-глутамином). Клетки высевали в чашки Петри 35 мм² (225000 клеток на чашку), содержащие 8 частей метилцеллюлозы Metho Cult SF 3236 (StemCell Technologie Inc.), 1 часть клеток и 2 части -среды, смешанной с предварительно кондиционированной НЕК-клетками средой, содержащей ЕРО-дериваты (150 Е/л в случае мышиного ЕРО). 150 Е/л rhEPO (Roche) использовали в качестве положительного контроля. Чашки инкубировали при 37°С в увлаженной атмосфере, содержащей СО₂, в течение 48 часов. Для оценки учитывали только красноватые колонии, содержащие по меньшей мере 6 гемоглобинизированных клеток.

Гемопоэтический потенциал вариантов ЕРО

Metho Cult SF 3236 запускает образование колоний (CFU-M, CFU-G или CFU-E) только после добавления подходящих цитокинов. Образование CFU-E (колониеобразующая единица-эритробласт) можно наблюдать после добавления эритропоэтина, спустя 2 дня. Малые нерегулярные красноватые колонии исчезают в день 3.

В этом анализе гемопоэтический потенциал этих вариантов испытывали и сравнивали с формой ЕРО дикого типа, а также rhEPO. Были приготовлены следующие условия для сравнения: среды из НЕК-клеток, трансфицированных pZ/EG, в качестве отрицательного контроля, среда из НЕК-клеток, трансфицированных pZ/EG-клетками плюс 150 Е/л rhEPO (Roche) в качестве положительного контроля, и среда из НЕК-клеток, трансфицированных либо pZ/EG-EPO-IRES (150 Е/л мышиного ЕРО), pZ/EG-Splice-IRES (вариант S; mS), либо pZ/EG-G3-IRES (вариантом G3; mG3). При разделении 2 считали только красноватые колонии, содержащие по меньшей мере 6 гемоглобинизированных клеток. Результаты трех независимых экспериментов изображены на фиг.5.

В сравнении с мышиным ЕРО и rhEPO мышиные варианты ЕРО (варианты mS и mG3) не имели гемопоэтического потенциала.

Первичные культуры нейронов

Первичные нейронные культуры крысы получали из Е16 - ранних Е19 зародышей крыс Wistar (Bundesinstitut fur gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinarmedizin, Berlin, Germany). Cre-экспрессирующие нейроны мыши получали из зародышей Е16 гетерогенных трансгенных мышей, экспрессирующих Cre-рекомбиназу под контролем промотора тубулина -1 (предоставленного доктором U. Schweitzer; Experimental Endocrinology, Charite). Мышиные культуры и культуры крысы получали в соответствии с модифицированным протоколом из Brewer (1995) J Neurosci Res. 42: 674-83. Кору головного мозга выделяли после удаления оболочек головного мозга и промывали дважды в ЗФР (Biochrom, Berlin, Germany). После 15 минут инкубации в смеси трипсин/ЭДТА (0,05/0,02% мас./об. в ЗФР) при 37°С, ткани промывали дважды в N-Med (модифицированной Иглом среде из Gibco, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, 100 Е пенициллина плюс стрептомицина из Biochrom, 2 мМ L-глутамин, 100 МЕ инсулина/л, 10 мМ HEPES и 44 мМ глюкозу) и диссоциировали осторожно в малом объеме N-Med при помощи Пастеровской пипетки. Клетки осаждали при комнатной температуре 2-минутным центрифугированием при 210×g и ресуспендировали в среде NBM для закваски (Neurobasal medium из Gibco с 2% добавкой В27 из Gibco, 1% Пенициллином/стрептомицином, 0,5 мМ L-глутамином и 25 мкМ глутаматом).

Приготовление культуральных планшетов

24-луночные планшеты и 6-луночные планшеты предобрабатывали инкубированием в течение ночи при 4°С поли-L-лизином из Biochrom (2,5 мкг/мл в ЗФР). После промывания лунок ЗФР их инкубировали 1 час при 37^оС со средой для покрытия (модифицированной средой Игла с 5% FCS GOLD из PAA, 1% Пенициллином/стрептомицином, 10 мМ HEPES и 0,03% мас./об. коллагена G из Biochrom), затем эти лунки тщательно промывали дважды с использованием ЗФР. Объем и тип среды для посева выбирали в зависимости от экспериментальной процедуры.

Недостаточность кислорода/глюкозы в первичных кортикальных нейронах - модель церебральной ишемии в культуре клеток

Для OGD культуральную среду вымывали промыванием один раз ЗФР. OGD индуцировали 500 мкл дезоксигенированным агликемическим раствором (BSS₀-О₂; 143,8 мМ Na⁺ , 5,5 мМ К⁺, 1,8 мМ Са²⁺, 0,8 мМ Mg ²⁺, 125,3 мМ Cl^-, 26,2 мМ HCO₃ ^- и 0,8 мМ SO₄ ^2-, рН 7,4) в гипоксической атмосфере, генерированной предназначенным для этого содержащим увлажненный газ термостатом (Concept 400, Ruskinn Technologies, Bridgend, UK), промываемым газовой смесью, содержащей 5% СО₂, 85% N₂ и 10% Н₂. Время OGD зависело от плотности и возраста культуры и варьировалось между 2 ч 30 мин и 2 ч 40 мин. В контрольных экспериментах эти лунки обрабатывали 500 мкл оксигенированного гликемического раствора BSS₀ (BSS₀+О ₂; 143,8 мМ Na⁺,

5,5 мМ К ⁺, 1,8 мМ Са²⁺, 0,8 мМ Mg²⁺, 125,3 мМ Cl^-, 26,2 мМ HCO₃ ^-, 0,8 мМ SO₄ ^2- и 20 мМ глюкоза, рН 7,4) и инкубировали при 37°С в нормоксической атмосфере, содержащей 5% СО₂ . Сразу же после OGD обработанным клеткам и контролям заменяли среду с BSS-раствора на 500 мкл среды, содержащей 40% кондиционированной NBM плюс 60% свежей NBM. Спустя 24 часа измеряли активность лактатдегидрогеназы (LDH) в супернатантах в качестве индикатора смерти клеток.

Для измерения LDH 25 мкл среды смешивали с 100 мкл свежего раствора -НАДН (0,15 мг/мл в 1×LDH-буфере; Sigma, восстановленная форма) в 96-луночном планшете (Greiner). 25 мкл 22,7 мМ пирувата (Sigma) добавляли непосредственно перед помещением этого планшета в планшет-ридер (Thermo Labsystems; MRX^TC Relevation). Параметры выбирали следующим образом: фильтр: 340 нм, время встряхивания: 5 сек, интервал: 30 сек, счет: 10. Концентрацию LDH рассчитывали пропорционально LDH-стандарту (Greiner, system calibrator).

Индукция нейрозащиты кондиционированной средой из трансфицированных клеток НЕК 293, экспрессирующих варианты ЕРО

В следующих экспериментах rhЕРО (рекомбинантный ЕРО человека из Sigma Aldrich, Deisenhofen, Germany) использовали в качестве положительного контроля. Анализы нейрозащиты схематически изображены на фиг.6. Нейроны высевали в 24-луночных планшетах при плотности 300000 клеток в конечном объеме 600 мкл заквасочной среды NBM. Спустя 4 дня 200 мкл этой среды заменяли 250 мкл свежей NBM (той же самой, что и заквасочная NBM, но без глутамата).

Для предобработки rhЕРО, mЕРО дикого типа, hEPO дикого типа или вариантами ЕРО среду удаляли до конечного объема 200 мкл и дополняли 200 мкл свежей NBM+B27, содержащей эквимолярные количества (соответствующие 200 Е/л rhЕРО) ЕРО или вариантов ЕРО, соответственно. Эквивалентные концентрации различных вариантов ЕРО (а также mЕРО и hEPO) в кондиционированной среде из клеток НЕК293 оценивали посредством Вестерн-блота и ЕРО-ELISA. После этого нейроны выращивали в течение 48 часов при нормоксических, увлажненных условиях при 37°С перед выполнением депривации кислорода-глюкозы (OGD) (интервал OGD, как указано). Смерть клеток оценивали спустя 24 часа после OGD измерением высвобождения LDH. Уменьшение высвобождения LDH в сравнении с ложнообработанными нейронами (среда из клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой-скелетом; = ko (нокаут генов); 100%), является количественной мерой нейрозащиты. Во всех экспериментах авторы наблюдали более сильное нейрозащитное действие, обеспечиваемое вариантами ЕРО, в сравнении с ЕРО дикого типа (см. Панель А и В фиг.7 для мышиного ЕРО и его вариантов и панели А и В (фиг.8) для ЕРО человека и его вариантов).

Нейрозащита, индуцированная мышиными вариантами ЕРО, является более сильной, чем защита, индуцированная ЕРО (rhЕРО, а также мышиным ЕРО дикого типа). Например, нейрозащиту, опосредованную ЕРО, могли наблюдать только в ясно определенном окне длины OGD (соответствующем ясно определенному уровню повреждения). При низкой концентрации нейрозащита посредством hS3 и hS4 была равной нейрозащите hEPO дикого типа или лучшей, чем защита hEPO дикого типа. В целом, нейрозащита, индуцированная вариантами, является более сильной, чем защита, индуцированная rhEPO. В дополнение, варианты имеют более высокий защитный потенциал, чем обе формы дикого типа, mЕРО и hEPO, которые были получены с использованием той же самой процедуры, что и варианты ЕРО.

Клетки Н9с2-модель ишемии

Клеточную линию миобластов сердца крыс BDIX (полученную из Европейской Коллекции Культур Клеток) культивировали в DMEM (Biochrom), содержащей 4,5 г/л глюкозы, дополненной 2 мМ L-глутамином, 10% инактивированной фетальной телячьей сывороткой и 1% пенициллином-стрептавидином. Субконфлюентные культуры (70%) субкультивировали 1:4. Клетки высевали в 400 мкл среды, содержащей 120 пМ hEPO или hS3, соответственно, при плотности 15000 клеток на лунку в 24-луночных планшетах и культивировали в течение 48 часов. Гипоксию получали культивированием этих клеток в 400 мкл бессывороточной DMEM, содержащей 4,5 г/л глюкозы, дополненной 2 мМ L-глутамином и 1% пенициллином, оставлением их в течение 24 часов в анаэробной рабочей станции (Concept 400, Ruskinn Technologits, Bridgend, UK), насыщенной газовой смесью, содержащей 5% СО₂, 85% N₂ и 10% Н₂ , при 37°С. Контрольные клетки оставляли в бессывороточной DMEM в нормоксическом термостате. В конце эксперимента среду заменяли 400 мкл свежей бессывороточной DMEM и измеряли LDH в соответствии со стандартными протоколами спустя 24 часа.

Иммунопреципитация

Для этих экспериментов использовали самцов мышей 129S6 или самцов мышей C57Bl6 (8-10 недельных, Bundesinstituts fur Risikobewertung, Berlin), имеющих свободный доступ к корму и воде. CoCl₂ инъецировали подкожно в дозе 60 мг/кг и животных убивали спустя 18 часов. Экспрессию белка измеряли в экстрактах белка сыворотки, почки и головного мозга при помощи коммерчески доступного ELISA (R&D, mЕРО).

Антитела для преципитации покупали из R&D (анти-mЕРО-антитело, козье, меченное биотином) и Santa-Cruz (анти-rhЕРО-антитело, кроличье). Иммунопреципитацию выполняли в соответствии со стандартными протоколами и оценивали при помощи Вестерн-блоттинга.

Блокирование детектирующего антитела Вестерн-блота выполняли двухчасовым инкубированием с 10 мкг Дарбпоэтина А при комнатной температуре перед инкубированием блота.

Генерирование альфа-спираль-мутантов (фиг.10)

Все альфа-спираль-мутанты человека генерировали с использованием подходов на основе ПЦР с применением стандартных протоколов.

Мутант А (hAmA) и мутант Е (hAmE) являются вариантами альфа-спирали с аминокислотной заменой в положении 41 (аргинин). кДНК-последовательность изменяли с AGG в GCG для мутанта А (аланин) или в GAG для мутанта Е (глутамат). -20аа и -10аа являются делеционными вариантами альфа-спирали, не имеющими 20 аминокислот или 10 аминокислот, соответственно на С-конце. Все мутанты генерировали без V5 и His-метки и экспрессировали в клетках НЕК 293. Эксперименты по нейрозащите выполняли, как описано ранее, с использованием среды трансфицированных клеток НЕК, экспрессирующих различные варианты.

hEPO- и hS3-опосредованная цитозащита в модели ишемии в клетках Н9с2 (фиг.11)

Цитозащитный потенциал вариантов ЕРО демонстрировали в качестве примера для очищенного hEPO и hS3 в модели ишемии, состоящей из депривации сыворотки и гипоксии в сердечных миобластах Н9с2 (фиг.1). Высвобождение LDH оценивали в качестве маркера апоптотической смерти клеток. Авторы нашли значительные цитозащитные активности для обоих вариантов (приблизительно 20% и 25% для hEPO и hS3).

Иммунопреципитация выявляет сплайсинговую изоформу ЕРО в экстрактах белка почки CoCl₂-обработанных мышей (фиг.12)

Для подкрепления открытия авторов сплайсинговых изоформ ЕРО в тканях человека и мыши при помощи подхода на основе ПЦР авторы выполняли иммунопреципитации на экстрактах белка сыворотки, головного мозга и почки CoCl₂-обработанных мышей с использованием антител, испытанных в отношении узнавания обеих изоформ. Известно, что подкожная инъекция CoCl₂ увеличивает уровни эритропоэтина в нескольких тканях мыши, а именно, в крови, головном мозге, печени и почке.

Авторам удалось преципитировать эритропоэтин (приблизительно 40 кДа) из экстрактов белка сыворотки, головного мозга и почки CoCl₂-обработанных мышей (фиг.2); преципитация эритропоэтина из экстракта белка почки необработанной мыши не удалась вследствие низкого уровня экспрессии. Кроме того, авторам удалось доказать существование второго небольшого белка (приблизительно 30 кДа) в экстракте белка почки CoCl₂ -обработанных мышей. Этот белок специфически узнается анти-rhЕРО-антителом, как показано полным блокированием взаимодействия антитело-антиген при помощи Дарбпоэтина А. Эти открытия в сильной степени подтверждают существование сплайсинговой изоформы мышиного эритропоэтина. Эти результаты воспроизводили во втором штамме мыши, а именно, С57Bl6.

Нейрозащита, опосредованная различными изоформами альфа-спирали эритропоэтина (фиг.13)

Анализируя нейрозащитные потенциалы идентифицированных до сих пор вариантов эритропоэтина, авторы изобретения предположили, что альфа-спираль является функционально важным доменом для нейрозащитного характера эритропоэтина. Для испытания этой гипотезы авторы экспрессировали укороченную форму эритропоэтина человека, а именно, домен альфа-цепи, в клетках НЕК 293, и испытывали этот пептид в OGD-модели авторов. Авторы обнаружили эквивалентный защитный потенциал с 30 пМ и 15 пМ этого пептида относительно 30 пМ hEPO, как показано на фиг.13.

Для идентификации функционально важных остатков в доменах альфа-спирали эритропоэтина человека авторы генерировали различные мутанты эритропоэтина, содержащие либо аминокислотные замены (hAmA и hAmE), либо делеции полного домена (hA-10 и hA-20).

Ни нейтральная, ни кислотная аминокислотная замены в положении 41 не былы способны разрушить нейрозащитный потенциал альфа-спирали в OGD-модели авторов (фиг.14).

Нейрозащита, опосредованная несколькими изоформами ЕРО человека (n=6) Р*<0,05; ANOVA1 против контроля (фиг.14)

Делеционные варианты, лишенные 10 или 20 аминокислот на С-конце альфа-спирали, экспрессировали в клетках НЕК 293 и также испытывали в OGD-модели. Делеционный вариант hA-10 все еще имел нейрозащитные свойства, сравнимые со сплайсинговой изоформой hS3. Делеция 20 аминокислот (hA-20) приводила к пептиду, который уже не имел защитных свойств (фиг.15).

Иммуномодуляция вариантов эритропоэтина человека (фиг.16)

Варианты ЕРО человека hS3 и hS4 проявляют сильные иммуномодулирующие действия. В макрофагах человека, стимулированных эндотоксином-липополисахаридом (LPS), hS3 и hS4 индуцируют противовоспалительный цитокин IL-10 и уменьшают экспрессию провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8. В сравнении с ЕРО (hWT), противовоспалительные эффекты hS3 и hS4 являются гораздо более сильно выраженными. Эти противовоспалительные свойства вариантов ЕРО применимы в лечении воспалительных заболеваний (например, рассеянного склероза, вирусных и бактериальных инфекций, сепсиса) и дегенеративных заболеваний (например, инсульта, инфарктов миокарда).