способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якутов

Формула изобретения

Способ прогнозирования риска развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 у якутов, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, отличающийся тем, что амплификацию специфичности гена адипонектина (ADIPOQ) определяют методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипа *Н/*Н полиморфного варианта Y111H ADIPOQ прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано в офтальмологии, эндокринологии, медицинской генетике, общественном здоровье и здравоохранении, медико-социальной экспертизе, генной инженерии, генотерапии для прогнозирования развития и профилактики диабетической ретинопатии (ДР) при сахарном диабете типа 2 (СД типа 2) у якутов, проживающих в Республике Саха (Якутия).

Известен способ прогнозирования возникновения и развития диабетической ретинопатии у больных инсулинзависимым сахарным диабетом (заявка 2003122404/15, G01N 33/68, 27.02.2005 г.), который позволяет прогнозировать возникновение и прогрессирование диабетической ретинопатии у больных инсулинзависимым сахарным диабетом при проведении иммунологического исследования сыворотки крови путем определения содержания интерлейкина-1 при наличии его в концентрации 50 пкг/мл и выше. Возникновение диабетической ретинопатии при отсутствии клинических явных изменений на глазном дне прогнозируют при концентрации интерлейкина-1 700 пкг/мл и более.

Известен способ Диагностика риска развития у субъекта атеросклероза или диабетической ретинопатии (заявка 2001130755/14, C12Q 1/68, 27.08.2003 г.), который включает определение у диабетика наличие полиморфизма на участке сигнального пептида препро-NPY человека, данный полиморфизм заключается в замене лейцина на пролин в 7-ом положении на участке сигнального пептида препро-NPY человека и является индикатором повышенного риска развития диабетической ретинопатии и атеросклероза.

Известен Способ прогнозирования клинической манифестации диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом 2 типа (патент 2292549, G01N 33/487, 27.01.2007 г.), который позволяет исследовать индуцированную хемолюминесценцию слезной жидкости и световую чувствительность макулы с помощью фотостресс-теста. При значениях индуцированной хемолюминесценции слезной жидкости от 0,031-0,043 отн. ед. и показателях световой чувствительности макулы от 56 до 75 секунд прогнозируют высокий риск клинической манифестации диабетической ретинопатии на ранней стадии.

Известен Способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии (заявка 2005112169/15 G01N 33/48 от 27.10.2006 г.), который включает определение нитритов в крови, а в слезной жидкости - холестерина, СОД и каталазы, по этим показателям составляют карту, по которой определяют стадии развития ДР.

Известен Способ диагностики диабетической ретинопатии (патент 2071059, G01N33/68, 27.12.1996 г.), который позволяет диагностировать диабетическую ретинопатию при определении в сыворотке крови повышенного уровня тироксинсвязывающего гормона в 1,5 и более раз.

Известен Способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии (патент 2124727, G01N 33/53, A61F 9/00, 10.01.1999 г.), который обеспечивает возможность прогнозирования перехода непролиферативной стадии диабетической ретинопатии в пролиферативную путем иммунологического исследования слезной жидкости и определения концентрации иммуноглобулина А при его значениях не менее 0,20 г/л.

Однако все перечисленные выше способы не позволяют в полном объеме определять специфические и генетические признаки диабетической ретинопатии непосредственно у больных сахарным диабетом типа 2 в зависимости от этнической принадлежности обследуемых пациентов.

Наиболее близким к предлагаемому способу является Диагностика риска развития у субъекта атеросклероза или диабетической ретинопатии (заявка 2001130755/14, C12Q 1/68, 27.08.2003 г.), включающая прогнозирование развития диабетической ретинопатии, при котором у больного сахарным диабетом путем использования ДНК-локусов крови и применения молекулярно-генетических методов определяют полиморфный вариант гена человека на участке сигнального пептида препро-NPY, который является индикатором повышенного риска развития диабетической ретинопатии и атеросклероза.

Данный способ диагностики разработан на основе изучения генетической предрасположенности к ДР при сахарном диабете независимо от его типа в гетерогенной популяционной среде и поэтому неприемлем для медико-генетического консультирования по ДР при СД типа 2 в других регионах, в частности в Республике Саха (Якутия). Это обусловлено тем, что генетическая предрасположенность к ДР при СД типа 2, как и к другим многофакторным заболеваниям, формируется в зависимости от особенностей популяционно-генетической структуры этноса, к которому относится этническая группа якутов.

Задача предлагаемого способа - повышение точности прогнозирования ДР при СД типа 2 у якутов, проживающих в Республике Саха (Якутия).

Поставленную задачу решают за счет того, что амплификацию специфичности гена адипонектина (ADIPOQ) определяют методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипа *Н/*Н полиморфного варианта Y111H ADIPOQ прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь для выделения ДНК собирали из локтевой вены пациента в специальный вакутейнер с консервантом EDTA. Собранную кровь замораживали в специальном контейнере при температуре -20°C и ниже.

ДНК экстрагировали из лейкоцитов с помощью системы очистки (Promega, Madison, WI).

В работе использовали полиморфный маркер гена адипонектина, участвующий в метаболизме липидов и углеводов: ADPIQ (вариант Y111H).

Гаплотип rs17366743 гена ADIPOQ анализирован с помощью аллельной дифференциации Tagman универсальной средой ПЦР (по AmpErase UNG). Все реакции проводились на системе ABI7300 с использованием программы SDS 1.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Фрагменты ПЦР денатурировались при температуре 95°C в течение 5 минут с последующей ренатурацией понижением температуры до 25°C на протяжении 45 минут. Идентификация аллелей выполнена с использованием системы Wave Nuclear Acid Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha, NE). Результаты соответствовали прямым данным секвенирования.

Статистическая обработка материалов. Статистический анализ данных проведен с использованием пакета Statistica 8.0 и SAS 7.0. При сравнении качественных данных использован критерий Пирсона ² и точный критерий Фишера. Критическое значение уровня значимости принималось равным 5%. Относительный риск заболевания по каждому аллелю вычисляли как соотношение шансов (odds ratio - OR) с расчетом доверительных интервалов (OR'). При OR=1 ассоциации нет, OR>1 - положительная ассоциация заболевания с аллелем и генотипом, и OR<1 - отрицательная ассоциация.

Офтальмологическое обследование пациентов включало стандартные методы определения визометрии, офтальмотонуса, биомикроскопии, офтальмоскопии с применением универсальной линзы Гольдмана в условиях медикаментозного мидриаза при отсутствии противопоказаний.

Учитывая особые этические моменты, связанные с охраной права личности, осмотры и забор биологического материала проводились с заполнением специальных медицинских карт при добровольном согласии на участие в клиническом исследовании взрослого пациента или родителя несовершеннолетнего больного. Форма указанной медицинской карты одобрена Комитетом по этике при Якутском научном центре СО РАН РФ (Протокол № 5 от 21.06.2006 г.).

Нами обследованы коренные жители, принадлежащие к этнической группе якутов, проживающие в 5 районах (Амгинский, Усть-Алданский, Таттинский, Чурапчинский, Мегино-Кангаласский) Республики Саха (Якутия).

В ходе работы исследованы 238 образцов ДНК этнических якутов. Группу исследования составили 78 больных ДР (Классификация E.Kohner, M.Porta, 1990) при СД типа 2 в возрасте свыше 40 лет. Контрольная группа состояла из 160 добровольных доноров той же этнической группы без клинических и лабораторных признаков сахарного диабета, не родственных между собой и не имеющих отягощенный семейный анамнез по сахарному диабету. Сравнительная клинико-социальная характеристика исследуемых пациентов в обеих группах представлена в таблице 1.

Таблица 1
Сравнительная социально-клиническая характеристика исследуемых пациентов в этнической группе якутов
Характеристика исследуемых пациентов в этнической группе якутов	Группа больных ДР при СД 2 типа	Контрольная группа
1	2	3
Возраст	54.7±10.9	57.0±14.7
Пол (М/Ж в %)	31.5/68.5	42.6/57.4
Индекс массы тела	27.5±3.76	25.2±2.87
Гликемия (ммоль/л)	11.7±4.81	4.8±0.75
Артериальное давление (систолическое) (ммHg)	151±24	140±14
Артериальное давление (диастолическое) (ммHg)	92±11	88±8

Из таблицы 1 видно, что пациенты обеих групп не имели особых статистических различий по полу и возрасту. Основной составляющей обеих групп были женщины в возрасте старше 50 лет. Среди пациентов исследуемой группы отмечается повышенный индекс массы тела, уровень гликемии и артериального давления.

В результате офтальмологического исследования пациентов установлено, что длительность развития ДР варьировала в диапазоне от 1 года до 20 лет. ДР развилась в 62.8% случаев после установления СД типа 2 в течение первых 5 лет. Впервые выявленная ДР, преимущественно 1 и 2 стадии, установлена нами при сроке СД типа 2 на момент исследования и продолжительности основного заболевания до 1 года в 30% случаев.

Данный факт подтверждает тяжесть диабетических микроангиопатий органа зрения, обуславливающих раннюю слепоту и слабовидение пациентов в первые годы заболевания.

В результате молекулярно-генетического исследования отмечено, что эмпирическое распределение частот генотипов полиморфного варианта Y111H гена адипонектина в популяции якутов соответствует теоретически ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга ( ²=0.037, Р=0.999).

Оценка распределения частот генотипов и аллелей полиморфного варианта Y111H гена адипонектина (ADIPOQ) обнаружила статистически значимые различия между больными ДР и контрольной группой ( ²=7.513, Р=0.029) (табл.2).

Из табл.2 видно, что с большей частотой в группе больных ДР, чем в контрольной группе, встречается генотип *Н/*Н (4.94% против 0.81%, Р=0.026). Относительный риск (OR) составил 6.37 (CI _OR=1.4-29.04). Частоты других генотипов и аллелей достоверно не различаются.

Примечание к таблице 2:

n - количество наблюдений, р_i - частота генотипа (аллеля); s_p - ошибка p_i; P - вероятность; OR (odds ratio) - показатель соотношения шансов; CI (confidence interval) - 95% доверительный интервал.

Таблица 2
Анализ ассоциаций полиморфного варианта Y111H в экзоне 3 гена адипонектина с диабетической ретинопатией в популяции якутов
	Контрольная группа	Больные ДР	P	OR	CI OR
n	pi±s p (%) CI	n	pi±s p (%) CI
Генотипы
*Y/*Y	292	78.71±2.13 74.18-82.76	60	74.07±4.87 63.14-83.18	0.446	-	-
*Y/*H	76	20.49±2.1 16.49-24.96	17	20.99±4.52 12.73-31.46	0.959	-	-
*H/*H	3	0.81±0.47 0.17-2.34	4	4.94±2.41 1.36-12.16	0.026	6.37	1.4-29.0
Аллели
*Y	660	88.95±±1.15 86.47-91.11	137	84.57±2.84 78.07-89.76	0.153	-	-
*H	82	11.05±1.15 8.89-13.53	25	15.43±2.84 10.24-21.93	-	-

Предлагаемый способ позволяет при выявлении генотипа *Н/*Н полиморфного варианта Y111H (ADIPOQ) гена адипонектина у якутов прогнозировать риск развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2.

Выявленный генотип *Н/*Н полиморфного варианта Y111H (ADIPOQ) гена адипонектина является маркером повышенного риска диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 для данного этноса. Полученные результаты будут способствовать своевременному прогнозированию и/или выявлению группы риска по диабетической ретинопатии среди якутов и помогут определить тактику ведения пациента с предрасположенностью к диабетической ретинопатии с использованием индивидуального комплекса профилактических и лечебных мероприятий.