способ получения суммы водорастворимых протеолитических ферментов

Формула изобретения

1. Способ получения суммы водорастворимых протеолитических ферментов из высушенного млечного сока незрелых плодов дынного дерева, включающий экстракцию сырья водой при комнатной температуре и перемешивании, разделение твердой и жидкой фаз и выделение очищенного продукта, отличающийся тем, что водное извлечение, полученное после разделения твердой и жидкой фаз, дополнительно профильтровывают через фильтр с размером пор 0,45-2,0 мкм, высушивают методом распыления до получения очищенного продукта в виде сухого экстракта с протеолитической активностью не менее 3,5 ПЕ/мг препарата и содержанием белка 0,43-0,50 мг/мг препарата, растворяют в воде, затем проводят стерилизирующую фильтрацию и лиофильную сушку раствора.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный сухой экстракт используют для изготовления мягких лекарственных форм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу получения суммы водорастворимых протеолитических ферментов, используемой в медицинской практике в качестве протеолитического средства.

Сумму водорастворимых протеолитических ферментов получают в виде сухого экстракта и лиофилизата из высушенного млечного сока (латекса) незрелых плодов дынного дерева - Carica papaya L., семейство папаевые - Caricaceae. Основными биологически активными веществами ее являются: папаин, химопапаин А и В, пептидазы А и В (Куркин В.А. Фармакогнозия, Самара, ООО «Офорт», 2004, стр.200-201).

Группа продуктов, получаемых из млечного сока папайи (в том числе сам сок, пищевые продукты и лекарственные препараты, а также папаин в виде частично очищенного или кристаллического продукта), известны под коммерческим названием «папаин». Папаин является протеолитическим ферментом (цистеиновой протеиназой), т.е. ферментом, расщепляющим белок. Его протеолитическая активность выражается в протеолитических единицах (ПЕ).

На основе высушенного млечного сока папайи в бывшем СССР, в России и за рубежом (Грузия, Словения и др.) были разработаны и получили широкую известность такие препараты, как «Карипазим» и «Лекозим». Указанные препараты были предложены к медицинскому применению в виде лиофилизата для приготовления раствора для наружного применения (Государственный реестр лекарственных средств. М., 2004, стр.244; то же, 2008, стр.855; Регистр лекарственных средств России, М., 1993, стр.523).

Известен способ получения очищенной суммы комплекса протеолитических ферментов из высушенного млечного сока дынного дерева (папайи). Данный способ включает экстракцию сырья водой в соотношении 1:25 при комнатной температуре и перемешивании, фильтрацию извлечения, помещение фильтрата в ледяную баню и осаждение суммы ферментов из фильтрата охлажденным 95% этанолом до полного выделения осадка, выдерживание полученной суспензии в ледяной бане для полноты осаждения, отделение комплекса ферментов центрифугированием и их сушку в вакууме (Материалы I съезда фармацевтов Грузии. Ст. Д.Г.Чантурия и др. «Протеолитический фермент - папаин дынного дерева, интродуцированного в Грузии». Ин-т фармакохимии АН ГССР, Изд. Тбилиси, 1978, стр.172-175).

Известен способ получения суммы водорастворимых протеолитических ферментов и лекарственных средств на ее основе, включающий экстракцию высушенного млечного сока папайи водой при комнатной температуре и перемешивании, разделение твердой и жидкой фаз и выделение очищенного продукта (Программа и тезисы докладов XXIX научной конференции-конкурса молодых ученых. Ст. Г.С.Еркомаишвили и др. «Лекарственные средства из отечественного папаина» и Ст. Д.Г.Чантурия и др. «Исследование процесса получения лекарственных средств из ферментов папайи», Тбилиси, 1986, стр.20-22).

В данном способе, также как и в предыдущем, из полученного водного извлечения осаждают ферменты 96% этанолом, суспензию ферментов выдерживают, отфильтровывают и высушивают до получения готового продукта.

Недостатками этих способов являются: неполная экстракция водорастворимых ферментов водой из-за недостаточного ее количества, длительность технологического процесса (а вследствие этого возможное снижение активности ферментов), использование токсичного и взрывоопасного этилового спирта, необходимость последующей регенерации его из маточного раствора, возможная инактивация ферментов этанолом, использование низких температур для непосредственного выделения продукта. Кроме этого, эти способы предложены для лабораторных исследований.

Позднее на основе комплекса водорастворимых протеолитических ферментов было создано средство для лечения ожоговых и гнойных ран - карипазим в стерильной лекарственной форме: лиофилизат для приготовления раствора для наружного применения 350 ПЕ (ВФС 42-1749-87).

Как известно, коммерческий папаин, поставляемый в Россию из Индии, Китая, Вьетнама и других тропических стран, как правило:

- содержит различное количество балластных веществ (до 40% высушенного млечного сока при экстракции водой может в ней не раствориться);

- микробиологически часто очень сильно загрязнен;

- имеет различную степень измельчения (вплоть до «пыли»).

Как результат этого, при масштабировании процесса указанные факторы могут привести к значительному увеличению продолжительности процесса, снижению активности и к получению нестерильного готового продукта.

Этому также способствует и то, что экстрагентом протеолитических ферментов служит вода, которая быстро обсеменяется и водное извлечение само по себе может быстро прокиснуть.

В связи со всем вышесказанным процесс получения водорастворимых протеолитических ферментов из высушенного млечного сока известными способами требует непрерывного и оперативного проведения всего многостадийного процесса - малейший сбой процесса (замедление обычной и стерилизирующей фильтрации, розлива или лиофильной сушки) может привести к получению нестандартного готового продукта - карипазима.

При приготовлении промышленных серий препарата требуется одномоментно либо много единиц дорогостоящих сублимационных сушилок, либо одна большой производительности, что экономически невыгодно.

Кроме того, при получении лиофилизата протеолитических ферментов, стадия очистки исходного сырья экстракцией водой с последующим отфильтровыванием балластных веществ и стадии приготовления готовой лекарственной формы - карипазима лиофилизата стерилизирующей фильтрацией полученного водного фильтрата с последующей лиофильной сушкой стерильного раствора совмещены, т.е. очищенный комплекс водорастворимых протеолитических ферментов в сухом состоянии не выделяется, что, на наш взгляд, нетехнологично.

В дополнение к этому, на стерилизирующую фильтрацию и последующую сушку направляются очень разбавленные растворы, что также нерационально.

В указанном способе исходный продукт - нативный высушенный млечный сок незрелых плодов папайи невозможно использовать без дополнительной очистки для приготовления других, например мягких, лекарственных форм, содержащих сумму водорастворимых протеолитических ферментов, а использовать для этих целей лиофильно высушенный продукт экономически невыгодно.

В соответствии с этим авторами поставлена задача, направленная на повышение технологичности и экономичности способа с высоким качеством получаемого продукта за счет получения из торгового папаина очищенной суммы водорастворимых протеолитических ферментов в виде сухого экстракта, который в дальнейшем используют для приготовления различных лекарственных форм, что существенно расширяет возможности данного способа.

Для решения этой задачи в способе получения суммы водорастворимых протеолитических ферментов и лекарственных средств на ее основе из высушенного млечного сока незрелых плодов дынного дерева, включающем экстракцию сырья водой при комнатной температуре и перемешивании, разделение твердой и жидкой фаз и выделение очищенного продукта, предложено водное извлечение, полученное после разделения твердой и жидкой фаз дополнительно профильтровывать через фильтр с размером пор 0,45-2,0 мкм, высушивать методом распыления до получения очищенного продукта в виде сухого экстракта с протеолитической активностью не менее 3,5 ПЕ/мг препарата и содержанием белка от 0,43-0,50 мг/мг препарата.

При этом полученный сухой экстракт в виде порошка можно использовать для приготовления раствора для наружного применения или мягких лекарственных форм (мазей, гелей).

В способе получения лекарственного средства на основе полученного сухого экстракта предложено также сухой экстракт с протеолитической активностью не менее 3,5 ПЕ/мг препарата и содержанием белка от 0,43-0,50 мг/мг препарата растворять в воде, затем проводить стерилизирующую фильтрацию и лиофильную сушку раствора.

Способ реализуется следующим образом.

Высушенный млечный сок папайи экстрагируют однократно очищенной водой при комнатной температуре и постоянном перемешивании, при этом соотношение сырье-вода (кг/л) составляет 1:33-37, что позволяет наиболее полно проэкстрагировать весь комплекс водорастворимых протеолитических ферментов из исходного сырья и избежать экстракции других веществ, содержащихся в нем. Затем экстракционную массу, представляющую собой суспензию, отфильтровывают от балластных веществ, не растворимых в воде, дополнительно профильтровывают полученное водное извлечение через фильтр с размером пор 0,45-2,0 мкм для повышения степени микробиологической чистоты и сушат на распылительной сушилке. Сухой продукт просеивают через сито № 23 с целью удаления в нем комков и получения порошка с одинаковым размером частиц. Получают сухой экстракт - очищенную сумму водорастворимых протеолитических ферментов с протеолитической активностью не менее 3,5 ПЕ/мг препарата и содержанием белка от 0,43 до 0,50 мг/мг препарата, т.е. с такими же нормами, что и в готовой лекарственной форме - Карипазиме лиофилизате.

Далее сухой экстракт растворяют в воде для инъекций, фильтруют полученный раствор через стерилизирующий фильтр с размером пор 0,22 мкм, разливают стерильный раствор по 2,0 мл ± 8% (350 ПЕ) во флаконы и лиофильно высушивают. Получают лекарственный препарат «Карипазим лиофилизат для приготовления раствора для наружного применения 350 ПЕ», соответствующий нормативной документации.

Кроме этого, используют сухой экстракт в виде расфасованного порошка для приготовления раствора для наружного применения или для приготовления мягких лекарственных форм.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующим примером.

Пример. 1,0 кг высушенного млечного сока (размер частиц 0,2 мм, потеря в массе при высушивании 7,4%) с протеолитической активностью 3,0 ПЕ/мг препарата и содержанием белка 0,32 мг/мг препарата суспендируют в 3 л очищенной воды до получения однородной суспензии, после чего к концентрированной суспензии папаина в воде добавляют 34 л очищенной воды и ведут экстракцию суммы водорастворимых протеолитических ферментов водой в течение 30 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Соотношение сырье-вода составляет 1:37. Спустя указанное время экстракционную массу, представляющую собой суспензию, отфильтровывают от балластных веществ, не растворимых в воде, через фильтр, заправленный фильтровальным картоном марки «Т». Осадок на фильтре тщательно отжимают, промывают 1,5 л очищенной воды, после чего полученное водное извлечение протеолитических ферментов (34 л) дополнительно профильтровывают через фильтр с размером пор (0,45-2,0) мкм. Получают 33 л отфильтрованного водного извлечения, которое высушивают методом распыления при следующих параметрах процесса:

- скорость подачи извлечения 20-25 л/ч;

- давление сжатого воздуха 5,0-5,5 кгс/см²;

- температура воздуха на входе 120-140°С;

- температура воздуха на выходе 60-75°С.

Высушенный продукт просеивают на капроновом сите № 23. Получают 0,74 кг Прокарипазима экстракта сухого, соответствующего ФСП 42-9123-08, в том числе по микробиологической чистоте (категория 1.2 Б), с выходом 74,0% от массы исходного сырья.

Прокарипазим (0,74 кг) растворяют при перемешивании в 4 л воды для инъекций, добавляют воду до 14 л, перемешивают полученный раствор в течение 20-30 мин, после чего фильтруют через стерилизирующий мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Стерильный раствор 13,5 л разливают по 2,0 мл ± 8% (350 ПЕ) во флаконы и высушивают лиофильно в сублимационной сушилке при следующих параметрах:

- замораживание раствора до температуры минус 35°С и выдерживание при этой температуре в течение двух часов;

- сушка замороженного раствора в глубоком вакууме (15 Па) с постепенным повышением температуры до 0°С в течение 7 часов;

- тепловая сушка в глубоком вакууме при температуре выше 0°С в течение 4-5 часов;

- досушивание при температуре 25-27°С в течение 5-6 часов.

Общая продолжительность сушки составляет 30-32 часа.

Получают 664 флакона по 0,1 г лекарственного препарата «Карипазим лиофилизат для приготовления раствора для наружного применения 350 ПЕ», соответствующего ФСП 42-9225-08, с выходом 89,73% от массы сухого экстракта. Общий выход Карипазима лиофилизата от начала процесса составляет 66,4% от массы исходного сырья.

Использование предлагаемых способов по сравнению с известными обеспечивает следующие преимущества:

- достаточно высокий и стабильный выход очищенной суммы протеолитических ферментов (в виде сухого экстракта), а следовательно, и карипазима лиофилизата;

- получение очищенной суммы протеолитических ферментов с высокой протеолитической активностью и высоким содержанием белка, т.е. с такими же нормами, что и у карипазима лиофилизата;

- очищенная сумма протеолитических ферментов и карипазим лиофилизат в отличие от известных способов содержат тот же комплекс протеолитических ферментов, что и в водном извлечении, т.к. на сушку направляется все водное извлечение, а не продукт, полученный из него, осаждением этанолом;

- стабильные выход и качество карипазима лиофилизата при переработке различных партий папаина, так как для его изготовления используется уже очищенная сумма протеолитических ферментов - Прокарипазим экстракт сухой со стабильным качеством, а не торговый папаин (высушенный млечный сок папайи), содержащий до 40% балластных веществ и микробиологически загрязненный;

- сокращение общей длительности операции приготовления стерильного раствора карипазима за счет растворения и стерилизирующей фильтрации уже очищенного продукта и за счет сокращения объема раствора для стерильной фильтрации, так как можно использовать вдвое более концентрированные растворы очищенной суммы протеолитических ферментов;

- как результат, оперативное ускорение процесса наработки карипазима лиофилизата в зависимости от потребностей рынка;

- схемы получения очищенной суммы протеолитических ферментов и карипазима лиофилизата разведены по помещениям различного класса чистоты, что необходимо с точки зрения проведения различных типов технологических процессов и актуально в свете требований GMP; в результате схемы их становятся более компактными.

- получаемый Прокарипазим экстракт сухой (очищенная сумма водорастворимых ферментов) может использоваться не только для приготовления карипазима лиофилизата, но и в виде порошка для приготовления раствора для наружного применения или для приготовления мягких лекарственных форм (гелей, мазей).

Разработанный способ проверен в промышленных условиях при переработке различных партий сырья папаина и подтвердил вышеописанные результаты. Качество полученных продуктов является стабильным и соответствует нормативной документации на препараты.