состав хлорида натрия для восстановления или разбавления лекарственных препаратов

Формула изобретения

1. Способ получения состава, содержащего Фактор IX для внутривенной инъекции, включающий добавление к лиофилизированному составу, содержащему Фактор IX, от 25 до 150 мМ раствора хлорида натрия с получением состава, подготовленного для внутривенной инъекции, при этом полученный состав является по существу изотоническим по отношению к плазме, или слабо гипотоническим, или слабо гипертоническим по отношению к плазме, и обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов при внутривенном введении.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный состав является по существу изотоническим по отношению к плазме и имеет осмолярность примерно от 270 до 330 мОсм/л.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный состав является слабо гипотоническим по отношению к плазме и имеет осмолярность примерно от 220 до 270 мОсм/л.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный состав является слабо гипертоническим по отношению к плазме и имеет осмолярность примерно от 330 до 600 мОсм/л.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ионная сила полученного состава составляет по меньшей мере примерно 25 мЭкв/л ионов Na ⁺ и Сl^-.

6. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ионная сила полученного состава составляет, по меньшей мере, примерно 30 мЭкв/л ионов Na⁺ и Сl ^-.

7. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ионная сила полученного состава составляет, по меньшей мере, 36 мЭкв/л ионов Na⁺ и Сl^-

8. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ионная сила полученного состава составляет, по меньшей мере, примерно 40 мЭкв/л ионов Na⁺ и Сl^-.

9. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ионная сила полученного состава составляет, по меньшей мере, примерно 40 мЭкв/л ионов Na ⁺ и Сl^- и менее примерно 150 мЭкв/л ионов Na ⁺ и Сl^-.

10. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ионная сила полученного состава соответствует значению электропроводности, составляющему, по меньшей мере, 2,5 мСм/см.

11. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ионная сила полученного состава соответствует значению электропроводности, составляющему, по меньшей мере, 4,0 мСм/см.

12. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанный раствор хлорида натрия имеет концентрацию примерно от 40 до 150 мМ.

13. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанный раствор хлорида натрия имеет концентрацию примерно от 36 до 44 мМ.

14. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанный раствор хлорида натрия имеет концентрацию примерно 40 мМ.

15. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что до добавления раствора хлорида натрия фармацевтический состав не содержит значительного количества ионизирующейся соли.

16. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный лиофилизированный состав при восстановлении его водой содержит не более 5 мМ ионизирующейся соли.

17. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный лиофилизированный состав при восстановлении его водой содержит не более 25 мМ ионизирующейся соли.

18. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что до добавления раствора хлорида натрия указанный состав содержит гистидин, глицин, сахарозу и полисорбат.

19. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что до добавления раствора хлорида натрия указанный состав содержит гистидин, глицин, сахарозу, полисорбат и Фактор IX.

20. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что до добавления раствора хлорида натрия указанный состав при восстановлении его водой содержит:

(a) примерно от 5 до 30 мМ гистидина;

(b) примерно от 0,1 до 0,3 М глицина;

(c) примерно от 0,5 до 2% сахарозы; и

(d) примерно от 0,001 до 0,05% полисорбата.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что до добавления раствора хлорида натрия указанный состав при восстановлении его водой дополнительно содержит:

(e) примерно от 50 МЕ/мл до 2000 МЕ/мл Фактора IX.

22. Способ по п.14, отличающийся тем, что к указанному лиофилизированному составу, содержащему Фактор IX, добавляют 5 мл 40 мМ раствора хлорида натрия.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что объем указанного состава, содержащего Фактор IX, до лиофилизации составляет примерно 4 мл.

24. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанный лиофилизированный состав, содержащий Фактор IX, при восстановлении водой содержит примерно 10 мМ гистидина, 0,26 М глицина, 1% сахарозы, 0,005% полисорбата и Фактор IX.

25. Фармацевтический набор, содержащий:

(a) ампулу, содержащую лиофилизат, при этом при восстановлении указанного лиофилизата с помощью 5 мл воды полученный раствор содержит:

(i) примерно от 5 до 30 мМ гистидина;

(ii) примерно от 0,1 до примерно 0,3 М глицина;

(iii) примерно от 0,5 до 2% сахарозы;

(iv) примерно от 0,001 до 0,05% полисорбата; и

(v) примерно от 50 до 2000 МЕ/мл Фактора IX;

(b) раствор хлорида натрия с концентрацией примерно от 25 до 150 мМ; и

(c) инструкции по восстановлению лиофилизата раствором хлорида натрия, при этом после восстановления полученный раствор является по существу изотоническим и имеет ионную силу, достаточную для предотвращения агрегации эритроцитов при внутривенной инъекции.

26. Фармацевтический набор, содержащий:

(а) ампулу, содержащую лиофилизат, при этом при восстановлении указанного лиофилизата с помощью 4 мл воды полученный раствор содержит:

(i) примерно 10 мМ гистидина;

(ii) примерно 0,26 М глицина;

(iii) примерно 1% сахарозы;

(iv) примерно 0,005% полисорбата 80; и

(v) примерно от 50 до 2000 МЕ/мл Фактора IX;

(b) раствор хлорида натрия с концентрацией примерно 40 мМ; и

(c) инструкции по восстановлению лиофилизата в ампуле с помощью примерно 5 мл раствора хлорида натрия, при этом после восстановления полученный раствор содержит:

(i) примерно от 7 до 9 мМ гистидина;

(ii) примерно от 200 до 210 мМ глицина;

(iii) примерно от 0,7 до 0,9% сахарозы;

(iv) примерно от 0,004% полисорбата 80;

(у) примерно от 50 до 2000 МЕ/мл Фактора IX; и

(vi) примерно 40 мМ NaCl.

Описание изобретения к патенту

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки США номер 60/732221, поданной 1 ноября 2005 г., описание которой включено в настоящее изобретение во всей полноте посредством ссылки.

Все патенты, заявки на патент и публикации, упоминаемые в настоящей заявке, включены в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Полное содержание указанных публикаций включено в настоящую заявку посредством ссылки с тем, чтобы дать более полное представление о существующем уровне техники на дату подачи настоящей заявки с точки зрения специалиста в данной области техники.

Некоторые разделы настоящего документа защищены законом об авторском праве. Правообладатель не возражает против факсимильного воспроизведения данного документа или его частей, в том виде, в котором он представлен в фондах или на носителях Патентного ведомства, однако сохраняет за собой все права на данное изобретение.

При смешении цельной крови с раствором лекарственного препарата, например, в устройстве для внутривенного (IV) введения лекарственного препарата, подходящего для указанного введения, может происходить образование «монетных» столбиков из эритроцитов, или агрегация эритроцитов (также называемая агглютинация красных кровяных телец), если этот раствор лекарственного препарата не обладает достаточной ионной силой. Агрегация эритроцитов наблюдается, например, для 5% раствора декстрозы в воде (обычный раствор для парентерального введения в больших объемах) и для многих других фармацевтических препаратов с низкой ионной силой.

Фармацевтические препараты часто находятся в лиофилизированной форме, поэтому перед парентеральным введением их необходимо восстановить с помощью раствора. Однако, если восстановление лиофилизированных препаратов проводят с помощью растворов с низкой ионной силой, то полученный препарат также может вызывать агрегацию эритроцитов. Несмотря на то, что восстановление лиофилизатов с помощью физиологического раствора (0,9% NaCl), в отличие от стерильной воды для инъекций (sWFI), обеспечивает увеличение ионной силы, полученный раствор лекарственного препарата может быть гипертоническим и при введении оказывать нежелательные побочные эффекты.

Таким образом, необходим раствор, подходящий для восстановления лиофилизатов или разбавления фармацевтических растворов, обеспечивающий получение в результате указанного восстановления или разбавления инъекционного препарата, который является изотоническим по отношению к плазме и обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агрегации эритроцитов.

В настоящем изобретении впервые установлено, что агглютинация эритроцитов обусловлена низкой ионной силой растворов, контактирующих с кровью. Таким образом, если фармацевтические составы приготовлены для внутривенного введения путем восстановления или разбавления растворами с низкой ионной силой, такими как 5% раствор декстрозы, 3% раствор декстрана или стерильная вода для инъекций, то осмолярность полученных препаратов может быть достаточной для того, чтобы раствор препарата был по существу изотоническим по отношению к крови, однако ионная сила указанного раствора зачастую недостаточна для предотвращения агглютинации. С другой стороны, если фармацевтические составы подготовлены для внутривенного введения путем восстановления или разбавления растворами с высокой ионной силой, такими как физиологический раствор (0,9% NaCl или 154 мМ NaCl), то ионная сила полученного препарата может быть достаточной для предотвращения агглютинации, однако его осмолярность может быть такой, что полученный состав может являться гипертоническим по отношению к крови, что приводит к дегидратации красных кровяных телец (red blood cells, RBCs), венозному воспалению и/или может приводить к тромбофлебиту, если такие инъекции делают часто или в течение длительного времени.

Согласно одному из аспектов в настоящем изобретении предложен способ получения фармацевтического состава для внутривенного введения. Указанный способ включает добавление к фармацевтическому составу примерно от 25 мМ до 150 мМ раствора хлорида натрия с получением состава, готового для внутривенного введения, при этом полученный состав является по существу изотоническим по отношению к плазме, или слабо гипотоническим или слабо гипертоническим по отношению к плазме, и при этом ионная сила полученного состава является достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов (или агрегации эритроцитов).

Полученный состав является по существу изотоническим по отношению к плазме, например, если его осмолярность составляет примерно от 270 до 330 мОсм/л. Полученный состав является слабо гипотоническим по отношению к плазме, например, если его осмолярность составляет примерно от 220 до 270 мОсм/л. Полученный состав является слабо гипертоническим по отношению к плазме, например, если его осмолярность составляет примерно от 330 до 600 мОсм/л.

Согласно одному из аспектов полученный состав обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов, если он содержит, например, по меньшей мере примерно 25 мг-экв/л ионов Na⁺ и Cl^-. Согласно другому аспекту полученный состав обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов, если он содержит, например, по меньшей мере примерно 40 мг-экв/л ионов Na⁺ и Cl^-. Согласно другому аспекту полученный состав обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов, если он содержит, например, по меньшей мере примерно 40 мг-экв/л ионов Na⁺ и Cl^-, но менее примерно 150 мг-экв/л ионов Na ⁺ и Cl^-. Согласно другому аспекту полученный состав обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов, если, например, ионная сила указанного раствора соответствует измеренному значению электропроводности, составляющему по меньшей мере примерно 2,5 мСм/см. Согласно другому аспекту полученный состав обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов, если, например, его ионная сила соответствует измеренному значению электропроводности, составляющему по меньшей мере примерно 4,0 мСм/см.

Фармацевтический состав, который должен быть приготовлен для инъекционного введения, может представлять собой, например, состав, не являющийся жидкостью, или состав в виде раствора. Соответственно, состав, не являющийся жидкостью, можно восстановить с помощью раствора хлорида натрия с концентрацией примерно от 25 до 150 мМ, от 25 до 100 мМ, от 25 до 80 мМ, от 25 до 40 мМ, от 25 до 35 мМ, от 25 до 30 мМ или примерно 40 мМ. Соответственно, жидкий состав, или состав в виде раствора, можно разбавить раствором хлорида натрия с концентрацией примерно от 25 до 150 мМ, от 25 до 100 мМ, от 25 до 80 мМ, от 25 до 40 мМ, от 25 до 35 мМ, от 25 до 30 мМ или примерно 40 мМ. Состав, не являющийся жидкостью, может представлять собой, например, лиофилизированный состав.

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения раствор хлорида натрия, который добавляют к фармацевтическому составу, содержит примерно от 40 до 150 мМ хлорида натрия. Согласно одному из аспектов раствор хлорида натрия, который добавляют к фармацевтическому составу, представляет собой по существу раствор хлорида натрия с концентрацией примерно от 40 до 150 мМ. Согласно одному из аспектов раствор хлорида натрия, который добавляют к фармацевтическому составу, содержит примерно 40 мМ хлорида натрия. Согласно одному из аспектов раствор хлорида натрия, который добавляют к фармацевтическому составу, представляет собой по существу раствор хлорида натрия с концентрацией 40 мМ. Согласно одному из аспектов раствор хлорида натрия, который добавляют к фармацевтическому составу, представляет собой по существу раствор, содержащий раствор хлорида натрия с концентрацией примерно 40 мМ±10 мМ.

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения до добавления раствора хлорида натрия фармацевтический состав не содержит значительного количества диссоциирующей соли. Значительным количеством диссоциирующей соли может быть, например, количество более примерно 5 мМ. Согласно другому аспекту значительное количество диссоциирующей соли может составлять, например, количество более примерно 25 мМ. Если фармацевтический состав представляет собой лиофилизированный состав, то указанный состав не содержит значительного количества диссоциирующей соли в случае, если после восстановления водой он содержит, например, не более 5 мМ или 25 мМ диссоциирующей соли.

Согласно одному из аспектов до добавления раствора хлорида натрия фармацевтический состав содержит гистидин, глицин, сахарозу и полисорбат. Согласно другому аспекту до добавления раствора хлорида натрия фармацевтический состав содержит гистидин, глицин, сахарозу, полисорбат и терапевтический белок. Согласно настоящему изобретению указанный терапевтический белок может представлять собой, например, белок, применяемый для лечения нарушений свертываемости крови или при гемостазе, включая без ограничения Фактор VII, Фактор VIII, Фактор IX, Фактор XIII, антитела, аналоги и производные указанных соединений. Согласно другому аспекту до добавления раствора хлорида натрия фармацевтический состав содержит гистидин, глицин, сахарозу, полисорбат и Фактор IX (включая рекомбинантный Фактор IX (rFIX)). Согласно настоящему описанию Фактор IX может включать модифицированные версии Фактора IX, такие как, например, ПЭГилированный Фактор IX, Фактор IX, содержащий слитые белки, например, альбуминсодержащий Фактор IX или Фактор IX, содержащий иммуноглобулин (целый или его домены), и гликозилированный Фактор IX.

Согласно одному из аспектов, где фармацевтический состав представляет собой лиофилизированный состав, этот состав перед добавлением раствора хлорида натрия содержит: (а) примерно от 5 до 30 мМ гистидина; (b) примерно от 0,1 до 0,3 М глицина; (с) примерно от 0,5 до 2% сахарозы; и (d) примерно от 0,001 до 0,05% полисорбата (или примерно от 0,005 до 0,05%), где указанные содержания приведены для состава, восстановленного водой до первоначального объема, т.е. объема состава до лиофилизации. Согласно одному из аспектов указанный состав может дополнительно содержать: (е) примерно от 0,1 до 100 мг/мл или более терапевтического белка, или примерно от 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 МЕ/мл (международных единиц/мл) или более терапевтического белка, где указанные содержания приведены для состава, восстановленного водой. Согласно одному из аспектов указанный состав может дополнительно содержать: (е) примерно от 0,1 до 100 мг/мл или более Фактора IX, или примерно от 0,4 до 20 мг/мл Фактора IX, или примерно от 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 МЕ/мл или более Фактора IX, где указанные содержания приведены для состава, восстановленного водой.

Согласно одному из аспектов в настоящем изобретении предложен способ предотвращения агглютинации эритроцитов, вызванной внутривенным введением. Указанный способ включает восстановление или разбавление фармацевтического состава с помощью примерно от 25 до 150 мМ раствора хлорида натрия, при этом восстановленный или разбавленный фармацевтический состав обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов при внутривенном введении указанного восстановленного или разбавленного фармацевтического состава пациенту.

Согласно одному из аспектов в настоящем изобретении предложен способ подготовки лиофилизированного фармацевтического состава с получением фармацевтического состава, готового для внутривенного введения. Указанный способ включает восстановление лиофилизированного фармацевтического состава с помощью примерно от 25 до 150 мМ раствора хлорида натрия, при этом после восстановления указанный состав обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов, и осмолярностью, соответствующей примерно изотоническому (или слабо гипертоническому, или слабо гипотоническому) раствору.

Согласно одному из аспектов лиофилизированный состав восстанавливают раствором хлорида натрия, при этом объем раствора хлорида натрия, применяемого для восстановления, меньше, чем объем указанного состава до лиофилизации (то есть меньше объема наполнения (fill volume)). Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ уменьшения объема состава, предназначенного для введения.

Согласно одному из аспектов лиофилизированный состав восстанавливают раствором хлорида натрия, при этом объем раствора хлорида натрия, применяемого для восстановления, больше объема указанного состава до лиофилизации (то есть больше объема наполнения). Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ обеспечения изотоничности состава, предназначенного для введения.

Например, лиофилизированный состав может быть восстановлен с помощью раствора хлорида натрия, объем которого больше, чем объем указанного состава до лиофилизации. Например, восстановление осуществляют с помощью 5 мл хлорида натрия, в то время как объем состава до лиофилизации составлял 4 мл. Например, лиофилизированный состав объемом 4 мл, восстановленный с помощью 4 мл воды, представляет собой изотонический раствор, содержащий 10 мМ гистидина, 260 мМ глицина, 1% сахарозы, 0,005% полисорбата, что соответствует осмолярности примерно 300 мОсм/л. Однако если этот лиофилизированный состав восстановить с помощью 4 мл 40 мМ раствора NaCl (80 мОсм/л), то полученный состав будет представлять собой слабо гипертонический раствор (300 мОсм/л + 80 мОсм/л = 380 мОсм/л). Если этот лиофилизированный состав восстановить с помощью 5 мл 40 мМ раствора NaCl, то полученный раствор будет содержать примерно 8 мМ (8 мОсм/л) гистидина, 208 мМ (208 мОсм/л) глицина, 0,8% (24 мОсм/л) сахарозы, 0,004% (пренебрежимо малая осмолярность) полисорбата и 40 мМ (80 мОсм/л) NaCl, что составляет примерно 320 мОсм/л. Таким образом, согласно настоящему изобретению при восстановлении предварительно лиофилизированного состава, который является по существу изотоническим, раствором хлорида натрия, объем которого превышает объем наполнения, полученный раствор также является по существу изотоническим. Другими словами, при восстановлении предварительно лиофилизированного состава, который является по существу изотоническим, раствором хлорида натрия, объем которого меньше или примерно равен объему наполнения, полученный раствор может являться слабо гипертоническим. Чтобы избежать этого, в настоящем изобретении предложен способ обеспечения изотоничности путем восстановления лиофилизированного состава раствором хлорида натрия, объем которого превышает объем указанного состава до лиофилизации.

Согласно одному из аспектов в настоящем изобретении предложен способ обеспечения изотоничности лиофилизированного состава после восстановления. Указанный способ включает восстановление лиофилизированного состава до объема, по меньшей мере на 20% превышающего объем указанного состава до лиофилизации, при этом указанный состав до лиофилизации является по существу изотоническим, и восстановленный состав является по существу изотоническим и обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов. При восстановлении лиофилизированного состава до объема, превышающего объем указанного состава до лиофилизации, вклад осмолярности лиофилизата в осмолярность восстановленного состава снижается прямо пропорционально увеличению объема состава, полученного после восстановления, по сравнению с объемом состава до лиофилизации. Например, при восстановлении состава, тоничность которого до лиофилизации составляла 300 мОсм/л при объеме X, с помощью раствора объемом Y, превышающим на 20% объем X, осмолярность восстановленного раствора объемом Y становится равной 240 мОсм/л вместо исходных 300 мОсм/л (20% снижение осмолярности из-за 20% увеличения объема). Если раствор объемом Y представляет собой раствор хлорида натрия, то вклад раствора хлорида натрия в тоничность равен удвоенной концентрации хлорида натрия в этом растворе. Например, если раствор объемом Y имеет концентрацию 40 мМ, то тоничность восстановленного раствора составляет 240 мОсм/л плюс 80 мОсм/л, и, таким образом, восстановленный раствор является по существу изотоническим и обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов.

Согласно одному из аспектов в настоящем изобретении предложен способ получения лиофилизированного состава на основе Фактора IX для внутривенного введения. Указанный способ включает добавление примерно от 25 до 150 мМ раствора хлорида натрия к лиофилизированному составу Фактора IX с получением состава, готового для внутривенного введения, при этом полученный состав является по существу изотоническим по отношению к плазме, или слабо гипотоническим, или слабо гипертоническим по отношению к плазме, и обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов. Согласно одному из аспектов лиофилизированный состав на основе Фактора IX содержит: (а) примерно от 5 до 30 мМ гистидина; (b) примерно от 0,1 до 0,3 М глицина; (с) примерно от 0,5 до 2% сахарозы; (d) примерно от 0,001 до 0,05% полисорбата; и (е) примерно от 0,4 до 20 мг/мл Фактора IX, или примерно от 0,1 до 100 мг/мл или другое растворимое количество Фактора IX, или примерно от 10 до 500 МЕ/мл Фактора IX, или примерно от 10 до 5000 МЕ/мл Фактора IX, где указанные содержания приведены для состава, восстановленного водой. Согласно одному из аспектов к лиофилизированному составу на основе Фактора IX добавляют примерно 40 мМ раствор хлорида натрия. Согласно одному из аспектов к лиофилизированному составу на основе Фактора IX добавляют примерно 5 мл примерно 40 мМ раствора хлорида натрия. Согласно одному из аспектов лиофилизированный состав на основе Фактора IX содержит примерно 10 мМ гистидина, примерно 0,26 М глицина, примерно 1% сахарозы и примерно 0,005% полисорбата, где указанные содержания приведены для состава, восстановленного водой.

Согласно одному из аспектов в настоящем изобретении предложен фармацевтический набор, содержащий: (а) ампулу, содержащую лиофилизат, раствор которого, полученный путем восстановления указанного лиофилизата примерно 5 мл воды, содержит: (i) примерно от 5 до 30 мМ гистидина; (ii) примерно от 0,1 до 0,3 мМ глицина; (iii) примерно от 0,5 до 2% сахарозы; (iv) примерно от 0,001 до 0,05% полисорбата; и (v) примерно от 0,4 до 20 мг/мл Фактора IX, или примерно от 0,1 до 100 мг/мл или другое растворимое количество Фактора IX, или примерно от 50 до 500 МЕ/мл Фактора IX, или примерно от 10 до 5000 МЕ/мл Фактора IX; (b) примерно от 25 до 150 мМ раствор хлорида натрия; и (с) инструкции по восстановлению лиофилизата раствором хлорида натрия, при этом после восстановления полученный раствор является по существу изотоническим и обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агрегации эритроцитов при внутривенном введении.

Согласно одному из аспектов в настоящем изобретении предложен фармацевтический набор, содержащий: (а) ампулу, содержащую лиофилизат, раствор которого, полученный при восстановлении указанного лиофилизата 4 мл воды, содержит: (i) примерно 10 мМ гистидина; (ii) примерно 0,26 М глицина; (iii) примерно 1% сахарозы; (iv) примерно 0,005% полисорбата 80; и (v) примерно от 50 до 5000 МЕ/мл Фактора IX; (b) примерно 40 мМ раствор хлорида натрия; и (с) инструкции по восстановлению лиофилизата в ампуле с помощью примерно 5 мл примерно 40 мМ раствора хлорида натрия, при этом раствор, полученный после восстановления, содержит: (i) примерно от 7 или 8 примерно до 10 мМ гистидина; (ii) примерно от 200 до 210 мМ глицина; (iii) примерно от 0,7 до 0,9% сахарозы; (iv) примерно 0,004% полисорбата 80; (v) примерно от 50 до 5000 МЕ/мл Фактора IX; и (vi) примерно 40 мМ NaCl.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1 представлены значения оседания эритроцитов, полученные в ходе экспериментов, описанных в Примере 3. Оседание эритроцитов измеряли через 60 минут, используя вариант модифицированного метода Вестергрена (Westergren) (см. Пример 2), согласно которому человеческую кровь, собранную в ЭДТА, смешивали в соотношении 1:4 с исследуемыми растворами. Через 60 минут измеряли расстояние в миллиметрах от нулевой отметки до поверхности раздела эритроциты/плазма. Горизонтальные отрезки представляют среднее значение, а вертикальные скобки - стандартное отклонение для группы из 12 доноров. Результаты были получены в ходе 4-х независимых экспериментов, каждый из которых проводили с использованием крови 3-х доноров.

На Фиг.2 представлена оценка оседания эритроцитов для составов BeneFIX®, восстановленных растворами NaCl. 40 мМ раствора NaCl достаточно для предотвращения агглютинации эритроцитов при восстановлении как выпускаемого в настоящее время продукта BeneFIX®, так и нового состава BeneFIX® (BeneFIX®-R, где до лиофилизации объем раствора составлял 4 мл и раствор содержал 10 мМ гистидина, 260 мМ глицина, 1% сахарозы, 0,005% полисорбата 80; а после лиофилизации указанный раствор был восстановлен в 5 мл 40 мМ хлорида натрия, при этом после восстановления BeneFIX®-R содержал 40 мМ NaCl, 8 мМ гистидина, 208 мМ глицина, 0,8% сахарозы и 0,004% полисорбата).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложены способы получения фармацевтических составов для инъекций (в частности, препаратов, подготовленных для внутривенных инъекций), которые не вызывают агглютинации эритроцитов, гемолиза и/или сжатия клеток. Для предотвращения агглютинации готовый к инъекции фармацевтический состав должен обладать достаточной ионной силой. Для предотвращения гемолиза или сжатия клеток готовый к инъекции фармацевтический состав должен быть по существу изотоническим по отношению к плазме. В настоящем изобретении предложены способы получения фармацевтических составов для инъекций, при этом указанные составы обладают ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации, и тоничностью, необходимой для предотвращения значительного гемолиза или дегидратации или сжатия клеток. Предложенные способы включают использование раствора хлорида натрия с концентрацией примерно от 25 до 150 мМ для восстановления лиофилизатов (или других фармацевтических составов, не являющихся жидкостью), или для разбавления растворов фармацевтических составов. При использовании указанных растворов хлорида натрия для восстановления или разбавления добавление конкретных растворов хлорида натрия обеспечивает получение фармацевтического препарата для инъекций, который является по существу изотоническим по отношению к плазме или крови и обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агрегации эритроцитов при инъекции, в частности, при внутривенной инъекции.

Термины

Согласно настоящему описанию «моляльность» раствора представляет собой число молей растворенного вещества на килограмм растворителя.

Согласно настоящему описанию «молярность» раствора представляет собой число молей растворенного вещества в литре раствора.

Согласно настоящему описанию «осмоль» представляет собой количество вещества, которое, в случае идеального раствора, образует такое количество частиц (число Авогадро), что способно понижать температуру замерзания растворителя на 1,86 K.

Согласно настоящему описанию «осомоляльность» раствора представляет собой число осмолей растворенного вещества на килограмм растворителя. Осмоляльность является мерой количества частиц, присутствующих в растворе, и не зависит от размера или массы этих частиц. Осмоляльность можно измерить только путем измерения свойства раствора, которое зависит только от концентрации частиц. К таким свойствам относятся понижение давления паров, понижение температуры замерзания, повышение температуры кипения и осмотическое давление, именуемые в целом коллигативными свойствами.

Согласно настоящему описанию «осмолярность» раствора представляет собой число осмолей растворенного вещества в литре раствора.

Согласно настоящему описанию «фармацевтический состав», который подготовлен для инъекции, может представлять собой любое лекарственное средство, предназначенное для введению субъекту. Например, фармацевтический состав может представлять собой лиофилизат, раствор, порошок или твердое вещество. Этот состав, если он не находится в жидкой форме, переводят в раствор с помощью раствора NaCl согласно настоящему изобретению. Если состав находится в жидкой форме, то этот состав разбавляют раствором NaCl согласно настоящему изобретению или смешивают с ним.

Ионная сила

Ионная сила является характеристикой раствора электролита (жидкости, содержащей растворенные положительно и отрицательно заряженные ионы). Обычно ее выражают как среднюю величину электростатического взаимодействия между ионами электролита. Ионная сила электролита равна половине суммы произведений моляльности (количества вещества на единицу массы растворителя) каждого из ионов на квадрат его валентности.

Ионная сила тесно связана с концентрацией электролитов и указывает, насколько эффективно заряд, имеющийся на конкретном ионе, экранирован или стабилизирован другими ионами в электролите (так называемая ионная атмосфера). Основным различием между ионной силой и концентрацией электролита является то, что ионная сила возрастает с увеличением заряда ионов. Например, ионная сила раствора полностью диссоциированного (распавшегося на ионы) сульфата магния (Mg²⁺SO ₄ ^2-) в 4 раза превышает ионную силу раствора хлорида натрия (Na⁺Cl^-) той же концентрации. Другим отличием между этими двумя величинами является то, что ионная сила выражает концентрацию свободных ионов, а не просто количество соли, добавленное в раствор. Иногда соль может находиться в растворенном состоянии, но соответствующие ионы могут быть по-прежнему попарно связаны друг с другом наподобие незаряженных молекул в растворе. В этом случае ионная сила будет намного ниже, чем концентрация соли.

Согласно настоящему изобретению фармацевтические препараты для инъекций получают таким образом, чтобы они были не только изотоничными, но также обладали ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации красных кровяных телец. Достаточная ионная сила препарата, готового для инъекции (то есть лиофилизата, восстановленного раствором NaCl согласно настоящему изобретению, или раствора лекарственного средства, разбавленного раствором NaCl согласно настоящему изобретению) может обеспечиваться, например, при содержании ионов Na⁺ и Cl^-, составляющем по меньшей мере примерно 25 миллиграмм-эквивалентов на литр (мЭкв/л). Согласно одному из вариантов реализации достаточная ионная сила обеспечивается при содержании ионов Na⁺ и Сl^-, составляющем по меньшей мере примерно 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или по меньшей мере примерно 40 мЭкв/л.

Ионная сила также может быть выражена через электропроводность раствора. Электропроводность представляет собой способность материала или раствора проводить электрический ток. Принцип, на котором основано инструментальное измерение электропроводности, прост - две пластины помещают в образец, между этими пластинами прикладывают потенциал (обычно синусоидальное напряжение), и измеряют ток. Электропроводность (G), которая обратно пропорциональна сопротивлению (R), определяют на основании значений напряжения и тока по закону Ома: G=I/R=I (амперы)/Е (вольты).

Так как заряд находящихся в растворе ионов облегчает прохождение электрического тока, электропроводность раствора пропорциональна концентрации ионов в растворе. Однако в некоторых случаях электропроводность может не коррелировать прямо с концентрацией. Однако для растворов хлорида натрия электропроводность прямо пропорциональна концентрации ионов. Основной единицей электропроводности является сименс (См), который раньше называли «мо». Так как геометрия испытуемого образца влияет на значение электропроводности, стандартизованные измерения выражаются в единицах удельной электропроводности (См/см), чтобы учесть различия в геометрии электродов. Удельная электропроводность (С) является произведением измеренной электропроводности (G) и постоянной электродной ячейки (L/A), где L представляет собой длину столба жидкости между электродами, а А представляет собой площадь электродов. С=G×(L/A). Если постоянная ячейки равна 1 см^-1, то удельная электропроводность будет равна измеренной электропроводности раствора. Хотя форма электродов может быть различной, электрод всегда можно представить в виде эквивалентной теоретической ячейки.

Таким образом, согласно одному из вариантов реализации достаточная ионная сила препарата, готового для инъекции, может соответствовать электропроводности, равной, например, по меньшей мере примерно 4 мСм/см или выше. Согласно другому варианту реализации достаточная ионная сила раствора, готового для инъекции, соответствует удельной электропроводности, составляющей по меньшей мере примерно 2,5; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9; 3,0; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 3,8 или по меньшей мере примерно 3,9 мСм/см.

Для пояснения термина «достаточная ионная сила» можно также использовать эмпирическое определение, согласно которому раствор обладает достаточной ионной силой, если его ионная сила достаточна для предотвращения агглютинации эритроцитов. Вывод о том, является ли ионная сила достаточной, может быть сделан, например, на основании эксперимента, в ходе которого к цельной крови добавляют испытуемый раствор и определяют расстояние, на которое оседают эритроциты (см. Пример 2; адаптированный модифицированный метод Вестергрена). Согласно одному из вариантов реализации, если при смешении испытуемого раствора с цельной кровью в соотношении 4:1 оседание эритроцитов через 60 минут составляет менее 10 мм (см., например, Пример 2, Фиг.1 и 2), то испытуемый раствор обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов. Согласно другому варианту реализации, если при смешении испытуемого раствора с цельной кровью в соотношении 4:1 оседание эритроцитов через 60 минут составляет менее примерно 5 мм, то испытуемый раствор обладает ионной силой, достаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов.

Осмолярность раствора

Способы согласно настоящему изобретению обеспечивают получение фармацевтических препаратов для инъекций, которые являются по существу изотоническими по отношению к крови. Для того чтобы определить, является ли фармацевтический препарат по существу изотоническим по отношению к крови, рассчитывают осмолярность всех химических компонентов раствора, включая растворитель. Осмолярная концентрация фармацевтических препаратов для инъекций (парентеральных растворов) может оказывать неблагоприятное воздействие на клетки крови и сосуды человеческого тела. Для жидкостей и растворенных или разбавленных лекарственных препаратов можно рассчитать тоничность, которая выражается количеством миллиосмолей на литр жидкости (мОсм/л). Эта величина известна также как осмолярность. Осмолярность крови составляет от 285 до 310 мОсм/л. Если в кровь вводят гипотонические или гипертонические растворы, жидкость переходит внутрь клеток или из них, что может вызвать ряд негативных эффектов.

Осмолярность раствора основана, в частности, на теории осмоса и осмотического давления. Осмос представляет собой диффузию растворенных веществ (растворенных частиц) или перенос жидкости через полунепроницаемые мембраны, такие как стенки сосудов или клеточные мембраны. Осмотическое давление, которое способствует переносу молекул через мембраны, выражают через осмолярную концентрацию и подразделяют на гипоосмотическое (гипотоническое), изоосмотическое (изотоническое) или гиперосмотическое (гипертоническое) по сравнению с биологическими жидкостями, такими как кровь или плазма. Термины «тоничность» и «осмотическое давление» часто являются синонимами.

Осмотическое давление представляет собой гидростатическое (или гидравлическое) давление, необходимое для того, чтобы противостоять движению воды через полунепроницаемую мембрану, возникающее в ответ на «осмотический градиент» (то есть различие концентраций частиц с двух сторон мембраны). Осмоляльность сыворотки крови можно измерить с помощью осмометра, или же ее можно рассчитать как сумму концентраций растворенных веществ, присутствующих в растворе. Величина, измеренная в лабораторных условиях, обычно называется осмоляльностью. Величина, рассчитанная на основании концентраций растворенных веществ, в лаборных отчетах указывается как осмолярность. Осмотическая разность представляет собой разность между этими двумя величинами.

В настоящем описании тоничность и осмотическое давление считают синонимами и трактуют широко. Тоничность может означать эффективную осмоляльность и равна сумме концентраций растворенных веществ в растворе, способном оказывать осмотическое давление на мембрану, включая клеточную мембрану. Строго говоря, осмоляльность является свойством конкретного раствора и не зависит от мембраны. Тоничность представляет собой свойство раствора по отношению к конкретной мембране. Однако настоящее изобретение относится к растворам, которые являются изотоническими по отношению к биологическим растворам, таким как кровь или плазма, что означает, что конкретный раствор является изотоническим с кровью или плазмой по отношению к клеточной мембране клетки, содержащейся в крови или плазме, или в другом биологическом растворе.

Для пояснения указанного термина можно использовать эмпирическое определение тоничности, основанное на результате, наблюдаемом в ходе эксперимента, согласно которому испытуемый раствор добавляют к цельной крови. Если красные кровяные тельца в цельной крови набухают и разрываются, то говорят, что испытуемый раствор является гипотоническим по сравнению с нормальной плазмой. Если красные кровяные тельца сжимаются и становятся зазубренными, то говорят, что испытуемый раствор является гипертоническим по сравнению с нормальной плазмой. Если красные кровяные тельца остаются без изменения, то говорят, что испытуемый раствор является изотоническим относительно плазмы. Клеточная мембрана красных кровяных телец является мембраной сравнения. Например, цельная кровь, помещенная в физиологический раствор (то есть 0,9% раствор хлорида натрия), не набухает, и следовательно, можно сказать, что физиологический раствор является изотоническим.

Характеристики изотонических растворов

В настоящем изобретении предложены способы получения или подготовки фармацевтических составов для инъекций субъекту, при этом указанные составы получают в виде растворов, которые являются (1) по существу изотоническими по отношению к крови (или плазме, или другой биологической жидкости), или же являются не настолько гипертоническими или гипотоническими, чтобы вызывать значительный гемолиз, тромбоз или раздражение сосудов, и (2) обладают ионной силой, достаточной для предотвращения агрегации эритроцитов.

Согласно одному из примеров реализации тоничность или осмолярность изотонических (по отношению к крови) фармацевтических составов, готовых для инъекций, составляет более примерно 270 мОсм/л и менее примерно 330 мОсм/л. Согласно одному из вариантов реализации тоничность или осмолярность изотонических фармацевтических составов, готовых для инъекции, составляет более примерно 270 мОсм/л и менее примерно 328 мОсм/л.

Хотя такие растворы, как 0,9% раствор хлорида натрия и 5% раствор декстрозы, являются изотоническими, при использовании их для восстановления или разбавления многих фармацевтических составов ионная сила полученного раствора может быть недостаточной для предотвращения агглютинации эритроцитов (как в случае 5% раствора декстрозы), или слишком высокой, так что полученный раствор является гипертоническим. Таким образом, согласно способам, предложенным в настоящем изобретении, для разбавления или восстановления используют растворы с минимальным содержанием хлорида натрия с обеспечением (а) ионной силы, достаточной для уменьшения агрегации эритроцитов, и (b) тоничности, достаточной для предотвращения гемолиза, и растворы с максимальным содержанием хлорида натрия с обеспечением (с) суммарной тоничности, которая не настолько велика, чтобы растворы были гипертоническими. Кроме того, способы согласно настоящему изобретению предусматривают использование для разбавления или восстановления растворов, обеспечивающих достаточную ионную силу и изотоничность по отношению к крови, при этом объем указанных растворов позволяет использовать их на практике для получения инъецируемого фармацевтического препарата.

Характеристики гипотонических растворов

В настоящем изобретении предложены способы получения фармацевтических составов для инъекций субъекту, при этом указанные составы получают в виде растворов, которые не являются гипотоническими по отношению к крови, или являются не настолько гипотоническими (то есть являются слабо гипотоническими по отношению к крови), чтобы вызывать значительный гемолиз. Согласно одному из вариантов реализации тоничность или осмолярность фармацевтических составов, готовых для инъекции, являющихся слабо гипотоническими по отношению к крови, может составлять менее примерно 270 мОсм/л и более примерно 240 мОсм/л. Согласно одному из вариантов реализации тоничность или осмолярность фармацевтических составов, готовых для инъекции, являющихся слабо гипотоническими по отношению к крови, может составлять менее примерно 270 мОсм/л и более примерно 220 мОсм/л.

Примеры гипотонических растворов включают многие фармацевтические препараты, подготовленные для инъекции с использованием стерильной воды. При введении гипотонических растворов происходит перемещение жидкости, и вода поступает в эндотелиальные клетки вен и кровяные клетки. Клетки, которые поглощают слишком много воды, могут разрываться и, таким образом, инъекция гипотонических растворов может вызвать раздражение вен, флебит и гемолиз.

Характеристики гипертонических растворов

В настоящем изобретении предложены способы получения фармацевтических препаратов для инъекции субъекту, при этом указанные препараты получают в виде растворов, которые не являются гипертоническими по отношению к крови, или являются не настолько гипертоническими, чтобы вызывать значительный тромбоз и/или раздражение сосудов (то есть являются слабо гипертоническими). Согласно одному из вариантов реализации тоничность или осмолярность фармацевтических составов, готовых для инъекций, являющихся слабо гипертоническими, может составлять более примерно 340 мОсм/л и менее примерно 600 мОсм/л. Согласно одному из вариантов реализации тоничность или осмолярность фармацевтических составов, готовых для инъекции, являющихся слабо гипертоническими, может составлять более примерно 340 и менее примерно 375, 400, 425, 450, 500 или примерно 575 мОсм/л. В целом, тоничность гипертонических растворов составляет более примерно 340 мОсм/л. Растворы с осмолярностью более примерно 600 мОсм/л следует применять для инъекций с осторожностью.

Примеры нежелательных гипертонических растворов включают многие фармацевтические составы, которые подготовлены для инъекций с использованием 10% раствора декстрозы, или фармацевтические препараты, содержащие многочисленные добавки, влияющие на осмолярность. При инъекции гипертонических растворов происходит перемещение жидкости, и вода вытягивается из эндотелиальных клеток вен или клеток крови. Клетки, которые теряют слишком много воды, могут сжиматься, и, таким образом, инъекция гипертонических растворов может вызывать раздражение вен, флебит и тромбоз.

рН

рН крови находится в диапазоне примерно от 7,35 до 7,45, который считается нейтральным. Фармацевтические препараты с рН ниже 7 считаются кислыми лекарственными препаратами, а препараты с рН ниже 4,1 считаются сильно кислыми. Лекарственные препараты, значение рН которых превышает 7,5, считаются основными или щелочными лекарственными препаратами, а препараты со значением рН более 9,0 считаются сильно основными или сильно щелочными. Сильно кислые или сильно щелочные лекарственные препараты могут вызывать флебит и тромбоз. Таким образом, согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложены растворы хлорида натрия для восстановления лиофилизированных лекарственных составов или разбавления жидких лекарственных составов с целью подготовки указанных составов для инъекции, при этом подготовленные для инъекций препараты (1) имеют рН не менее 4,1, и не более 9,0; (2) обладают ионной силой, достаточной для предотвращения агрегации эритроцитов, и (3) являются по существу изотоническими (или слабо гипертоническими, или слабо гипотоническими) по отношению к крови и, таким образом, не вызывают гемолиза или зазубренных очертаний красных кровяных телец. Однако рН раствора не связывают с решением вопроса, является ли ионная сила данного раствора достаточной для предотвращения агрегации эритроцитов. Другими словами, если значение рН лиофилизированного состава при его восстановлении водой составляет менее 4,1 или более 9,0, это не препятствует использованию раствора хлорида натрия для восстановления состава с обеспечением предотвращения агглютинации эритроцитов.

Расчет осмолярности

Осмолярность любого фармацевтического состава можно рассчитать по следующей формуле: осмолярность = (масса вещества (г), деленная на молекулярную массу вещества (г/л)), умноженная на количество частиц, умноженная на 1000 для перевода в миллиосмоли. Термин «частицы» обозначает количество ионов или химических частиц, образующихся при растворении.

Фармацевтические составы, готовые или подготовленные для инъекции

В настоящем изобретении предложены способы перевода в раствор лиофилизированных лекарственных препаратов с целью подготовки указанных лекарственных препаратов для инъекции субъекту. Восстановленный лекарственный препарат готов для инъекции, если он обладает достаточной ионной силой и тоничностью, который является по существу изотонической по отношению к крови.

Способы согласно настоящему изобретению также предусматривают разбавление растворов лекарственных препаратов с целью подготовки указанных растворов лекарственных препаратов для инъекции субъекту. Разбавленные растворы лекарственных препаратов готовы для инъекции, если они обладают достаточной ионной силой и являются по существу изотоническими по отношению к крови.

Согласно одному из вариантов реализации осмолярность лиофилизированного или высушенного лекарственного препарата/состава при его восстановлении водой составляет примерно от 100 до 360 мОсм/л. Поскольку способы восстановления согласно настоящему изобретению предусматривают использование растворов хлорида натрия с концентрацией примерно от 25 до 150 мМ, выбор конкретного раствора хлорида натрия должен осуществляться практикующим врачом на основании предполагаемой суммарной осмолярности лиофилизированного лекарственного препарата, восстановленного указанным раствором хлорида натрия. Таким образом, например, если осмолярность лиофилизированного лекарственного препарата при его восстановлении водой составляет примерно 300 мОсм/л, то раствор NaCl для восстановления должен иметь концентрацию примерно от 25 до 30 мМ. Согласно другому примеру, если осмолярность лиофилизированного лекарственного препарата при его восстановлении водой составляет примерно 100 мОсм/л, то раствор NaCl для восстановления должен иметь концентрацию примерно от 25 до 130 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации лекарственный препарат (лиофилизированный или находящийся в виде раствора), который необходимо подготовить для инъекции по способам согласно настоящему изобретению, не должен содержать гидроксиэтилкрахмал (ГЭК). Содержащие ГЭК составы даже при восстановлении или разбавлении растворами NaCl, обеспечивающими надлежащую ионную силу, могут при проведении экспериментов in vitro вызывать оседание и агглютинацию эритроцитов. Согласно другому варианту реализации лекарственный препарат, который необходимо подготовить для инъекции по способам согласно настоящему изобретению, не содержит декстраны, поскольку исследования с помощью адаптированных модифицированных методов Вестергрена (см. Пример 2) показывают, что добавление NaCl не устраняет повышенную седиментацию, которую может вызывать декстран.

Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложены способы подготовки фармацевтического препарата для внутривенной инъекции, где указанный фармацевтический препарат представляет собой лиофилизат, содержащий исходный наполнитель. Этот исходный наполнитель может быть, например, преимущественно недиссоциирующим. Недиссоциирующие наполнители включают без ограничения маннит, глицин, сахарозу, лактозу, другие дисахариды, терапевтические белки или активный ингредиент самого состава, или же другие наполнители, известные из уровня техники. Концентрация недиссоциирующих наполнителей не оказывает заметного влияния на то, имеет ли раствор ионную силу, достаточную для предотвращения агглютинации. Однако концентрация таких наполнителей оказывает заметное воздействие на осмолярность и, следовательно, может влиять на тоничность. Концентрация глицина, например, эквивалентна его вкладу в осмолярность; таким образом, 10 мМ глицина эквивалентно 10 мОсм/л.

Белковые составляющие в фармацевтических составах, включая активные ингредиенты, не влияют в значительной степени на ионную силу раствора или осмолярность раствора. Например, предположим, что молекулярная масса белка составляет 50000, и в 1-2 мл раствора, предназначенном для инъекции, содержится 2,5 мг белка. Это эквивалентно 0,05 мМ, и, таким образом, белок не вносит заметного вклада в осмолярность.

Фармацевтические препараты часто содержат также поверхностно-активные вещества, например, полисорбат-80. Полисорбат-80 и другие поверхностно-активные вещества представляют собой молекулы с большой молекулярной массой, поэтому количества, в которых они обычно присутствуют в препаратах, например, от 0,001 до 0,01%, слишком малы, чтобы внести заметный вклад в осмолярность или ионную силу. Другие поверхностно-активные вещества включают Brij® 35, Brij® 30, Lubrol-px , Triton X-10, Pluronic® F127 и додецилсульфат натрия (ДСН).

Другими молекулами с большой молекулярной массой, которые могут присутствовать в небольших количествах в фармацевтических составах и не оказывают заметного влияния на осмолярность или степень ионизации, являются полимеры, при условии, что они не представляют собой соли, такие как сульфат декстрана. Примеры таких полимеров включают декстран, поливиниловый спирт (ПВС), гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), желатин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и поливинилпирролидон (ПВП).

Фармацевтические составы также часто содержат сахарозу или другие сахара или многоатомные спирты, часто в количествах от 0 до 2, от 0 до 5 или от 0 до 10% или более. Например, если состав не содержит наполнителя, можно использовать от 5 до 10% сахарозы. В общем случае, если для лиофилизированных составов указано содержание компонентов в процентах или молярных единицах, то указанные содержания относятся к молярности и процентному составу раствора до лиофилизации (то есть к содержанию компонентов в составе наполнения (fill amounts)). Таким образом, если раствор содержит 1% сахарозы, это эквивалентно 29,2 мМ. Поскольку сахароза не ионизируется или не диссоциирует в растворе в заметной степени, 29 мМ сахарозы эквивалентно 29 мОсм/л. Примерами других сахаров или многоатомных спиртов, которые не ионизируются или не диссоциируют в растворе в заметной степени, являются глицерин, ксилит, сорбит, маннит (который также может использоваться в качестве наполнителя), глюкоза, инозит, рафиноза, мальтотриоза, лактоза и трегалоза.

Фармацевтические составы могут также содержать буферные агенты. Буферные агенты включают, например, ацетат, цитрат, глицин, гистидин, фосфат (натрия или калия), диэтаноламин и Трис. Буферные агенты включают агенты, которые поддерживают рН раствора в заданном диапазоне. Такие буферные агенты, как глицин, гистидин и диэтаноламин, в основном не ионизируются и, таким образом, их концентрации эквивалентны осмолярности, что необходимо учитывать при решении вопроса о том, является ли подготовленный для инъекции состав по существу изотоническим. Такие буферные агенты, как ацетат и цитрат, обычно являются солями и, следовательно, ионизируются, и их концентрации умножаются при расчете их вклада в осмолярность раствора.

Фармацевтические составы могут включать по существу любые активные ингредиенты, включая белки, нуклеиновые кислоты, вирусы и химические соединения. Эти молекулы в основном не оказывают заметного влияния на ионную силу или осмолярность раствора для инъекции. Если эти молекулы представляют собой соли, поскольку часто соединения, молекулы которых являются небольшими, представляют собой фармацевтические соли, то они могут оказывать заметное влияние на ионную силу и/или осмолярность.

Некоторые аминокислоты также входят в некоторые фармацевтические составы, и их используют в качестве криопротекторов, лиопротекторов и/или наполнителей. Некоторые аминокислоты, такие как гистидин, в основном не ионизируются, и, таким образом, концентрацию аминокислот в составе следует учитывать только при расчете осмолярности раствора с тем, чтобы обеспечить изотоничность готового для инъекции состава по отношению к крови.

BeneFIX®

BeneFIX® получают с помощью генной инженерии из клеточной линии яичников китайского хомячка, которая была подробно изучена и для которой было показано, что она не содержит инфекционных агентов. При этом банк клеток не содержит продуктов на основе крови или плазмы. Клеточная линия яичников китайского хомячка выделяет рекомбинантный Фактор IX (rFIX) в определенную среду для культуры клеток, которая не содержит никаких белков, производных от белков животного или человека, и этот рекомбинантный Фактор IX очищают методом хроматографической очистки, который не требует стадии моноклональных антител и обеспечивает получение активного продукта высокой чистоты. Для дополнительной защиты от вирусов включают стадию фильтрации через мембрану, которая способна задерживать молекулы с кажущейся молекулярной массой >70000 (такие как большие белки и вирусные частицы). Согласно данным, полученным с помощью метода электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, BeneFIX® преимущественно является единственным компонентом. Активность (в международных единицах, ME) определяют с использованием проводимого in vitro одноступенчатого эксперимента по свертыванию в соответствии с Международным Стандартом Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) (World Health Organization (WHO)) для концентрата Фактора IX. Одна международная единица представляет собой меру активности Фактора IX, содержащегося в 1 мл смешанной нормальной человеческой плазмы. Удельная активность BeneFIX® превышает или равна 180 ME на миллиграмм протеина. BeneFIX® не получают из человеческой крови, и он не содержит консервантов или добавок, полученных из компонентов материалов животных или человека.

BeneFIX® выпускают в виде стерильного непирогенного лиофилизата в виде порошка. BeneFIX® предназначен для внутривенных (IV) инъекций. Он выпускается в виде одноразовых ампул, содержащих указанное на этикетке количество активного компонента - Фактора IX, выраженное в международных единицах (ME). Каждая ампула содержит, например, 250, 500 или 1000 ME (или более, включая 2000 ME) коагуляционного Фактора IX (рекомбинантного). После восстановления лиофилизированного лекарственного препарата стерильной водой, концентрации наполнителей в дозированных формах, содержащих 500 и 1000 ME, составляют 10 мМ L-гистидина, 1% сахарозы, 260 мМ глицина, 0,005% полисорбата-80. В дозированных формах, содержащих 250 ME, указанные концентрации после восстановления составляют половину от концентраций в двух других дозированных формах. Дозированные формы, содержащие 500 и 1000 ME, являются изотоническими после восстановления, а тоничность дозированной формы, содержащей 250 ME, после восстановления в два раза меньше тоничности двух других дозированных форм. После восстановления каждой из дозированных форм получается прозрачный бесцветный раствор.

Согласно одному из вариантов реализации в настоящем изобретении предложены способы подготовки BeneFIX®, предназначенного для инъекционного введения субъекту, согласно которым BeneFIX® восстанавливают раствором хлорида натрия, при этом концентрация указанного раствора хлорида натрия составляет более примерно 25 мМ и менее примерно 150 мМ. Согласно одному из вариантов реализации концентрация раствора хлорида натрия, применяемого для восстановления BeneFIX®, составляет примерно 40 мМ. Согласно одному из вариантов реализации для восстановления одной ампулы лиофилизированного BeneFIX® используют примерно от 4 до 5 мл раствора хлорида натрия с концентрацией от 25 до 150 мМ.

BeneFIX® модифицированного состава (BeneFIX®-R)

Вследствие того, что при восстановлении водой ионная сила BeneFIX® является низкой, были приготовлены различные модифицированные составы (BeneFIX® новой рецептуры, BeneFIX®-R). Указанные модификации были предприняты с целью обеспечения достаточной ионной силы состава BeneFIX®, чтобы снизить возможность агглютинации красных кровяных телец. Для увеличения ионной силы BeneFIX® можно заменить стерильную воду в восстановленном продукте нового состава, используемую в качестве раствора для восстановления, на хлорид натрия. Альтернативно можно улучшить состав BeneFIX® путем добавления NaCl к предварительно лиофилизированному составу; в этом случае восстановление по-прежнему можно проводить водой, однако получение лиофилизированных солевых растворов солей является более сложным, и на практике проще восстанавливать лиофилизата растворами NaCl. Это справедливо также для других лиофилизированных фармацевтических препаратов, которые при восстановлении стерильной водой для инъекций не обладают достаточной ионной силой для предотвращения агглютинации.

Согласно одному из вариантов реализации лиофилизации может быть подвергнут BeneFIX-R того же состава, что и BeneFIX® (10 мМ L-гистидина, 260 мМ глицина, 1% сахарозы, 0,005% полисорбата 80), при этом указанные составы будут различаться только концентрацией рекомбинантного Фактора IX (rFIX). Затем полученный лекарственный препарат может быть помещен, например, в 4 мл ампулу совместно с 10 мМ L-гистидина, 260 мМ глицина, 1% сахарозы, 0,005% полисорбата 80, и лиофилизирован. При восстановлении BeneFIX-R с помощью 5 мл 25-150 мМ раствора NaCl на ампулу, например, 40 мМ NaCl, концентрация наполнителей снижается на 20% по сравнению с составом BeneFIX-R до лиофилизации. Данный способ обеспечивает получение состава, который является (1) изотоническим, (2) обладает ионной силой, достаточной для снижения возможности агглютинации красных кровяных телец, и (3) обеспечивает уменьшение инъецируемого объема в случае более высоких доз rFIX. Можно получить BeneFIX®-R, например, в дозированных формах, содержащих 250, 500, 1000 и 2000 ME rFIX на ампулу. Таким образом, после восстановления с помощью 5 мл 25-150 мМ раствора NaCl полученный раствор BeneFIX®-R может содержать примерно от 7 до 9 мМ гистидина; примерно из от 188 до 220 мМ глицина; примерно от 0,7 до 0,9% сахарозы; и примерно 0,004% полисорбата 80. В зависимости от содержания rFIX в ампуле, например, 250, 500, 1000 или 2000 ME, после восстановления с помощью 5 мл раствора NaCl концентрация rFIX может составлять примерно 50, 100, 200 или 400 МЕ/мл, соответственно. Осмолярность состава BeneFIX®-R, восстановленного в 5 мл 40 мМ раствора NaCl, составляет примерно 320 мОсм/л.

Примеры составов, подготавливаемых для инъекции

Рекомбинантный фактор IX также можно лиофилизировать в виде составов, предложенных в патенте США № 6372716, включенного в настоящее изобретение посредством ссылки. Составы согласно указанному патенту можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, при этом указанные составы не ограничиваются лишь составами, содержащими в качестве активного ингредиента rFIX. Таким образом, например, лиофилизированные составы, которые могут быть восстановлены с помощью растворов хлорида натрия 25-150 мМ с целью их подготовки для инъекции, включают составы, содержащие глицин, полисорбат, сахарозу, гистидин и активный ингредиент. Этот активный ингредиент может представлять собой по существу, например, любой белок, вирус, нуклеиновую кислоту или химическое соединение. Концентрация глицина может составлять, например, примерно от 0,1 М до 0,3 М. Концентрация полисорбата может составлять, например, примерно от 0,001 до 0,05%. Концентрация сахарозы может составлять, например, примерно от 0,5 до 2%. Концентрация гистидина может составлять, например, примерно от 5 до 30 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации лиофилизированный состав, который восстанавливают 25-150 мМ раствором хлорида натрия, содержит примерно от 0,1 до 0,3 М глицина, примерно от 0,5 до 2% сахарозы, примерно от 0,001 до 0,05% полисорбата, примерно от 5 до 30 мМ гистидина и примерно от 0,1 до 20 мг/мл активного ингредиента. Этим активным ингредиентом может быть, например, rFIX. Согласно другому варианту реализации лиофилизированный состав, содержащий rFIX, который подвергают восстановлению 25-150 мМ раствором хлорида натрия, содержит примерно от 0,13 до 3 мг/мл rFIX или примерно от 50 до 600 МЕ/мл rFIX, примерно 0,26 М глицина, примерно 10 мМ гистидина, примерно 1% сахарозы и примерно 0,005% полисорбата.

ПРИМЕРЫ

Представленные ниже примеры приведены для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1: Влияние анти-коагулянтов и компонентов состава на вызываемую BeneFIX® агглютинацию красных кровяных телец

Время от времени появляются сообщения о вызываемой BeneFIX® агглютинации красных кровяных телец в катетерах-бабочках или в шприцах. Последние исследования крови страдающих гемофилией собак показывают, что агглютинация происходит в отсутствие рекомбинантного человеческого FIX во входящем в состав буфере. Таким образом, в настоящем исследование изучается влияние стандартных анти-коагулянтов, различных компонентов BeneFIX® и ионной силы на вызываемую BeneFIX® агглютинацию.

Кровь была получена из общего банка от анонимных волонтеров-людей, и ее отбирали в трубки Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), содержащие стандартный антикоагулянт, например, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), цитрат натрия или гепарин.

Для исследования агглютинации образцы крови в трубках Vacutainer сначала непрерывно перемешивали на качалке. Кровь, 12,5 мкл, разбавляли в 87,5 мкл испытуемого раствора на культуральном планшете с 48 лунками и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 минут перед проведением наблюдения с помощью микроскопа с контрастом по инверсионной фазе с 400-кратным увеличением. Каждую лунку фиксировали с помощью видеозаписи, чтобы зафиксировать изображение для подсчета агглютинации красных кровяных телец в соответствии с критериями, приведенными ниже в Таблице 1.

Влияние стандартных анти-коагулянтов на агглютинацию красных кровяных телец: Первое исследование включало оценку образцов крови, взятой от трех доноров. Кровь от каждого донора собирали в пробирки Vacutainer с ЭДТА, гепарином и цитратом натрия. Предмет испытания включал BeneFIX®, 100 МЕ/мл, восстановленный с помощью растворов NaCl с каждой из следующих концентраций: 0 мМ (стерильная вода для инъекций), 20 мМ, 40 мМ, 60 мМ и 77 мМ NaCl. Кроме того, в качестве позитивного контроля включили 5% раствор декстрозы в воде (D5W). Образцы разбавляли в соотношении кровь:BeneFIX® или кровь:(D5W) 1:8. Изображения были получены, сохранены в числовом формате, масштабированы и оценены численно по отношению к агглютинации. Через две минуты после добавления крови к BeneFIX®, восстановленного стерильной водой для инъекций, можно было наблюдать агглютинацию в образцах, полученных от каждого из трех доноров, невзирая на тип использованного анти-коагулянта. По мере того, как использовали возрастающие концентрации NaCl, агглютинация уменьшалась. Заметную агглютинацию можно было наблюдать при добавлении крови к D5W.

Влияние NaCl на агглютинацию красных кровяных телец у предварительно отобранных доноров: Взятые от доноров образцы были собраны в гепаринизированные пробирки Vacutainer. Поскольку в некоторых предшествующих образцах наблюдали спонтанную агглютинацию, всех доноров сначала протестировали с использованием 154 мМ NaCl. Если наблюдали агглютинацию, данный образец не допускали к последующим исследованиям. Оставшиеся образцы от каждого донора разбавляли в соотношении 1:8 одним из двух составов: (1) 100 МЕ/мл BeneFIX®, восстановленным стерильной водой для инъекций, и (2) 100 МЕ/мл BeneFIX®, восстановленным 154 мМ NaCl. Изображения были получены, сохранены в числовом формате, масштабированы и оценены численно в отношении агглютинации. Агглютинация наблюдалась в случае BeneFIX®, восстановленного стерильной водой для инъекций, в то время как восстановление 154 мМ NaCl снижает или подавляет возникновение агглютинации (см. Таблицу 2 для численной оценки).

Влияние компонентов состава и концентрации BeneFIX®: Несколько составов BeneFIX® исследовались для определения влияния различных компонентов на агглютинацию красных кровяных телец. Были приготовлены восемь различных смесей, с 154 мМ NaCl и без него, всего 16 смесей (Таблица 3). Двенадцать доноров были проверены на спонтанную агглютинацию, и два были отстранены от дальнейшего участия в исследовании. Для первых 8 составов (образцы с 1-А по 1-Н) были использованы образцы крови от оставшихся доноров с 5 по 10, а для вторых 8 составов (образцы с 2-I по 2-Р) были использованы образцы от остальных пяти доноров. Образцы разбавляли 1:8, как и раньше, и изображения были получены и оценены, как это было описано ранее.

Таблица 3
Матрица формирования составов (+/- указывает на присутствие/отсутствие какого-либо ингредиента)
Идентификационный номер набора/образ ца	Концентрация BeneFIX® (МЕ/мл)	Глицин (GLY) 260 мМ	Сахароза 10 мг/мл	Tween-80 (Полисорбат-80) 0,005%	Гистидин (HIS) 10 мМ	NaCl 154 мМ
1-А, BeneFIX®	100	+	+	+	+	-
1-В, BeneFIX®	100	+	+	+	+	+
1-С, BeneFIX®	300	+	+	+	+	-
1-D, BeneFIX®	300	+	+	+	+	+
1-Е, BeneFIX®	600	+	+	+	+	-
1-F, BeneFIX®	600	+	+	+	+	+
1-G, отсутствие BeneFIX®	-	+	+	+	+	-
1-H, отсутствие BeneFIX®	-	+	+	+	+	+
2-I, BeneFIX®, отсутствие GLY	100	-	+	+	+	-
2-J, BeneFIX®, отсутствие GLY	100	-	+	+	+	+
2-K, отсутствие сахарозы	100	+	-	+	+	-
2-L, отсутствие сахарозы	100	+	-	+	+	+
2-М, BeneFIX®, отсутствие Tween-80	100	+	+	-	+	-
2-N, отсутствие Tween-80	100	+	+	-	+	+
2-O, BeneFIX®, отсутствие HIS	100	+	+	+	-	-
2-P, BeneFIX®, отсутствие HIS	100	+	+	+	-	+

Численная оценка агглютинации для эксперимента, изложенного в Таблице 3, приведена ниже в Таблицах 4А и 4В. Ни один из конкретных компонентов (активное вещество или наполнитель) препарата BeneFIX® не был связан с агглютинацией. Как и предполагалось, удаление глицина вызывало распад красных кровяных телец из-за гипотоничности раствора. Однако восстановление с помощью 154 мМ NaCl снижает или устраняет in vitro агглютинацию и распад.

Таблица 4А
Численная оценка агглютинации - Изменение концентрации BeneFIX®
ID донора	1-А	1-В	1-С	1-D	1-Е	1-F	1-G	1-Н
6	4	1	2	1	4	1	3	2
14	3	0	2	3	3	1	2	4
19	4	1	3	0	3	1	3	1
40	1	0	2	1	2	2	3	1
43	3	0	3	1	4	0	3	3
Среднее значение	3	0,4	2,4	1,2	3,2	1	2,8	2,2
Таблица 4В
Численная оценка агглютинации - влияние наполнителей
ID донора	2-I	2-J	2-K	2-L	2-М	2-N	2-O	2-Р
1	Распад	1	2	0	3	1	3	0
11	4	0	4	1	3	1	2	0
18	Распад	1	4	1	3	2	3	2
34	Распад	0	2	0	2	2	3	2
45	Распад	1	4	1	4	3	2	3
Среднее значение	Распад	0,6	3,2	0,6	3	1,8	2,6	1,4

Влияние пониженных концентраций NaCl на агглютинацию красных кровяных телец у предварительно отобранных доноров: Образцы крови доноров были отобраны в пробирки Vacutainer с гепарином. Поскольку в некоторых предшествующих пробах наблюдали агглютинацию, образцы крови от каждого донора сначала проверяли с использованием 154 мМ NaCl. Если наблюдали агглютинацию, эту пробу исключали из дальнейшего исследования. Оставшиеся образцы от каждого донора разбавляли 1:8, как и раньше, одним из трех составов: (1) 100 МЕ/мл BeneFIX® со стерильной водой для инъекций; (2) 100 МЕ/мл BeneFIX® с 40 мМ NaCl; (3) 100 МЕ/мл BeneFIX® с 77 мМ NaCl. Изображения были получены, собраны и численно оценены, как и раньше. Результаты приведены ниже в Таблице 5. Агглютинация наблюдалась для всех пяти проб с BeneFIX®, восстановленным водой, в то время как восстановление BeneFIX® с помощью 40 мМ или 77 мМ NaCl снижало или подавляло возникновение агглютинации.

Таблица 5
Численная оценка агглютинации
№ донора	NaCl	BeneFIX® + стерильная вода для инъекций	BeneFIX® + 40 мМ NaCl	BeneFIX® + 77 мМ NaCl
8	0	3	1	2
34	0	3	2	1
39	0	4	3	1
40	0	3	0	1
47	0	3	1	1
Среднее значение	0	3,2	1,4	1,2

Анализ: Агглютинация красных кровяных телец происходит в крови с анти-коагулянтами: гепарином, ЭДТА или цитратом натрия при смешивании с BeneFIX® при соотношении крови и восстановленного BeneFIX®, равном 1:8. Не было установлено наличия влияния типа анти-коагулянта на агглютинацию; таким образом, при последующих оценках в качестве анти-коагулянта применяли гепарин. В некоторых пробах агглютинация происходила в присутствии только 0,9% NaCl (отрицательный контроль для агглютинации). Следовательно, последующие оценки проводили только с пробами, которые не давали агглютинации с контрольным 0,9% NaCl.

Затем проводили оценку влияния на агглютинацию красных кровяных телец при смешивании с кровью, содержащей в качестве анти-коагулянта гепарин, при объемном соотношении крови и BeneFIX®, равном 1:8, для трех концентраций BeneFIX® (100, 300 или 600 МЕ/мл) и каждого индивидуального компонента BeneFIX®, восстановленного стерильной водой для инъекций или раствором NaCl. Устранение любого конкретного компонента, включая рекомбинантный человеческий FIX белок, не оказывало влияния на агглютинацию. Это указывает на то, что широкий диапазон различных фармацевтических составов можно подготовить (восстановить или разбавить) для внутривенного введения с помощью растворов NaCl. Удаление глицина приводило к распаду красных кровяных телец. Однако использование 40 мМ (0,234% NaCl, подходящего для инъекций), 77 мМ (0,45% NaCl, подходящего для инъекций) или 154 мМ NaCl (0,9% NaCl, подходящего для инъекций) для восстановления снижает или устраняет агглютинацию и распад.

Таким образом, полученные результаты показывают, что ни один из конкретных компонентов состава BeneFIX® не связан с наблюдаемой агглютинацией. Хотя устранение глицина из состава BeneFIX® и восстановление водой приводит к образованию гипотонического раствора, который вызывает распад, осмолярность и тоничность явным образом связаны с ионной силой и агглютинацией. Эти результаты показывают, что агглютинация связана с низкой ионной силой восстановленного стерильной водой для инъекций рекомбинантного Фактора IX (rFIX), а восстановление с помощью NaCl ослабляет или устраняет агглютинацию. Таким образом, восстановление других фармацевтических составов растворами NaCl, даже если эти растворы имеют концентрацию ниже, чем 154 мМ, может предотвратить как агглютинацию, так и распад при внутривенном введении.

Пример 2: Применение модифицированного способа Вестергрена для измерения скорости оседания эритроцитов для оценки агрегации эритроцитов, вызванной фармацевтическими агентами или составами

Выпускаемый в настоящее время состав BeneFIX® является неионным составом. При введении этого состава BeneFIX®, восстановленного стерильной водой для инъекций, имели место редкие случаи агрегации эритроцитов (то есть агглютинации) при смешении крови пациента с восстановленным BeneFIX®, как это происходит при внутривенных вливаниях. В настоящем изобретении впервые установлен тот факт, что агрегация эритроцитов связана с составом, а не с rFIX, и ее можно избежать при использовании разбавителей, которые содержат по меньшей мере примерно 40 мМ NaCl. Для того чтобы помочь в составлении обычных разбавителей, содержащих по меньшей мере около 40 мМ NaCl, была разработана методика оценки оседания эритроцитов, которую можно использовать для оценки агрегации эритроцитов in vitro. Модифицированный метод Вестергрена, согласно которому кровь разбавляют в соотношении 4:5 физиологическим раствором, был адаптирован для оценки агрегации в крови, разбавленной 1:4 или 1:8 либо физиологическим раствором, либо испытуемыми растворами (то есть полученными разбавителями).

Человеческая кровь была получена от здоровых взрослых добровольцев и собрана в пробирки, содержащие ЭДТА. Для того чтобы продемонстрировать пригодность проб крови изучения оседания, была измерена клинически определяемая скорость оседания эритроцитов СОЭ₆₀ с помощью модифицированного метода Вестергрена. Описывая кратко, хорошо перемешанную кровь разбавляли 4:5 154 мМ раствором NaCl, тщательно, но не интенсивно перемешивали, а затем немедленно помещали в пробирку Вестергрена с автоматически устанавливаемым нулем, которую помещали в специально изготовленный штатив на 10 пробирок. Измеряли и записывали расстояние в мм от нулевой отметки в верхней части пробирки до поверхности раздела плазма:эритроциты через 60 минут. Эти результаты СОЭ₆₀ сравнивали с опубликованными нормальными сравнительными величинами (Morris, M.W. et al., Basic examination of blood, in Henry, J.В., ed., Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia, PA, WB Saunders, 2001: 479-519).

Были проведены два эксперимента, чтобы показать пригодность адаптированного, модифицированного метода Вестергрена для оценки агрегации эритроцитов, связанной с фармацевтическими составами. Пробы человеческой крови подходили для использования в этих оценках, поскольку все они имели значения СОЭ₆₀, которые находились в пределах нормальных значений. Эти пробы разбавляли 1:4 в первом эксперименте и 1:8 во втором.

В первом эксперименте оседание эритроцитов было повышено 5% декстраном 70 или BeneFIX®, восстановленным стерильной водой для инъекций или 10 мМ NaCl. В пределах 5 минут в пробирках, в которые была налита кровь, разбавленная или 3% декстраном 70, или BeneFIX®, восстановленным стерильной водой для инъекций, наблюдали агрегаты. Через 60 минут в этих пробирках наблюдалось большее оседание эритроцитов, чем в контрольном опыте с физиологическим раствором (Таблица 6). Через 90 минут кровь от одного донора, которая была разбавлена BeneFIX®, восстановленным 10 мМ NaCl, имела двухфазную картину оседания с явной поверхностью раздела эритроциты: плазма, расположенной в 8 мм от нулевой отметки, и другую поверхность раздела между плотноупакованными и менее плотноупакованными эритроцитами, расположенную в 149 мм от нулевой отметки.

Таблица 6
Осаждение эритроцитов человеческой крови, разбавленной 1:4 BeneFIX® или 3% декстраном (Данные по седиментации в мм, измеренной от нулевой отметки)
Донор и время с момента разбавления	Физ. раствор	0 мМ NaCl	10 мМ NaCl	20 мМ NaCl	30 мМ NaCl	40 мМ NaCl	50 мМ NaCl	60 мМ NaCl	77 мМ NaCl	154 мМ NaCl	3% декстран 70
Донор 5
60 мин	2	135	н/о	2	2	2	1	1	2	1	132
90 мин	3	145	н/о	4	3	3	3	2	2	2	159
120 мин	4	150	н/о	5	4	4	4	3	4	3	167
150 мин	6	153	н/о	7	6	5	5	5	5	5	169
Донор 22
60 мин	0	161	4	3	0	0	0	0	0	н/о	145
90 мин	3	164	149	3	3	3	2	2	3	н/о	166
120 мин	4	166	151	6	4	4	4	3	4	н/о	171
150 мин	7	167	152	8	6	5	5	5	6	н/о	172
Концентрации растворов NaCl те же, что и при восстановлении BeneFIX®

Во втором эксперименте оседание эритроцитов было повышено 5% декстрозой, "MFR-927" (буферный состав для BeneFIX®, не содержащий rFIX), и BeneFIX®, восстановленным 10 мМ NaCl (Таблица 7). В отличие от первого эксперимента, оседание в этих пробирках было быстрым, и максимальное или близкое к максимальному оседание достигалось в течение от 15 до 30 минут.

Результаты этих экспериментов показывают, что модифицированный метод Вестергрена, используемый для измерения оседания эритроцитов, можно адаптировать для оценки агрегации эритроцитов, вызванной фармацевтическими препаратами или составами. Например, измерение оседания эритроцитов в пробирках Вестергрена через 60 минут после помещения в них крови, разбавленной 1:4 испытуемыми растворами, является подходящим для выявления агентов, которые увеличивают агрегацию (то есть 5% декстроза, 3% декстран 70, MFR-927 и BeneFIX®, восстановленный стерильной водой для инъекций), и агентов, не вызывающих увеличения агрегации (то есть физиологический раствор и BeneFIX®, восстановленный разбавителями, содержащими примерно 25 мМ или более NaCl).

Таблица 7
Оседание эритроцитов человеческой крови, разбавленной 1:8 MFR-927, BeneFIX® или 5% декстрозой (Расстояние оседания в мм, измеренное от нулевой отметки)
Донор и время разбавления	Физ. раствор	MFR-927	10 мМ NaCl	25 мМ NaCl	30 мМ NaCl	40 мМ NaCl	50 мМ NaCl	60 мМ NaCl	77 мМ NaCl	5% декстроза
Донор 56	0
15 мин	0	>180	~155	1	0	0	0	0	0	175
30 мин	1	>180	177	2	1	0	0	0	0	178
45 мин	2	>180	180	3	2	1	1	1	1	179
60 мин		>180	>180	3	2	1	1	1	1	180
Донор 57
15 мин	0	>180	180	1	1	0	0	0	0	179
30 мин	1	>180	>180	2	2	1	0	1	1	>180
45 мин	1	>180	>180	3	3	1	2	1	1	>180
60 мин	2	>180	>180	4	3	2	3	2	2	>180
Концентрации NaCl представляют собой концентрации, применяемые для восстановления BeneFIX®; MFR-927 представляет собой буферный состав для BeneFIX®, который не содержит rFIX.

Пример 3: Достаточность содержания 40 мМ NaCl в разбавителе для BeneFIX® с измененным составом для уменьшения агрегации эритроцитов, вызываемой применением состава

Неионный состав выпускаемого в настоящее время BeneFIX® связывают с агрегацией эритроцитов in vitro, которая происходит при смешении крови пациента с BeneFIX® при внутривенном введении. В настоящем изобретении впервые установлен тот факт, что агрегация эритроцитов связана с составом, а не с рекомбинантным фактором IX, и агрегации можно избежать путем восстановления влагосодержания BeneFIX® разбавителями, которые содержат по меньшей мере 40 мМ NaCl.

Целью данного Примера является исследование надежности 40 мМ разбавителя для восстановления препаратов BeneFIX® с измененным составом (BeneFIX®-R). Конкретно, эксперименты были спланированы так, чтобы определить, являются ли концентрации NaCl, которые отклоняются от 40 мМ более, чем на 10%, достаточными для предотвращения вызываемой составом агрегации эритроцитов, что оценивалось с помощью адаптированного модифицированного метода Вестергрена для измерения скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Кроме того, надежность влияния концентрации NaCl на оседание эритроцитов оценивали как для ампул с большим содержанием BeneFIX®-R (то есть 2000 ME), так и для ампул с низким содержанием BeneFIX®-R (то есть 250 ME).

Влияние составов BeneFIX®-R, MFR-927 и 3% декстрана 70 на оседание эритроцитов исследовали при комнатной температуре с использованием варианта модифицированного метода Вестергрена, как это описано в Примере 2. План эксперимента приведен в Таблице 8.

Таблица 8
План эксперимента согласно Примеру 3
Группа	Обработка	Кол-во экспериментов	Общее кол-во исследуемых проб от доноров	Разбавление исследуемой крови
1	Физ. раствор	4	12	1:4
2	MFR-927	4	12	1:4
3	BeneFIX®-R (55 IU/мл); 36 мМ NaCl	4	12	1:4
4	BeneFIX®-R (55 IU/мл); 40 мМ NaCl	4	12	1:4
5	BeneFIX®-R (55 IU/мл); 44 мМ NaCl	4	12	1:4
6	BeneFIX®-R (440 IU/мл); 36 мМ NaCl	4	12	1:4
7	BeneFIX®-R (440 IU/мл); 40 мМ NaCl	4	12	1:4
8	BeneFIX®-R (440 IU/мл); 44 мМ NaCl	4	12	1:4
9	3% декстран 70	4	12	1:4

В ходе эксперимента, проводимого в течение одного дня, ампулы как с высоким содержанием (ампулы с лиофилизированным BeneFIX®-R, содержащие примерно 2000 ME rFIX), так и с низким содержанием BeneFIX®-R (ампулы с лиофилизированным BeneFIX®-R, содержащие примерно 250 ME rFIX) были восстановлены непосредственно перед использованием с помощью 5 мл 36 мМ, 40 мМ или 44 мМ NaCl. Раствор для положительного контроля - 3% (мас./об.) декстран 70 был приготовлен на стерильном физиологическом растворе, модифицированном по Dulbecco и содержащем фосфатный буфер, не содержащий кальций и магний (PBS-CMF; рН 7,4). Человеческую кровь получали от доноров и собирали в пробирки Vacutainer, содержащие ЭДТА. Образцы крови использовали для исследования оседания в течение 3 часов после отбора.

Цельную кровь разбавляли 1:4 испытуемыми растворами (то есть 400 мкл цельной крови добавляли к 1,2 мл испытуемого раствора), хорошо перемешивали, а затем помещали в одноразовые стеклянные пробирки Westergren с автоматически устанавливающимся нулем, которые удерживали в абсолютно вертикальном положении в специально изготовленном штативе. Измеряли и записывали оседание эритроцитов через 60 минут, которое представляет собой расстояние в миллиметрах от нулевой отметки в верхней части пробирки до поверхности раздела плазма-эритроциты.

Результаты, полученные для всех 12 доноров, были сходными. Выпускаемый в настоящее время буфер для состава BeneFIX®, который не содержит rFIX (MFR-927), и 3% декстран 70, стандартный раствор для положительного контроля, показали повышенное оседание эритроцитов по сравнению с кровью, которая была смешана с испытуемыми растворами NaCl (см. Фиг.1). Независимо от концентрации NaCl в буфере (36 мМ, 40 мМ или 44 мМ) или концентрации rFIX в продукте, BeneFIX®-R не вызывал увеличения оседания эритроцитов после восстановления разбавителем, содержащим NaCl.

Результаты этого исследования показывают, что концентрации NaCl, на 10% большие или меньшие 40 мМ, в разбавителях BeneFIX®-R являются достаточными для предотвращения повышенного оседания или агрегации (агглютинации) эритроцитов. Результаты показывают также, что положительное влияние NaCl на связанную с составом агрегацию эритроцитов не зависело от концентрации активного ингредиента (то есть rFIX).

Пример 4: Роль ионной силы в буфере для восстановления BeneFIX® в возникновении агглютинации красных кровяных телец

Человеческую кровь отбирали посредством венопункции у четырех различных доноров в стандартные пробирки для отбора с гепарином. Образование агглютинатов красных кровяных телец устанавливали, набирая в шприц сначала 2,6 мл буфера или восстановленного белка BeneFIX®, а затем 0,6 мл гепаринизированной крови. Поведение этих агглютинатов в отношении смешивания/оседания наблюдали в этих шприцах в течение некоторого времени и регистрировали фотографически с использованием цифровой камеры.

Выпускаемый в настоящее время состав BeneFIX® до лиофилизации содержит rFIX, примерно 10 мМ гистидина, примерно 260 мМ глицина, примерно 1% сахарозы и примерно 0,005% полисорбата-80, рН 6,8. Этот состав BeneFIX® лиофилизируют и перед инъекцией восстанавливают стерильной водой для инъекций. Ранее предполагали, что причиной агглютинации является сахароза. Следовательно, буферы для испытания были составлены с 1%, 0,5% или 0% сахарозы. Каждый исследуемый буфер с сахарозой набирали в шприц, после чего туда набирали небольшое количество гепаринизированной крови. Было обнаружено, что агглютинация красных кровяных телец и последующее быстрое оседание идентичны для этих трех буферов, на основании чего можно заключить, что содержание сахарозы в составе BeneFIX® не является причиной наблюдаемой агглютинации. BeneFIX®, восстановленный в физиологическом растворе, а не в стерильной воде, не вызывает агглютинации. Эти данные указывают на то, что ионная сила состава BeneFIX® недостаточна для предотвращения агглютинации при восстановлении BeneFIX® в воде.

Для того чтобы определить минимальную ионную силу, необходимую для подавления агглютинации, BeneFIX® был восстановлен (или состав BeneFIX® до лиофилизации можно изменить таким образом, чтобы он включал хлорид натрия, хотя способы лиофилизации составов с хлоридом натрия являются более сложными по сравнению с лиофилизацией составов, не содержащих хлорид натрия) растворами с концентрациями NaCl 0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 и 137 мМ. BeneFIX® также восстанавливали в физиологическом растворе, содержащем 154 мМ NaCl. Во всех этих растворах исследовали поведение красных кровяных телец в отношении агглютинации и оседания. В Таблице 9 приведены осмолярность и ионная сила (выраженная в виде электропроводимости) некоторых из этих растворов наряду с другими традиционными растворами для внутривенного введения. При добавлении хлорида натрия к составу BeneFIX® либо в ходе прямого добавления хлорида натрия к составу до проведения лиофилизации, либо в ходе восстановления лиофилизата раствором хлорида натрия, можно предположить, что NaCl будет полностью диссоциировать с образованием эквивалентных концентраций ионов Na⁺ и Cl^-. Таким образом, можно предположить, что ионная сила (выраженная в мЭкв/л (миллиграмм-эквиваленты/л) Na⁺ и Cl^-) содержащегося в указанном составе буфера плюс NaCl будет эквивалентна концентрации NaCl, если буфер состава не содержит других ионов.

Таблица 9
Характеристика различных растворов
Раствор	Приблизительная расчетная осмолярность (мОсм/л)	Приблизительная расчетная электропроводность (мСм/см)	рН
Состав BeneFIX®	300	0 (наблюдаемая электропроводность составляет <0,2 мСм/см)	6,8
Состав BeneFIX® + 10 мМ NaCl	320	1	6,8
Состав BeneFIX® + 20 мМ NaCl	340	2	6,8
Состав BeneFIX® + 40 мМ NaCl	380	4	6,8
Состав BeneFIX® + 80 мМ NaCl	460	7	6,8
Состав BeneFIX® + 137 мМ NaCl	574	12,8	6,8
Состав BeneFIX® + 154 мМ NaCl	607	14,4	6,8
0,9% хлориданатрия (эквивалентно 154 мМ NaCl; 154 мЭкв/л ионов Na + и Cl-)	308	14,4	6,0
5% декстрозы (для инъекций)	250	0	4,5

При контакте крови с растворами, указанными в Таблице 9, в шприцах отдельно наблюдали агглютинацию красных кровяных телец, а затем содержимое шприцов осторожно перемешивали и переворачивали, чтобы наблюдать осаждение крови. Во всех составах BeneFIX®, восстановленных по меньшей мере примерно 40 мМ NaCl, не наблюдали агглютинации (как указано в предыдущем примере, примерно 36 мМ NaCl было также достаточно для предотвращения агглютинации). Поведение клеток крови в растворах, содержащих по меньшей мере 40 мМ NaCl, было неотличимо от поведения в физиологическом растворе.

Седиментацию крови исследовали с использованием серии шприцов, содержащих состав BeneFIX®, разбавленный (если использовали состав до лиофилизации)/восстановленный (если он был лиофилизирован) растворами с уменьшающимися концентрациями NaCl (начиная с 40 мМ) через 15 минут после переворачивания. Был отмечен стойкий концентрационно-зависимый отклик в отношении образования агглютинатов и последующей скорости оседания - увеличение агглютинации и более быстрое оседание с уменьшением концентрации NaCl в буфере. Явная агглютинация наблюдалась в случае одной пробы крови в буфере, содержащем 25 мМ NaCl, а в случае другой пробы крови - в буфере, содержащем 30 мМ NaCl. Во всех содержащих буфер препаратах с 40 мМ NaCl поведение клеток крови было неотличимо от поведения в физиологическом растворе или BeneFIX®, восстановленном физиологическим раствором. BeneFIX®, восстановленный 40 мМ NaCl, соответствует расчетной электропроводности 4 мСм/см.

5% раствор декстрозы для инъекций, каждый миллилитр которого содержит 50 мг водной декстрозы USP (фармакопея США) в воде для инъекций, имеет расчетную осмоляльность 250 мОсм/л и расчетную ионную силу 0 мСм/см. Этот раствор, который обычно вводят внутривенно, также вызывает агглютинацию красных кровяных телец и очень быстрое осаждение крови, сходные с теми, которые наблюдаются для составов BeneFIX®, восстановленных водой.

Таким образом, полученные результаты показывают, что агглютинация красных кровяных телец, вызванная BeneFIX®, восстановленным водой, является результатом низкой ионной силы состава BeneFIX® (расчетная ионная сила 0 мЭкв/л, измеренная электропроводность <0,2 мСм/см). Данная проблема может быть решена путем восстановления растворами NaCl с концентрацией 40 мМ, таким образом, чтобы расчетная ионная сила восстановленного раствора для инъекций составляла примерно 40 мЭкв/л или выше (ионную силу, достаточную для предотвращения агглютинации, также можно рассчитать по электропроводности, которая должна составлять примерно 4 мСм/см или выше).