новые tat-комплексы и включающие их вакцины

Формула изобретения

1. Комплекс, включающий в себя первый и второй пептиды, для применения в лечении или профилактике ВИЧ-инфекции, где первый пептид содержит V3-петлю gp120, и где петля V3 связана с участком связывания на втором пептиде, а второй пептид содержит указанный участок связывания, причем участок связывания на втором пептиде включает, по меньшей мере, остатки 21-40 и 46-58 Tat в последовательности SEQ ID NO:1 или его мутанта, в котором Cys22 Tat заменен глицином, где указанный Суs22-мутант Tat способен связывать участок gp120, содержащий остатки 301-419 gp120 в последовательности SEQ ID NO:2.

2. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что участок связывания включает, по меньшей мере, остатки 21-58 в последовательности SEQ ID NO:1 или указанного Суs22-мутанта, способного связываться с остатками 301-419 в последовательности SEQ ID NO:2.

3. Комплекс по п.1, полученный с использованием неокисленного Tat.

4. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что пептид, содержащий петлю V3, включает полную последовательность SEQ ID NO:2 или ее фрагмент, способный связывать пептид, состоящий из остатков 21-58 последовательности SEQ ID NO:1.

5. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что пептид, содержащий петлю V3, состоит из участка петли V3 gp120.

6. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что пептид, включающий в себя петлю V3, содержит, по меньшей мере, остатки 301-419 в последовательности SEQ ID NO:2 или ее фрагмент, способный связывать пептид, состоящий из остатков 21-58 в последовательности SEQ ID NO:1.

7. Комплекс по п.1, содержащий полностью или частично gp160 в качестве своего компонента, где gp160 содержит, по меньшей мере, петлю V3 gp120 и не содержит, по меньшей мере, большую часть петли V2 gp120.

8. Комплекс по п.1, содержащий V2Env в качестве своего компонента.

9. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что пептид, содержащий петлю V3, включает, по меньшей мере, остатки 301-419, приведенные в последовательности SEQ ID NO:2.

10. Комплекс по п.1, дополнительно включающий молекулу или вещество, способное взаимодействовать с Env, делая доступным функциональную петлю V3.

11. Комплекс по п.10, отличающийся тем, что указанная молекула или вещество представляет собой CD4 или его фрагмент.

12. Комплекс по п.1, дополнительно включающий в себя также гепарансульфат, необязательно дополнительно включающий, по меньшей мере, одну другую молекулу, способную связываться с указанным гепарансульфатом.

13. Комплекс по п.1, дополнительно включающий вещество, выбранное из интегрина, основного фактора роста фибробластов, CD26, рецепторов VEGF и хемокиновых рецепторов.

14. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что участок связывания содержится во фрагменте Tat, образуемом протеосомами человеческих клеток под воздействием Tat.

15. Комплекс по п.14, отличающийся тем, что Tat-фрагмент выбран из фрагментов, содержащих цистеин-обогащенные, основные или RGD участки Tat; фрагментов, содержащих цистеин-обогащенные и основные участки Tat; фрагментов, содержащих основные и RGD участки Tat; и фрагментов, содержащих только основной участок Tat.

16. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что указанные пептиды являются поперечно-связанными.

17. Комплекс, включающий в себя первый и второй пептиды, для применения в лечении или профилактике ВИЧ-инфекции, где первый пептид содержит V3-петлю gp120, и где петля V3 связана с участком связывания на втором пептиде, а второй пептид содержит указанный участок связывания, причем участок связывания на втором пептиде получен из Tat, и он распознается моноклональным антителом против второй внеклеточной петли CCR5.

18. Комплекс по любому из пп.1-17, предлагаемый в виде сочетания пептидов в носителе, пригодном для инъекции.

19. Применение комплекса по любому из пп.1-17 для получения антител против этого комплекса.

20. Применение комплекса по п.19 в способе получения моноклональной клеточной линии.

21. Применение по п.19 или 20, отличающееся тем, что указанные антитела выбраны таким образом, чтобы они не распознавали никакой из эпитопов в группе, состоящей из нативного Tat, gp160, CD4 или gp120, CCR5 и участка петли V3 gp120, также распознаваемого антителами, образуемыми одним из представителей этой группы, при использовании его в качестве иммуногена по отдельности, но только в виде комплекса по п.1 или 17.

22. Применение комплекса по любому из пп.1-17 в качестве иммуногена для вакцинации.

23. Применение по п.22, отличающееся тем, что указанный вирус представляет собой ВИЧ.

24. Набор для вызывания иммунного ответа против ВИЧ-инфекции, включающий, по меньшей мере, два отдельных препарата из компонента комплекса по любому из пп.1-17.

25. Применение комплекса по любому из пп.1-17 для вызывания иммунного ответа против ВИЧ-инфекции.

26. Способ вызывания иммунного ответа против ВИЧ-инфекции, где инфицирующий вирус экспрессирует молекулу, способную образовывать тройной комплекс между указанной молекулой, CD4 и CCR5, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, комплекса по любому из пп.1-17.

27. Применение комплекса по любому из пп.1-17 для установления того, содержит ли взятый от пациента образец антитела против указанного комплекса.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к применению белковых материалов, содержащих петлю V3 gp120, в производстве вакцины против вирусов, экспрессирующих gp120.

Адсорбция ВИЧ на мембране клеток-мишеней осуществляется при взаимодействии gp120 ВИЧ с клеткой-рецептором CD4. Указанное взаимодействие индуцирует в gp120 конформационный переход, который открывает возможность воздействия на петлю V3 gp120. В соответствии с предлагаемой моделью петля V3 gp120 взаимодействует, в свою очередь, с другими молекулами на клеточной поверхности, действующими в качестве корецепторов для ВИЧ. Наиболее важными корецепторами для ВИЧ являются хемокиновые рецепторы CCR5 и CXCR4. В настоящее время в целом принято считать, что макрофаг-тропные (М-тропные) изоляты штаммов ВИЧ инфицируют макрофаги через CCR5, тогда как штаммы ВИЧ, тропные к Т-клеточной линии (TCL-тропные), инфицируют ТCL через CXCR4, а штаммы с двойной тропностью могут инфицировать их также посредством любого из этих корецепторов.

Взаимодействие петли V3 gp120 с корецепторами ВИЧ создает условия для образования тройного комплекса между корецептором, CD4 и gp120, что, в свою очередь, ведет к конформационным изменениям в gp41. Вместе с gp120 gp41 участвует в образовании гликопротеинового комплекса вирусной оболочки (Env). Считается, что указанные конформационные изменения требуются, чтобы открыть для воздействия слитую последовательность на N-конце gp41, которая взаимодействует с клеточной поверхностью и приводит к слиянию вирусной оболочки и клеточной мембраны. В ходе данного ступенчатого механизма криптические эпитопы на gp41 и gp120 становятся доступны в результате взаимодействия между gp120 и CD4. Указанные эпитопы обычно скрыты и в случае gp120 распознаются антителами против части gp120, взаимодействующей с корецепторами.

Указанные криптические эпитопы были объектом интенсивных исследований в области вакцинации и пассивной иммунизации, в результате которых были получены убедительные доказательства того, что петля V3 gp120 вовлекается в распознавание и использование корецептора. В частности, было показано, что точечные мутации и мутации в V3 устраняют или меняют характер использования корецептора; было доказано, что V3-пептиды взаимодействуют с CXCR4; и антитела против V3 могут нарушить или блокировать связывание gp120-CCR5. Данная модель в целом была принята, хотя различные наблюдения указывают на то, что при использовании корецептора вовлекаются дополнительные события, в частности это относится к макрофагам.

Tat представляет собой регуляторный белок, ассоциированный с вирусом иммунодефицита человека типа 1 (HIV-1), продуцируемого очень скоро после инфицирования, который является обязательным для экспрессии вирусного гена, репликации и инфекционности вирусов (Arya 1985; Fisher 1986; Chang 1995). В ходе острой инфекции Т-клеток под действием ВИЧ Tat также высвобождается во внеклеточное пространство и захватывается окружающими клетками (Frankel 1988; Ensoli 1990; Ensoli 1993; Chang 1997), где, в зависимости от концентрации, конформационного состояния и типа клеток, он может повысить инфекционность вируса. Конкретно, захват Tat может повысить в инфицированных клетках экспрессию вирусного гена и его репликацию (Frankel 1988; Ensoli 1993; Chang 1997), тогда как в неинфицированных клетках он повышает экспрессию обоих корецепторов CCR5 и CXCR4, способствуя передаче и макрофагов, и Т-лимфоцит-тропных штаммов ВИЧ-1 (Huang 1998; Secchiero 1999).

В соответствии с данными наблюдениями было показано, что иммунный ответ на Tat играет ключевую роль в контроле развития СПИДа и СПИД-ассоциированных заболеваний и в защите Tat-вакцинированных обезьян от инфекции SHIV (Cafaro et al., Nat Med 1999). Однако на основе доступных исследований и их результатов не было выявлено или предложено какой-либо специфической роли Tat в молекулярных событиях, вовлекаемых в абсорбцию ВИЧ или слияние мембран.

В WO 01/54719 описывается использование Tat и/или Nef в качестве антигенов, в виде функциональных, инактивированных или антигенных пептидов, вместе с Env дикого типа, основанное на том наблюдении, что сочетание данных антигенов является полезным в плане защитной вакцинации обезьян против провокации SHIV. Дериватизация антигенов до описанных антигенных форм делает их более безопасными и/или более стабильными. Однако в документе не высказано предположение, что между Tat или Nef и Env образуется комплекс.

Неожиданно авторы обнаружили, что Tat может взаимодействовать с петлей V3 gp120, имитируя, таким образом, корецептор CCR5 как на молекулярном (структурном), так и на функциональном уровне и придавая тем самым CCR5-тропным штаммам ВИЧ способность инфицировать клетки-мишени, экспрессирующие лишь очень малые количества CCR5, которые не могли быть инфицированы тем же самым вирусом в отсутствие иммобилизованного Tat.

Таким образом, в своем первом аспекте настоящее изобретение относится к комплексу, включающему в себя первый и второй пептиды, где первый пептид содержит V3-петлю gp120, и V3-петля доступна для координации со связывающим участком на втором пептиде, где связывающий участок был получен из Tat и распознается моноклональным антителом против второй внеклеточной петли CCR5 (Lee, B., et al., J. Biol. Chem., 1999, Vol. 274, 9617-9626), для использования в терапии. Идентифицированное моноклональное антитело доступно от компании Фарминген (Pharmingen) под номером 36460D.

В альтернативном аспекте настоящее изобретение относится к комплексу, включающему в себя первый и второй пептиды, где первый пептид содержит V-петлю gp120, V3-петля доступна для координации с участком связывания на втором пептиде, а связывающий участок включает в себя по меньшей мере фрагмент из остатков 21-40 и 46-60 или 21-60 в SEQ ID NO.1 или его фрагмент, мутант или вариант, способный связываться с остатками 301-419 в SEQ ID NO.2.

Предпочтительно связывающий участок состоит по меньшей мере из остатков 21-58 в SEQ ID NO.1. Предпочтительно остатки 21-48 и 46-60 или 46-58 в SEQ ID NO.1 связаны с подходящим линкером и соответствующим образом расположены так, что они способны связываться с фрагментом из остатков 301-419 в SEQ ID NO.2. Альтернативно, единая, непрерывная нить, включающая 21-58 в SEQ ID NO.1, является также предпочтительной, также при условии, что сохраняется способность связывать остатки 301-419 в SEQ ID NO.2.

Предпочтительно, чтобы связывающий участок включая в себя по меньшей мере остатки 21-58 в SEQ ID NO.1. Альтернативно, также предпочтительно, чтобы связывающий участок включая в себя по меньшей мере остатки 21-40 и 46-58 в SEQ ID NO.1.

Изобретение также относится к комплексу, включающему в себя первый и второй пептиды, где первый пептид включает в себя V3-петлю gp120, причем V3-петля доступна для координации с участком связывания на втором пептиде, а связывающий участок получен из Tat и распознается антителом против CCR5, для применения в терапии, в частности в качестве иммуногенного компонента вакцины.

В контексте настоящего описания термин «пептид» используется для обозначения вещества, имеющего пептидные или пептидомиметические связи, которое может быть частью более крупной молекулой, включающей другие типы соединений, такие как сахарные остатки. В основном предпочтительно, чтобы пептид содержал преимущественно природные аминокислоты и особенно предпочтительно, чтобы указанные природные аминокислоты составляли более 90% пептидов. В одном предпочтительном варианте пептиды состоят из природных пептидов, необязательно содержащих замещения блокирующими группами на одном или обоих концах и/или гликозидными остатками.

Для авторов стал особенно неожиданным тот факт, что Tat способен связываться с V3-петлей gp120 и что дополнительно участок Tat, который связывается с V3-петлей, распознается антителами против CCR5. Ввиду чрезвычайно высокой специфичности моноклональных антител можно полагать, что эффект Tat на V3-петлю gp120 аналогичен или полностью идентичен таковому CCR5. Практически авторы установили, что внеклеточный Tat эффективен в плане обеспечения функциональных свойств CCR5 в отношении Т-клеток, которые экспрессируют очень малые количества данного корецептора, по меньшей мере в том, что касается инфекционности ВИЧ.

Относительно WO 01/54719, например, следует отметить, что, хотя Tat и Env могут вводиться вместе, Tat не способен связываться с V3-петлей Env в препарате, поскольку Env не активируется под действием CD4, и если не были предприняты специфические меры для того, чтобы избежать изменений во взаимодействии Tat и V3-петли, таких как сшивание комплекса или добавление адъюванта, он образуется только после формирования комплекса. В случае WO 01/54719, ко времени активации Env под действием CD4, он больше не находится в непосредственной близости от Tat, так что единственным преимуществом, достигаемым при их совместном введении, является то известное преимущество, что Tat может действовать как адъювант. В рамках настоящего изобретения не только сам Tat, в случае его присутствия, действует как адъювант, но и его ассоциация с V3-петлей создает новый антигенный эпитоп или несколько таких эпитопов, которые могут быть полезны в плане защиты против ВИЧ-инфекции или против распространения инфекции.

Таким образом, М-тропные штаммы ВИЧ имеют вначале в качестве мишеней только макрофаги, но как только высвобождается Tat, даже Т-клетки, экспрессирующие очень малые количества CCR5, могут быстро инфицироваться, что может привести к процессу масштабного образования вирусов, необходимого для установления персистентной инфекции.

На основе этого понимания можно создать антигенный комплекс, состоящий по меньшей мере из релевантных частей Tat и Env, с целью стимуляции иммуногенного ответа у индивидуума для профилактики или лечения.

Такие комплексы могут также использоваться для создания антител с целью их применения в пассивной иммунизации, например, когда имеется опасение, что индивидуум мог быть инфцирован ВИЧ. Образование таких антител может быть индуцировано у животных для использования людьми, которые могут быть также секвенированы и подвергнуты гуманизации известными в данной области методами.

Несмотря на то, что рассматриваемые комплексы и антитела против них могут найти специфическое применение против CCR5-тропных штаммов вирусов, они могут также использоваться против TCL-тропных штаммов для задержки или даже блокирования Tat-опосредованного распространении вируса от одной Т-клетки к другой. Аналогично, соответствующей мишенью могут быть штаммы с двойной тропностью.

В связи с наличием молекулярной мимикрии между CCR5 и Tat, комплексы и антитела, получаемые против данных комплексов, будут также, частично, имитировать действие или напрямую действовать против эпитопов, присутствующих в CCR5 или в комплексе CCR5/V3-петля, способствуя повышению эффективности вакцины или антител, используемых для пассивной иммунизации.

Комплекс согласно настоящему изобретению может в основном представлять собой комбинацию двух видов пептидов в носителе, подходящем для инъекции. Носитель, содержащий комплекс, может храниться как таковой или может быть создан в виде отдельных препаратов индивидуальных пептидов и/или носителя с целью их объединения непосредственно перед употреблением.

Комплекс согласно настоящему изобретению в типичном случае включает два вида пептида, взаимодействующих друг с другом. Предпочтительно, хотя и не обязательно, оба вида присутствуют в стехиометрических количествах, иными словами, не отдается предпочтения какому-либо из них при образовании комплекса или при связывании друг с другом. Все, что требуется, это наличие достаточного количества антигенного сочетания двух видов, присутствующих в таком порядке, который позволяет стимулировать иммунный ответ.

Комплекс согласно настоящему изобретению может быть создан просто на основе естественного взаимодействия между Tat и петлей V3 gp120. Могут использоваться также более слабые комплексы, но в основном предпочтительно усиливать комплекс. В этом отношении, например, возможно использовать дисульфидные мостики, которые могут быть ассоциированы с цистеин-обогащенным участком Tat-белка, или использовать другие методики сшивки белка, известные в данной области, например использовать BS3 линкер.

Комплекс может просто включать релевантные участки Tat и gp120. В случае gp120, полностью петля V3 или его существенная часть достаточны, хотя как показали данные анализа молекулярного «причаливания», in vivo также могут вовлекаться остатки, ближайшие к V3-петле. В случае Tat, хотя участок аминокислот 1-61 и, возможно, до аминокислоты 70 и выше, вовлекается в связывание V3-петли, представляется особенно выгодным использовать участки 21-58. Данный участок Tat-последовательности демонстрирует особенно сильную способность к связыванию с моноклональным антителом против CCR5.

Та часть Tat-молекулы, которая, по всей видимости, особенно важна для осуществления настоящего изобретения, включает остатки 1, 2, 4, 16, 19-22, 25, 26, 29, 34, 35, 45-47, 51, 55, 57, 59 и 61 из SEQ ID NO.1. Однако анти-CCR5 очень хорошо распознает Tat(21-58)-пептид и, в меньшей степени, Tat(46-60)-пептид, который охватывает основной участок Tat. Известно, что Tat на участке 21-58 содержит два важных функциональных домена белка: цистеин-обогащенный участок (21-40) и основной по характеру участок (46-58). Tat(21-58)-пептид, но не 21-40, то есть цистеин-обогащенный участок, является также минимальным пептидом, требуемым для Tat-опосредованной экспансии ВИЧ тропизма относительно TCL с низкой экспрессией CCR5. Приведенные данные позволяют с высокой степенью вероятности полагать, что цистеин-обогащенный участок Tat требуется для создания наилучшей конформационной структуры основного участка Tat для имитации CCR5. Таким образом, в том случае, когда в рамках настоящего изобретения используется Tat с меньшей длиной, чем его полная длина, то предпочтительно использовать по меньшей мере участки 21-58 или 21-60, с усечением пептидов промежуточной длины или, по меньшей мере, в случае наличия обоих участков 21-40 и 46-58, при соединении их друг с другом или через линкерный участок в один рекомбинантный пептид, что также предпочтительно формирует часть настоящего изобретения. В том случае, когда используется мутант или вариант указанной последовательности, их вид может варьировать за счет делеции, вставки или инверсии одного или нескольких остатков, при условии, что полученный пептид будет способен связываться с V3-петлей природного gp120, что определяют в соответствии с тестом, описанным в прилагаемых примерах. Предпочтительные для сохранения участки включают следующие: 1, 2, 4, 16, 19-22, 25, 26, 29, 34, 35, 45-47, 51, 55, 57, 59 и 61.

В SEQ ID NO.1 показана полная аминокислотная последовательность Tat.

Считается, что пептидные носители или рамочные молекулы могут включать релевантную часть Tat, но при этом могут создаваться другие эпитопы, что в целом не предпочтительно, когда целью не является создание других эпитопов.

Пептид, включающий петлю V3, может содержать или полностью состоять из gp120, необязательно усеченным и/или с делециями, или может включать более крупную или меньшую молекулу. В одном предпочтительном варианте пептид, включающий петлю V3, может включать полностью Env или некоторую его часть. В этом случае Env, в своей нативной форме, рассматривается как непроцессированный белок, продуцируемый вирусом в виде белка слияния gp120-gp41, известного как gp160. Данный пептид может также включать фрагменты Env, при этом следует понимать, что Env, в контексте настоящего описания, относится не только к Env и его фрагментам, но к любому пептиду, экспрессирующему или способному к экспрессии петли V3. Для информации полная последовательность gp120 приведена в описании в виде SEQ ID NO.2. В данном контексте следует понимать, что пептид может состоять просто из петли V3 и может также представлять собой любую промежуточную молекулу, такую как молекула-носитель, экспрессирующая или экспонирующая один или несколько петлевых фрагментов V3, как это приведено в настоящем описании.

Молекула или комплекс на основе Env могут быть природного происхождения или могут содержать любую делецию или вариацию, при условии, что в них все еще сохранятся петля. Делеционные мутанты предпочтительны, такие как мутант V2Env, в котором отсутствует петля V2, но сохраняется часть gp41. Было показано, что данный мутант дает особенно хорошие результаты при сочетании с Tat, приводя к образованию высоких титров антитела против Env.

V2Env образует комплекс с Tat и усиливает гуморальный ответ против Env без супрессии ответа против Tat. Тогда как Env дикого типа образует комплекс, но не усиливает гуморальный ответ против Env и подавляет гуморальный ответ против Tat, что указывает на то, что V2Env, при его использовании, стимулирует более сильный репертуар B-клеток, чем Env дикого типа.

Таким образом, в предпочтительном варианте комплекс согласно настоящему изобретению содержит V2Env в качестве своего компонента.

Петля V3, содержащая участок Env, предпочтительно включает по меньшей мере остатки 301-412 в SEQ ID NO.2 и может включать любую вариацию или мутацию в данной последовательности, такую как мутация, введенная делецией, вставкой или инверсией одной или нескольких аминокислот, при условии, что полученная петля способна связывать Tat, как показано в SEQ ID NO.1, при определении по тесту, приведенному в сопровождающих описание примерах. Более предпочтительно, любая последовательность, содержащая петлю V3, включает по меньшей мере остатки 301, 316, 317, 318, 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 405, 407, 412, 416-419, как показано в SEQ ID NO.2. Однако сама по себе петля V3, включающая нуклеотиды 299-333 в SEQ ID NO.2, также является объектом настоящего изобретения.

Известно, что Tat может функционировать как адъювант, повышая клеточные иммунные ответы против антигенов и поляризуя иммунный ответ в сторону Th1 фенотипа (Fanales Belasio et al., J Immunol 2002; Ensoli B., WO 03/0098670). Дополнительно, Tat расширяет Th1 ответы против антигенов за счет изменения их процессинга протеосомами (Ensoli et аl., PCT/EP2004/11950). Такое рода явление приводит к индукции ответов против антигенных эпитопов цитотоксических Т-клеток (CTL), которые в норме являются субдоминантными (Ensoli et аl., PCT/EP2004/11950).

Авторы показали, что указанные свойства не затрагиваются, так что использование Tat вместе с Env стимулирует более широкий ответ против субдоминантных эпитопов, даже Env, и, кроме того, могут вводиться и другие антигены в сочетании.

Более предпочтительно, любая молекула или вещество, способные к взаимодействию с Env, делая доступным функциональную V3-петлю, могут использоваться в настоящем изобретении, например, с целью стимуляции образования антител. В данном случае функциональная V3-петля способна связываться с Tat, как показано в SEQ ID NO.1, при определении по тесту, описанному в соответствующих примерах.

Соответствующий пример включает в себя CD4 или его фрагмент, способный привести к экспонированию петли V3 при взаимодействии с Env. В область настоящего изобретения также включаются компоненты оболочки и их фрагменты вирусных частиц, которые, при связывании Tat с поверхностью вируса, могут вступать в реакцию, делая доступным V3 петлю, присутствующую в Env.

Известно, что V3-петля является главной детерминантой при связывании Env с гепарансульфатами, которые присутствуют во внеклеточной матрице и клеточных мембранах. Известно также, что Tat связывается через свой основной участок с гепарансульфатами. Соответственно, поскольку авторы показали, что Tat и Env образуют комплекс, то настоящее изобретение также распространяется на комплексы, включающие также гепарансульфат, необязательно вместе с другими молекулами, которые связываются с гепарансульфатами и которые ассоциируются с сайтами инфекции/воспаления. Такие другие молекулы могут включать, например, основной фактор роста фибробластов, при этом комплексы особенно полезны для использования в качестве иммуногена для проведения вакцинации.

Поскольку, как известно, Tat связывается с интегринами, которые являются рецепторами клеточной адгезии, включающими _{V 3}, _{5 1}, _{V 5}, и которые вовлекаются в механизм поступления Tat в клетки, настоящее изобретение также распространяется на комплекс по настоящему изобретению с интегрином, взятым в качестве другого компонента, особенно в варианте его использования как иммуногена при вакцинации. Другие молекулы, полезные для образования комплекса, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, включают молекулы и вещества, которые связываются или с Tat, или с Env, или с ними обоими и которые могут, например, включать CD26, рецепторы VEGF и рецепторы хемокинов.

Важным является то, что предлагается комплекс, который адекватен для стимуляции иммунного ответа, так что образуются антитела, которые будут распознавать комплекс Tat/Env in vivo. Таким образом, поскольку в целом возможно использовать варианты Tat последовательности для связывания V3 петли gp120, вполне вероятно, что антитела, получаемые против образуемого комплекса, не будут распознавать комплекс Tat или Tat_21-58 и Env in vivo, где пространственная конфигурация комплекса Tat-пептида и петли отличается от варианта комплекса, образуемого in vivo между Tat или Tat_21-58 и Env.

Таким образом, в основном предпочтительно, что комплекс, используемый для получения антител или в качестве иммуногена в вакцинном препарате, включает по существу полную последовательность Tat или предпочтительно по меньшей мере Tat _21-58 в иммунологически естественной конформации. В этой связи, имеется возможность вводить определенные замещения аминокислот без воздействия на иммуногенность Tat, хотя такие замещения могут влиять на биологическую эффективность полученного Tat по другим механизмам. Введение указанного рода замещений может быть желательно по таким причинам, как, например, гарантированное достижение более высокой эффективности связывания между Tat и петлей V3, или такие замещения могут возникать в результате использования некоторых более предпочтительных генноинженерных методик.

Для образования комплекса не столь важно, чем представлена петля V3: целой молекулой Env или ее частью, при этом рассматриваемая петля V3 может вводиться в соответствующем варианте в молекуле-носителе, при условии, что она доступна в такой форме, в которой она, способна образовывать комплекс с пептидом. В частности, считается, что такая молекула-носитель может экспрессировать более, чем одна петля V3, с образованием мультимерного комплекса с различными Tat-белками.

В основном предпочтительно используется природный Env или аналогичный или близкий к нему белок, такой как его вариант или мутант, полученный генноинженерными методами, при условии, что конформационно он становится доступным для петли V3. Такая экспонированность может быть достигнута, например, при добавлении CD4 или gp120-связывающего эпитопа CD4, с необязательным включением гепарансульфатов, к препарату других двух пептидных видов, предпочтительно таким образом, чтобы компоненты могли соединяться, например, в виде белка слияния или путем химической сшивки, делая в такой системе gp120 доступным для V3-петли.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к использованию описанного выше комплекса при получении лекарственного средства для лечения или профилактики вирусной инфекции, в ходе которого инфицирующий вирус экспрессирует молекулу, способную к образованию тройного пространственного комплекса между ним самим, CD4 и CCR5.

Пептиды, используемые в данном комплексе, могут быть дериватизированы или подвергнуты замещению любым традиционным способом при условии, что они все еще будут способны выполнять нужные функции, описанные выше. В частности, в том случае, когда пептиды короткие, их N- и/или С-концы могут быть, например, подвергнуты химической блокировке для ингибирования действия пептидаз. В том случае, когда пептиды являются химически синтезированными или имеют полусинтетический характер, может быть также желательно провести замещение чувствительных связей фрагментами, менее чувствительными к атаке. В некоторых случаях может быть удобно осуществить замещение крупных участков пептидов пептидомиметическими группами.

В предпочтительном комплексе согласно настоящему изобретению второй пептид включает цистеин-обогащенный участок Tat-ВИЧ и основной участок, а первый пептид включает петлю Env ВИЧ. Второй пептид может включать фрагменты Tat-ВИЧ или их производные, а первый пептид может включать фрагменты Env ВИЧ или их производные. Второй пептид может включать пептиды или эпитопы Tat-ВИЧ и первый пептид может включать пептиды или эпитопы Env ВИЧ.

В предпочтительном варианте комплексы по настоящему изобретению включают по меньшей мере одну ковалентную связь между пептидами. Комплекс может представлять собой ковалентно связанную химерную молекулу, образованную, например, между Tat-ВИЧ-1, его фрагментами или производными и Env ВИЧ, его фрагментами или производными.

В одном предпочтительном комплексе связывающий участок второго пептида включает аминокислотные остатки 1-61 из Tat или их иммунологические эквиваленты. Tat-компонент может представлять собой мутант, полученный путем трансактивации.

Считается, что предпочтительные комплексы должны по существу быть свободны от клеток и клеточных осколков.

Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения или ингибирования передачи ВИЧ от матери к ребенку или между индивидуумами, инфицированными ВИЧ, включающему введение пассивной вакцины, определенной в настоящем описании, матери или такому индивидууму.

В основном вирусом-мишенью для такого способа лечения или профилактики может быть штамм ВИЧ или HTLV, но он также может представлять собой штамм животного, такой, например, как SHIV.

Антитела против комплекса согласно настоящему изобретению могут быть получены стандартными способами, при этом получают соответствующие моноклональные или поликлональные антитела, предпочтительно моноклональные. Предпочтительно, такие антитела способны не связываться с CCR5 Tat, Env или петлей V3 gp120, но способны связываться с комплексом Tat и Env или корецептора и Env. Таким образом, полученные антитела могут связываться и блокировать комплексы Tat или корецептора и Env in vivo, тем самым предупреждая или подавляя инфекцию. Считается, что необязательно, чтобы такие антитела связывали оба или все компоненты комплекса при взаимодействии с новыми эпитопами, полученными в ходе образования комплекса, а могут просто связывать криптические эпитопы, открываемые при связывании Tat с Env. Такие эпитопы могут быть на Tat, Env и даже на CCR5, что также определяет преимущество настоящего изобретения.

При получении подходящих антител против комплексов согласно настоящему изобретению антитела, которые связываются с эпитопами, обычно присутствующими на Tat или Env, могут быть удалены простым отмыванием или удалением антител или линий, которые связываются с Tat, Env или петлей V3 gp120, по отдельности, из поликлонального препарата или выбранных моноклональных линий, с получением в результате только поликлональных препаратов или линий, экспрессирующих антитела, которые связываются с эпитопами, присутствующими только в комплексе.

Считается, что моноклональные антитела, получаемые таким способом из животных, могут быть соответствующим образом гумунизированы с помощью известных в данной области методик. Настоящее изобретение распространяется на поликлональные, моноклональные и гуманизированные антитела, специфичные для описанных в настоящем изобретении комплексов.

Активные вакцины, включающие комплексы по настоящему изобретению, предлагаются в виде препаратов антител для пассивной иммунизации, содержащих антитела согласно настоящему изобретению и хорошо известные в данной области носители, подходящие для таких вакцин и которые могут также включать соответствующие другие вещества, такие как стабилизаторы, изотонические средства и антибактериальные агенты.

Носитель для комплекса или антитела может храниться в концентрированном или инактивированном виде, пригодном для разбавления и/или активации, при необходимости. Подходящие носители могут представлять собой солевой раствор или его производные, или другие агенты, известные специалистам в данной области, которые предпочтительно представлены в форме для инъекций или могут быть переведены в форму инъецируемого препарата.

Количество комплекса или антитела должно быть достаточным для того, чтобы выполнять функцию иммуногена или стимулятора или оказывать биологический эффект, или его усиливать, соответственно.

Настоящее изобретение также распространяется на сами комплексы. Один из способов использования таких комплексов относится к методу хроматографирования, целью которого является выявление в конкретном, взятом от пациента образце антител против комплекса. Комплекс может использоваться любым традиционным способом, в рамках такой методики, как фиксация на носителе, вносимом в колонку, при этом соответствующий агент-детектор может представлять собой, например, маркирующее анти-антитело.

Комплексы согласно настоящему изобретению могут также использоваться для воздействия на целевые клетки и для идентификации лекарственных средств, препятствующих, например, поступлению ВИЧ в клетки. Культура, включающая клетки и комплекс, после воздействия инфицирующей дозы вируса, может быть протестирована с помощью соответствующего анализа для установления наличия инфицирования и его степени, например.

Таким образом, комплекс Tat-V3-петля представляет собой новый антиген, который может использоваться для профилактической или терапевтической вакцинации за счет индукции защитных антител, способных блокировать или связывать in vivo взаимодействие Tat-V3-петля, нарушая таким образом последующую инфекцию. Антитела могут также блокировать взаимодействие по типу CCR5-V3 петля, так что данный комплекс может использоваться при получении защитных антител для пассивной иммунизации, направленной на блокирование передачи ВИЧ от матери к ребенку или горизонтальной передачи ВИЧ, например, у инфицированных индивидуумов.

В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к молекулярному комплексу, образуемому между белком Tat-ВИЧ и белком оболочки Env-ВИЧ, который образуется при взаимодействии цистеин-обогащенных и основных участков Tat и V3-петли gp120. Молекулярные комплексы, образуемые при использовании полного белка Tat, его мутантов, фрагментов или их производных и белка gp160 оболочки ВИЧ, фрагментов или их производных, предпочтительны в плане их использования в качестве антигенов для профилактической или терапевтической вакцинации против ВИЧ/СПИД.

Предпочтительный комплекс включает цистеин-обогащенный участок и основной участок Tat-ВИЧ и петля V3 из Env-ВИЧ. Поскольку белки после воздействия Tat по-разному процессируются протеосомами клеток (Ensoli et al., PCT/EP2004/11950), другой предпочтительный комплекс включает фрагменты Tat, получаемые под действием протеосом из клеток, подвергшихся воздействию Tat, включая фрагменты, содержащие цистеин-обогащенные, основные и RGD участки Tat, цистеин-обогащенные и основные участки Tat, основной участок и RGD участок Tat или один только основной участок. Другой вариант включает Tat-фрагменты ВИЧ или их производные и Env-фрагменты ВИЧ или их производные, тогда как еще один вариант может включать пептиды или эпитопы Tat-ВИЧ и пептиды или эпитопы Env-ВИЧ.

Также предпочтительной является ковалентно связанная химерная молекула, образуемая между Tat-ВИЧ-1, его фрагментами или производными и Env ВИЧ, его фрагментами или производными.

Tat компонент в одном варианте может представлять собой молчащий мутант, полученный путем трансактивации, например, мутант Tat-cys₂₂.

ВИЧ в рассматриваемых вариантах представляет собой предпочтительно ВИЧ-1. Предпочтительным таксоном является ВИЧ-1, подтипы A, B, C, D, E, F, G и О. Следует понимать, что изобретение распространяется на CCR5-тропные, CXCR4-тропные штаммы и штаммы с двойной тропностью и что ссылка на любой конкретный вирус, или тип, или его класс равным образом применима к вирусам, описанным в настоящем изобретении.

Вакцины согласно настоящему изобретению будут особенно полезны при профилактике или подавлении передачи ВИЧ от матери к ребенку или между ВИЧ-инфицированными индивидуумами.

Ниже настоящее изобретение поясняется с помощью иллюстрирующих его неограничивающих примеров.

ПРИМЕР 1

Молекулярное взаимодействие Tat-ВИЧ-1 с V3-петлей gp120

Связывание Tat-ВИЧ-1 с V3-петлей gp120 ВИЧ-1 исследуют с использованием модели анализа молекулярного «причаливания», в которой Tat (штамм BH10 HIV) подвергают реакции с V3-петлей белка Env (штамм Ba-L HIV). Все структурные модели анализируют с использованием в качестве матрицы всех доступных структур Tat-белка и Env белка из числа депонированных в информационном банке данных по белкам Protein Data Bank (Berman, H.M. et al., Nucl. Acids Res. 28, 235-242, 2000) в июле 2003 года. Проводят сопоставление последовательностей различных белков с использованием программы ClustalW (Thompson, J.D. et al., Nucl. Acids Res. 22, 4673-4680, 1994) и получают структурные модели с использованием программы Modeller6v2 (Sali, A. and Blundell, T.L. J. Mol. Biol. 234, 779-815, 1993). Все рассчитанные структурные модели оптимизируют по методике энергетической минимизации с использованием программы AMBER-5 (Pearlman, D.A. et al., in AMBER 5.0, University of California, San Francisco, 1997). Полученные структурные модели используют далее для расчета белок-белковых аддуктов по программе BIGGER (Palma, P.N. et al., Proteins Struct. Funct. Genet. 39, 372-384, 2000). Данная программа позволяет рассчитывать белок-белковые комплексы и ранжировать их на основе комплементарности формы и взаимодействий, отличных от взаимодействия через химические связи (электростатические взаимодействия и взаимодействия под действием сил Ван-дер-Ваальса).

Исходные молекулярные расчеты проводят с использованием выделенных петель V3 (аминокислоты 297-336), на основе которых сделан вывод о наличии трех типов низкоэнергетических аддуктов, характеризующихся тремя уникальными участками взаимодействия. Указанный аддукты характеризуются различными Tat остатками, взаимодействующими с петлей V3, хотя в отличие от них V3-петля демонстрирует наличие лишь одного участка взаимодействия, который включает остатки Thr300, Arg301, Ala331, His332, Asn334 и несколько аминокислот из сегмента 306-328 в петле V3.

Далее также анализируют взаимодействие между Tat и относительно крупным доменом (291 аминокислота) в Bal gp120 ВИЧ, открытым для взаимодействия с петлей V3. Поскольку отсутствует какая-то структурная информация о конформации петли V3 и ее ориентации относительно остатка домена gp120, в качестве образца был взят диапазон доступных конформаций и вариантов гибкости петли V3. Вариабельность конформации петли фактически может оказывать заметный эффект на геометрию комплекса. Конформационный анализ проводят путем динамической стимуляции длинной молекулы в определенном растворителе. Расчеты проводят по методу анализа «причаливания», в соответствии с которым Tat подвергают взаимодействию с пятью разными конформациями gp120 белка Env, включая две наиболее различающихся конформации петли V3 плюс три промежуточных конформации.

Проведенные расчеты позволяют идентифицировать аддукт, взаимодействующий с Tat в участке, включающем петлю V3, который по существу соответствует тому участку, который был найден в одном из аддуктов, при проведении расчетов только с одной петлей V3. Предполагается, что данный аддукт является наиболее стабильным, и он был использован в расчетах по методу анализа молекулярной динамики (MД) с целью оптимизации его конформации и оценки его стабильности, при действии эффективного поля полной силы (создаваемого атомами двух молекул). Расчеты проводились как в окисленном состоянии (то есть при наличии дисульфидного мостика в петле V3), так и в восстановленном состоянии белка Env, и показали, что аддукт является в равной мере стабильным в обоих состояниях окисления. Для подтверждения модели взаимодействия, полученной в рамках описанной ранее процедуры, и для анализа белок-белкового интерфейса проводят также расчеты по методу анализа «причаливания» с использованием программы Haddock. Было найдено пять аддуктов с наименьшим запасом энергии, которые обладают той же геометрией, что и модель, полученная при расчетах по программе BIGGER.

Все описанные расчеты указывают на уникальный способ взаимодействия. Было показано, что окончательная структурная модель аддукта является весьма стабильной и характеризуется средним показателем поверхности взаимодействия 2260±112Å ² и средним показателем белок-белковой внутримолекулярной энергии -412±14 ккал/моль. Наибольший вклад в энергию взаимодействия вносят электростатические силы со средним показателем энергии -325±12 ккал/моль: поверхность взаимодействия включает остатки 1, 2, 4, 16, 19-22, 25, 26, 29, 34, 35, 45-47, 51, 55, 57, 59, 61 на Tat и остатки 301, 316, 317, 318, 321, 322, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 405, 407, 412, 416-419 на Env.

Было показано, что три межмолекулярных солевых мостика между остатками Tat и gp120, соответственно (Asp5-Arg316, Lys50-Glu407 и Lys19-Asp327), являются полностью консервативными во всех различных моделях и в ходе стимуляции молекулярной динамики. Показано также, что аддукт дополнительно стабилизируется межмолекулярными водородными связями, которые варьируют по количеству в ходе стимуляции от шести до одиннадцати, но всегда вовлекается по меньшей мере один остаток из общего участка взаимодействия. Заметный вклад в стабилизацию аддукта был определен на уровне 30-40 гидрофобных взаимодействий. От двадцати до тридцати указанных взаимодействий вносится остатками, принадлежащими петле V3, тогда как 20 из них - остатками, принадлежащими сегменту 20-59 в Tat.

ПРИМЕР 2

Tat связывается с петлей gp120 V3 в тесте ИФТФА

Иммуноферментный твердофазный анализ (ИФТФА) проводят для определения того, связывается ли фактически Tat с петлей V3 gp120 in vitro. С этой целью на пластинки для ИФТФА наносят пептид, полностью покрывающую петлю V3, и затем проводят мощное блокирование носителем бычьим сывороточным альбумином (БСА), с использованием множественных стадий отмывки и дополнительной инкубации с биологически активным Tat-белком или, в случае контроля, его буфером (ФБР-БСА 0,1%) (Cafaro et al., Nat Med 1999; Fanales-Belasio et al., Immunology 2001). Моноклональные анти-V3 и поликлональные анти-Tat-антитела используют в качестве первичных антител для обнаружения связанного белка.

При использовании в тесте ИФТФА ячеек без покрытия (то есть блокированных БСА) с анти-Tat или анти-V3 антителами обнаруживается слабый фоновый сигнал, варьирующий от 0,1 до 0,4 ОП. Полученные результаты показаны в Таблице 1. Однако когда с ячейки с наслоенным V3 пептидом инкубируют с Tat, то сигнал повышается до оптической плотности примерно 1 (ПО). И наоборот, при инкубировании ячеек с одним буфером получают сигналы, сравнимые с фоновыми значениями (ячейки без нанесения покрытия). Как и ожидалось, в случае ячеек с наслоенным V3 получают высокие сигналы при проведении ИФТФА, если используются анти-V3 антитела. Данные эксперименты показывают, что биологически активный Tat связывается с петлей V3 gp120 in vitro, подтверждая данные, полученные при проведении расчетов по методу анализа «причаливания». Аналогичные результаты получают при наслоении на ячейки Tat-покрытия, с последующим инкубированием таких покрытых ячеек с возрастающими количествами пептида из петли V3, при этом, как и ожидалось, выявлено зависимое от дозы связывание пептида из петли V3 с иммобилизованным Tat (Таблица 1 бис).

Таблица 1
	Антитела
Нанесенное покрытие	Инкубирование	анти-Tat	анти-V3
нет	буфер	0,132 ОП	0,15 ОП
нет	Tat	0,431 ОП	0,122 ОП
V3 (500 нг)	буфер	0,277 ОП	3 ОП
V3 (500 нг)	Tat	1 ОП	3 ОП

Таблица 1 бис
Ячейки с наслоенным Tat (100 нг) и блокированные бычьим сывороточным альбумином (БСА) (100 мкг)
Количество пептида V3-петли (нг)	0	50	100	200	500
анти-V3 антитело	0,119 ОП	0,181 ОП	0,285 ОП	0,435 ОП	0,787 ОП
анти-Tat антитело	1,438 ОП	1,545 ОП	1,51 ОП	1,515 ОП	1,567 ОП
Ячейки с наслоенным БСА (100 мкг)
Анти-V3 антитело	0,103 ОП	0,124 ОП	0,148 ОП	0,142 ОП	0,179 ОП

ПРИМЕР 3

Tat распознается антителами, направленными против

корецептора CCR5-ВИЧ

Поскольку петля V3 gp120 является, по всей видимости, основной детерминантой для выбора корецептора и использования штаммами ВИЧ, проводят эксперименты для выявления того, определяется ли способность Tat связываться с V3-пептидом наличием мимикрии с молекулами корецептора Tat. С этой целью анализируют по методу ИФТФА моноклональные антитела против главных корецепторов ВИЧ-1 (CCR5 и CXCR4) (Pharmingen) для определения, могут ли они распознавать Tat или Tat-пептиды, состоящие из специфических Tat-последовательностей и/или структурных или функциональных доменов. Известно, что указанные моноклональные антитела распознают конформационные эпитопы, присутствующие на корецепторах ВИЧ-1 (Lee B et al., J Biol. Chem., 1999; Baribaud F et al., J Virol. 2001). Соответственно, любое распознавание Tat данными антителами будет указывать на то, что Tat имеет структурное сходство с релевантным корецептором.

На планшеты для проведения ИФТФА наслаивают либо нативный Tat, либо один из указанных ниже Tat-пептидов (участок или участки, которым данные пептиды по существу соответствуют, приведены в скобках):

Tat (1-40) (N-концевой домен);

Tat (21-40) (цистеин-обогащенный участок-домен трансактивации);

Tat (36-50) (ядерный домен);

Tat (46-60) (основной домен-сигнал ядерной локализации);

Tat (56-70) (глютамин-обогащенный участок);

Tat (65-80) (последовательность RGD);

Tat (73-86) (последовательность RGD);

Tat (83-102) (С-концевой домен); и

Tat (21-58) (цистеин-обогащенный, ядерный и основной участки).

На стадии выявления используют моноклональные анти-CCR5 или анти-CXCR4. Анти-CCR5 специфически распознает рекомбинантный нативный Tat-белок, Tat(21-58)-пептид и, хотя и с меньшей эффективностью, Tat(46-60)-пептид. Результаты эксперимента показаны в Таблице 2. При этом, наоборот, не наблюдается реакции распознавания при использовании антител, направленных против CXCR4.

Таблица 2
Нанесенное покрытие	Антитела
	анти-CCR5	анти-CXCR4	CTR изолят	анти-Tat
Tat	1,452	0,085	0,081	3,000
Tat (1-20)	0,000	0,000	0,006	3,000
Tat (21-40)	0,000	0,133	0,082	0,1
Tat (36-50)	0,000	0,000	0,000	0,000
Tat (46-60)	0,466	0,000	0,063	0,000
Tat (56-70)	0,147	0,000	0,000	0,75
Tat (65-80)	0,000	0,000	0,000	0,1
Tat (73-86)	0,000	0,077	0,019	0,087
Tat (83-102)	0,000	0,058	0,000	0,000
Tat (21-58)	3,000	0,072	0,108	0,551

Известно, что анти-CCR5-антитела, используемые в данных экспериментах, распознают конформационный эпитоп, присутствующий во втором внеклеточном петлевом фрагменте CCR5 (ECL2), и нейтрализуются в случае ВИЧ (Lee B et al., J Biol. Chem., 1999). Кроме того, известно, что RCL2 вовлекается в конформационные изменения Env, ведущие к мембранному слиянию (Lee B et al., J Biol. Chem., 1999). Таким образом, полученные данные указывают на то, что Tat-последовательность, охватывающая и домен трансактивации Tat, и обогащенные основными группировками участки, имитирует на структурном уровне участок CCR5, вовлекаемый в клеточное слияние при распознавании gp120 CCR5.

ПРИМЕР 4

Нативный биологически активный Tat нужен для

распознавания CCR5 анти-CCR5-антителами

Данные, приведенные в Таблице 3, показывают, что Tat-последовательность, присутствующая в пептиде 21-58, способна к образованию складчатой структуры, имитирующей конформацию эпитопа в корецепторе CCR5. Для выявления того, требуется ли специфическая конформация Tat для распознавания анти-CCR5-антитела, способность нативного биологически активного Tat распознаваться анти-CCR5-антителами сравнивают в этом отношении с препаратам окисленного Tat, полученного при воздействии на белок воздуха и прямого освещения в соответствии с известной процедурой, устраняющей в существенной степени его биологическую активность (Fanales-Belasio, Immunology, 2001). Указанная процедура приводит к окислению -SH-групп и к образованию внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей между цистеиновыми остатками, присутствующими в домене трансактивации Tat. Известно, что трансактивирующие свойства Tat, в свою очередь, сказываются на активации экспрессии хозяйских генов, включающих корецепторы ВИЧ (Huang 1998; Secchiero 1999). Однако трансактивирующие свойства Tat теряются у мутанта трансактивации, в котором цистеин 22 замещен глицином (Tat-cys₂₂) (Caputo A et al., Gene Ther. 1996). Данный Tat-мутант, тем не менее, сохраняет иммуногенные свойства интактного состояния (Caselli E et al., J. Immunol. 1999). Таким образом, Tat-cys₂₂ также включается в указанный набор экспериментов.

На ячейки планшетов для ИФТФА наслаивают нативный Tat, окисленный Tat (Tat ОХ) или Tat-cys₂₂ и на стадии выявления используют анти-CCR5- и анти-CXCR4-антитела. Приведенные эксперименты показывают, что антитела специфически распознают рекомбинантный нативный Tat-белок и Tat-cys₂₂ мутант, но не распознают окисленный Tat-белок. Результаты показаны в Таблице 3. Тогда как взятые в качестве контроля поликлональные (от кролика) анти-Tat-антитела распознают, как и ожидалось, все белки с одинаковой эффективностью, указывая на то, что все ячейки были одинаково покрыты.

Таблица 3
Нанесенное покрытие	Антитела
	анти-CCR5	анти-CXCR4	CTR-изолят	анти-Tat
Tat	1,24	0,042	0,051	3
Tat ОХ	0,128	0,071	0,016	3
Tat-cys 22	0,75	0	0,026	3

Результаты данных экспериментов показывают, что Tat-последовательности, включающие в себя домен трансактивации Tat, ядерный участок и основной участок, подвергаются складчатому структурированию для имитации главного эпитопа, присутствующего на CCR5, и что точечная мутация, которая устраняет трансактивирующие свойства Tat, не мешает образованию эпитопа.

ПРИМЕР 5

Внеклеточный Tat усиливает инфицирование CD4+ чувствительных клеток под действием ВИЧ-1 и расширяет ВИЧ-1-тропизм в клеточных линиях с низкой экспрессией CCR5

Для выявления того, может ли Tat участвовать в процессе входа ВИЧ-1 в клетки путем имитации CCR5, необходимо определить эффекты Tat на вход ВИЧ в CCR5-независимой системе. С этой целью проводят эксперименты по инфицированию с тестированием одного цикла при использовании дефектного по репликации рекомбинантного варианта ВИЧ-1 с репортерным геном, кодирующим хлорамфениколацетилтрансферазу (САТ), который был подвергнут псевдотипированию с гликопротеином оболочки CXCR4-тропного изолята HXBc ВИЧ или CCR5-тропных ADA- или YU2-изолятов ВИЧ. Указанные дефектные по репликации вирусы (далее называемые R4-тропным HXBc2/HIV-CAT или R5-тропными ADA/ или YU2/HIV-CAT вирусами) входят в чувствительные клетки через образование CD4/CXCR4 или CD4/CCR5, интегрируют свои кДНК в клеточный геном и экспрессируют репортерный ген САТ, но они не могут продуцировать потомство, то есть не могут поддерживать дальнейшую инфекцию клеток через осуществление последующих циклов образования вирусов (Helseth E. J. Virol 1990). Таким образом, HIV-CAT-вирусы осуществляют один цикл инфекции целевых клеток, и количественный анализ уровня ацетилирования под действием САТ позволяет оценить эффективность ВИЧ-инфекции.

На основе данных, полученных в примерах 1-4, описанных выше, проводят эксперименты для выявления того, может ли Tat способствовать ВИЧ-инфекции, расширению ВИЧ-тропизма и придавать TCL-чувствительность при инфекции R5-тропными (то есть, моноцит/макрофаг-тропными) штаммами ВИЧ благодаря молекулярной мимикрии CCR5-корецептора Tat. С этой целью CEMss и клетки Jurkat, две TCL, экспрессирующие и CD4, и CXCR4, но утратившие способность к экспрессии CCR5, с образованием белка в количествах, выявляемых стандартными методиками проточной цитометрии или вестерн-блоттинга, или CD4-негативную клеточную линию 293 наносят на Tat-покрытые ячейки, которые предварительно инкубировались с HIV-CAT-вирусами, псевдотипированными с оболочкой X4-тропного штамма HXBc2 или CCR5-тропными штаммами ADA или YU2. Как и ожидалось, клеточные линии и CEMss, и Jurkat эффективно инфицируются HXBc2/HIV-CAT, тогда как не выявляется инфекции при использовании CD4-негативных клеток 293 из-за отсутствия первичного рецептора ВИЧ-1. В этой связи также удивительно, что и CEMss, и клетки Jurkat с высокой эффективностью подвергаются инфицированию ADA или YU2 псевдотипированными HIV-CAT, несмотря на то, что они, как известно, резистентны к инфекции R5-тропными штаммами ВИЧ-1. Таким образом, приведенные данные подтверждают неожиданное предположение о том, что иммобилизованный Tat способен увеличивать клеточный тропизм ВИЧ-1 по механизму молекулярной мимикрии специфических внеклеточных структурных доменов CCR5, то есть за счет придания CCR5-тропности штаммам, способным инфицировать TCL, экспрессирующие такие малые количества, что они не могут быть инфицированы в отсутствие Tat.

Дальнейшие эксперименты показали, что Tat_21-58, но не Tat_21-40, достаточно для того, чтобы способствовать инфицированию клеток CEMss R5-тропным ADA Сat-вирусом, что указывает на то, что участок Tat, опосредующий связывание с V3-петлей gp120, тот же, что и требуется для расширения ВИЧ-тропизма.

ПРИМЕР 6

Анти-CCR5-антитела, но не анти-CXCR4-антитела блокируют

Tat-поддерживаемую инфекцию клеточных линий с низкой

экспрессией CCR5

Для того, чтобы дополнительно продемонстрировать, что иммобилизованный Tat расширяет клеточный тропизм R5-тропных штаммов ВИЧ-1 путем имитации CCR5, проводят эксперимент для определения, могут ли активные молекулы, способные блокировать CCR5, блокировать также и Tat-поддерживаемую инфекцию CD4-негативных клеток. С этой целью CD4+/CCR5-клетки CEMss (CCR5 RТ-PCR-положительные) высевают в присутствии антител против CCR5, CXCR4 или CCR3 в ячейки с наслоенным Tat, которые предварительно инкубировались с клеточными супернатантами, содержащими R5-тропный рекомбинантный вирус ADA/HIV-CAT с одним раундом инфекции. Tat-поддерживаемая инфекция полностью устраняется анти-CCR5-антителом, тогда как при использовании анти-CXCR4 или CCR5-антител не наблюдается снижения инфекционности в сравнении с контролем. Поскольку клетки CEMss являются CCR5-негативными на уровне белка, полученные данные указывают на то, что блокирующая активность антител определяется их способностью распознавать структурные мотивы Tat, имитирующие конформационные эпитопы CCR5, как было подробно описано в примерах 3 и 4. Кроме того, полученные данные подтверждают, что молекулярная мимикрия CCR5 со стороны Tat нужна для входа CCR5-тропных штаммов ВИЧ-1 в CCR5-негативные клетки.

ПРИМЕР 7

Комплексы между Tat и Env являются новыми иммуногенами

Для определения того, представляют ли собой комплексы Tat/Env новые иммуногены, то есть становятся доступными криптические эпитопы, мышей иммунизируют смесями: белков Tat и Env, в отношении которых известно, что в них экспонирована петля V3; Tat и пептид петли V3; или только антигенами, в качестве контроля. Принцип данного эксперимента основан на предположении, что в обоих указанных антигенах объединенный репертуар B-клеточного эпитопа будет отличаться от такового в единичных антигенах, поскольку генерируются новые эпитопы, становятся доступными криптические эпитопы и/или ранее существовавшие эпитопы скрываются при образовании комплекса.

Соответственно, предполагается, что некоторые комплексы будут расширять и/или повышать интенсивность гуморальных ответов против Tat и/или Env, а другие будут сужать/снижать по меньшей мере часть из них, в зависимости от природы комплекса и от того, экспонируются или закрываются генерированные B-клеточные эпитопы.

Были выбраны три молекулы Env: мономерный gp120 дикого типа (Env дикого типа), который, как было показано, генерирует более интенсивные антительные реакции против петли V3, что связано с лучшим экспонированием петли V3 в сравнении с тримерной формой, присутствующей в оболочке вируса (Fouts TR et al., J. Virol, 1997; Earl PL et al., J. Virol, 1994), тримерной формой gp140 молекулы Env, которая сохраняет часть gp41 и не содержит петли V2 ( V2Env) и в которой, как известно, экспонирована петля V3 (Srivastava IK et al., J. Virol, 2003, Vol. 77:11244-11259); и циклический пептид, соответствующий петле V3. С целью подтверждения доступности петли V3 для выбранных молекул Env, проводят ИФТФА мономерного Env дикого типа и тримерного V2Env для определения их реактивности против поликлональных антител к участку V3-петли, получив положительные результаты.

В первом 2-ступенчатом эксперименте мышей иммунизируют Tat, Env дикого типа, V2Env или сочетанием Tat и Env дикого типа или Tat и V2Env (в присутствии квасцов в качестве адъюванта) в дни 0, 14 и 28. Гуморальные ответы (титры IgG) анализируют методом ИФТФА с использованием мышиной сыворотки, взятой в день 38. Титры анти-Env-IgG очень сильно повышаются у мышей, вакцинированных сочетанием Tat и V2Env, в сравнении с мышами, иммунизированными одним только V2Env. Тогда как они были сравнимыми у мышей, иммунизированных сочетанием Env дикого типа и Tat или одним только Env дикого типа. Кроме того, титры антител против Tat снижаются при его сочетании с Env дикого типа, но не при сочетании с V2Env.

Полученные данные подтверждают тот факт, что сочетание Tat с Env дикого типа или V2Env приводит к образованию нового вида молекул (комплексов), отличающихся наличием нового детерминантного репертуара B-клеточного эпитопа. Дополнительно, они показывают, что комплекс Tat/ V2Env обладает способностью в значительно мере повышать гуморальные анти-Env-ответы, защищая от проявления высоких титров анти-Tat-антител, которые при вакцинации Env дикого типа, наоборот, подавляются. Поскольку мономерный Env дикого типа экранируется большим количеством ВИЧ и инфицированными клетками, данный вывод согласуется с низкой частотой встречаемости анти-Tat-антител при естественной инфекции (Butto et.al., J. Infect Dis, 2002; Rezza et al. J. Infect Dis, в печати).

Мышей иммунизируют Tat, пептидом петли V3 или сочетанием Tat и пептида петли V3 в квасцах. Следует отметить, что сам пептид петли V3 не обладает иммуногенностью, не проявляя или демонстрируя лишь пограничные титры антител, тогда как сочетание Tat и пептида петли V3 в значительной мере повышает титры антител против петли V, не оказывая воздействия на титры антител против Tat.

Таким образом, полученные данные показывают, что комплексы Tat/Env или Tat/петля V3 представляют собой новые иммуногены, способные проявлять более высокие или новые иммунные ответы. В частности, комплекс Tat, в сочетании с V2Env или пептидом петли V3, лучше индуцирует гуморальные ответы против Env-ВИЧ, которые отличаются от ответов, проявляемых соответствующими отдельными антигенами или комплексом, образованным между Tat и Env дикого типа.

ПРИМЕР 8

Комплексообразование Tat и Env изменяет характер

распознавания антителами индивидуальных эпитопов,

присутствующих на Env

Для определения того, индуцируют ли комплексы Tat/Env гуморальные ответы, направленные против эпитопов Env, отличающихся от тех, которые распознаются при иммунизации молекулами одного только Env, сыворотки, взятые от тех же мышей, что и в первом протоколе иммунизации, описанном в примере 7, используют для анализа реактивности со специфическими эпитопами Env В-клеточной линии. С этой целью 15-членные пептиды, охватывающие Env дикого типа или V2Env (SHIV-1 SF162.P3), смешивают с образованием пула пептидов, состоящих из трех непрерывных 15 остатков (то есть, охватывающих участок из 45 аминокислот в Env или V2Env) и три 15-членных варианта, каждый из которых перекрывает область соединения между двумя соприкасающимися пептидами.

Сыворотки мышей, иммунизированных Env дикого типа или V2Env в сочетании с Tat, распознают линейные эпитопы, присутствующие на участке между остатками 77-132, то есть охватывающем первые 14 аминокислот в петлевом фрагменте V1 ВИЧ-1. И наоборот, указанные эпитопы не распознаются сыворотками мышей, иммунизированных Env или V2Env, которые используются в виде отдельных антигенов. Ввиду делеции петли V2 в V2Env только Env дикого типа выявляет антитела, направленные против петли V2, и реактивность в значительной мере повышается при сочетании с Tat. И наоборот, иммунизация одним только Env дикого типа выявляет сильную реактивность против участка, охватывающего остатки 28-83 в Env-SF162-ВИЧ, которая полностью теряется при совместной иммунизации с Tat. Приведенные данные показывают, таким образом, что взаимодействие между Tat и Env или DV2Env делает доступными/скрывают линейные Env/ V2Env-эпитопы, что соответствует образованию комплекса.

Существенно, что сыворотки мышей, иммунизированных Tat в сочетании с V2Env, но не одним только V2Env, демонстрируют сильную реактивность против участка, охватывающего N- и C-спиральную область gp41, что указывает на конформационные модификации gp41, которые, как известно, происходят при связывании Env с CD4 и, в свою очередь, петли V3 относительно CCR5 или других корецепторов, которые, как известно, необходимы, предшествуя слиянию вирусной оболочки и клеточной мембраны. Таким образом, полученные данные соответствуют представлению о связывании Tat с петлей V3 и наличии мимикрии ССR5-связывания с Env, необходимого для входа вируса в клетку. Наиболее важен тот факт, что полученные данные указывают на способность комплекса между Tat и V2Env индуцировать антитела против gp41-ВИЧ и, тем самым, на его способность нейтрализовать инфекционность вируса.

Указанные линейные эпитопы gp41 не распознаются сыворотками мышей, иммунизированных одним только V2Env, и это указывает на то, что комплекс между Tat и V2Env представляет собой новый иммуноген.

Аналогичное изменение в механизме распознавания эпитопа вполне вероятно и случае конформационных эпитопов.

ПРИМЕР 9

Повышение титров анти-Env-антител при иммунизации Tat/ V2Env

или комплексами V3 петлевого пептида связано с образованием новых/усиленнных B-клеточных эпитопов, присутствующих в комплексе, и не связаны с повышением Th2-ответов против Env

В данной области хорошо известно, что ответы Т-хелперного типа 2 (Th2), такие как образование интерлейкина 4 (IL-4) Т-клетками, относятся к ключевой реакции при генерировании гуморальных ответов против антигенов. Таким образом, повышение титра анти-Env-антител, выявляемое при иммунизации Tat в сочетании с V2Env или пептидом петли V3, может быть, по меньшей мере частично, объяснено, в дополнение к образованию новых эпитопов на комплексе, повышением и/или расширением Th2-ответов против Env. Исходя из этого, авторы изучили влияние иммунизации комплексами Tat/ V2Env на Th2-ответы.

С этой целью мышей иммунизируют сочетанием Tat и V2Env или одним только V2Env (см. пример 7, протокол исследования) и оценивают антиген-специфичные клеточные ответы против Env в тесте ELISPOT на IL-4. Данный тест позволяет определить уровень образования IL-4 и используется для оценки Th2 ответов против антигенов или пептидов T-клеточных эпитопов. Анти-Env клеточные ответы оценивают с использованием матриц пептидных пулов, содержащих 15-членный Env (с перекрыванием по 11 аминокислотам), полностью охватывающий молекулу V2Env. Проведенные эксперименты показывают, что иммунизация с использованием V2Env в сочетании с Tat не повышает или не расширяет Th2-ответы против Env, в сравнении с иммунизацией одним V2Env, выявляя Th2-ответы, направленные против тех же самых Env-эпитопов. Таким образом, полученные данные указывают на то, что повышение титров антител против Env при иммунизации Tat в сочетании с V2Env или с петлей V3, связано с генерированием/экспонированием новых/усиленных B-клеточных эпитопов при образовании комплекса.

ПРИМЕР 10

Tat расширяет клеточные ответы на Env у мышей, подвергшихся совместной иммунизации обоими антигенами

Известно, что Tat может функционировать как адъювант, повышающий клеточные иммунные ответы против антигенов, и поляризует иммунный ответ в сторону Th1 фенотипа (Fanales Belasio et al., J Immunol 2002; Ensoli B., WO 03/009867). Дополнительно Tat расширяет Th1-ответы против антигенов за счет изменения их процессинга протеосомами (Ensoli et al., PCT/EP2004/11950). Указанное изменение приводит к индукции ответов против антиген-цитотоксических T-клеточных (CTL) эпитопов, которые в норме являются субдоминантными (Ensoli et. al., PCT/EP2004/11950).

Для изучения эффектов иммунизации сочетанием Tat и Env в комплексе на Th1-ответы и поляризации под действием Tat анализируют образование IFN (типичного Th1 цитокина) клетками селезенки мышей, иммунизированных сочетанием Tat и V2Env или одним только V2Env, с использованием матриц пептидных пулов, содержащих 15-членные Env (с перекрыванием по 11 аминокислотам) (см. пример 7 с описанием протокола исследований). Анти-Env g-ELISPOT выявляет Env-специфические Т-клеточные ответы против большего числа пептидных пулов и эпитопов (данные не показаны) у мышей, иммунизированных Tat+ V2Env, чем у мышей, иммунизированных одним только V2Env. Полученные данные указывают на то, что Tat в сочетании с V2Env сохраняет способность расширять Th1-ответы против Env у иммунизированных мышей, что уже было показано для Tat, объединенного с Env дикого типа (Ensoli et. al., PCT/EP2004/11950). Исходя из этого Env-комплексы могут использоваться в качестве иммуногенов для индукции эффективных/нейтрализующих гуморальных ответов и в то же самое время для расширения CTL-ответов против Env.