способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека

Формула изобретения

Способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека, включающий микробиологический синтез белка-предшественника путем культивирования бактерий Escherichia coli, содержащих плазмиды с геном интерферона-альфа2b человека и нуклеотидной последовательностью, кодирующей сайт протеолиза энтеропептидазой Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, расположенный перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей зрелую часть интерферона-альфа2b человека, с последующим выделением телец включения синтезированного предшественника, частичную ренатурацию выделенного предшественника в присутствии препятствующего замыканию дисульфидных связей дитиоэритритола, гидролиз предшественника ферментом энтеропептидазой с образованием безметионинового интерферона-альфа2b человека, а после завершения реакции гидролиза предшественника полную ренатурацию интерферона-альфа2b человека в присутствии пары соединений цистин и цистеин и очистку полученного безметионинового интерферона-альфа2b человека методом хроматографии на КМ-сефарозе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности, медицинской биотехнологии, генной инженерии и представляет способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека.

Использование интерферонов в медицинской практике позволяет добиться значительных успехов в терапии онкологических и вирусных заболеваний [Pestka S. et al. Inter-ferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev. 2004, 202:8-32; Masci P. et al. New and modified interferon alias: preclinical and clinical data. Curr Oncol Rep. 2003, 5(2):108-13]. В настоящее время широчайшее применение находят рекомбинантные интерфероны-альфа, полученные экспрессией в бактериях Escherichia coli [Baron E. et al. From cloning to a commercial realization: human alpha interferon. Crit Rev Biotechnol. 1990, 10(3):179-90.].

Основная проблема при выделении и очистке таких рекомбинантных белков - это наличие N-концевого метионина с остатком муравьиной кислоты. В норме в E.coli этот формилированный метионин удаляется двумя ферментами: пептидил-деформилазой, удаляющей остаток муравьиной кислоты с метионина, и метионинаминопептидазой, удаляющей сам N-концевой метионин. Но при суперэкспрессии в бактериях рекомбинантных белков количеств данных ферментов не хватает для эффективного протеолиза [Meinnel Т, Mechulam Y, Blanquet S. Methionine as translation start signal: a review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli. Biochimie. 1993; 75(12):1061-75.].

В заявляемом способе предложено использовать фермент энтеропептидазу, которую с успехом используют в белковой инженерии [Mann NS et al. Enterokinase. Proc Soc Exp Biol Med. 1994; 206(2):114-8; Light A. et al. Enterokinase (enteropeptidase): comparative aspects. Trends Biochem Sci. 1989; 14(3):110-2]. Субстратом данного фермента является пептидная последовательность из 4-х остатков аспарагиновой кислоты и лизина - Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (D₄K в однобуквенном коде) [Likhareva VV et al. New substrates for enteropeptidase. I. Biologically active hepta-nonapeptides. Bioorg Khim. 2003 (2): 129-34.]. Таким образом, введя данный пептидный участок в аминокислотную последовательность интерферона-альфа2b человека непосредственно после N-концевого формилметионина, можно, после обработки энтеропептидазой, получить готовый к использованию безметиониновый интерферон-альфа2b человека.

Сведений об использовании энтеропептидазы для получения безметионинового интерферона-альфа2b человека в источниках информации не обнаружено.

Ближайшим аналогом заявляемого способа является способ (KR 20000065580) получения безметионинового интерферона-альфа2b человека путем его выщепления ферментом метионинаминопептидазой из синтезированного в клетках штамма E.coli КССМ 10053 белка-предшественника, являющегося метионинсодержащим интерфероном-альфа2b человека.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала способов получения безметионинового интерферона-альфа2b человека.

Задачу решают путем конструирования

- рекомбинантной плазмидной ДНК pSX51, кодирующей синтез предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека, имеющей размер 3236 п.н., содержащей ген интерферона-альфа2b человека с сайтом Asp-Asp-Asp-Asp-Lys для протеолиза энтеропептидазой под контролем лактозного и триптофанового промотеров, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1;

- рекомбинантной плазмидной ДНК pIAH-417, кодирующей синтез предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека, имеющей размер 6177 п.н., содержащей ген интерферона альфа-2b человека с сайтом Asp-Asp-Asp-Asp-Lys для протеолиза энтеропептидазой и гексагистидиновым тагом под контролем индуцибельного промотера поздних генов фага Т7, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2;

- рекомбинантного штамма Escherichia coli ВКПМ В-10390 - продуцента предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека, полученного трансформацией штамма Escherichia coli BL21 плазмидной ДНК, содержащей ген, соответствующий нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 1;

- рекомбинантного штамма Escherichia coli ВКПМ В-10391 - продуцента предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека, полученного трансформацией штамма Escherichia coli BL21DЕ3 плазмидной ДНК, содержащей ген, соответствующий нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 2,

а также разработки способа получения безметионинового интерферона-альфа2b человека путем микробиологического синтеза его предшественника путем культивирования бактерий Escherichia coli, содержащих плазмиды с генами интерферона-альфа-2b человека и сайт протеолиза энтеропептидазой Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, выделение телец включения синтезированного предшественника, частичную ренатурацию выделенного предшественника в присутствии препятствующего замыканию дисульфидных связей дитиоэритритола, гидролиз предшественника ферментом энтеропептидазой с образованием безметионинового интерферона альфа-2b человека, а после завершения реакции гидролиза предшественника полную ренатурацию интерферона альфа-2b человека в присутствии способствующей замыканию дисульфидных связей пары соединений цистин и цистеин, с последующей очисткой безметионинового интерферона альфа-2b человека методом хроматографии на КМ-сефарозе.

Для решения задачи получают рекомбинантную плазмидную ДНК pSX51, состоящую из мультикопийного вектора pSX с включенным в него геном гибридного интерферона-альфа2b человека под контролем лактозного (P_lac) и триптофанового промотеров (P_trp). Ген гибридного интерферона-альфа2b представляет собой лидерный пептид Met-Ala-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (MAD₄ K), обеспечивающий эффективный протеолиз по сайту D₄ K ферментом энтеропептидазой, и структурную часть гена интерферона-альфа2b человека с нуклеотидными заменами, обеспечивающими эффективный синтез белка в E.coli (37 (А С), 39 (G T), 40 (A C), 42 (G T), 67 (A C), 69 (G T), 70 (A C), 72 (A T), 96 (G A), 100 (A C), 102 (A T), 114 (A C), 120 (C G), 126 (G A), 129 (G A), 330 (С G), 339 (G A), 342 (G A), 487 (A C), 489 (A T), 495 (G A)). Штамм E.coli BL21, трансформированный рекомбинантной плазмидой pSX51, за 12-14 часов ферментации накапливает 200 мг предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека на 1 л культуральной жидкости при культивировании в минеральной среде М9 (мас.%: Na₂HPO₄ - 17,2, КН ₂РO₄ - 3, NaCl - 0,5, NH₄Cl - 0,1, вода - остальное), содержащей 2 мл/л 1М MgSO₄x7H ₂O, 1% кислотного гидролизата казеина, 1% глюкозы исходно и 40 мкг/мл канамицина сульфата при температуре 38-39°С. Наблюдаемый эффект достигается, во первых, за счет введения в реципиентную клетку Е.coli мультикопийного вектора (количество копий клонированного гена составляет 200-300 копий на геномный эквивалент), а, во-вторых, за счет использования двух сильных конститутивных промотеров, обеспечивающих эффективную транскрипцию клонированного гена. Заявляемый штамм E.coli BL21/pSX51 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-10390.

Для решения задачи получают также рекомбинантную плазмидную ДНК pIAH-417, состоящую из вектора рЕТ16b с включенным в него геном гибридного интерферона-альфа2b человека под контролем индуцибельного промотера поздних генов фага Т7. Отличие гена гибридного интерферона-альфа2b человека в составе вектора pIAH-417 от такового в составе вектора pSX51 состоит во введении дополнительного участка нуклеотидной последовательности, кодирующей 6 остатков гистидина перед сайтом D₄K4 . Штамм E.coli BL21DE3, трансформированный рекомбинантной плазмидой pIAH-417 за 12-14 часов ферментации в среде LB/M9 (мас.%: NaCl - 1, бакто-триптона - 1, дрожжевого экстракта - 0,5, 2 мл/л 2М NaOH, среда М9 - остальное), содержащей 0,2% фруктозы исходно и 150 мкг/мл ампициллина, при температуре 37°С накапливает 100 мг предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека на 1 л культуральной жидкости. Условия индукции Т7-промотера: 20 г лактозы на 1 л культуральной среды; индукция проводится по достижении плотности бактериальной культуры 15 опт.ед. Заявляемый штамм E.coli BL21DE3/pIAH-417 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-10391.

Конструирование штамма ВКПМ В-10390 и способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека с использованием этого штамма состояли из нескольких этапов.

Этап 1. Создание генно-инженерными методами гена гибридного интерферона-альфа2b человека, содержащего последовательность, кодирующую лидерный пептид MAD₄K, и введение в данный ген сайтов для эндонуклеаз рестрикции.

Этап 2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pSX51, основными характеристиками которой являются высокая копийность (200-300 копий на геномный эквивалент), удобный селективный маркер (устойчивость к антибиотику канамицину), 2 сильных промотера, обеспечивающих в штаммах E.coli эффективную экспрессию клонированного гена интерферона-альфа2b.

Этап 3. Трансформация сконструированной рекомбинантной плазмидой pSX51 штамма E.coli BL21, подтверждение соответствия нуклеотидной последовательности клонированного гена с последовательностью гена гибридного интерферона-альфа2b.

Этап 4. Ферментация полученного штамма E.coli BL21/pSX51 на минеральной среде М9, содержащей 1% кислотного гидролизата казеина, 1% глюкозы, 40 мкг/мл канамицина сульфата, при температуре 38-39°С.

Этап 5. Выделение из культуральной жидкости телец включения и растворение в 6М гуанидине. Частичная ренатурация белка и обработка ферментом энтеропептидазой.

Этап 6. Завершение ренатурации и очистка интерферона-альфа2b человека без N-концевого метионина от негидролизованной формы путем ионообменной хроматографии на карбоксиметилсефарозе (КМ-сефароза).

Конструирование штамма ВКПМ В-10391 и способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека с использованием этого штамма состояли из тех же этапов, что и в случае штамма ВКПМ В-10390, за несколькими исключениями: 1) ген гибридного интерферона-альфа2b человека содержал последовательность, кодирующую лидерный пептид MAH₆D₄K; 2) селективный маркер вектора pIAH-417 - устойчивость к антибиотику ампициллину; 3) используемый промотер - индуцибельный промотер поздних генов фага Т7; 4) сконструированной рекомбинантной плазмидой pIAH-417 трансформируют штамм E.coli BL21DE3; 5) ферментация полученного штамма E.coli BL21DE3/pIAH-417 осуществляется в среде LB/M9, содержащей 0,2% фруктозы исходно и 150 мкг/мл ампициллина, при температуре 37°С; 6) очистку интерферона-альфа2b человека без N-концевого метионина от негидролизованной формы проводят либо путем ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе, либо хроматографической очистки на Ni-NTA-агарозе, либо последовательно путем ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе и хроматографической очистки на Ni-NTA-агарозе.

Штаммы E.coli ВКПМ В-10390 и E.coli ВКПМ В-10391 обладают следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

1. Морфологические признаки. Клетки - прямые палочки, 1,1-1,5×2.0-6,0 мкм, подвижные за счет перитрихальных жгутиков, грамотрицательные, неспороносные.

2. Культуральные признаки. Клетки штамма хорошо растут на стандартных, описанных для E.coli средах. При выращивании на полноценных агаризованных средах (LB-агар, агаризованная среда Хоттингера) колонии блестящие, гладкие, круглые, с ровными краями. При 37°С достаточно 12-14 часов роста. При выращивании в жидких средах в пробирках клетки образуют равномерную муть, достигая оптической плотности 2,4-2,6 при длине волны 600 нм за 10-12 часов роста при 37°С.

3. Физиолого-биохимические признаки. Температурный оптимум для роста клеток 37°С, факультативный анаэроб, оксидазоотрицательные, каталазоположительные, отрицательные по признакам образования H₂S, гидролиза мочевины и активности липазы, катаболизируют D-глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты и газа, источником азота могут служить минеральные соли в аммонийной форме, а также органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта и аминокислот.

4. Генотипические признаки. Основной генотипический признак заявляемого штамма E.coli ВКПМ В-10390 (В F^- dcm ompT hsdS(r_B- m_B-) gal) состоит в наличии гена предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека (с последовательностями, кодирующими сайт D₄ K для протеолиза ферментом энтеропептидазой) под регуляцией лактозного (P_lac) и триптофанового промотеров (P_trp ), интегрированного в состав многокопийного экспрессионного вектора, содержащего в качестве селективного маркера ген устойчивости к канамицину. Основной генотипический признак заявляемого штамма E.coli ВКПМ В-10391 (В F^- dcm ompT hsdS(r_B- m_B-) gal (DE3)) состоит в наличии гена предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека (с последовательностями, кодирующими сайт D₄K для протеолиза ферментом энтеропептидазой и гексагистидиновой участок для очистки на Ni-NTA-агарозе) под регуляцией индуцибельного Т7-промотера, интегрированного в состав экспрессионного вектора, содержащего в качестве селективного маркера ген устойчивости к ампициллину.

5. Устойчивость к антибиотикам. Устойчивость к канамицину у штамма E.coli ВКПМ В-10390 не ниже 50 мкг/мл на твердых агаризованных средах, при наращивании в жидких полноценных средах - не менее 40 мкг/мл. Устойчивость к ампициллину у штамма E.coli ВКПМ В-10391 не ниже 150 мкг/мл на твердых агаризованных средах, при наращивании в жидких полноценных средах - не менее 120 мкг/мл.

6. Стабильность плазмиды pSX51 в штамме E.coli ВКПМ В-10390 и плазмиды pIAH-417 в штамме E.coli ВКПМ В-10391. При хранении клеток на агаризованной среде (сроком до 1 месяца), при серии последовательных пересевов (в течение не менее 6 месяцев) и в процессе культивирования в жидкой среде с антибиотиком не происходит потери и перестройки плазмид.

Способ в общем виде

Процесс биосинтеза предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека в штаммах E.coli включает стадии получения посевного материала, основную ферментацию, получение биомассы и выделение из нее фракции телец включения. Выращивание посевного материала и основную ферментацию штамма-продуцента предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека осуществляют в аэробных условиях.

- на минеральной среде М9, содержащей 2 мл/л 1М MgSO₄×7H₂ O, 1% кислотного гидролизата казеина и 1% глюкозы исходно. В среду вносят канамицин в концентрации 40 мг/л. Биомассу выращивают при рН 7.0-7.4 и температуре 38°С-39°С до концентрации 20 оптических единиц (опт.ед.).

Или

- на среде LB/M9, содержащей 0,2% фруктозы исходно. В питательные среды вносят ампициллин в концентрации 150 мг/л. Биомассу выращивают при рН 7.0-7.4 и температуре 37°С.

После завершения процесса ферментации бактериальные клетки отделяют от культуральной среды центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 минут при температуре 4°С и ресуспендируют в буферном растворе, после чего выделяют фракцию телец включения [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. Для последующего выделения предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека тельца включения растворяют в 8М гуанидине-НСl и далее проводят частичную ренатурацию белка-предшественника с добавлением восстановителя дитиоэритритола (ДТЭ), предотвращяющего замыкание SH-связей, при температуре 4°С в течение 7-9 часов. Далее ренатурационный раствор закисляют до рН 4,8 и добавляют фермент энтеропептидазу и CaCl₂ (конечные концентрации 0,2 U/мл и 2 мМ соответственно). В нашей работе использовали энтеропептидазу, выделенную в ФГУП «ГосНИИгенетика» из слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки свиней и очищенную последовательными хроматографиями на DEAE-целлюлозе, бензоамидин-агарозе и Butyl-Toyopearl; для финальной очистки использовали гель-фильтрацию на Toyopearl HW55. Удельная активность полученного препарата составляла 330 U/мг белка, или 12 U/мл (за 1 U энтерокиназной активности принято количество фермента, способного продуцировать за 1 мин при рН 5,0 и 25°С 1 нмоль трипсина из трипсиногена). Препараты энтерокиназы хранили в 50 мМ Трис-НСl буфере, рН 8, содержащем 0,5 М NaCl и 50% глицерин, при -20°С. Гидролиз предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека энтеропептидазой проводят в течение 16 часов при температуре 14°С-16°С. Ферментативную реакцию останавливают добавлением раствора мочевины (конечная концентрация 1М), затем добавляют пару соединений цистин и цистеин (конечная концентрация 1 мМ), способствующих замыканию дисульфидных связей, и доводят рН до 8,0 для осуществления полной ренатурации образовавшегося безметионинового интерферона-альфа2b человека. Смесь выдерживают при температуре 4°С в течение 24 час, а затем переходят к стадии хроматографической очистки. Ионообменное разделение безметионинового интерферона-альфа2b человека от негидролизованной формы предшественника проводят на карбоксиметил-сефарозе (КМ-сефарозе) в градиенте рН 5,0-7,0 [Препаративная жидкостная хроматография, под ред. Б.Бидлингмейера. - М.: Мир, 1990].

Заявляемая группа изобретений иллюстрируется следующими чертежами.

Фиг.1. Физико-генетическая карта рекомбинантной плазмиды рSХ51.

Рекомбинантная плазмида рSХ51 состоит из следующих фрагментов ДНК.

1) Последовательность с 1 нуклеотида по 194 нуклеотид (н.) включает фрагмент ДНК размером 194 п.о., содержащий триптофановый промотер (P_trp) и последовательность Шайн-Дальгарно, ответственную за инициацию трансляции. 2) Последовательность с 195 н. по 713 н. включает фрагмент ДНК размером 519 п.о., содержащий ген интерферона альфа2b с сайтом для энтеропептидазы (МАD₄К-интерферон-альфа2b). 3) Последовательность с 714 н. по 1156 н. включает фрагмент ДНК размером 442 п.о., содержащий последовательность строгого терминатора транскрипции rrnBT₁T₂. 4) Последовательность с 1157 н. по 2063 н. включает фрагмент ДНК размером 906 п.о., содержащий промотор гена -лактамазы и структурную область гена kan. 5) Последовательность с 2064 н. по 3236 н. включает фрагмент ДНК размером 1173 п.о., содержащий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды (ori) и lac промотер (P_lac). XbaI и PstI - сайты рестрикции.

Фиг.2. Физико-генетическая карта рекомбинантной плазмиды pIAH-417.

Последовательность рекомбинантной плазмиды pIAH-417 соответствует стандартному вектору для клонирования pET16b (Novagen, США, кат.номер 69662-3) за исключением вставки по сайтам рестрикции Ncol и BamHI гена МАН₆D₄ К-интерферона-альфа2b. NcoI и BamHI - сайты рестрикции. Amp-R - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину. Ori - последовательность, ответственная за репликацию плазмиды. LacI - ген репрессора LacI. T7-promoter - индуцибельный промотер поздних генов фага Т7.

Фиг.З. Электрофоретическое разделение в денатурирующем 12% ПААГ фракций телец включения Escherichia coli.

М - белковые маркеры с известными молекулярными массами. 1 - образцы телец включения E.coli BL21/pSX50 (интерферон-альфа2b человека), 2 - образцы телец включения E.coli BL21/pSX51 (МАD₄К-интерферон-альфа2b), 3 - образцы телец включения E.coli BL21DE3/pIAH-417 (МАН₆D ₄К-интерферон-альфа2b).

Фиг.4. Разделение безметионинового интерферона от негидролизованной формы белка путем ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе.

Ионообменное разделение безметионинового интерферона-альфа2b от негидролизованной формы проводят на КМ-сефарозе в градиенте рН 5,0-7,0. Элюирование исследуемых веществ осуществляли градиентом рН: в качестве буфера А использовали 50 мМ MES-Na рН 5,0, буфером Б служил 50 мМ MES-Na рН 7,0 (все буферы содержат 1 мМ ЭД-ТА). По оси абсцисс отложено время (в минутах), по оси ординат - оптическая плотность (в тысячных долях единиц поглощения).

Фиг.5. Электрофоретическое разделение в 12% ПААГ хроматографических фракций.

Номера фракций на фиг.5 соответствуют номерам фракций на фиг.4. Фракции 5 и 6 являются очищенным безметиониновым интерфероном-альфа2b человека.

Пример 1. Конструирование гена MAD₄K-IFNальфа2b и создание плазмиды pSX51.

Ген MAD₄K-IFNальфа2b получают из ДНК исходной плазмиды pSX50 с геном интерферона-альфа2b человека (предоставлена ООО «Фармапарк» по RU 2319502) методом ПЦР с использованием пары праймеров IFNd4k (5'-GCCTCTAGATGGCGGATGATGATGATAAATGTGATCTGCCTCAAACC-3') и IFN-R (5'-CAGCTGCAGGTCGACGGATCCTC-3'). Состав реакционной смеси: 10х буфер для ПЦР (конечная концентрация в смеси: 75 mM Tris-HCl (рН 8.8 at 25°C), 20 mM (NH₄)₂ SO₄, 0.01% (v/v) Tween 20) - 2 мкл, 25 mM MgCl ₂ (конечная концентрация - 2.5 mM) - 2 мкл, 1.25 mM dNTP (конечная концентрация - 0.125 mM) - 2 мкл, праймеры IFNd4k и IFN-R - по 5 pmol на реакцию каждого, ДНК pSX50 - 2 нг на реакцию, Taq-полимераза - 5 ед.акт. на реакцию, mQ H₂O (деионизованная) - до 20 мкл. Амплификацию проводят в условиях: предварительная денатурация 94°С - 2 мин, 25 циклов (денатурация 94°С - 10 сек, отжиг праймеров 60°С - 10 сек, элонгация 72°С - 20 сек), заключительная элонгация 72°С - 5 мин. Полученную в ходе ПЦР ДНК наносят на 1% агарозный гель, проводят электрофорез, фрагмент соответствующий размерам гена, вырезают и очищают с помощью набора для выделения Fermentas (Литва). Для проведения дальнейшего клонирования получают плазмиду pSX50 с вырезанным по сайтам XbaI и PstI геном IFNальфа2b (pSX50 rest.). Состав реакционной смеси рестрикции: плазмида pSX50 - 2 мкл (200 нг), 10х буфер Trango Yellow+ (Fermentas (Литва); конечная концентрация в смеси: 33 mM Tris-acetate, рН 7,9, 10 mM Mg-acetate, 66 mM K-acetate, 0,1 mg/ml BSA) - 2 мкл, рестриктаза XbaI - 1 мкл (10 ед.акт.), рестриктаза Pst I - 1 мкл (10 ед.акт.), mQ H₂ O - 14 мкл. Далее плазмиду pSX50 rest. и ген MAD₄K-IF Nальфа2b объединяют в молярном соотношении 1:8 (плазмида: вставка) и рестрицируют по сатам XbaI и PstI. Состав реакционной смеси рестрикции: плазмида pSX50 rest - 2 мкл (150 нг), ген MAD ₄K-IF Nальфа2b - 5 мкл (200 нг), 10х буфер Trango Yellow+ (Fermentas (Литва); конечная концентрация в смеси: 33 mM Tris-acetate, рН 7,9, 10 mM Mg-acetate, 66 mM K-acetate, 0,1 mg/ml BSA) - 2 мкл, рестриктаза XbaI - 1 мкл (10 ед.акт.), рестриктаза Pst I - 1 мкл (10 ед.акт.), mQ H₂O - 9 мкл. Рестрикции проводят при 37°C в течение часа. Полученную смесь осаждают 2,5 объемами 96% этанола с добавлением 1/10 по объему ЗМ ацетата натрия (рН 5,0) в течение 30 минут на -70°C. Далее осадившуюся ДНК откручивают на центрифуге при 13400 об/мин в течение 7 минут, промывают 70% этанолом, центрифугируют еще 2 минуты при 13400 об/мин и высушивают на вакуумной сушке.

Полученную смесь расщепленных гена и плазмиды лигируют в течение 1 часа при 20°C. Состав реакционной смеси лигирования: 10х буфер для лигирования (Fermentas (Литва); конечная концентрация в смеси: 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2,5 mМ АТР (рН 7.8 при 25°C)) - 2 мкл, рестриктная смесь pSX50 rest и MAD₄K-IFNальфа2b - 10 мкл, Т4-лигаза - 1 мкл (5 ед.акт.), mQ H₂O - 7 мкл. Полученную лигазную смесь осаждают 2,5 объемами 96% этанола с добавлением 1/10 по объему З М ацетата натрия (рН 5,0) в течение 30 минут на -70°C. Далее осажденную ДНК центрифугируют при 13400 об/мин в течение 7 мин, промывают 70% этанолом, центрифугируют еще 2 минуты при 13400 об/мин и высушивают на вакуумной сушке. Далее лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli BL21 и рассевают на чашке Петри со средой LB с агаром, содержащей 50 мкг/мл канамицина сульфата. Трансформацию проводят химическим методом: лигазную смесь добавляют в компетентные клетки, 30 минут инкубируют на ледяной бане, далее 2 минуты при 42°C, потом добавляют по 1 мл среды LB, 30 минут инкубируют при 37°C и рассевают клетки по чашке. Чашки инкубируют при 37°C в течение ночи.

На следующий день с чашек отбирают клоны на скрининг. Скрининг осуществляют с помощью ПЦР с использованием праймеров Psx1 (5'-TAACTAGTACGCAAGTTCACG-3') и Psx2 (5'-AGACCGCTTCTGCGTTCTG-3'). Состав реакционной смеси: 10х буфер для ПЦР (конечная концентрация в смеси: 75 mМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°C), 20 mM (NH ₄)₂SO₄, 0.01% (v/v) Tween 20) - 2 мкл, 25 mM MgCl₂ (конечная концентрация - 2.5 mM) - 2 мкл, 1,25 mM dNTP (конечная концентрация - 0.125 mM) - 2 мкл, праймеры - по 5 pmol на реакцию каждого, клетки с колонии - 1 мкл на реакцию, Taq-полимераза - 5 ед.акт. на реакцию, mQ Н₂О - до 20 мкл. ПЦР-положительные клоны рассевают на чашке Петри со средой LB с агаром, содержащей 50 мкг/мл канамицина сульфата. На следующий день моноклоны с чашки пересевают в пробирки с жидкой средой LB и культивируют в течение ночи при 37°C. Из полученной культуры выделяют плазмиду с помощью набора для выделения (Fermentas, Литва). В результате получают плазмиду pSX51.

Пример 2. Получение штамма E.coli ВКПМ В-10390 - продуцента предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека.

Полученную плазмиду pSX51 секвенируют на участках, содержащих ген MAD₄K-IFNaльфa2b. Реакцию секвенирования проводят на амплификаторе Eppendorf (Германия) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C - 2 мин, 25 циклов (денатурация 94°C - 10 сек, отжиг праймеров 60°C - 10 сек, элонгация 72°C - 20 секунд), заключительная элонгация 72°C - 5 минут. Секвенирование проводят с помощью следующих праймеров: Psx1, Psx2, IFinF (5'-GACCCTCCTAGACAAATTCTAC-3'), IFinRev (5'-GGTCATTCAGCTGCTGGTAG-3'), Is1 (5'-CATCAAGGTACGACGGCTAC-3'), Is2 (5'-TCAGAGCAGAAATCATGAGATC-3'). Состав реакционной смеси: десятикратный буфер для секвенирования - 1 мкл, праймер - по 10 pmol на реакцию, плазмида - 200 нг на реакцию, радиоактивная метка (альфа32Р-аАТР, активность 250 mkKu) - 1 мкл, дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты-терминаторы - 2 мкл (свой в каждую реакцию), Taq-полимераза - 1 мкл (10 единиц активности), mQ Н₂О - до 8 мкл. Остановку реакции осуществляют добавлением реагента StopSolution. Далее продукты реакции секвенирования прогревают до 95°C и наносят на 5% полиакриламидный гель с мочевиной. Электорофорез проводят 4-5 часов. После этого гель вымачивают 20 минут в 10% уксусной кислоте, переносят на лист 3 мм ватмана и высушивают на гель-драйере. Далее гель закладывают в кассету с рентгеновской пленкой и оставляют на ночь в полной темноте. На следующий день пленку проявляют, оценку последовательности нуклеотидов проводят в программе VectorNTI 8.0 (Invitrogen, США). Плазмидой с выверенной нуклеотидной последовательностью трансформируют штамм E.coli BL21. Трансформацию проводят химическим методом: плазмиду в количестве 200 нг добавляют в компетентные клетки, смесь 30 минут инкубируют на ледяной бане, далее инкубируют 2 минуты при 42°C, потом добавляют по 1 мл среды LB, 30 минут инкубируют при 37°C и рассевают клетки по чашке Петри со средой LB с агаром, содержащей 50 мкг/мл канамицина сульфата. Чашки инкубируют при 37°C в течение ночи.

В результате получают штамм E.coli ВКПМ В-10390 - продуцент предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека.

Пример 3. Ферментация штамма E.coli ВКПМ В-10390 и получение безметионинового интерферона-альфа2b человека.

Для препаративной наработки MAD₄K-интерферона-альфа2b клетки штамма E.coli ВКПМ В-10390 выращивают на агаризованной LB-среде с канамицином (40 мкг/мл) при 37°C в течение 12-14 часов, затем используют выросшую биомассу для получения посевного материала. Для этого клетки переносят в колбу Эрленмейера на 750 мл со 100 мл среды М9, содержащей ImM MgSO₄×7H ₂O, 1% кислотного гидролизата казеина, 1% глюкозы и 40 мкг/мл канамицина. Культуру выращивают на качалке при интенсивном перемешивании (240 об/мин) при 37°C до оптической плотности 2.4-2.6 (измеренной при длине волны 600 нм). Основное культивирование проводят в ферментерах объемом 3000 мл на среде М9, содержащей ImM MgSO₄×7H₂O, 1% кислотного гидролизата казеина, 1% глюкозы и 40 мкг/мл канамицина. Ферментацию проводят в условиях термо- и рН-статирования, доза засева 2%, добавляют канамицин - 40 мкг/мл, содержание растворенного кислорода в среде поддерживают на уровне 5%, в качестве источника углерода используют глюкозу в дробной подаче в количестве 1-2 г/л/час, поддержание рН 7.0-7.2 достигают автоматической подтитровкой аммиачной водой. Культуру наращивают в течение 2 часов при температуре 28°C и далее 12-14 часов при температуре 38°C.

Биомассу получают центрифугированием культуральной жидкости при 5000 об/мин при температуре 4°C в течение 10 минут. Полученную биомассу подвергают обработке ультразвуковым излучением до раздробления клеточных стенок и мембран, регистрируемого визуально. Полученную суспензию центрифугируют 20 минут на 13400 об/мин, полученный осадок многократно промывают 1% Triton X-100, получая в итоге фракцию телец включения. 100 мг телец включения растворяют в 1,5 мл 8 М раствора гуанидина-HCl. Через 30 мин к пробам добавляют 120 мкл 0,5 М раствора дитиоэритритола (DTE). Через 4 часа инкубирования при комнатной температуре пробы центрифугируют 10 мин при 20000 об/мин. Затем 1,5 мл полученного супернатанта вносят в 300 мл ренатурационного буфера (20 мМ Tris-HCl рН 8,0; 0,2 М Urea; 20 мМ NaCl, 0,1% Triton X-l 14; 0,2 мМ DTE). Частичную ренатурацию (без замыкания дисульфидных связей Cys 1-Cys 98) осуществляют в течение 10 часов при температуре 4°C.

Для проведения гидролиза предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека (MAD₄K-интерферона-альфа2b) энтеропептидазой рН ренатурационного раствора доводят до 4,8 путем добавления 1 М раствора уксусной кислоты, вносят растворы CaCl₂ и энтеропептидазы (конечные концентрации 2 мМ и 0,2 U/мл соответственно) и реакционную смесь выдерживают 16 часов при температуре 15°C. Останавливают энтеропептидазную реакцию добавлением в реакционную смесь 8 М раствора мочевины до конечной концентрации 1 М. Для осуществления полной ренатурации полученного безметионинового интерферона-альфа2b в реакционную смесь вносят 100 мМ растворы цистина и цистеина (конечная концентрация 1 мМ) и доводят рН до 8,0 с помощью 1М раствора NaOH. Пробы помещают на 24 часа в холодильник на 4°C, после чего доводят рН до 4,5 уксусной кислотой, центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин при температуре 4°С и переходят к стадии хроматографической очистки.

Поскольку в ходе энтеропептидазной реакции 10%-20% MAD₄K-интерферона-альфа2b остаются не гидролизованными, разделение MAD₄K-интерферона-альфа2b и безметионинового интерферона-альфа2b человека осуществляют путем ионообменной хроматографии реакционной смеси на КМ-сефарозе. Колонку с КМ-Сефарозой (0,5 см × 6,0 см) предварительно промывают 0,2 М NaOH (10 мл); 50 мМ Na-ацетатным буфером рН 5,5, содержащим 1 М NaCl и 1 мМ ЭДТА (10 мл); 50 мМ Na-ацетатным буфером рН 4,5, содержащим 1 мМ ЭДТА (20 мл). Нанесение исследуемых проб на колонку осуществляют при температуре не выше 16°C. Скорость нанесения 1 мл/мин. После прохождения образца колонку промывают 40 мл 50 мМ Na-ацетатного буфера рН 4,5 и 20 мл 50 мМ MES буфера рН 5,0. Элюирование исследуемых веществ осуществляют градиентом рН: в качестве буфера А используют 50 мМ MES-Na рН 5,0, буфером Б служит 50 мМ MES-Na рН 7,0 (все буферы содержат 1 мМ ЭДТА).

В результате получают интерферон-альфа2b человека без N-концевого метионина (безметиониновый интерферон-альфа2b человека), что подтверждают хроматографическим и электрофоретическим методами.

Пример 4. Конструирование гена MAH₆D₄K-IFNальфа2b и создание плазмиды pIAH-417

Конструирование плазмиды pIAH-417 проводят согласно примеру 1. Отличия заключаются в использовании других праймеров и другого вектора-реципиента для клонирования. Для создания гена MAH₆D₄K-IFNaльфa2b используют праймеры HIST7 (5'-GCGACCATGGCGCCATCATCATCACCATCACGATGATGATGATAAATGTGATCTGC-3') и IFN-R. В качестве матрицы для наработки нового гена используют плазмиду pSX51. После наработки с помощью ПЦР гена MAH₆ D₄K-IFNальфа2b, его клонируют по сайтам NcoI и BamHI в вектор pET16b (Novagen, США), несущий индуцибельный промотер поздних генов фага Т7.

Пример 5. Получение штамма Е.coli ВКПМ В-10391 - продуцента предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека.

Получение штамма E.coli ВКПМ В-10391 проводят согласно примеру 2 за несколькими исключениями: 1) секвенирование проводят с помощью следующих праймеров: Т7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGGG-3'), T7-t (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGGT-3'), IFinF, IFinRev, Is1 и Is2; 2) плазмидой pIAH-417 трансформируют клетки штамма E.coli/BL21DE3, несущего в своем геноме ген РНК-полимеразы фага Т7.

Пример 6. Ферментация штамма E.coli ВКПМ В-10391 и получение безметионинового интерферона-альфа2b человека

Ферментацию штамма E.coli ВКПМ В-10391 проводят согласно примеру 3, за следующими исключениями: 1) ферментацию проводят в среде LB/M9, содержащей 0,2% фруктозы исходно и 150 мкг/мл ампициллина при температуре 37°C; 2) для наработки предшественника безметионинового интерферона-альфа2b человека проводят индукцию Т7-промотера лактозой в количестве 20 г на 1 л культуральной среды; индукцию проводят по достижении плотности бактериальной культуры 15 опт.ед.

Этапы получения очищенного интерферона-альфа2b человека без N-концевого метионина совпадают с таковыми для штамма E.coli ВКПМ В-10390 согласно примеру 3. В качестве дополнительного этапа очистки от негидролизованной формы проводят хроматографическую очистку на Ni-NTA-агарозе [протокол QIAGEN, A handbook for high level expression and purification of 6xHis-tagged proteins, 5^th Edition, 2003].

В результате получают интерферон-альфа2b человека без N-концевого метионина (безметиониновый интерферон-альфа2b человека), что подтверждают хроматографическим и электрофоретическим методами.