штамм streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini вкпм ас-1083 - продуцент тобрамицина и способ получения тобрамицина

Формула изобретения

1. Штамм Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ac-1083 - продуцент тобрамицина.

2. Способ получения тобрамицина, предусматривающий культивирование штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ac-1083, выделение тобрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н. аммиака, гидролизом при 100°С в (0,1-0,3)н. растворе едкого натра, повторной хроматографической очисткой, концентрацией в вакууме и осаждением в форме сульфата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается нового штамма-продуцента противобактериального антибиотика тобрамицина из группы аминогликозидов.

Аминогликозидные антибиотики, обладая высокой антибактериальной активностью и широким спектром антибактериального действия, являются необходимыми препаратами для лечения тяжелых опасных для жизни инфекционных заболеваний. Благодаря высокой активности в отношении грамотрицательных патогенов и особенно синегнойной палочки тобрамицин, как лидер среди аминогликозидных антибиотиков, широко используется в медицинской практике.

Известен штамм Streptoalloteichus cremeus var. tobramycini var. nov. 2242 - продуцент аминогликозидных антибиотиков небрамицинового комплекса [1]. Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания тобрамицина в культуральной жидкости (не более 1,0 г тобрамицина в 1 л культуральной жидкости).

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент тобрамицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия ультрафиолетовых и гамма (⁶⁰Со) лучей и N-нитрозоэтилмочевины на исходный штамм с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин, рифамицин и тобрамицин в качестве селективных агентов.

Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКПМ Ас-1083.

Штамм Ас-1083 обладает повышенной продуктивностью тобрамицина - (4,0 г в 1,0 л культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма 1083. Температура (28-37)°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глицериннитратной агаровой среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (таблица 1).

Морфологические признаки. Цепочки спор спиральные, спирали растянутые, с 2-6 оборотами, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С и в диапазонах значений pH (5,0-10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует фруктозу и глюкозу, умеренно сахарозу, маннит, лактозу, слабо использует инозит, рамнозу, рафинозу, не использует арабинозу, ксилозу и целлюлозу.

Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом.

Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре № 2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов. Штамм фагоустойчив. Фаг в культуре отсутствует.

Штамм ВКПМ Ас-1083 поясняется следующим примером.

Пример. Для получения спорового материала культуру Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini 1083 выращивают в течение 8 дней при 37°С на глицериннитратной агаровой среде Линденбайна следующего состава, %:

Глицерин	3,0
K 2HPO4	0,1
MgSO 4	0,05
KCl	0,05
FeSO 4	0,001
NaNO3	0,2
Агар	2,0
Вода	Водопроводная
pH до стерилизации	7,0-7,2

Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 1,0 атм и 120°С.

Для получения посевного мицелия споры культуры засевают на среду следующего состава, %:

Соевая мука	3,0
Глюкоза	3,0
NaCl	0,5
CaCO 3	0,5
Вода	Водопроводная
pH до стерилизации	7,0-7,2

Посевной материал выращивают при 37°С в течение 48 ч в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, количество среды в колбах 150 мл. Скорость вращения качалки (200-240) об/мин. Количество посевного материала для инокуляции - (5-7)%.

Ферментация проводится на качалке при 37°С на среде (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) следующего состава, %:

Глицерин	2,0
Соевая мука	2,0
NH4Cl	0,3
NH4NO3	0,1
MgSO 4	0,5
CaCO3	0,3
ZnSO4	0,01
pH до стерилизации	6,9
Вода	Водопроводная

Антибиотик накапливается в культуральной жидкости штамма-продуцента.

Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-микроорганизма Bacillus subtilis 6633.

Содержание тобрамицина в культуральной жидкости продуцента к концу ферментации (через 144 ч) составляет 4000 мкг/мл.

Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является в 4 раза повышенная продуктивность антибиотика, а именно содержание тобрамицина в культуральной жидкости штамма-прототипа тобрамицина 1000 мкг/мл, а в заявленном штамме - 4000 мкг/мл.

С целью выделения тобрамицина проводят его сорбцию из нативного раствора (обработанной щавелевой кислотой и отфильтрованной от мицелия культуральной жидкости) с pH=(6,7-6,9) на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом. Десорбцию тобрамицина проводят путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22) н. аммиака. Элюат концентрируют в вакууме до концентрации (100-150) мг/мл и проводят гидролиз антибиотика при 100°С в (0,1-0,3) н. раствора едкого натра, при этом карбамоилтобрамицин превращается в тобрамицин. Тобрамицин отделяют из реакционной смеси сорбцией на карбоксильном катионите КБ-2 с последующей десорбцией разбавленным раствором аммиака. Полученный раствор тобрамицина концентрируют в вакууме, добавляют (24,0-24,2) 5-й раствор серной кислоты до pH 4,5 и тобрамицина сульфат осаждают добавлением избытка метанола.

Тобрамицина сульфат, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini 1083, представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде и нерастворимый в органических растворителях. По своим физико-химическим свойствам (данные ¹³С-ЯМР, значения Rf при тонкослойной хроматографии и электрофоретическая подвижность при электрофорезе на бумаге в электролитах в области pH=(1,7-2,5), антибактериальной активности и токсичности (LD₅₀ составляет 80 мг/кг при внутривенном введении мышам)) полученный тобрамицина сульфат полностью соответствует тобрамицину, описанному в литературе. Брутто-формула: C₁₈H₃₇N₅O ₉ H₂SO₄. Мол. масса=565,5 а.е.м. Мол. масса основания (метод MALDI-TOF-MS)=468,5 а.е.м. (МН) ⁺. [ ]²⁰ _D+128° (с 1,0, H₂O).

Выход целевого продукта 30,0% от его содержания в культуральной жидкости.

Таким образом, создан новый мутантный штамм Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ac-1083 продуцент тобрамицина, характеризующийся высокой способностью антибиотикообразования, превосходящий активность штамма-прототипа 2242-ЛБ в 4 раза

Антибиотическая активность нового штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ac-1083 составляет 4000 мкг/мл. Использование нового штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ac-1083 как продуцента для биосинтеза тобрамицина позволяет увеличить выход целевого продукта при выделении тобрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22) н. аммиака, гидролизом при 100°С в (0,1-0,3) н. растворе едкого натра, повторной хроматографической очисткой, концентрированием в вакууме и осаждением в форме сульфата, что обеспечивает 30%-ный выход целевого продукта от содержания тобрамицина в культуральной жидкости.

ЛИТЕРАТУРА

1. Синягина О.П., Лапчинская О.А., Лаврова-Балашова М.Ф., Нестерова Т.П., Пономаренко В.И. Получение мутантов, образующих тобрамицин, в культуре продуцента комплекса аминогликозидных антибиотиков Streptomyces cremeus var. tobramycini var. nov. 2242. // Антибиотики № 12, с.891-894 (1980).

Таблица 1.
Культурально-морфологические признаки штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ac-1083
Агаровая среда	Рост воздушного мицелия*	Цвет мицелия	Растворимый пигмент
Воздушного	Субстратного
№ 1 Гаузе	++	Беловато-кремовый (д-3, б-6)	Буровато-желтый (д-4)	Светло-желтый (д-4)
Овсяная	+-	Белый до кремового (б-6)	Бледно-бурый (б-4)	Бледно-бурый (б-4)
Чапека	-	-	-	-
Глюкозо-аспарагиновая	++++	Беловато-кремовый (а-3, б-6)	Бледно-бурый (б-4)	Бледно-бурый (б-4)
Линденбайна (глицериннитратная)	++++	Беловатый (д-3)	Коричневато-желтоватый (д-2)	Коричневато-желтоватый (д-2)
Глюкозо-нитратная № 2 Гаузе	+-	Беловато-кремовый (д-3, б-6)	Светло-желтый (д-4)	Коричневатый (б-7)
Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом)	Меланоидные пигменты не образует
*/(+++) - хороший; (++) - умеренный; (+) - слабый; (-) - отсутствие роста.