способ дифференциальной диагностики клещевого энцефалита, иксодового клещевого боррелиоза и их микстинфекций у детей

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики клещевых инфекций различной этиологии, включающий оценку иммунологических параметров методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что на ранних стадиях заболевания определяют комплекс сывороточных цитокинов ИЛ-1 , ИФН , ИЛ-10, устанавливают уровни этих цитокинов в период начала болезни при клещевом энцефалите интерлейкин-1 в интервале 298-358 пг/мл, интерферон- - 295-350 пг/мл и интерлейкин-10 - 115-150 пг/мл; при иксодовом клещевом боррелиозе в интервале интерлейкин-1 178-270 пг/мл, интерферон- 125-190 пг/мл и интерлейкин-10 - 11,5-18 пг/мл; при микстинфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита и боррелиями, интерлейкин-1 в интервале 30-75 пг/мл, интерферон- 115-130 пг/мл и интерлейкин-10 - 22-65 пг/мл.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням у детей.

Инфекции, возбудители которых передаются детям иксодовыми клещами Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus, составляют достаточно большую группу инфекционных заболеваний, разнообразных как по этиологии, так и по своим клиническим проявлениям. Среди них наибольшую актуальность для здравоохранения на территории Российской Федерации представляют клещевые энцефалиты (КЭ) и иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ), что обусловлено их широкой распространенностью, большой социально-экономической значимостью из-за высокой заболеваемости детского населения и нерешенности многих вопросов диагностики. В последние годы участились случаи сочетанных вирусных и бактериальных заболеваний: клещевого энцефалита в сочетании с иксодовым клещевым боррелиозом - микстинфекциями. Эти сочетанные инфекции характеризуются повсеместной распространенностью на территории Российской Федерации, полиморфизмом клинических проявлений и сложностью диагностики в первые дни заболевания. Улучшение диагностики в ранние сроки заболевания и лечение занимают в последнее время значительное место в проблеме изучения клещевых инфекций в России (Ранний цитокиновый и иммунный ответ при иксодовом клещевом боррелиозе у детей. / Г.Ф.Железникова, Н.В.Скрипченко, Ю.П.Васильева и др. // Мед. иммунология. - 2002. - Т.4, № 3. - С.459-466; Самаров М.Н., Воробьева Н.Н., Мерзлова Н.Б. Микст-инфекции, передающиеся клещами, у детей Пермского края. / Медицина в Кузбассе - 2008. - № 5. - С.138-139).

Клинические проявления клещевых микстинфекций разнообразны, что создает определенные трудности в своевременной и правильной диагностике, а также при дифференциально-диагностическом разграничении его от других заболеваний, передающихся при укусе клеща (Диагностика, лечение и профилактика клещевого энцефалита, болезни Лайма и их микст-инфекций. / Т.А.Захарычева, Г.М.Воронкова, Т.В.Мжельская и др.: пособие для врачей. - Хабаровск, 2003. - 64 с.).

Методы диагностики клещевых инфекций не стандартизированы. Разработаны способы выявления каждой инфекции в отдельности. Наиболее распространенным методом диагностики клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза является метод иммуноферментного анализа (ИФА). Но серологическое обследование имеет существенные недостатки. Одним из них является невозможность установления диагноза на раннем этапе инфекции при отсутствии антител у больного (Бедарева Т.Ю., Попонникова Т.В., Вахраммева Т.Н. Изменение цитокинового статуса и уровня антимикробных пептидов при клещевых нейроинфекциях у детей. / Сибирский медицинский журнал - 2008. - № 7. - С.22-25).

Специфические иммуноглобулины класса М при клещевом энцефалите определяются с конца первой-второй, при иксодовом клещевом боррелиозе с третьей-четвертой недели заболевания (Современные представления о диагностике клещевых инфекций. / А.Н.Усков, К.Д.Байгеленов, О.А.Бургасова, Н.Е.Гринченко. / Сибирский медицинский журнал - 2008. - № 7. - С.148-152).

Известны способы экспресс-диагностики клещевого энцефалита, основанные на исследовании сыворотки крови методом полярограммы надосадочной жидкости («Способ диагностики клещевого энцефалита» Самоделкин Е.И., патент РФ № 2095814 от 10.11.1997 г.), однако он требует большой трудоемкости и позволяет определять только вирус клещевого энцефалита. В способе экспресс-диагностики КЭ по наличию в лейкоцитарной массе в сыворотке крови с гепарином специфических антигенов клещевого энцефалита («Способ экспресс-диагностики клещевого энцефалита» Леонова Г.Н., Борисович В.Г., Гагач Г.Ф., Сирант И.В., Филина О.В. патент РФ № 2217758 от 27.11.2003 г.) также есть существенный недостаток - способность идентифицировать только антиген вируса КЭ.

Для экспресс-диагностики ИКБ в последние годы широко применяется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Однако многие авторы описывают низкую чувствительность метода от 40 до 70% и невысокую специфичность, т.к. могут быть ложноположительные результаты в случае наличия других спирохетозных заболеваний у человека (Диагностика, лечение и профилактика клещевого энцефалита, болезни Лайма и их микст-инфекций. / Т.А.Захарычева, Г.М.Воронкова, Т.В.Мжельская и др.: пособие для врачей. - Хабаровск, 2003. - 64 с.). Метод ПЦР диагностики при КЭ не стандартизирован и, по мнению ряда авторов, считается вспомогательным к серологическому обследованию (Марьина Н.М., Шетекаури С.А., Ольховский И.А. Возможности ранней лабораторной диагностики клещевых нейроинфекций: клещевого энцефалита и Лайм-боррелиоза. // Бюллетень сибирской медицины. - Приложение 1. Новосибирск, 2008. - С.55-57; Миронов И.Л. Диагностика клещевого энцефалита на современном этапе. // Инфекционные болезни - 2006. - Т.4, № 1. - С.90-93).

Таким образом, улучшение диагностики клещевого энцефалита, иксодового клещевого боррелиоза, микстинфекций на первой неделе заболевания может иметь неоценимое значение для постановки правильного диагноза. Этот недостаток устраняется в предлагаемом способе.

Прототипом заявленного способа является статья Бедаревой Т.Ю. с соавт. «Состояние цитокинового статуса у детей с клещевыми инфекциями в Кузбассе» (Мать и Дитя в Кузбассе - 2008. - № 3 (34). - С.26-29). Сущность способа заключается в том, что для мониторинга клещевых инфекций определяют комплекс цитокинов в первые 3 дня заболевания - интерлейкин-6 (ИЛ-6), интерлейкин-8 (ИЛ-8), интерлейкин-10 (ИЛ-10), интерферон- (ИФН ), интерферон- (ИФН ). Однако набор указанных пептидов не позволяет точно охарактеризовать патогенетические механизмы, возникающие в первые дни заболевания при клещевых инфекциях. Так, в наборе Бедаревой Т.Ю. с соавт. отсутствует интерлейкин-1 альфа, считающийся ответственным за пирогенные реакции при клещевом энцефалите и ведущим сывороточным пептидом при формировании мигрирующей эритемы в месте укуса клеща при ИКБ. Также авторы определяют ИЛ-6, который относится как к про-, так и противовоспалительным цитокинам, и его уровень при клещевых инфекциях зависит от уровня ИЛ-1 , который ученые не определяли. Хемокин ИЛ-8 наиболее целесообразно определять в случае наличия тяжелых бактериальных осложнений у инфекционных больных, которые достаточно редки у пациентов с клещевыми инфекциями. Следует отметить, что клиническая картина микстинфекций в Кемеровской области отличается преобладанием лихорадочных и менингеальных форм, тогда как на территории остальной России в случае микстинфекций доминирует клиника боррелиоза, что мы и зафиксировали в своих наблюдениях. Авторы устанавливают следующие уровни этих цитокинов: при ИКБ ИФН - от 4,5±1,1 пг/мл до 43,3±3,6 пг/мл, при КЭ - от 1,1±0,2 пг/мл до 15,1±3,2 пг/мл, при микстинфекции от 12,5±3,2 пг/мл при лихорадочных формах до 15,8±3,2 пг/мл при менингеальной. ИФН при ИКБ от 194±35,4 пг/мл до 436,6±25,8 пг/мл, при КЭ от 55,6±9,2 пг/мл (при лихорадочной форме КЭ) и 87,9±22,1 пг/мл (при менингоэнцефалитической) до 237,5±13,2 пг/мл при менингеальной форме КЭ, при микстинфекции - от 235,2±12,8 пг/мл при лихорадочных формах до 237,5±13,6 пг/мл при менингеальных. ИЛ-6 при ИКБ от 296,7±15,2 пг/мл до 305,4±15,9 пг/мл, при менингеальной форме КЭ - 260,2±9,4 пг/мл, при лихорадочной форме - 253,2±1,5 пг/мл, при менингоэнцефалитической 252±0,6 пг/мл, при микстинфекции - от 302,8±12,3 пг/мл при лихорадочной форме до 311,4±16,7 пг/мл при менингеальной. Интерлейкин-8 при ИКБ от 102,5±38,4 пг/мл до 180,3±47,5 пг/мл, при лихорадочной форме КЭ 40,6±4,3 пг/мл, при менингеальной - 54,2±5,6 пг/мл, при менингоэнцефалитической 48,5±3,2 пг/мл, при микстинфекции при лихорадочной форме - 128,3±37,2 пг/мл, при менингеальной - 152,3±47,5 пг/мл. ИЛ-10 при ИКБ от 9,6±1,4 пг/мл до 16,5±3,7 пг/мл, при лихорадочной форме КЭ 2,7±0,4 пг/мл, при менингеальной - 3,6±0,7 пг/мл, при менингоэнцефалитической 2,4±0,5 пг/мл, при микстинфекции при лихорадочной форме 10,8±2,7 пг/мл, при менингеальной - 12,6±3,1 пг/мл.

К недостаткам указанного метода относится несовершенство набора цитокинов и отсутствие случаев микстинфекции с доминированием клиники ИКБ, неполный набор цитокинов - отсутствует ИЛ-1 . Определение ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН , ИФН требует больших финансовых вложений, трудоемко, не отличается в описанном способе точностью исследований (большая ошибка, недостоверные различия в уровнях сывороточных цитокинов как внутри одного заболевания, так и между различными этиологиями), поэтому для диагностики в первые три дня заболевания КЭ, ИКБ и микстинфекции не может использоваться.

Задача изобретения - усовершенствование способа дифференциальной диагностики мистинфекций клещевого энцефалита с иксодовым клещевым боррелиозом (от моноинфекций) у детей в первые три дня заболевания, что крайне важно для прогноза развития патологии и позволяет своевременно назначить этиотропную и патогенетическую терапию.

Технический результат настоящего изобретения состоит в том, что метод прост, доступен. Использование способа дает возможность одновременного обследования большого количества проб, позволяет в ранние сроки косвенно определить возбудителя болезни, что крайне важно для прогноза развития заболевания и позволяет своевременно назначить этиотропную и патогенетическую терапию.

Авторами не найдены в литературе данные по ранней диагностике клещевых инфекций на основе анализа цитокинов.

Заявленный способ диагностики возбудителей клещевых инфекций с использованием сывороточных цитокинов имеет следующие общие признаки с прототипом:

1. Методика забора исследуемого материала кровь из локтевой вены не более 3-5 мл двукратно).

2. Определение сывороточных цитокинов у детей больных клещевым энцефалитом, иксодовым клещевым боррелиозом и их микстинфекциями.

Отличительными от прототипа признаками заявляемого способа являются:

1. Определение уровня трех цитокинов в сыворотке крови - ИЛ-1 , ИФН , ИЛ-10.

2. Определение статистически достоверных различий в секреции ИЛ-1 , ИФН , ИЛ-10 объясняется тем, что авторы определяли вышеуказанные цитокины при иных формах клещевых инфекций у детей.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики клещевого энцефалита, иксодового клещевого боррелиоза и их микстинфекций у детей, включающий оценку иммунологических параметров методом иммуноферментного анализа, на ранних стадиях заболевания определяют комплекс сывороточных цитокинов: интерлейкин-1 альфа (ИЛ-1 ), интерферон-гамма (ИФН ), интерлейкин-10 (ИЛ-10), устанавливают уровни этих цитокинов: при значении интерлейкин-1 альфа (ИЛ-1 ) выше 298 пг/мл, интерлейкин-10 (ИЛ-10) выше 115 пг/мл и интерферон-гамма ИФН выше 295 пг/мл диагностируют клещевой энцефалит, а при значении интерлейкин-1 альфа (ИЛ-1 ) выше 178 пг/мл, интерферон-гамма (ИФН ) выше 125 пг/мл, интерлейкин-10 (ИЛ-10) выше 11,5 пг/мл диагностируют иксодовый клещевой боррелиоз, при этом их мистинфекции диагностируют при значении интерлейкин-1 альфа (ИЛ-1 ) выше 30 пг/мл, интерферон-гамма (ИФН ) выше 115 пг/мл, интерлейкин-10 (ИЛ-10) выше 22 пг/мл.

Клещевой энцефалит в Приморье, также как и на различных территориях Российской Федерации (Северо-Западном регионе, Новосибирской области, Красноярском крае, в Приангарье) часто протекает в виде очаговых форм, которые в аналоге были представлены всего в 6% случаев. В наших исследованиях очаговые формы клещевого энцефалита встречались в 45,6% наблюдений. ИКБ, анализируемый в аналоге, характеризуется практически полным отсутствием эритемных форм болезни (6%), тогда как на большинстве территорий РФ идет наоборот преобладание типичных форм заболевания с развитием мигрирующей эритемы в месте укуса клеща и в наших наблюдениях она встречалась также достаточно часто (в 47,5% случаев). Микстинфекция в Приморье отличается преобладанием в клинической картине клиники боррелиоза, так же как и в большинстве субъектов Российской Федерации, тогда как Кемеровскую область можно отнести к региону исключению - на территории Кузбасса сочетанные формы клещевого энцефалита с боррелиозом протекают с доминированием клиники энцефалита и признаками поражения ЦНС, что не характерно для ранних проявлений микстинфекций на других эндемичных территориях.

Способ осуществляется следующим образом.

С помощью метода сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем производства Санкт-Петербургской фирмы ООО «Цитокин» определяли в сыворотке крови больного комплекс цитокинов - интерлейкин-1 , интерферон- , интерлейкин-10. Были обследованы 3 группы пациентов с клещевыми инфекциями: 17 пациентов с клещевым энцефалитом, 18 пациентов с иксодовым клещевым боррелиозом и 13 детей с сочетанной формой клещевого энцефалита и иксодового клещевого боррелиоза (микстинфекцией). В качестве контроля при исследовании уровня цитокинов в сыворотке крови использовались образцы сыворотки здоровых детей, не имеющих хронических заболеваний, взятые в зимние месяцы, что позволило исключить факт укуса клеща. Оценку результатов проводили с использованием статистических приемов для малых выборок. Статистическая обработка полученных материалов произведена с применением прикладной программы Statistica 6,0. с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни и коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

При изучении цитокинов сыворотки крови при клещевых инфекциях (таблица 1) содержание ИЛ-1 , регулятора Th1 иммунного воспаления, в сыворотке крови в острый период зависело от вида возбудителя. Если при КЭ наблюдалось увеличение концентрации ИЛ-1 в 9,2 раза (от 298 до 358 пг/мл в среднем 323,2±25,9 пг/мл против 35,3±5,9 пг/мл у здоровых, р<0,001), то при ИКБ уровень сывороточного ИЛ-1 повышался менее значительно, но при этом в 7,6 раза превышал контроль (от 178 до 270 пг/мл, в среднем 235,7±30,3 пг/мл против 35,3±5,9 пг/мл у здоровых, р<0,001). Уровень ИЛ-1 при микстинфекции варьировал от 30 до 80 пг/мл, в среднем 53,4±19,9 пг/мл, незначительно превышая показатели контрольной группы (р>0,05), но значительно ниже уровня моноинфекции (в 10,6 раза).

Уровень сывороточного ИФН при КЭ был от 295 до 350 пг/мл, в среднем 320,8±25,9 пг/мл, что в 4,2 раза выше уровня контроля (75,0±4,1 пг/мл, р0,001).

При ИКБ данный цитокин повышался менее значительно (от 125 до 190 пг/мл, в среднем составив 162,1±13,3 пг/мл против 75,0±4,1 пг/мл, р<0,001), что в 2,2 раза выше контроля и в 2,4 - ниже уровня при КЭ и выше, чем при микстинфекции. При которой он составил от 115 до 130 пг/мл, в среднем 120,2±5,5 пг/мл, что несколько превышало уровень здоровых детей (р<0,01).

Показателен мониторинг одного из ранних медиаторов иммунного воспаления Th2 типа, ИЛ-10. В острый период болезни у больных с КЭ наблюдалась его гиперсекреция: от 115 до 150, в среднем составляя - 138,6±29,8 пг/мл против контрольных величин 14,6±1,8 пг/мл (р<0,001, выше в 9,6 раза). При ИКБ этот процесс протекал менее активно: уровень сывороточного цитокина практически равен контролю (от 11,5 до 18 пг/мл, в среднем 16,6±5,1 пг/мл), ниже, чем при микстинфекции (в 2 раза) и в 10 раз, чем при КЭ. У детей больных сочетанной формой уровень сывороточного ИЛ-10 не выше уровня контрольной группы (от 22 до 65 пг/мл, в среднем 41,1±19,7 пг/мл против 14,6±1,8 пг/мл, р>0,05), и не выше, чем у больных ИКБ (41,1±19,7 пг/мл против 16,6±5,1 пг/мл, р>0,05), но достоверно ниже, чем при КЭ (41,1±19,7 пг/мл против 138,6±29,8 пг/мл, р<0,01).

Нашими исследованиями определены статистически достоверные различия в секреции ИЛ-1 , ИФН и ИЛ-10 у больных клещевыми инфекциями разной этиологии (КЭ и ИКБ и их сочетанный вариант), что позволяет проводить косвенную диагностику данных возбудителей.

Способ можно проиллюстрировать на конкретных примерах.

Пример 1

Больной Е., 9 лет, история болезни № 1844. Предварительный диагноз - Клещевой энцефалит.

Поступил в ГКБ № 2 в ДИО 2 на 2 день болезни с жалобами на повышение температуры тела до 39,0°С, вялость, выраженную головную боль, многократную рвоту.

При поступлении состояние тяжелое за счет неврологической симптоматики, гипертензионного, интоксикационного синдрома, температура тела 39,5°С, в зеве вялая разлитая гиперемия. Тоны сердца приглушены, при беспокойстве - аритмичные с ЧСС - 110-120 в минуту. Печень пальпируется на 1,0 см ниже реберной дуги. Менингеальные симптомы положительные: ригидность затылочных мышц - 2 п/п, симптом Кернига - 140°. Очаговые симптомы: сглаженность левой носогубной складки, девиация языка влево. В клиническом анализе крови: лейкоциты - 5,5×10 ⁹/л, нейтрофилез - 57%, СОЭ - 19 мм/час.

Ликвор бесцветный, прозрачный, вытекал частыми каплями. Цитоз - 57 клеток (2/3 -лимфоциты, 1/3 - нейтрофилы), реакция Панди - положительная, белок - 0,8 г/л, сахар -2,9 ммоль/л, Cl - 125 ммоль/л.

В крови выявлены маркеры КЭ: в ИФА IgM на 5-й день заболевания. Антитела к ИКБ в ИФА не обнаружены.

Исследование цитокинового спектра:

2 день болезни: ИЛ-1 - 350 пг/мл, ИФН - 300 пг/мл, ИЛ-10 - 116 пг/мл.

Окончательный диагноз: Клещевой энцефалит, менингоэнцефалитическая форма.

Пример 2

Больной В., 4 года, история болезни № 1983. Предварительный диагноз: Укус клеща.

Поступил в ГКБ № 2 в ДИО 2 во вторые сутки заболевания с жалобами на повышение температуры тела до 37,5°С, вялость, головные боли, боли в сердце, сноговорение.

При поступлении состояние средней тяжести за счет симптомов интоксикации. Кожные покровы бледно-розовые. В зеве яркая разлитая гиперемия, задняя стенка глотки зерниста.

Место укуса клеща без особенностей. Тоны сердца приглушены, аритмичны, систолический шум на верхушке I степени. ЧСС - 65-93 в 1 минуту, экстрасистолия.

Печень на 1,0 см ниже края реберной дуги.

В клиническом анализе крови: лейкоциты 7,4×10⁹/л, лимфоцитоз до 51%, СОЭ - 2 мм/час.

В крови выявлены маркеры иксодового клещевого боррелиоза в ИФА IgM на 20 день болезни, клещевого энцефалита в ИФА отрицательные. Исследование цитокинового спектра:

2 день болезни: ИЛ-1 - 240 пг/мл, ИФН - 132 пг/мл, ИЛ-10 - 12 пг/мл.

Окончательный диагноз: Иксодовый клещевой боррелиоз, безэритемная форма, средней степени тяжести.

Пример 3

Больной Л., 10 лет, история болезни № 1529. Предварительный диагноз: Иксодовый клещевой боррелиоз, эритемная форма, средней степени тяжести.

Поступил в ГКБ № 2 в ДИО в первые сутки заболевания с жалобами на повышение температуры тела до 38,5°С, вялость, головную боль, головокружение, отечность, покраснение мошонки (место укуса клеща), увеличение паховых лимфатических узлов.

При поступлении состояние средней тяжести за счет симптомов интоксикации. Кожные покровы бледные, гиперемия лица и верхней половины туловища, на мошонке эритема в месте укуса клеща до 2 см в d. Пальпируются паховые лимфоузлы до 1,5 см, единичные, безболезненные не спаянные с окружающими тканями. Менингеальные симптомы отр.

В клиническом анализе крови: лейкоциты верхняя граница нормы - 9,8×10⁹/л, лимофоцитоз - 49%, СОЭ - 5 мм/час.

В крови выявлены маркеры ИКБ: в ИФА IgM на 9 день болезни, антитела к КЭ IgM на 24 день болезни.

Исследование цитокинового спектра:

3 день болезни: ИЛ-1 - 50 пг/мл, ИФН - 125 пг/мл, ИЛ-10 - 38 пг/мл.

Окончательный диагноз: Микстинфекция. Иксодовый клещевой боррелиоз, эритемная форма средней степени тяжести. Клещевой энцефалит, лихорадочная форма.

Таким образом, настоящий способ диагностики клещевого энцефалита, иксодового клещевого боррелиоза и микстинфекции у детей позволяет своевременно предположить возбудителя данного заболевания. Диагностика осуществляется сразу при поступлении в клинику, на основе комплексного анализа цитокинового статуса. Обоснованием выбора трех указанных цитокинов является: наличие двух провоспалительных: интерлейкин-1 альфа (ИЛ-1 ), интерферон-гамма (ИФН ) и одного противовоспалительного - интерлейкин-10 (ИЛ-10). ИЛ-1 - является ведущим цитокином в формировании кожного маркера боррелиоза - мигрирующей эритемы, также он пирогенный цитокин и играет важную роль в развитии лихорадки при клещевых инфекциях. Повышение количества определяемых цитокинов не дает дополнительных качественных результатов и увеличивает финансовые затраты. Таким образом, выбор трех цитокинов необходим, достаточен и экономически выгоден. Полученные значения позволяют с высокой точностью диагностировать клещевой энцефалит, иксодовый клещевой боррелиоз, а также микстинфекцию (сочетание КЭ с ИКБ). Метод доступен и укорачивает сроки определения возбудителей клещевого энцефалита, иксодового клещевого боррелиоза, что крайне важно для прогноза развития заболевания и позволяет своевременно назначить этиотропную и патогенетическую терапию.