способ гистохимического выявления метацида в печени при отравлении суррогатным алкоголем на полимерной основе

Формула изобретения

Способ гистохимического выявления метацида в печени при отравлении суррогатным алкоголем на полимерной основе, включающий приготовление парафинового среза, депарафинирование, окрашивание 2%-ным раствором конго красного в 10%-ном спирте, промывание в воде, исследование микропрепаратов печени с помощью светового микроскопа, отличающийся тем, что предварительно осуществляют обзорную микроскопию, отбирают микропрепараты с подозрением на токсический гепатит с интралобулярным холестазом, а окрашивание конго красным проводят в течение 10-15 мин, после промывания в воде микропрепарат печени помещают в глицерин, затем исследуют его под микроскопом и при визуализации оранжевого ободка вокруг желчных включений и цилиндров и неравномерного оранжевого окрашивания цитоплазмы гепатоцитов определяют наличие в ткани печени метацида (полигексаметиленгуанидина гидрохлорида).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности - к гистохимии (гистологии), и может быть использовано при гистологическом исследовании микропрепаратов печени, а именно для качественного определения полимеров с основными свойствами в тканях печени.

В последнее время резко возросло использование полимерных соединений во всех сферах жизнедеятельности человека, в том числе они нашли свое применение в медицине. Полимеры природного и синтетического происхождения (гормоны, ферменты, белковые препараты крови, поливинилпирролидон и т.п.) используются в практической медицине и биотехнологии в качестве лекарственных средств, плазмозаменителей и дезинтоксикантов. Усилился интерес к возможности использования полимеров для борьбы с микроорганизмами, создания антибактериальных, антивирусных и противогрибковых полимерных препаратов, консервантов для анатомического бальзамирования (Гембицкий П.А., Васильев О.Д., 2008). Значительный прирост новейших средств химической и фармацевтической отраслей промышленности сочетается с неустановленным их влиянием на организм человека.

Рост спектра отравляющих веществ, внедрение продукции инновационных технологий опережает технические возможности и создает определенные проблемы проведения судебно-химической экспертизы. Современное качественное изменение состава ядов сопровождается не только наличием, но и появлением особенностей структурных повреждений ткани (Пиголкин Ю.И., Богомолова И.Н., 2006). Поэтому существенную значимость в диагностике отравлений приобретает морфологическое исследование.

Результаты гистоморфологического исследования помогают определить повреждающий фактор, отразить гистохимические особенности патологических процессов во внутренних органах, установить ведущие синдромы и провести комплексный клинико-анатомический анализ имеющихся данных. Патоморфологическая картина отражает основные механизмы умирания, участвует в обосновании причинно-следственной связи между отравлением и смертью, в исключении других возможных причин смерти пострадавших, что позволяет объединить их в одну группу по виду повреждающего воздействия на человека. В 2006 году при массовом отравлении спиртсодержащими жидкостями установлено, что в их состав обязательно входила полимерная добавка «Метацид» (полигексаметиленгуанидина гидрохлорид - ПГМГ-ГХ). Методом судебно-химической экспертизы органов погибших, экспериментальными методами исследования причину токсического гепатита с холестазом, выраженного желтухой и поражением всех внутренних органов, установить не удалось.

В рамках антиалкогольной концепции РФ необходимостью стала разработка научно-обоснованных критериев судебно-медицинской диагностики и экспертной оценки отравлений суррогатным алкоголем на полимерной основе для уничтожения рынков сбыта данной продукции и обеспечения административно-правовых норм, направленных на защиту населения от химической травмы и пропаганду здорового образа жизни.

Известны способы определения веществ на основе полимеров, имеющих свойство накапливаться в тканях органов человека или животных. Это такие соединения, как, например, декстран, поливинилпирролидон (ПВП).

В комплексе методов морфологического исследования обязательным приемом является окрашивание анализируемой ткани.

Известен способ выявления декстрана в тканях, при котором свежие препараты, фиксированные метанолом, окрашивали раствором ниагарского небесно-голубого в 90-процентном метаноле в течение 15-20 минут (Янксо-Габор, 1955). Известно, что для выявления сульфата декстрана используют серию спиртовых растворов убывающей крепости, содержащих толуидиновый синий (Моури). Этот краситель образует с сернокислым сульфатом декстрана осадок, нерастворимый в воде, что позволяет перейти от спиртовых растворов толуидинового синего к водным, в которых наблюдается интенсивное окрашивание.

Известен способ выявления поливинилпирролидона, накопленного в тканях человека, с прочным хлорозоловым розовым (Э.Пирс. Гистохимия теоретическая и прикладная (пер. с англ.). - М.: Изд. Иностр. лит. - 1962. - С.888). При осуществлении способа необходимо: - довести срезы до воды; - окрашивать 1-процентным раствором прочного хлорозолового розового в 50-процентном спирте при 60° в течение 10-30 мин; сполоснуть в воде; дополнительно окрашивать ядра гемалауном Майера в течение 3 мин; промыть, дифференцировать в 1-процентном подкисленном спирте; промывать до посинения ядра; обезводить, просветлить и заключить в синтетическую смолу. Результат: поливинилпирролидон окрашивается в розовый или вишнево-красный цвет, а ядра - в синий.

Известен способ выявления поливинилпирролидона, накопленного в тканях человека, с конго красным (Э.Пирс. Гистохимия теоретическая и прикладная (пер. с англ.). - М.: Изд. Иностр. лит. - 1962. - С.887) - прототип. Способ предусматривает следующее: - довести срезы до воды; - окрашивать 2-процентным раствором конго красного в 10-процентном спирте в течение 30 мин; - промыть в воде; - дополнительно окрашивать 1-процентным водным раствором светового зеленого SF в течение 2 мин; - быстро сполоснуть; - промокнуть фильтровальной бумагой и заключить в гумми-сироп Апати; - исследовать микропрепараты печени под светооптическим микроскопом. Результат: поливинилпирролидон окрашивается в оранжевый или вишнево-красный цвет, эластичные ткани - в коричневый, ядра - от коричневого до зеленого, а остальные структуры - в зеленый.

Недостатки способа: окрашивание ПВП конго красным в указанном способе нестойко, так как краска быстро выцветает, а окрашивание среза световым зеленым смазывает гистологическую картину в связи с зеленым окрашиванием желчных пигментов при токсическом гепатите с холестазом, что не позволяет выявить наличие других полимеров в тканях, например, таких как метацид (ПГМГ-ГХ).

В основу изобретения положена задача - расширить круг определяемых полимеров с основными свойствами, накапливаемых в тканях организма, выявить метацид в печени для аргументации клинико-морфологических особенностей токсического гепатита с холестазом и возможности проведения дифференциальной диагностики отравления суррогатным алкоголем на полимерной основе.

Указанная задача решается тем, что способ гистохимического выявления метацида печени при отравлении суррогатным алкоголем на полимерной основе, включающий приготовление парафинового среза, депарафинирование, окрашивание 2% раствором конго красного в 10% спирте, промывание в воде, исследование микропрепаратов печени с помощью светового микроскопа, характеризуется тем, что предварительно осуществляют обзорную микроскопию, отбирают микропрепараты с подозрением на токсический гепатит с интралобулярным холестазом, а окрашивание конго красным проводят в течение 10-15 минут, после промывания в воде микропрепарат печени помещают в глицерин, затем исследуют его под микроскопом и при визуализации оранжевого ободка вокруг желчных включений и цилиндров и неравномерного оранжевого окрашивания цитоплазмы гепатоцитов констатируют наличие в ткани печени метацида (полигексаметиленгуанидин гидрохлорида).

Предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет выявить такой полимер с основными свойствами, как метацид (ПГМГ-ГХ) в ткани печени, обуславливающий развитие медленно разрешающегося холестаза при токсическом гепатите, отличить отравление суррогатным алкоголем на его от алкогольной болезни печени, отравлений другими спиртсодержащими жидкостями.

Метацид или полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (Гембицкий П.А., 1984) - запатентованный дезинфектант для наружного применения - линейный или разветвленный полимер, прозрачная стеклообразная масса, растворимая в воде, не выявляется на современном этапе из биологических тканей при газовой и жидкостной хроматографии. При комнатной температуре в водных 10%-процентных, более высоких концентраций растворах происходит его студнеобразование вследствие интенсивного образования водородных связей. Полимер, по мнению автора, проходит стенку желудка и накапливается в ткани печени, придавая ей характерный зеленый оттенок при осмотре органов невооруженным глазом до и/или после фиксации материала.

Факт накопления метацида (ПГМГ-ГХ) в печени до сих пор не установлен. Вопрос об этиологии токсического гепатита с холестазом дискутируется. В 2008 году была опубликована экспериментальная работа на крысах ФГУН «Института токсикологии» ФМБА России (Санкт-Петербург). Учитывая противоречивость информации о кумулятивных свойствах метацида (ПГМГ-ГХ), проведена оценка кумулятивного эффекта с использованием теста «субхронической токсичности» в трех сериях экспериментов. Полученный средний коэффициент кумуляции 1,83 (по классификации Л.И.Медведя) свидетельствовал о выраженной кумуляции этого вещества (Бонитенко Е.Ю., Петров А.Н., Шевчук М.К. Влияние полигексаметиленгуанидин гидрохлорида на токсичность этилового спирта. / Проблемы стандартизации и внедрения современных диагностических и лечебных технологий в практической токсикологической помощи пострадавшим от острых химических воздействий: тезисы Росс. науч. конф. - Екатеринбург, 2008. - С.100-103).

По мнению других ведущих специалистов РФ роль токсиканта выполняет смесь спиртов (этанола, технических спиртов), взаимно усиливающих гепатотоксический эффект. Моноотравление полигексаметиленгуанидина гидрохлоридом может обсуждаться лишь гипотетически, поскольку достоверных признаков, подтверждающих его прямое гепатотоксическое действие, до сих пор не установлено. (В.В.Бенеманский, Ю.В.Солодун, Г.Г.Юшков. Сравнительная морфологическая характеристика изменений в печени у людей при отравлении спиртосодержащими жидкостями и у животных после подострого воздействия этиловым, пропиловым спиртами, этиленгликолем и их смесью. // Судебно-медицинская экспертиза. - 2010. - № 3. - С.14-16).

На основе заявляемого способа гистохимического выявления метацида (ПГМГ-ГХ) в печени при отравлении суррогатным алкоголем на полимерной основе установлено, что данное соединение обладает ролью биологической матрицы для оседания солей желчных кислот, гемоглобиногенных пигментов, присоединяет эндогенное железо как комплексонообразователь. Медленно разрешающийся холестаз обуславливает гепатонекрозы, развитие токсического гепатита с гипербилирубинемией и желтухой. Это в свою очередь приводит к формированию характерной клинической и морфологической картины отравления, сопровождающей токсический гепатит. Таким образом, подтверждается версия об отравлениях метацидом (полигексаметиленгуанидин гидрохлоридом), обнаруженным в спиртосодержащих жидкостях и оказывающим прямое токсическое действие на печень.

Предлагаемый способ осуществляют общепринятым в условиях гистологических лабораторий, практических учреждений здравоохранения методом (Бюро судебно-медицинской экспертизы, патологоанатомических отделений и бюро).

Для гистологического исследования на вскрытии берется кусочек печени размером 1×1×1 см у умершего больного с подозрением на отравление гепатотропным ядом, токсический гепатит, алкогольную болезнь печени. Кусочек ткани в течение 24 часов фиксируется в 10% формалине, промывается в проточной воде и обрабатывается по следующей схеме. Производится вырезка ткани печени (с учетом размера формочек для заливки в парафин) и толщиной не более 0,5 см, маркировка кусочков. Материал поступает в проводку, где повторно фиксируется в 10% формалине в течение суток. Затем промывается проточной водой не менее 20 часов и обезвоживается в спиртах восходящей концентрации (в гистологической батарее). Просветляется в двух сменах ксилола. Пропитывается спиртом и хлороформом, хлороформом, хлороформом и парафином, парафином не менее 30-45 минут. Для этого используются современные автоматы-лаборанты. После чего следует заливка в расплавленный парафин, помещенный в специальные формочки (на 4-6 часов) и охлаждение. Изготовление тканевых срезов производится на микротомах санного и роторного типов. Расправление тканевых срезов происходит на водяной бане и предметных стеклах. Далее следует сушка срезов на нагревательном столике. Тканевые срезы депарафинируют - проводят через растворитель парафина (ксилол), спирты нисходящей концентрации. Промывают в трех сменах дистиллированной воды. Промокают предметное стекло вокруг среза фильтровальной бумагой.

Приготавливают 2% раствор конго красного в 10% спирте. Наносят на срезы по 2-3 капли красящего раствора, относящегося к кислым красителям. Инкубируют 10-15 минут. Сливают остатки красителя. Промывают, погружая срез 8-10 раз в лабораторный стаканчик с дистиллированной водой. Промокают воду фильтровальной бумагой и заключают микропрепарат в глицерин.

Производится гистологическое исследование микропрепаратов печени под светооптическим микроскопом. Окислительно-восстановительная реакция, направленная на свойства химических соединений с основными свойствами связывать кислые тканевые красители, выявляет основные свойства субстрата, окрашенного конго красным. Вокруг включений в составе желчных цилиндров образуется оранжевый ободок, оранжевое окрашивание приобретает цитоплазма клеток Купфера, гепатоцитов, что позволяет сделать вывод о наличии в анализируемом препарате метацида (ПГМГ-ГХ).

Предлагаемый способ в отличие от известных позволяет выявить основные соединения (биополимеры с основными свойствами) в ткани печени, обуславливающие развитие медленно разрешающегося холестаза при токсическом гепатите, отличить отравление суррогатным алкоголем на полимерной основе от других отравлений.

Ранее подобные свойства накапливаться в ткани были установлены для препаратов поливинилпирролидона, гистологическое окрашивание которых разработано Пирсом (1962). В отличие от способа по Пирсу в предлагаемом способе не проводится докрашивание клеток световым зеленым. Трактовка результата окраски по Пирсу несколько меняется. Метацид окрашивается в оранжевый цвет. Желчные депозиты - в зеленый цвет. Эластические волокна и другие структуры, ядра клеток не окрашиваются.

Результаты заявляемого способа проиллюстрированы чертежами, где на фиг.1 - дана картина окрашивания метацида конго красным, вокруг желчных цилиндров, внутриклеточных желчных пигментов наблюдается оранжевое окрашивание; на фиг.2 - дана картина накопления материала умеренной электронной плотности (метаболитов ПГМГ-ГХ) в увеличенных по размеру и количеству лизосомах (фаголизосомах) клеток Купфера.

Пример 1. Исследована ткань печени умершего в стационаре А., 46 лет, от токсического гепатита. Гистоморфологическая картина изменений печени характеризовалась гепатонекрозами в центрах печеночных долек. Вокруг фокусов альтерации печеночных клеток накапливались сегментоядерные лейкоциты, лимфоцитов, макрофаги, пролиферировали гистиогенные клеточные элементы. Внутридольковый холестаз сопровождался формированием пигментных цилиндров в желчных капиллярах, внутриклеточным накоплением желчи. При окрашивании спиртовым раствором конго красного в ткани печени депозиты желчи и желчные цилиндры были окружены оранжевым ободком.

Пример 2. Исследована ткань печени умершего на дому гражданина В., 41 г., от отравления неустановленным гепатотропным ядом. В ткани печени - гепатонекрозы, жиробелковый детрит с реактивным лейкостазом. На фоне очагов деструкции лежат пигментные цилиндры с четкой границей, неправильной и округлой формы. Вокруг желчных пигментов имеется оранжевый ободок.

Пример 3. Исследована ткань печени гражданина С., умершего на дому от отравления гепатотропным ядом. Гепатонекрозы сочетаются с внутрипротоковым холестазом, пигментные цилиндры свободно лежат в жиробелковом детрите. При электронной микроскопии выявлены изменения клеток Купфера - печеночных макрофагов, представленные на фиг.2.

В фундаментальных исследованиях подобные изменения трактуются как макрофагальная реакция на инородный материал (Маянский Д.Н, 1991). Увеличение количества, размеров макрофагов, формирование макрофагальных узелков в печени выявлено заявителем при иммуногистохимической реакции с применением моноклональных антител к СД68.

Предлагаемый способ можно использовать для дифференциальной диагностики отравления суррогатным алкоголем на полимерной основе. Способ более прост, удобен и рентабелен для выполнения его в условиях гистологических лабораторий, так как используется только один краситель, уменьшена экспозиция окраски. В предлагаемом способе докрашивание световым зеленым (как у Пирса) не желательно, так как оно «смазывает» гистологическую картину в связи с зеленым окрашиванием желчных пигментов при токсическом гепатите, что снижает информативность исследования. Гумми-сироп Апати последнее десятилетие не поставляется в фирмы химических реактивов и лаборатории. Нестойкость окраски конго красным, кислая реакция бальзамов делает ненужным заключение в смолы (бальзамы), трудоемкие в использовании и предназначенные для длительного хранения гистологических микропрепаратов. В предлагаемом способе используется глицерин, а для фиксации результатов применяется микрофотосъемка.