способ моделирования синтициальных связей между клетками in vitro

Формула изобретения

Способ моделирования синцитиальных связей между клетками in vitro, включающий выделение клеток, отличающийся тем, что

- сливают нервные клетки, выделенные известными способами из ганглиев моллюска Lymnaea stagnalis, сняв их соединительнотканные капсулы и глиальные оболочки,

- помещают нервные клетки в культуральную среду,

- центрифугируют,

- оставляют на 2-е суток.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к моделям в нейробиологии и может быть использовано при морфологических исследованиях нервной системы и диагностике патологических факторов, влияющих на нейроны.

Известны несколько способов синцитиального слияния клеток: слияние с помощью вируса Сендай [1], с помощью полиэтиленгликоля [2], протамин сульфата, поли-Г4-этил-4-винил перидинийбромида и латекса полистерола [3], с помощью электропорации [4, 5] или электроакустического воздействия [6].

Однако эти методы не позволяют «сливать» нейроны, так как нейроны в отличие от других клеток имеют особую глиальную оболочку и находятся в соединительнотканных ганглиях. Кроме того, существующие методы требуют использование дополнительных «сливающих» веществ или воздействий, наносящих дополнительную травму живым клеткам. Часть из известных способов нельзя использовать для слияния клеток беспозвоночных, наиболее удобных для культивирования, так как при этом требуется поддержание повышенной температуры, неадекватной для большинства экспериментальных беспозвоночных.

Задача - моделирование синцитиального слияния нервных клеток без сливающих средств и повышения температуры среды.

Сущность предложенного способа моделирования синцитиальных связей между клетками in vitro, включающего выделение клеток, заключается в том, что предварительно выделенные известными способами [7] из ганглиев моллюска Lynmaea stagnalis нервные клетки сливают, сняв с них соединительнотканные капсулы и глиальные оболочки, затем их помещают в культуральную среду, центрифугируют и оставляют на 2-е суток.

Слияние достигается благодаря тому, что нейроны освобождены от соединительнотканной капсулы ганглия и собственной глиальной оболочки протеолитической обработкой. Затем их агрегируют центрифугированием и сохраняют в таком виде в питательной культуральной среде в течение двух дней. Нейроны восстанавливают естественную способность к адгезии и слиянию. Затем с помощью светового фазовоконтрастного микроскопа на полутонких срезах обнаруживают цитоплазматические ножки нейронов, связывающие клетки между собой (фиг.1), а далее на электронном микроскопе обнаруживают фрагментацию наружных клеточных мембран в области ножек и синцитиальное цитоплазматическое слияние нейронов, то есть превращение ножек в синцитиальные мостики (фиг.2).

Подписи к чертежам

На фиг.1 показано формирование цитоплазматических ножек при синцитиальном слиянии нейронов. Полутонкий срез, докраска толуидиновым синим, фазовый контраст; 1 - цитоплазматические ножки; 2 - вакуолеподобные расширения межклеточной щели; 3, 4, 5 - смежные нейроны. Об.40Ф, ок.10.

На фиг.2 показаны те же нейроны с помощью искусственного дифференциального контраста при синцитиальном слиянии нейронов. 1 - цитоплазматические ножки; 2 - вакуолеподобные расширения межклеточной щели; 3, 4, 5 - смежные нейроны. Об.40Ф, ок.10.

На фиг.3 показаны множественные образования цитоплазматических ножек и вакуолеподобных расширений межклеточной щели у двух контактирующих нейронов. 1 - цитоплазматические ножки контактирующих нейронов; 2 - вакуолеподобные расширения межклеточной щели; 3, 4 - смежные нейроны.

На фиг.4 показаны сохранившиеся наружные клеточные мембраны на границе цитоплазматических ножек двух нейронов. 1 - цитоплазматическая ножка контактирующего нейрона; 2 - вакуолеподобные расширения межклеточной щели; 3, 4 - смежные нейроны; 6 - межклеточная щель; 7 - цистерна эндоплазматической сети.

На фиг.5, 6 показаны варианты разрушенных границ между сливающимися двумя нейронами в области цитоплазматического мостика. 1 - цитоплазматическая ножка контактирующего нейрона; 2 - вакуолеподобные расширения межклеточной щели; 3, 4 - смежные нейроны; 6 - межклеточная щель; 7 - цистерна эндоплазматической сети; 8 - остаточные фрагменты разрушающихся мембран на границе двух нейронов.

Способ осуществляется следующим образом.

Большим пинцетом разрушают и удаляют раковину моллюска. Чтобы извлечь мозг, бранши глазных ножниц вводят в ротовое отверстие, вскрывают пищевод и удаляют окружающие ткани, расположенные дорсальное, обнажая окологлоточное кольцо ганглиев. Нервы, идущие от ганглиев кольца, обрезают. Перерезают пищевод. Окологлоточное кольцо переносят в физиологический раствор для моллюсков комнатной температуры, который содержит (мМ): 90 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl₂, 1.5 MgCl₂, а также 50 мкг/мл гентамицина сульфата для предотвращения инфицирования. Затем из нервного кольца выделяют ганглии, которые переносят в 0.4% раствор проназы при температуре около 20°-22°С. Используют лиофилизированную проназу из Streptomyces griseus (Serva). Проназу готовят на физиологическом растворе для моллюсков. Ганглии выдерживают в проназе 40 мин, затем отмывают от протеолитического фермента в физиологическом растворе.

Под бинокулярной лупой препаровальными иглами снимают с ганглиев соединительнотканную капсулу. Затем ганглии помещают на часовое стекло в небольшом количестве раствора Рингера и проводят пипетирование вначале с помощью Г-образной стеклянной микропипетки с диаметром отверстия кончика 0.8 мм, а затем - 0.6 мм. Таким образом, нервные клетки выделяют из ганглиев. Остатки оболочек ганглиев удаляют. Особенность этого метода заключается в том, что при сохранении нейронов он позволяет удалить и глиальные оболочки нейронов. Выделенную таким способом суспензию живых нервных клеток много раз промывают раствором Рингера для моллюсков. Для этого вращением часового стекла нервные клетки собирают в центре, а глиоциты и соединительная ткань оказывается на периферии и на поверхности. Ее удаляют с помощью микропипетки.

Последнее промывание проводят стерильным раствором питательной среды. В результате пипетирования удается получить изолированные, лишенные глии нейроны. В каждом опыте используются ганглии около 30 моллюсков.

Используется питательная культуральная среда Игла MEM (Sigma) без глютамина и бикарбоната. Такой состав среды является оптимальным для успешного культивирования диссоциированных нейронов Lymnaea stagnalis. В среду добавляют гентамицин сульфат в концентрации 50 мкг/мл. С помощью бикарбоната натрия устанавливают рН среды 7,8. Среду для стерилизации фильтруют, пропуская ее с помощью шприца через миллипоровые мембраны с диаметром пор 0,22 мкм. Фильтрованной средой заполняют стерильную центрифужную пробирку и осторожно Г-образной пипеткой переносят в нее выделенные нейроны. Перемещение клеток и центрифугирование проводится в специальном стерильном боксе. Нейроны центрифугируют в течение 30 минут при 3000 оборотов в минуту. Нервные клетки оставляют в центрифужной пробирке с культуральной средой на 2 суток. Центрифугирование применяется для агрегации клеток.

Для электронно-микроскопических исследований нейроны фиксирует 2,5%-ным раствором глютарового альдегида с последующей дофиксацией 2%-ным раствором осмиевой кислоты. Далее ганглии контрастируют в уранилацетате в течение 12 часов. После дегидратации в спиртах восходящей концентрации агрегат клеток заключают в аралдит и выдерживают по 24 часа в термостате при 37°С и 60°С для полимеризации аралдита. Срезы контрастируют цитратом свинца.

Для предварительного анализа формирования цитоплазматических ножек между нейронами фиксированный материал режут на ультратоме LKB-5 (Швеция) на полутонкие срезы и просматривают их под фазовоконтрастным видеомикроскопом. Ультратонкие срезы изучают под электронным микроскопом LEO 10 (Германия). Негативы сканируют в просвечивающем режиме с помощью сканера UMAX Astra 4000V (Тайвань). Позитивные изображения подвергают морфологическому анализу, пользуясь программой ImageJ.

Ультраструктурные исследования доказывают, что цитоплазмы смежных клеток сливаются, т.е. клетки объединяются в синцитий.

Способ позволяет впервые обнаружить межмембранные перфорации контактирующих нейронов, смоделировать и изучать образование синцитиальных связей между нейронами, что принципиально важно, фундаментально, ибо доказывает, что в нервной системе помимо межнейронных синапсов и электропроницаемых мембранных контактов существует третий тип коммуникаций - синцитиальная связь. Предлагаемый способ открывает новое направление, позволяя моделировать и изучать механизмы образования нейросинцитиев и их физиологические свойства.

Источники информации

1. Рингерц Н., Сэвидж Р. Гибридные клетки. М.: Мир, 1979, 415 с.

2. Lentz B.R., J.K.Lee. Poly (ethylene glycol) PEG - mediated fusion between pure lipid bilayers and mechanisms in common with viral fusion and secretory vesicle rebase. Mol. Membr. Biol. 1999. V.16. № 4. P.279-296.

3. Риттер В.Г., Ларин Ю.С., Самосудова И.В., Шунгская В.Е. Воздействие протамин сульфата, поли-N-этил-4-винилпиридинийбромида и полистирольного латекса на слияние миобластов в культуре. Биологические мембраны, М., Т.7, № 5, 1990, с.521-533.

4. Potter Н. Molekular genetic applications of electroporation // Electroporation and electrofusion in cell biology // Eds Neumann E., Sowers A.E., Jordan C.A. N.Y. and London. Plenum Press. 1989. P.331-342.

5. Абидор И.Г., Барбул А.И., Желев Д., Сухарев С.И., Бандрина И.Н., Федорова Л.И., Пастушенко В.Ф., Кузьмин П.И., Зеленин А.В. Электростимулируемое слияние клеток при центрифугировании и электрические свойства клеточных осадков. Биол. мембр., 1989, Т.6, № 12, с.1296-1312.

6. Bardsley D.W., Coakley W.T., Jones G., Liddell J.E. Electroacoustic fusion of millilitre volumes of cells in physiological medium. J. Biochem. Biophys. Meth., 1989, V.19, № 4, P.339-348.

7. Костенко М.А., Сотников О.С., Чистякова И.А., Сергеева С.С. Методические и методологические подходы к исследованию нейронов мозга взрослого животного (Lymnaea stagnalis) в культуре ткани. Морфология, 1998, т.114, в.4, с.102-106.