стабилизированная ферментная композиция

Формула изобретения

1. Стабилизированная ферментная композиция, содержащая фермент и эффективное количество кофейного материала, способствующего стабилизации фермента, при этом указанная композиция находится в сухом виде и содержит от около 1 до около 25% фермента и от около 75 до около 99% кофейного материала, причем указанный фермент представляет собой гидролазный фермент.

2. Композиция по п.1, в которой гидролазный фермент выбирают из группы, состоящей из маннаназы, целлюлазы, глюканазы, гемицеллюлазы, липазы, эстеразы, протеазы, арабиназы, галактаназы, арабино-галактаназы, нуклеазы, пектиназы, изомеразы, амилазы, лигниназы и их смесей.

3. Композиция по п.1 или 2, в которой кофейный материал выбирают из группы, состоящей из растворимого кофе, обжаренного и молотого кофе, кофейного масла, кофейной гущи, молотых зеленых кофейных бобов, водного экстракта кофе, экстракта незрелых кофейных бобов и их смесей.

4. Способ получения растворимого экстракта кофе, предусматривающий:

(1) обработку обжаренных твердых веществ кофе для получения кофейной суспензии, содержащей твердые вещества кофе;

(2) обработку кофейной суспензии эффективным количеством фермента в виде стабилизированной ферментной композиции при температуре и в течение времени, достаточных, чтобы гидролизовать твердые вещества кофе для получения растворимого кофейного экстрактного материала, причем стабилизированная ферментная композиция представляет собой композицию по любому из пп.1-3; и

(3) обработку растворимого кофейного экстрактного материала с получением растворимого экстракта кофе.

5. Способ по п.4, в котором кофейную суспензию на стадии (1) получают мокрым помолом твердых веществ обжаренного кофе, а растворимый экстракт кофе на стадии (3) получают путем разделения растворимого кофейного экстрактного материала на ретентат и пермеат, причем пермеат содержит растворимый экстракт кофе.

6. Способ по п.5, в котором разделение растворимого кофейного экстрактного материала на ретентат и пермеат проводят с использованием полупроницаемой мембраны с порогом отсечения по молекулярной массе от около 20000 до около 50000 Дальтон.

7. Полунепрерывный или непрерывный способ получения растворимого экстракта кофе, предусматривающий:

(1) обработку тонкомолотых твердых веществ кофе эффективным количеством фермента в виде стабилизированной ферментной композиции, чтобы гидролизовать твердые вещества кофе с получением растворимого кофейного экстрактного материала, содержащего растворимый экстракт кофе, причем указанная стабилизированная ферментная композиция представляет собой композицию по любому из пп.1-3;

(2) циркуляцию растворимого кофейного экстрактного материала через сепарационное устройство с полупроницаемой мембраной для непрерывного образования ретентата и пермеата, причем пермеат содержит растворимый экстракт кофе и непрерывно собирается в реакторе, а ретентат по меньшей мере частично рециркулируют в сосуд.

8. Способ по п.7, в котором полупроницаемая мембрана имеет порог отсечения по молекулярной массе от около 20000 до около 50000 Дальтон.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к стабилизированным ферментным композициям. В частности, изобретение относится к ферментным композициям, стабилизированным материалами на основе кофе. Стабилизированные ферментные композиции находят полезное применение в производстве кофейных продуктов.

Ферменты пищевого сорта обычно получают микробной ферментацией или экстракцией из растительных или животных тканей. Неочищенные ферменты, обычно представляющие собой водные растворы, могут быть очищены и сконцентрированы такими способами, как центрифугирование, мембранная фильтрация, микрофильтрация, осаждение солей, осаждение в среде растворителя и т.п. Очищенные ферменты стандартизируют и формируют в пригодные для продажи формы, такие как водные растворы, сухой гранулированный порошок или агломерированная гранулированная форма. Несформированные препараты, такие как водные ферментные концентраты или солевые осадки, часто используются в исследовательских целях, но редко используются в качестве коммерческих ферментов из-за трудности в их переработке, высокой вероятности микробного роста и/или понижения активности в ходе хранения. Стабилизация ферментов включает ингибирование микробного роста и консервацию ферментной активности в ходе обработки и хранения. Ферментная активность может уменьшаться в связи с протеканием ряда естественных процессов, включающих окисление, термический гидролиз и протеолиз. Микробиологический рост особенно характерен в водных системах и достаточно редок в сухих рецептурах. Однако не все ферменты способны легко высушиваться и во многих случаях водные рецептуры могут оказаться предпочтительными из-за отсутствия загрязнений из воздуха и легкости в использовании таких материалов.

Некоторые материалы или ингредиенты, удовлетворяющие пищевым нормам, могут добавляться в жидкость или сухие ферментные рецептуры для (1) стабилизации ферментной активности в ходе очистки, обработки, хранения и/или нарушения режима хранения, (2) ингибирования роста микроорганизмов, (3) возможности стандартизации активного ингредиента и/или (4) облегчения более удобного распределения фермента. Такие материалы или ингредиенты включают противомикробные препараты, ингибирующие микробный рост в продукте, стабилизаторы, предохраняющие уменьшение ферментной активности в ходе сушки, хранения или нарушений режима хранения, диспергаторы, способствующие смачиванию или диспергированию ферментов, агенты буферизации, которые регулируют рН рецептуры в ходе применения, а также наполнители/стандартизирующие агенты, способствующие корректировке активности до стандартного уровня и способствующие удобному распределению фермента. Примерами противомикробных агентов пищевого сорта могут служить сорбиновая кислота, пропионовая кислота, сорбат калия, эритоборат натрия. Другие стабилизаторы включают сахара, такие как сахароза и лактоза, такие многоатомные спирты, как глицерин, сорбит, манит, такие соли, как хлористый натрий, хлористый калий, хлористый аммоний, такие органические кислоты, как лимонная кислота, такие белковые материалы, как обезжиренное молоко, а также концентрат сывороточного молочного белка и т.п., такие олигомеры, как поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, и такие амфотерные материалы, как бетаин и гамма-аминодибутират. Механизм стабилизации не всегда понятен; однако предполагается, что он включает защиту ферментного белка (или в некоторых случаях, небелковой субстанции, требующейся для проявления активности) от денатурации или дезактивации при воздействии термических экстремумов, сушки, сдвиговых напряжений, осмотического стресса, рН стресса, ионных градиентов, протеолиза и других вредных влияний. Буферные агенты включают уксусную кислоту, ацетат натрия, фосфат натрия, серную кислоту, карбонат кальция и т.п. Диспергенты включают лецитин, сапонины и т.п. В том случае, когда ферментный препарат подлежит сушке, предпочтительно добавлять формирующие или стабилизирующие ингредиенты в водную среду до сушки, поскольку они лучше смешиваются с ферментами, а стабилизаторы могут предохранять ферменты в ходе сушки.

Растворимый кофе, на который ссылаются как на быстрорастворимый кофе, представляет собой удобную альтернативу более традиционному обжаренному и молотому кофе (R&G). Быстрорастворимые сорта кофе часто имеют крепкий аромат R&G бобов, что составляет удобство быстрого приготовления. Растворимый кофе обычно получают экстракцией и термическим гидролизом обжаренного и молотого (R&G) кофе, с последующим отделением и сушкой экстракта. Часто растворимый кофе может иметь несбалансированный вкус и аромат, связанный с высокой степенью обработки и соответствующими потерями. Высокие температуры и давления, используемые в таких процессах, часто способствуют нежелательному аромату, вследствие чего получают менее качественный продукт в сравнении с R&G кофе.

Худшее качество растворимых видов кофе является давнишней проблемой. Предпринимались многочисленные попытки создания высокопроизводительного способа получения растворимого кофе, устраняющего нежелательный привкус и сохраняющего максимально возможный кофейный аромат и вкус. Для решения таких давних проблем исследовалось использование ферментов в производстве растворимого кофе.

Так, например, в Патенте США No. 2282138, выданном на имя Kellogg, описывается производство растворимого кофе с использованием преобразующего фермента, такого как taka diastase, предназначенного для обработки кофейного материала. В таком процессе используется пар высокого давления (15 фунт/дюйм²) для размягчения и разрыхления кофейной бобовой матрицы с последующим охлаждением и обработкой ферментом при температуре по существу не выше 65°С, обычно 48-54°С.

В патенте США 4983408 (Coton) описывается способ, в котором используются ферменты для растворения кофейных компонентов после предварительной обработки молотого кофе методом «парового взрыва» с последующей быстрой декомпрессией для атмосферного давления. Используемый ферменты включают амилазы, гемицеллюлазу, целлюлазу, протеазу, целлобиазу, пектиназу и липазы.

В патенте США No. 4904484 (Smal et al.) описывается способ получения R&G кофе в результате обработки зеленых или частично поджаренных кофейных бобов в присутствии ферментов до окончательного обжаривания. Используемые ферменты включали переваривающую клеточную стенку, переваривающий компонент хранения клеток или фенольные оксидазные ферменты. Ферменты, переваривающие клеточные стенки, включают целлюлазы, гемицеллюлозы, пектиназы, глюканазы, маназы и лигниназы. Ферменты, переваривающие компоненты хранения клеток, включают амилазы, глюкозидазы, маннозидазы, декстраназы и протеазы. Фенолоксидазные ферменты включают тирозиназу, фенолазу и другие экстракты, такие как чаи, яблочный сок, грушевый экстракт и виноградный сок.

Сообщается об использовании кофейных материалов, таких как использованные кофейные массы (кофейная гуща) в качестве питательных веществ для ферментации для микробного производства ферментов. См., например, Regalado et al., J. Sci. Food Agr., 80:9, p. 1343-1350 (2000).

Позднее были получены растворимые кофейные экстракты, приготавливаемые с использованием ферментов в процессе гидролиза, совмещенном с методами мембранной проницаемости (см. заявку ЕР 05106563.9 от 18 июля 2005, включенную в данное описание путем ссылки). Обжаренный кофе подвергают мокрому размолу с получением кофейной суспензии. Кофейную суспензию обрабатывают эффективным количеством подходящего фермента с получением реакционной смеси, после чего обрабатывают при температуре 20-90°С для гидролиза кофейных компонентов обжаренных сухих веществ кофе с получением растворимого кофейного материала. Растворимый кофейный материал экстрагируют водой и затем разделяют на ретентат, который содержит фермент и другие нерастворимые мелкие частицы и пермеат, содержащий очищенный растворимый экстракт кофе, с использованием полупроницаемой мембраны. Особенно подходящими ферментами для указанного способа являются гидролазы, такие как манназа, целлюлаза, гемицеллюлаза, протеаза, пектиназа, нуклеаза и липаза. Рассмотренный процесс обеспечивает получение растворимого кофе с более сбалансированным, улучшенным ароматом без нежелательных соединений, образующихся в ходе термической деградации, при сравнении с термическим способом, при сохранении сравнимых значений растворимости.

Хотя ферменты позволяют преодолеть большинство ограничений, существующих в области производства растворимого кофе, в результате значительного понижения количества подводимого тепла, воздействующего на продукты, введение ферментов в процессы получения кофе достаточно сложны. Сами ферментные белки имеют большую молекулярную массу и будут выводиться в процессе получения растворимого кофе, однако большая часть типичных формирующих или стабилизирующих ингредиентов представляет собой низкомолекулярные вещества и сохраняется в готовом продукте. В частности ингредиенты, используемые для стабилизации ферментной активности в ходе хранения в течение срока годности, могут переноситься в готовые продукты и оказывать побочные эффекты, касающиеся качества продукта. Так, например, хотя способ, описанный в заявке на Европейский патент 0510653.9, предусматривает использование мембранного разделения, рецептурные ингредиенты могут проникать через мембрану и концентрироваться в растворимом кофейном продукте. Даже такие изначально нерастворимые рецептурные агенты, как мальтодекстрины, могут частично растворяться под воздействием ферментов и попадать в кофейный продукт. Удаление таких рецептурных агентов также повышает сложность и увеличивает стоимость процесса.

Следовательно, сохраняется потребность в разработке эффективного способа получения растворимого кофе, сохраняющего вкус и аромат крепкого кофе, аналогичный R&G кофе с использованием ферментов, но без традиционных рецептурных ингредиентов, обычно используемых для стабилизации таких ферментных субстанций. Кроме этого сохраняется потребность в разработке упрощенного более экономичного способа производства растворимого кофе, с уменьшенной стоимостью транспортировки.

Изобретение относится к стабилизированным ферментным композициям. В частности изобретение относится к ферментным композициям, стабилизированным материалами кофейного происхождения. Стабилизированные ферментные композиции по изобретению обладают сравнимой стабильностью активных компонентов с традиционно стабилизированными рецептурами, но содержат только рецептурные ингредиенты кофейного происхождения. Стабилизированные ферментные композиции по изобретению могут использоваться в любом применении, когда желательно избегать включения традиционных стабилизаторов и других добавок, повышающих стабильность. Такие стабилизированные ферментные композиции особенно полезны в ферментом производстве растворимого кофе и других кофейных продуктов.

Изобретение предусматривает стабилизированную ферментную композицию, содержащую фермент и эффективное количество материала на основе кофе, предназначенного для стабилизации фермента. Предпочтительный стабилизированный фермент в основном состоит из фермента и эффективного количества кофейного материала, предназначенного для стабилизации фермента и находящегося в виде водного раствора или суспензии, сухого порошка, сухих гранул, или суспензии сухого порошка или высушенных гранул в кофейном масле.

Кроме этого изобретение также предлагает способ получения растворимого экстракта кофе, предусматривающий

(1) обработку сухих веществ кофе для получения кофейной суспензии, содержащей сухие вещества кофе;

(2) обработку кофейной суспензии эффективным количеством ферментов в виде стабилизированной ферментной композиции при температуре и в течение времени, которые достаточны для гидролиза сухих веществ кофе для получения растворимого экстракта кофе, при этом стабилизированная ферментная композиция содержит фермент и эффективное количество кофейного материала для стабилизации фермента; и

(3) разделение растворимого экстракта кофе на ретентат и пермеат, причем пермеат содержит растворимый экстракт кофе.

Кроме этого изобретение предлагает полунепрерывный или непрерывный способ получения растворимого экстракта кофе, предусматривающий

(1) обработку тонкомолотых обжаренных сухих веществ кофе эффективным количеством фермента в виде стабилизированной ферментной композиции в сосуде для гидролиза сухих веществ кофе с получением растворимого кофейного экстрактного материала, содержащего растворимый экстракт кофе, причем стабилизированная ферментная композиция содержит фермент и эффективное количество кофейного материала для стабилизации фермента;

(2) циркуляцию растворимого экстракта кофе через сепарационное устройство с полупроницаемой мембраной для непрерывного образования ретентата и пермеата, причем пермеат содержит растворимый экстракт кофе и непрерывно собирается в системе и по меньшей мере часть ретентата рециркулируется в сосуд.

Как указывалось выше, изобретение относится к ферментным композициям, стабилизированным кофейными материалами. Стабилизированная ферментная композиция согласно изобретению может использоваться в любом применении, когда желательно избежать включения или использования традиционных стабилизаторов и других добавок, повышающих стабильность. Рассматриваемая стабилизированная ферментная композиция может использоваться в производстве различных пищевых продуктов, фармацевтических продуктов, косметических продуктов и т.п. при условии, что кофейные материалы приемлемы для обработки и в готовом продукте. Рассматриваемые стабилизированные ферментные композиции, позволяющие избежать использования традиционных стабилизаторов, все еще сохраняют желаемую стабильность и активность ферментов в ходе хранения и/или неправильного употребления при использовании только кофейных материалов.

Стабилизированные ферментные композиции особенно полезны для производства растворимого кофе и других кофейных продуктов при использовании ферментов, которые не содержат традиционных стабилизаторов, обычно ассоциирующихся с ферментными рецептурами. Так, стабилизированные ферментные композиции по изобретению особенно полезны в ферментной обработке сухих веществ кофе для гидролиза кофейных материалов.

Изобретение также может использоваться для стабилизации ферментного препарата, используемого в пищевой, фармацевтической, косметической и других отраслях промышленности, где нежелательно применять традиционные стабилизаторы. Рассматриваемые ферменты особенно полезны для использования в пищевом препарате, который может быть стабилизирован с использования рассматриваемого способа, включающего применение манназы, целлюлазы, глюканазы, гемицеллюлазы, липазы, экстеразы, протеазы, карбогидразы (например, арабиназы, галактаназы, арабино-галактаназы), нуклеазы, пектиназы, изомеразы, амилазы и лигназ, а также их смесей. В результате использования ферментных композиций, стабилизированных кофейными материалами, растворимые кофейные продукты могут быть легко получены без применения традиционных ферментных стабилизаторов.

Кофейные материалы, используемые для стабилизации ферментных композиций, включают, например, растворимый кофе, обжаренный и молотый кофе, кофейные масла, истощенные (т.е. частично экстрагированные) кофейные основы, молотые зеленые кофейные бобы, водные кофейные экстракты, экстракты зеленых кофейных бобов и т.п., а также их смеси; при желании экстракты или другие кофейные материалы могут концентрироваться. Разумеется, что такие кофейные материалы не должны включать или быть получены в присутствии ферментных композиций, содержащих традиционный стабилизатор, который согласно изобретению должен быть исключен из готового продукта. Так, например, растворимые кофейные материалы, используемые для стабилизации ферментных композиций, не должны быть производными растворимого кофе, полученного с использованием традиционно стабилизированных ферментных композиций.

Стабилизированные ферментные композиции по изобретению могут быть образованы в виде водных смесей или могут быть высушены с получением сухих композиций (например, порошка или агломерированных частиц). Обычно такие композиции содержат от около 1 до около 25% фермента и от около 10 до около 99% кофейных материалов от общего веса композиции. Обычно в случае водных рецептур активный ферментный белок содержится в количестве от около 1 до около 25% от веса рецептуры, а кофейные материалы содержатся в количестве от около 10 до около 50% (предпочтительно от около 20 до около 40%) от общего веса рецептуры. В сухих рецептурах содержание активного ферментного белка составляет от около 1 до около 25% от общего веса рецептуры, а содержание кофейных материалов составляет от около 75 до около 99% от общего веса рецептуры. В сухих формах кофейные материалы предпочтительно присутствуют в ходе образования сухой ферментной композиции (например, при распылительной сушке, лиофилизации и т.п.). Водные композиции предпочтительно хранят при охлаждении или в замороженном состоянии; сухие составы могут храниться в окружающих условиях, при охлаждении или в замороженном состоянии.

Используемый в тексте термин «традиционные стабилизаторы» включает традиционные противомикробные средства, которые ингибируют микробный рост в продукте и традиционные стабилизаторы, сохраняющие ферментную активность в ходе сушки, хранения или неправильного использования. Таким образом, без конкретных ограничений предполагается, что кофейные материалы, используемые в изобретении, выполняют обе указанные функции (т.е. ингибируют микробный рост и сохраняют ферментную активность при хранении и/или неправильном использовании). Опять-таки без конкретных ограничений предполагается, что кофейные материалы обладают и другими функциями, например такими, как функция буферных агентов и диспергентов в ферментных рецептурах. Отсюда следует, что кофейные стабилизаторы согласно изобретению обеспечивают защиту ферментного белка (или в некоторых случаях небелкового вещества, требующегося для проявления активности) от денатурации или дезактивации при термических экстремумах, сушке, сдвиговых напряжениях, осмотическом стрессе, рН стрессе, ионных градиентах, протеолизе и других вредных воздействиях.

В том случае, когда стабилизированные ферменты изобретения используют для приготовления растворимого экстракта кофе, неочищенной экстрактный материал содержит растворимый экстракт кофе, фермент и другие нерастворимые частицы. Поскольку ферментный состав стабилизировали кофейным материалом, традиционные стабилизаторы отсутствовали, то фермент и другие нерастворимые частицы можно было разделять традиционными способами с получением растворимого экстракта кофе, практически не содержащего некофейного материала. Нужный экстракт кофе предпочтительно выделять из других компонентов пропусканием реакционной смеси через полупроницаемую мембрану, как описано, например, в заявке на Европейский патент 05106563.9 от 18 Июля 2005 г. Мембрана может быть выполнена из любого материала с размером пор, способным удерживать фермент и другие нерастворимые вещества, но обеспечивая проникновение воднорастворимых сахаридов, экстракта кофе и других материалов. Обычно используются мембраны с номинальным размером пор менее 0,8 микрон. Так, например, мембраны из полиэфирсульфона с порогом отсечения по молекулярной массе от около 20000 до около 50000 Дальтон может применяться для выделения растворимого экстракта кофе. Предпочтительная полиэфирсульфоновая мембрана, подходящая для использования в способе согласно изобретению, может быть приобретена у Sepro, Inc. (Oceanside, CA). Для рассматриваемой цели могут использоваться мембраны, сконструированные из других материалов. Мембрана может находиться внутри сепарационной ячейки с поперечной мембраной или в другом аналогичном устройстве, которое может использоваться для мембранного разделения, такого как спирально-намотанные модули, мембраны из плоских волокон, пучки трубок или плоские и каркасные модули.

Преимущества и варианты осуществления изобретения дополнительно иллюстрируются следующими примерами, однако указанные количества, а также другие условия и подробности не следует рассматривать как чрезмерно ограничивающие область изобретения. Если не указано другое, то все части, соотношения и проценты являются весовыми. На все публикации, включающие патенты и опубликованные патентные заявки, ссылаются в настоящем документе.

Пример 1. Использовали замороженный, несформированный маннаназный фермент (FUM: ChemGen CL 160 от ChemGen Corp., Gaithersburg, MD). Фермент FUM получали ферментацией Bacillus lentus; клетки и дебрис удаляли центрифугированием с последующей концентрацией и очисткой фермента с использованной способа мембранной ультрафильтрации; другие материалы не добавляли. Размороженный фермент разбавляли в соотношении 1:20 в (образец 1) деионизированной воде и (образец 2) в деионизированной воде, содержащей 10% Kenco®Really Rich розничного растворимого кофе. Образцы обоих растворов погружали в кипящую водяную баню на 30 секунд и затем быстро охлаждали на бане со льдом. Необработанные растворы, а также ненагретый раствор образца 1 (т.е. контрольный) анализировали на активность фермента маннаназы, с использованием вискозиметрического определения в присутствии смолы рожкового дерева. В сравнении с контрольным образцом обработанный образец 1 терял около 33% начальной ферментной активности, тогда как образец 2, стабилизированный кофейными материалами, терял лишь около 2% исходной ферментной активности (т.е. в пределах точности эксперимента активность практически не менялась).

Пример 2. Этот пример иллюстрирует получение сухих ферментных препаратов, стабилизированных кофейными материалами. Использовали замороженный несформированный маннаназный фермент (FUM) из примера 1. Часть замороженного FUM оттаивали и готовили пять сухих рецептур путем добавления следующих индивидуальных ингредиентов (в количестве около 20%) к оттаявшим образцам FUM

(1) Растворимый кофе (Maxwell House®);

(2) Сорбит и хлористый натрий (по 10%) каждого вещества);

(3) Оксид кремния (40-100 меш; Fisher Scientific);

(4) Целлюлоза (Neocetl^TM в виде порошка; Mingtai Chemical) и

(5) Обжаренный и молотый (R&G) кофе (Maxwell House®), измельченный в сухом виде до частиц размера - 30 меш).

Образцы 2-4 формировали в присутствии типичных стабилизаторов, используемых в ферментных рецептурах. Каждый препарат тщательно перемешивали и затем быстро сушили вымораживанием в лиофильной сушилке VirTis Model 25ES. Часть лиофилизированных рецептур хранили при 20 и 50°С; через различные периоды времени образцы извлекали и проводили анализ на ферментную активность и микробиологический анализ.

Ферментную активность измеряли с помощью вискозиметрического анализа, используя свежеприготовленный раствор смолы рожкового дерева (1%; начальная вязкость 2800-3500 сП при 20°С). Ферментную рецептуру разбавляли водой в соотношении 1:10, тщательно перемешивали и при необходимости дополнительно разбавляли. Разбавленные образцы анализировали сразу после получения. В пробирку, содержащую 30 мл раствора смолы при 20°С, в «нулевое время» добавляли 25 микролитров подходящего разбавления данного ферментного раствора. Подходящее разбавление (обычно около 1:100) ферментной рецептуры позволяло эффективно уменьшать вязкость смолы до <500 cП за 5-15 минут.

Каждый раствор, содержащий смолу и фермент, перемешивали в течение 30 секунд и затем анализировали на вискозиметре Brookfield DVII+ (катушка 6, скорость вращения 20 об/мин). Временную зависимость вязкости регистрировали с помощью программного обеспечения Brookfield Wingather. Относительную ферментную активность определяли по линейному наклону кривой вязкость-время до 500 сП и/или по времени для достижения вязкости 500 сП. Поскольку наклон кривой был необязательно линейным при разбавлении фермента, сравнительные образцы и контрольные образцы подвергали анализу при таком же разбавлении (обычно 1:100). Поскольку при лиофилизации определенную роль играет концентрационный фактор, сухие образцы, исходя из предположения об отсутствии потери активности, характеризовались 2,5-кратной активностью в расчете на единицу веса (т.е. 250) исходного образца FUM (т.е. 100). Полученные результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1
Состав добавки	Относительная активность*
Хранение в течение 87 дней при 20°С	Хранение в течение 56 дней при 50°С
Растворимый кофе	271	167
Сорбит и хлористый натрий	198	118
Оксид кремния	235	49
Целлюлоза	159	35
R&G кофе	272	163
* Относительная активность FUM принята за 100. Рецептуры могут иметь активность выше 100 из-за эффекта концентрации. Традиционные стабилизаторы, используемые в ферментных рецептурах

Стабилизированные образцы кофейных материалов, которые хранили при 20°С, неожиданно демонстрировали более высокую активность, чем другие рецептуры даже после 3-месячного хранения.

Рецептуры, хранимые при температуре 50°С, оказались значительно менее активными, чем те, что хранили при 20°С. Однако неожиданно было установлено, что рецептуры на основе кофе сохраняли более высокую активность (т.е. около 60% активности сохранялось при хранении при температуре 20°С) по сравнению с рецептурами без кофейного материала. Поэтому кофепроизводные материалы в сухих рецептурах служат стабилизаторами при температурах хранения 20-50°С.

Микробиологическая стабильность оценивалась общим чашечным подсчетом (TPC) c использованием АОАС способа 966.23. Исходный замороженный FUM имел значение ТРС около 9800 подсчетов/грамм. Процесс лиофилизации повышал концентрацию сухого материала в 2,5 раза. В Таблице 2 представлены значения ТРС в образцах, хранимых в течение 3 и 9 недель при 20°С и в течение 3 недель при 50°С.

Таблица 2
Состав добавки	Общий чашечный подсчет/г*
Хранение при 20°С	Хранение в течение 56 дней при 50°С
3 недели	9 недель
Растворимый кофе	6300	<300	240
Сорбит и хлористый натрий +	10000	<300	750
Оксид кремния +	5500	<300	500
Целлюлоза +	500	<300	100
R&G кофе	6500	<300	380
* контрольная жидкость FUM характеризовалась значением чашечного подсчета 9800 подсчетов/г + Традиционные стабилизаторы используемые в ферментных рецептурах

Все сухие образцы демонстрировали значительное уменьшение ТРС (в отличие от увеличения, связанного только с коэффициентом концентрации). Образцы сформированные с кофейными материалами сравнивали с другими материалами рецептуры. Образцы, которые хранили при 50°С, характеризовались значительно более низкими подсчетами, чем образцы, хранимые при 20°С. Сухие образцы, хранимые при 20°С в течение 9 недель, анализировались при значениях менее 300 ТРС/г. Такие сухие образцы характеризовались очень низкой активностью воды, в результате чего наблюдалось ингибирование микробного роста. Все сухие образцы характеризовались приемлемо низким микробным ТРС.

Пример 3 . Пример иллюстрирует получение жидких ферментных рецептур, стабилизированных кофейными материалами. Замороженный несформированный маннаназный фермент из Примера 1 оттаивали, и жидкие рецептуры готовили добавлением следующих индивидуальных ингредиентов (в количестве 20%)

(1) Растворимый кофе (Maxwell House®);

(2) Сорбит и хлористый натрий (по 20%) каждого вещества);

(3) Контрольный FUM (без добавок)

Части водных жидких рецептур хранили при 4, 20 и 50°С и через различные временные интервалы отбирали образцы для определения ферментной активности и микробиологического анализа с применением тех же аналитических методов, что и в Примере 1.

В следующих ниже Таблицах 3 и 4 представлены значения ферментной активности и микробиологические результаты, соответственно.

Таблица 3
Состав добавки	Относительная активность
4°С в течение 49 дней	60 дней при 20°С	56 дней при 50°С
Контроль	97,5	31,9	11,1
Сорбит и хлористый натрий+	47,6	32,3	19,0
Растворимый кофе	73,4	10,0	0
Традиционные стабилизаторы, используемые в ферментных рецептурах

Таблица 4
Состав добавки	Общий чашечный подсчет/г
4°С в течение 3 недель	3 недели при 20°С	3 недели при 50°С
Контроль	3700	9,5Ч107	8
Сорбит и хлористый натрий+	3600	530	270
Растворимый кофе	100	200	20
Традиционные стабилизаторы, используемые в ферментных рецептурах

В Таблице 3 представлены ферментные активности жидких образцов, хранящихся в течение различного времени и при различных температурах. Из-за эффекта разбавления ингредиентов рецептуры можно предсказать, что сформированные жидкости будут характеризоваться 60% активностью контрольного образца (т.е. несформированного FUM), предполагая отсутствия влияния добавок.

В случае образцов, хранящихся при 4°С, несформированный FUM сохранял высокий процент контрольной активности (т.е. более 97%) даже через 7 недель хранения. Неожиданно было установлено, что рецептура растворимого кофе, хранимая при 4°С в течение 7 недель, характеризовалась 73% контрольной активности; это значение выше предсказанных 60%, если ингредиенты не оказывают влияния. Соль/сорбитная рецептура, хранящаяся при 4°С, характеризовалась активностью 47,6%.

При хранении в ненадлежащих условиях, т.е. при 50°С в течение 8 недель, несформированный FUM сохранял лишь 11% контрольной активности. Растворимая кофейная рецептура образовывала практически нерастворимый гель при 50°С и фактически теряла всю активность. В случае хранения при 20°С, несмотря на то, что в несформированном FUM наблюдался значительный микробный рост (см. ниже), сохранялось около 32% контрольной ферментной активности; рассматриваемый материал не является приемлемым из-за микробного роста. Растворимая кофейная рецептура сохраняла лишь 10% контрольной активности и при этом образовывался нерастворимый гель.

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что растворимый кофе, по-видимому, является эффективным стабилизатором ферментной активности в водных жидких рецептурах, хранящихся в условиях охлаждения (4°С). Однако такой режим не эффективен для хранения при комнатной температуре (20°С) или в более жестких условиях (50°С).

Как следует из Таблица 4, несформированный контрольный FUM микробиально нестабилен при хранении при 20°С; за 3 недели происходило резкое увеличение общего чашечного подсчета. Однако несформированный контрольный образец, хранящийся при 4°С, демонстрировал понижение ТРС более чем на 60% и 99% понижение в условиях хранения при 50°С. По-видимому, наблюдаемый эффект связан со смертностью в ходе хранения части первоначально присутствующих микробов. В отличие от этого оба образца сформированной рецептуры демонстрировали хорошую микробную стабильность в условиях хранения при 20°С в течение 3 недель; при этом растворимые кофейные рецептуры характеризовались несколько более низким значением ТРС. Таким образом, 40 вес.% растворимого кофе ингибирует микробный рост в ходе хранения при 20°С. В течение 6 недель хранения при 20°С образцы рецептуры демонстрировали незначительное изменение ТРС.