способ определения массовой доли пектиновых веществ в растительном сырье

Формула изобретения

Способ определения массовой доли пектиновых веществ в растительном сырье, включающий высушивание бумажных складчатых фильтров до постоянной массы, приготовление стандартизованных растворов протопектина и гидратопектина, отбор проб, нейтрализацию кислой среды раствора протопектина, омыление фракций пектиновых веществ в отобранных пробах, осаждение пектиновых веществ, фильтрование осадков, промывание осадков на фильтре дистиллированной водой, высушивание фильтров с осадками до постоянной массы, расчет массовой доли пектиновых веществ по фракциям, отличающийся тем, что омыление пектиновых веществ в анализируемых растворах проводят 40%-ным раствором NaOH в течение 15 мин, пектиновые вещества осаждает концентрированной HCl, а массовую долю пектиновых веществ рассчитывают по формулам

- для гидратопектина



где _гп - массовая доля фракции гидратопектина, %;

m₁ - масса навески исследуемого сырья, взятой для анализа, г;

m₂ - масса осадка, г;

0,8 - коэффициент пересчета объема «стандартизованного» раствора гидратопектина, взятого для исследований, к общему объему «стандартизованного» раствора гидратопектина;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

- для протопектина



где _пп - массовая доля фракции протопектина, %;

0,4 - коэффициент пересчета объема «стандартизованного» раствора протопектина, взятого для исследований, к общему объему «стандартизованного» раствора протопектина.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к технической биохимии, а именно к определению количества пектиновых веществ в растительном сырье.

Вне зависимости от природы растительного материала и методики количественного определения содержания пектиновых веществ в нем, первым шагом всегда является приготовление «стандартизированных» растворов гидратопектина и протопектина, суть которого заключается в поэтапном и максимально полном извлечении всего гидратопектина и протопектина из растительной ткани. Полученные таким образом экстракты гидратопектина и протопектина исследуют одним из существующих способов.

Известен способ количественного определения пектиновых веществ, который основан на осаждении пектиновых кислот сильными минеральными кислотами в условиях повышенного тяготения («объемный» метод).

К 200 мл «стандартизованного» раствора гидратопектина или протопектина, отобранных для исследования, прибавляют 2,5 мл 40%-ного раствора NaOH и выдерживают при комнатной температуре 15 минут. Образовавшуюся пектиновую кислоту осаждают 10 мл концентрированной HCl и центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10-15 минут в некотором количестве градуированных центрифужных пробирок. В результате центрифугирования пектиновые коллоиды образуют осадок, объем которого измеряют в каждой пробирке. Объемы осадков во всех пробирках суммируют. Затем, пользуясь калибровочной кривой и объемом полученного осадка, определяют концентрацию пектиновых веществ [Шелухина Н.П. Научные основы технологии пектина. - Фрунзе: Илим, 1988, - 168 с.].

К недостаткам данного способа можно отнести приведенные унифицированные параметры центрифугирования, которые на практике не обеспечивают точности анализа, так как пектиновые кислоты, выделенные из различного вида сырья, обладают неодинаковой способностью к образованию осадка в условиях повышенного тяготения. В результате осадки получаются различной плотности, что неизбежно сказывается на занимаемом ими объеме, и, кроме того, часть сгустков пектиновых кислот нередко свободно размещается в объеме жидкости центрифужной пробирки, так и не перейдя в осадок. Кроме того, объем осадков в пробирках бывает настолько мал, что по градуировке пробирки точно определить его количество не удается. Все это неизбежно приводит к высокой погрешности и неточному результату анализа. К недостаткам способа также следует отнести необходимость использования специфического оборудования (центрифуга и градуированные центрифужные пробирки).

Известен способ количественного определения пектиновых веществ, который основан на осаждении пектиновых кислот в виде кальциевых солей - пектатов - и учете их количества весовым способом («кальций-пектатный» метод).

Началу проведения анализа предшествует высушивание необходимого количества бумажных складчатых фильтров при температуре 100-105°С до постоянной массы.

Раствор протопектина подготавливают к омылению, нейтрализуя кислую реакцию среды, при которой проводилось экстрагирование протопектина, гидроксидом натрия.

Далее следует стадия омыления гидратопектина или протопектина, (в зависимости от исследуемого «стандартизованного» раствора), для чего отбирают по 50 мл соответствующего «стандартизированного» раствора. В эту же колбу прибавляют такой же объем 0,1н. (0,4%) раствора NaOH. Колбу закрывают и оставляют на 8-10 часов при комнатной температуре для проведения процесса омыления карбоксильных групп пектина.

По истечении указанного времени растворы подкисляют 50 мл 1н. уксусной кислоты и выдерживают в течение 30 минут. Образовавшиеся пектиновые кислоты осаждают 50 мл 11,1% раствора CaCl₂. Полученные 1 осадки пектата кальция отфильтровывают через заранее высушенные до постоянной массы фильтры. Осадки на фильтрах промывают 0,5% раствором CaCl ₂ порциями по 50 мл, после чего осадки многократно промывают холодной дистиллированной водой для полного удаления ионов хлора. Полноту отмывки осадка пектата кальция от ионов Cl^- определяют по качественной реакции фильтрата с AgNO₃ . С целью снижения зольности осадок на фильтре несколько раз промывают горячей дистиллированной водой.

Фильтры с промытым осадком аккуратно переносят в бюксы и сушат при температуре 100-105°С до постоянной массы.

Если масса осадка, полученная из разности между массой бюкса с высушенными фильтром и осадком пектина и массой бюкса с высушенным фильтром до фильтрования осадка не превышает 0,03 г, то расчет содержания отдельных фракций пектина в растительной ткани осуществляют по формуле (1):

где Х - содержание соответствующей фракции пектина в исследуемом материале, % от сырой массы;

m_ф+n - масса бюкса с фильтром и высушенным до постоянной массы осадком, г;

m_ф - масса бюкса с высушенным фильтром до фильтрования, г;

V_колбы - объем мерной колбы со «стандартизированным» раствором, мл;

0,9235 - коэффициент пересчета на пектовую кислоту;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

m_{навески} - масса навески исследуемого материала, г;

V_экстр - объем «стандартизированного» раствора, который необходимо взять для проведения эксперимента.

Если масса осадка, полученная из разности между массой бюкса с высушенными фильтром и осадком пектина и массой бюкса с высушенным фильтром до фильтрования осадка превышает 0,03 г, то эксперимент следует повторить с меньшим количеством «стандартизированного» раствора, объем которого определяется по формуле (2):

[Методы количественного определения пектиновых веществ в растительном сырье. Методические указания к практическим занятиям / Донченко Л.В., Кондратенко В.В., Кондратенко Т.Ю. - Краснодар, 2005, - 30 с.].

К недостаткам описанного способа следует отнести высокую погрешность определения, равную 0,3%, что может быть связано с переходом в осадок пектата кальция непектиновых примесей, а также высокую трудоемкость и большую продолжительность процесса анализа (нередко появляется необходимость переделывать анализ по причине превышения массы пектата кальция 0,03 г).

Техническим результатом изобретения является повышение точности результатов определения массовой доли пектиновых веществ в растительном сырье, сокращение затрат труда и времени, необходимых для проведения анализов, а также исключение использования специфического оборудования.

Технический результат достигается тем, что в известном способе, включающем высушивание бумажных складчатых фильтров до постоянной массы, приготовление «стандартизованных» растворов протопектина и гидратопектина, отбор проб, нейтрализацию кислой среды раствора протопектина, омыление фракций пектиновых веществ в отобранных пробах, осаждение пектиновых веществ, фильтрование осадков, промывание осадков на фильтре дистиллированной водой, высушивание фильтров с осадками до постоянной массы, расчет массовой доли пектиновых веществ по фракциям согласно предлагаемому способу, омыление пектиновых веществ в анализируемых растворах проводят 40%-ным раствором NaOH в течение 15 минут, пектиновые вещества осаждают концентрированной HCl, а массовую долю пектиновых веществ рассчитывают по формулам (3) и (4):

- для гидратопектина

где _гn - массовая доля фракции гидратопектина, %;

m₁ - масса навески исследуемого сырья, взятой для анализа, г;

m₂ - масса осадка, г;

0,8 - коэффициент пересчета объема «стандартизованного» раствора гидратопектина, взятого для исследований, к общему объему «стандартизованного» раствора гидратопектина;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

- для протопектина

где _nn - массовая доля фракции протопектина, %;

0,4 - коэффициент пересчета объема «стандартизованного» раствора протопектина, взятого для исследований, к общему объему «стандартизованного» раствора протопектина.

Применение 40%-ного раствора NaOH вместо 0,1н. раствора NaOH для омыления пектиновых веществ позволяет сократить требуемое для этого время с 8-10 часов до 15-ти минут.

Применение концентрированной HCl обеспечивает быструю и качественную нейтрализацию щелочной среды омыленных растворов (вместо предшествующего осаждению 11,1%-ным раствором CaCl₂, подкисления растворов 50 мл 1н. уксусной кислоты с 30-минутной экспозицией) и полное осаждение омыленных фракций пектиновых веществ, что повышает достоверность результатов определения.

Способ реализуют следующим образом. Высушивают необходимое количество бумажных складчатых фильтров до постоянной массы, готовят «стандартизованные» растворы протопектина и гидратопектина, отбирают пробы, нейтрализуют кислую среду раствора протопектина, исследуемые растворы омыляют 40%-ным раствором NaOH в течение 15 минут, затем осаждают пектиновые вещества концентрированной HCl, осадки фильтруют, промывают дистиллированной водой от ионов хлора, затем фильтры с осадками высушивают до постоянной массы, рассчитывают массовые доли фракций пектиновых веществ по формулам (3) и (4):

- для гидратопектина

- для протопектина

Примеры осуществления заявляемого способа

Пример 1. Подготавливают необходимое количество бумажных складчатых фильтров, высушивая их в бюксах в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы.

Определения проводят в трех повторностях.

Берут навеску 10 г сухого свекловичного жома и готовят «стандартизированные» растворы гидратопектина и протопектина.

После этого из общего количества приготовленных растворов фракций пектиновых веществ отбирают пробы объемом по 200 мл и в пробе раствора протопектина нейтрализуют кислую реакцию среды титрованием 0,1н. раствором NaOH в присутствии индикатора фенолфталеина (до появления устойчивой слабо-розовой окраски).

Затем к отобранным и подготовленным для исследования пробам «стандартизованных» растворов гидратопектина и протопектина прибавляют по 2,5 мл 40%-ного раствора NaOH и выдерживают при комнатной температуре 15 минут, омыляя пектиновые вещества. При этом индикатор окрашивает растворы в насыщенный малиновый цвет.

По прошествии указанного времени образовавшуюся пектиновую кислоту осаждают 10 мл концентрированной HCl. Образовавшиеся осадки фильтруют через высушенные до постоянной массы бумажные складчатые фильтры и многократно промывают холодной дистиллированной водой для полного удаления ионов хлора. Полноту отмывки осадка от ионов хлора определяют по качественной реакции промывных вод с AgNO₃.

По окончании фильтрования фильтры с осадками аккуратно укладывают в бюксы и высушивают в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы.

После этого определяют массу осадков, вычитая из массы высушенных фильтров с осадками массу высушенных фильтров до фильтрования, а массовую долю пектиновых веществ в исследуемом сырье определяют, используя формулы (3) и (4). Результаты расчетов заносят в таблицу 1.

1. ; .

2. ; .

3. ; .

Таблица 1
Серия опытов	Фракция пектиновых веществ	Масса осадков, г	Объемная доля пектиновых веществ, %
1	Гидратопектин	0,1091	1,37
Протопектин	0,4486	11,22
2	Гидратопектин	0,1052	1,36
Протопектин	0,4178	11,45
3	Гидратопектин	0,1061	1,33
Протопектин	0,4615	11,54

Пример 2. Подготавливают необходимое количество бумажных складчатых фильтров, высушивая их в бюксах в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы.

Определения проводят в трех повторностях.

Берут навеску 25 г сырых плодов дикорастущей груши и готовят «стандартизированные» растворы гидратопектина и протопектина.

После этого из общего количества приготовленных растворов фракций пектиновых веществ отбирают пробы объемом по 200 мл и в пробе раствора протопектина нейтрализуют кислую реакцию среды титрованием 0,1н. раствором NaOH в присутствии индикатора фенолфталеина (до появления устойчивой слабо-розовой окраски).

Затем к отобранным и подготовленным для исследования пробам «стандартизованных» растворов гидратопектина и протопектина прибавляют по 2,5 мл 40%-ного раствора NaOH и выдерживают при комнатной температуре 15 минут, омыляя пектиновые вещества. При этом индикатор окрашивает растворы в насыщенный малиновый цвет.

По прошествии указанного времени образовавшуюся пектиновую кислоту осаждают 10 мл концентрированной HCl. Образовавшиеся осадки фильтруют через высушенные до постоянной массы бумажные складчатые фильтры и многократно промывают холодной дистиллированной водой для полного удаления ионов хлора.

Полноту отмывки осадка от ионов хлора определяют по качественной реакции промывных вод с AgNO₃.

По окончании фильтрования фильтры с осадками аккуратно укладывают в бюксы и высушивают в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы.

После этого определяют массу осадков, вычитая из массы высушенных фильтров с осадками массу высушенных фильтров до фильтрования, а массовую долю пектиновых веществ в исследуемом сырье определяют, используя формулы (3) и (4). Результаты расчетов заносят в таблицу 2.

1. ; .

2. ; .

3. ; .

Таблица 2
Серия опытов	Фракция пектиновых веществ	Масса осадков, г	Объемная доля пектиновых веществ, %
1	Гидратопектин	0,0960	0,48
Протопектин	0,1521	1,52
2	Гидратопектин	0,0920	0,46
Протопектин	0,1475	1,48
3	Гидратопектин	0,0971	0,49
Протопектин	0,1540	1,54

Технический результат достигается только при сочетании описанных параметров процесса, что позволяет получить точные данные при высокой сходимости параллельных анализов.

Положительный эффект при реализации разработанного метода заключается в простоте выполнения и экономии затрат труда и времени на всех стадиях процесса.