способ выделения и стабилизации низкомолекулярных аминогликанов из отходов яичной скорлупы

Формула изобретения

1. Способ выделения низкомолекулярных аминогликановых соединений формулы I из отходов яичной скорлупы,

,

где М может быть одним или более из Na, Са, К, Mg, и n представляет собой целое число от 20 до 40;

причем указанный способ включает этапы, на которых:

(a) предварительно подготавливают отходы яичной скорлупы для извлечения зародышевого низкомолекулярного аминогликанового соединения формулы I с помощью полярного органического растворителя в воде и яичную скорлупу направляют на экстракцию;

(b) экстрагируют низкомолекулярное аминогликановое соединение формулы I в виде его водорастворимой соли, для этого яичную скорлупу этапа (а) энергично встряхивают с водным полярным солевым раствором при 10-35°С на протяжении 6-12 ч, затем фильтруют или центрифугируют, чтобы собрать водный слой, содержащий растворенное аминогликановое соединение формулы I;

(c) выделяют очищенное низкомолекулярное аминогликановое соединение формулы I при помощи формирования геля из водной смеси солей с помощью полярного органического растворителя, для этого в раствор этапа (b) последовательно пошагово добавляют смешиваемый с водой органический растворитель при легком перемешивании и охлаждают для поддержания температуры от 20 до 25°С, а сформированный гель оставляют на 2-24 ч для полного осаждения, затем фильтруют или центрифугируют для выделения полусухого аминогликанового соединения формулы I;

(d) стабилизируют выделенное аминогликановое соединение формулы I этапа (с) постепенным введением органических масел в полусухой гель для формирования аминогликанового соединения формулы I.

2. Способ по п.1, где полярный органический растворитель, применяемый на этапе (а), выбирают из группы, включающей спирт, ацетон, метилэтилкетон или 1,4-диоксан.

3. Способ по п.1, где указанный водный полярный солевой раствор, применяемый на этапе (b), выбирают из группы, включающей натриевые, калиевые, кальциевые или магниевые цитратные, глутаматные, ацетатные, пирролидонкарбонатные, тартратные, глицинатные, сульфатные, сульфитные, нитратные, карбонатные или оксалатные соли.

4. Способ по п.1, где полярный органический растворитель, применяемый на этапе (с), представляет собой низший спирт, выбранный из метанола, этанола, пропанола или бутанола, или органический эфир, выбранный из диэтилового эфира, тетрагидрофурана, метилаля или этилаля.

5. Способ по п.1, где органические масла, применяемые на этапе (d), представляют собой масла, полученные из растительных источников.

6. Способ по п.5, где указанное органическое масло выбирают из масла жожоба, миндаля, шалфея, розмарина, лаванды, сандала или алое.

7. Способ изготовления композиции, обладающей свойствами против морщин, включающей аминогликановое соединение формулы I по п.1, причем указанный способ включает этапы, на которых:

(a) предварительно подготавливают отходы яичной скорлупы для извлечения зародышевого низкомолекулярного аминогликанового соединения формулы I с помощью полярного органического растворителя в воде и яичную скорлупу направляют на экстракцию;

(b) экстрагируют низкомолекулярное аминогликановое соединение формулы I в виде его водорастворимой соли, для этого яичную скорлупу этапа (а) энергично встряхивают с водным полярным солевым раствором при 10-35°С на протяжении 6-12 ч, затем фильтруют или центрифугируют, чтобы собрать водный слой, содержащий растворенное аминогликановое соединение формулы I;

(c) выделяют очищенное низкомолекулярное аминогликановое соединение формулы I при помощи формирования геля из водной смеси солей с помощью полярного органического растворителя, для этого в раствор этапа (b) последовательно пошагово добавляют смешиваемый с водой органический растворитель при легком перемешивании и охлаждают для поддержания температуры от 20 до 25°С, а сформированный гель оставляют на 2-24 ч для полного осаждения, затем фильтруют или центрифугируют для выделения полусухого аминогликанового соединения формулы I;

(d) стабилизируют выделенное аминогликановое соединение формулы I этапа (с) постепенным введением органических масел в полусухой гель для формирования аминогликанового соединения формулы I;

(е) добавляют, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый наполнитель к стабилизированный аминогликанового соединения формулы I, полученному на этапе (d), для формирования композиции, обладающей свойствами против морщин.

8. Стабилизированное аминогликановое соединение формулы I, имеющее молекулярный вес, находящийся в диапазоне от 15000 до 28000 Да, полученное способом по п.1.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Варианты осуществления данного изобретения относятся к способу простого и эффективного выделения и стабилизации ультранизкомолекулярных аминогликанов из отходов яичной скорлупы.

Известный уровень техники

Варианты осуществления данного изобретения относятся к способам выделения, стабилизации и формуляции низкомолекулярных аминогликанов из отходов яичной скорлупы. Экстракт аминогликана применяют для изготовления косметических кремов со свойствами увлажнения кожи и против морщин.

Nakano и др. (Poult Sci. (1991), Vol.70 (12), pp.2524-8) показали, что химическая композиция гликозаминогликановых фракций из гребня и бородки у петухов породы белый Леггорн с листовидным гребнем состоит из гликозаминогликанов с очень большим молекулярным весом, которые применяют в терапии замещения хряща.

Balazs и др. (патент США № 4141973) описали способ выделения чистой гиалуроновой кислоты из ткани животных, имеющей молекулярный вес в диапазоне 1 MD (молекулярный вес) - 6 MD, которую применяют как заместитель для синовиальных жидкостей и стекловидного тела.

Heaney и др. (Biochim Biophys Acta. (1976), Vol.18; 451 (1), pp.133-42) показали, что органическая часть скорлупы куриных яиц состоит из коллагена, белков и полисахаридов, которые, вероятно, присутствуют в виде гликопротеинов и гликозаминогликанов. Далее при помощи хроматографии определяли органические компоненты для получения гликозаминогликанов, обладающих минимальным молекулярным весом 30000 дальтон. Анализ скорости осаждения в градиенте плотности показал, что полисахариды содержали эквимолярные количества глюкозамина (36,3% удельный вес) и глюкуроновой кислоты 35,6% вес./вес. Идентификация деградации продуктов показала, что гликозаминогликан главным образом являлся гиалуроновой кислотой.

Stahl и др. (патент США № 6537795) описали способ получения и выделения аминогликанов из культивируемых штаммов стрептококковой ферментации. Данные аминогликаны характеризуются своими крайне высокими молекулярными весами до 6 MD и применяются в терапии замещения хряща.

Подобные способы выделения и очистки гликозаминогликанов из других природных источников и тканей животных также можно найти в патенте США № 5824658, патенте США № 6660853, патенте США № 6451326. Материалы, которые обсуждались в данных патентах, включены в описание данного изобретения ссылкой.

Краткое описание изобретения

Варианты осуществления данного изобретения обеспечивают новый способ выделения низкомолекулярного аминогликанового соединения формулы I, которое состоит из альтернативной глюкуроновой кислоты и элементов N-ацетилглюкозамина, из прежде неизвестного природного источника отходов яичной скорлупы,

где M может быть одним или более из Na, Ca, К, Mg; a n представляет собой целое число от 20 до 40.

Причем указанный способ включает этапы, на которых:

(a) предварительно готовят отходы яичной скорлупы для извлечения зародышевого низкомолекулярного аминогликанового соединения формулы I, применяя полярный органический растворитель, растворенный в воде,

(b) экстрагируют низкомолекулярное аминогликановое соединение формулы I в виде его водорастворимой соли, применяя водный полярный солевой раствор,

(c) выделяют очищенное низкомолекулярное аминогликановое соединение формулы I формированием геля из водной смеси солей, применяя полярный органический растворитель с последующей фильтрацией и центрифугированием,

(d) стабилизируют выделенный экстракт аминогликана постепенным введением органических масел в полусухой гель для формирования аминогликановых соединений формулы I.

Варианты осуществления данного изобретения конкретнее относятся к этапу (b), где водный полярный солевой раствор может быть солью цитрата, глутамата, ацетата, пирролидонкарбоната, тартрата, глицината, сульфата, сульфита, нитрата, карбоната или оксалата натрия, калия, кальция или магния для получения раствора, содержащего аминогликановые соединения формулы I, которые приемлемы для селективной желатинизации и выделения.

Описанный способ является новым способом для селективного и простого получения низкомолекулярных аминогликановых соединений формулы I из отходов яичной скорлупы. Более конкретно, способ по данному изобретению по сравнению с методами выделения аминогликанов, раскрытыми в уровне техники, отличается тем, что:

a) идентифицируется как новый тем, что применяет неиспользованный ранее источник, отходы яичной скорлупы, от которых иначе сложно избавиться и которые вызывают существенное вредное воздействие на окружающую среду,

b) содержит очень низкие концентрации вредных белков и нуклеотидов,

c) не требует никаких дорогостоящих и неэффективных разделений органических и неорганических материалов в отходах яичной скорлупы,

d) включает более простые экстракции с применением мягких реагентов и растворяющих материалов, и

e) не требует ни ацетилирования, ни получения других производных, например, с помощью уксусного ангидрида и серной кислоты, как описано в патенте США № 5679657, для достижения необходимой вязкости и проникающих свойств, необходимых для косметического применения.

Аминогликановые соединения формулы I имеют необычно низкий молекулярный вес и стабилизированы без получения производного для обеспечения превосходного проникания через кожу для уменьшения морщин на поверхности кожи, а также проявляют превосходный смягчающий и увлажняющий эффекты.

Детальное описание изобретения

Отходы яичной скорлупы, полученные от промышленной перерабатки яиц, обычно промывают растворителями и обрабатывают для устранения неприятных запахов перед захоронением. Карбонат кальция скорлупы можно использовать только после распространенных методов разделения и очистки, что делает эту процедуру коммерчески неэкономичной. Нет никакой определенной потребности в измельчении яичной скорлупы в пределах узкого диапазона, поскольку для способа по данному изобретению не нужно отделять внутреннюю мембрану от яичной скорлупы, как для сложного способа и оборудования, описанного MacNeil (патент США № 6176376), для получения чистого карбоната кальция.

Определены способы селективного выделения ценных органических соединений, особенно аминогликановых соединений формулы I, из измельченной яичной скорлупы без дорогостоящего отделения органических и неорганических компонентов.

Измельченную яичную скорлупу можно обработать теплой водой или теплым 5% раствором этанола и отфильтровать для удаления прилипших органических отходов с поверхности скорлупы. Соотношение органической массы и карбоната кальция может составлять от 1% до 15% вес./вес. Большие соотношения органической массы служили бы признаком непромытой яичной массы в измельченной яичной скорлупе, что может привести к присутствию вредного белка и нуклеотидных продуктов в экстракте аминогликана. Отмечено, что в отличие от других источников аминогликанов, таких как животная ткань и ферментационные бульоны, как известно из уровня техники, применение отходов яичной скорлупы, как здесь показано, является уникальным из-за отсутствия значительного антигенного белка и нуклеотидных компонентов в экстрагированной среде, что обеспечивает более простые способы экстрагирования очищенного аминогликанового соединения формулы I. Яичную скорлупу можно дополнительно предварительно обработать ультрафиолетом для уничтожения микробов, которые могут там находиться даже после жидкой очистки.

Следующий этап включает подвергание вышеупомянутой массы скорлупы яиц высокоселективной экстракции углеводородного компонента в форме его водорастворимой соли. Способы включают суспендирование массы скорлупы яиц в объеме 1:2-1:10 водного раствора соли, содержащего 5%-40% по весу солей цитрата, глутамата, ацетата, пирролидонкарбоната, тартрата, глицината, сульфата, сульфита, нитрата, карбоната и оксалата натрия, калия, кальция или магния или комбинацию вышеупомянутых растворов солей, если нужно. Более конкретно, предпочтительны одновалентные соли органических кислот. Суспензию выдерживают на протяжении 1-24 часов, более предпочтительно на протяжении 6-12 часов, с периодическим энергичным встряхиванием при температурах в диапазоне от 10°С до 35°С. Затем суспензию фильтруют или центрифугируют, чтобы собрать водный раствор, содержащий соответствующую соль аминогликановых соединений формулы I. Масса скорлупы яиц, отделенная таким образом, проявляет намного меньшее связывание мембран со скорлупой яиц, и в результате ее можно намного легче обрабатывать способами, известными в технике, для отделения яичной скорлупы, содержащей чистый карбонат кальция, от органического остатка.

Следующий этап включает осаждение геля аминогликанового соединения формулы I в форме его соответствующей соли из водного раствора. Способ включает снижение полярности водного раствора и в результате растворимости аминогликанового соединения формулы I постепенным добавлением какого-либо смешиваемого с водой органического растворителя, такого как спирты, ацетон, диметилформамид, N-метилпирролидинон или 1,4-диоксан. Органический растворитель добавляют порциями при легком перемешивании и охлаждают для поддержания температуры реакции от 20°С до 25°С для получения белого геля, суспендированного в водном слое. Раствор оставляют на 2-24 часа, пока гель полностью не сформируется. Затем гель фильтруют или центрифугируют для получения полусухого экстракта аминогликанового соединения формулы I. Важно не позволить экстракту полностью высохнуть, так как необходимо определенное количество водной фазы для процесса стабилизации, который выполняют далее.

Последний этап включает стабилизацию низкомолекулярного аминогликанового соединения формулы I распределением молекул в липофильной среде для предупреждения сшивания, что характерно для неацетилированных и низкомолекулярных аминогликанов, как описано в известном уровне техники (патент США № 5679657). Этот этап способа включает постепенное добавление двух масел. Первое масло является более гидрофобным по природе и может быть выбрано из масел, которые обычно содержатся в орехах. Особенно в качестве первого масла более предпочтительно миндальное масло или масло жожоба. Второе масло является более гидрофильным по природе и может быть выбрано из масел, которые обычно выделены из трав и вегетативных частей видов растений. Особенно в качестве второго масла более предпочтительно масло шалфея, масло розмарина или масло лаванды. Количество всех добавленных масел может составлять от 5% до 50% веса экстрагированного аминогликана, тогда как соотношение двух масел может составлять от 0,1:1 до 1:0,1.

Молекулярный вес аминогликанового соединения формулы I, выделенного таким образом, сложно измерять непосредственно, и, таким образом, полагаются на измерение характеристической вязкости для определения молекулярного веса (Laurent и др., Biochimica et Biophysica Acta, Vol.42, pg. 476 (1960)). Было обнаружено, что характеристические вязкости различных растворов, содержащих аминогликановое соединение формулы I, составляют от 4 см³/г до 7 см³ /г, и когда нанесли на график, построенный по стандартным растворам солей гиалуроновой кислоты (мол. вес приблизительно 1,2 MD), это дало значение единственно возможного естественного ультранизкого молекулярного веса аминогликанового соединения формулы I в диапазоне от 15000 дальтон до 28000 дальтон. Ультранизкомолекулярное аминогликановое соединение формулы I из природного источника ранее было описано в известном уровне техники (например, как заключили Balazs и др. в патенте США № 4582865).

Результаты эксперимента

Пример 1

В открытое отверстие стеклянного контейнера с завинчивающимся колпачком добавили 500 г предварительно обработанных отходов яичной скорлупы с приблизительно 10% содержанием органики. Добавили 750 мл 5% водного раствора цитрата натрия, контейнер запечатали и поместили на качалку на 24 часа при средних скоростях. Через 24 часа всю смесь перенесли в воронку с фильтром и твердые отходы яичной скорлупы отделили от водной суспензии. Твердые вещества промыли 1×250 мл 5% водным раствором цитрата натрия, комбинированные водные слои один раз промыли 250 мл метиленхлорида для удаления возможного белковоподобного вещества и затем водный слой перенесли в 2-л чашу. Чашу поместили в баню с холодной водой и начали медленно добавлять абсолютный метанол при медленном перемешивании. После того как закончили добавлять приблизительно 200 мл метанола, начал формироваться мутный белый осадок, и перемешивание остановили. Медленно добавили эквивалентное дополнительное количество метанола и чашу оставили на 12 часов, чтобы убедиться, что формирование геля завершилось. Всю массу перенесли в воронку с фильтром и отфильтровали для получения кремового геля аминогликанового соединения формулы I. Осадок сушили до тех пор, пока содержание влаги не составило 5-7%. Конечный вес геля аминогликанового соединения формулы I составил 42 г.

Пример 2

Гелевый материал, содержащий аминогликановое соединение формулы I из примера 1, смешали с 4 г масла жожоба при 15°С-20°С и энергично перемешивали на протяжении 20 минут. Полученный в результате гель нагревали до 25°С и осторожно перемешивали на протяжении 1 часа. К этой массе добавили 1 г масла шалфея и полученный в результате гель затем осторожно перемешивали 10 минут. Затем гель медленно охлаждали до 10°С 4 часа для получения аминогликанового соединения формулы I, которое является устойчивым при отсутствии циркулирующего воздуха при комнатной температуре, по меньшей мере, 3 месяца.

Пример 3

Вышеупомянутый пример 1 повторили с 10% водным раствором тартрата калия для получения 46 г геля аминогликановых соединений формулы I.

Пример 4

Вышеупомянутый пример 1 повторили с 20% раствором ацетата натрия для получения 43 г геля аминогликановых соединений формулы I.

Пример 5

Вышеупомянутый пример 1 повторили, за исключением того, что вместо метанола применяли этанол для полного формирования геля для получения 47 г геля аминогликанового соединения формулы I.

Пример 6

Вышеупомянутый пример 1 повторили, за исключением того, что вместо метанола применяли ацетон для полного формирования геля для получения 41 г геля аминогликанового соединения формулы I.

Пример 7

Вышеупомянутый пример 1 повторили с 10% раствором карбоната натрия для получения 24 г геля аминогликанового соединения формулы I.

Пример 8

Вышеупомянутый пример 1 повторили с 25% раствором карбоната кальция для получения 14 г геля аминогликанового соединения формулы I.

Пример 9

10 г вышеупомянутого стабилизированного геля, полученного по методике, показанной в примере 2, добавили к 50 мл дистиллированной воды, содержащей 3 мл глицерина, и перемешивали до однородной суспензии. К этой суспензии добавили расплав, состоящий из 10 г эмульгирующего воска, 10 г парафинового воска, 4 г белого пчелиного воска и 13 г смеси применяемых в косметике растительных масел, таких как масла миндаля, лаванды, сандала и ореха, и смесь энергично перемешивали для получения однородного крема с отличными физическими характеристиками и свойствами против морщин.

Принимая во внимание вышеупомянутые выделенные и стабилизированные гели аминогликанового соединения формулы I, выполнили следующие аналитические и практические исследования.

Отсутствие хондроитинсульфата

Из уровня техники известно, что все коммерческие источники аминогликанов обычно тесно связаны с другими компонентами ткани, такими как хондроитинсульфат (Arkins and Sheehan, Structure of Hyaluronic Acid, Nature New Biol, 235, 253, 1972, and Bettelheim and Philpott, Electron Microscopic Studies of Hyaluronic Acid. - Protein Gels, Biochim Biophys Acta, 34, 124, 1959). Гелевый экстракт, выделенный способами, которые описаны выше, содержит менее чем 2% хондроитинсульфата, вероятно, из-за низкой ассоциации, возможной с очень небольшим размером выделенного аминогликанового соединения формулы I.

Отсутствие белков

Так как белки являются потенциально антигенными, для косметических формуляций важно выделить какой-либо гель аминогликана, не содержащий главным образом белок. Гелевый экстракт из примера 1 подвергли высокочувствительному колориметрическому анализу для определения присутствия белков, как описано Lowry и др. (J. Biol. Chem., 193, 265-275, 1951). Результат указывал на присутствие только менее чем 0,1% белков по весу.

Отсутствие какой-либо существенной концентрации белка является четко выраженным отличием от других соединений гликоаминогликана, выделенных из натуральных источников, таких как гребень петуха и ферментационные бульоны. Сообщали (Kludas, патент США № 5055298), что данные аминогликаны обычно ковалентно связаны с белками для формирования протеогликанов. Клинически релевантное устранение всех этих белков, которые не являются компонентами кожи человека, оказалось сложно выполнить. Присутствие этих белков в различных других экстрактах аминогликана идентифицировали как причину характерных воспалительных реакций на кожных поверхностях, что осложняет их применение в косметических формуляциях.

Отсутствие нуклеотидов

Ультрафиолетовую спектроскопию применяли, чтобы показать отсутствие потенциально антигенных нуклеотидов ДНК и РНК в выделенном аминогликановом соединении формулы I. Приготовили 1% раствор экстракта аминогликана из примера 1 в 10% растворе хлорида натрия. Этот раствор подвергли ультрафиолетовой спектроскопии при 257 нм для измерения уровня нуклеотидов в растворе. Отсутствие какой-либо абсорбции при данной длине волны приняли как меру отсутствия нуклеотидов в экстракте аминогликана из примера 1.

Вязкость

Небольшой образец геля сушили сублимацией для получения белого твердого вещества с нитеподобной структурой, которая медленно растворялась в воде. Раствор 1 мг порошка поместили в 1000 мл фосфатного буфера с pH 7. Вязкость измеряли в вискозиметре Оствальда при температуре 25°С. Измеренная относительная вязкость раствора составляла 0,76-0,80. По сравнению с аминогликанами известного высокого молекулярного веса, данное измерение вязкости дает молекулярный вес для аминогликанового соединения формулы I от 15000 дальтон до 28000 дальтон.

Присутствие глюкозамина

Присутствие глюкозамина в аминогликановом соединении формулы I исследовали способом Элсона и Моргана (Biochem J, Vol.27 (1933), p.1894) на материале, гидролизированном на протяжении 6 часов 5N соляной кислотой при 100°С и выпаренном досуха. Содержание глюкозамина аминогликанового соединения формулы I составило от 38% до 41%, что соответствовало ожидаемому рассчитанному значению.

Присутствие уроновой кислоты

Присутствие уроновой кислоты в соединении аминогликана формулы I определяли при помощи гидролиза с гиалуронидазой. Экстрагированное аминогликановое соединение формулы I промыли дистиллированной водой и гидролизировали гиалуронидазой Streptomyces (1 мг фермента/г аминогликана) в 10 мл 10 мМ CaCl₂/50 мМ-трис/HCl буфере, pH 7,6 на протяжении 48 часов при 37°С. Ингибиторы притеиназы, а именно фенилметансульфонилфторид (2 мМ) и N-этилмалеимид (10 мМ), добавили к образцам для ингибирования неспецифичного протеолиза. Гидролиз остановили добавлением мочевины до окончательной концентрации 6 М. Гидролизат центрифугировали при 4000g, а супернатант (гидролизат гиалуронидазы) удалили и противопоставили стандартной уроновой кислоте при помощи анализа HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография).

Способность к нитеобразованию

В известном уровне технике документально подтверждено, что чем выше способность к нитеобразованию, тем сильнее увлажняющий эффект аминогликана. Применяли много производных аминогликанов с высоким и средним молекулярным весом, например, при ацетилировании и сополимеризации (патент США № 5679657) для увеличения свойственной степени нитеобразования аминогликанов, выделенных из животных и бактериальных источников. Наблюдали, что ультранизкомолекулярное аминогликановое соединение формулы I, выделенное здесь, показывает исключительно высокую способность к нитеобразованию и может объяснять часть наблюдаемых высоких эффектов против морщин. Во влажной камере при температуре 25°С и относительной влажности 50% стеклянную палочку на 1 см погрузили в 1% водный раствор экстракта аминогликана из примера 1 и исследовали длину нити, полученной при погружении чаши при скорости 10 см/мин. Длина нити аминогликанового соединения формулы I по данному изобретению составила от 2,8 см до 3,5 см, которая значительно длиннее чем 0,8 см - 1,3 см, что наблюдалось у коммерчески доступного гиалуроната натрия, и даже лучше, чем длины у наблюдаемых производных аминогликанов.

Противоморщинные свойства

Исследовали противоморщинные свойства крема, полученного способом, который описан в примере 9, применяя систему обработки изображений 3D для измерения глубины поверхностных морщин. Применяли способ, который описан S. Jaspers и др., ("Microtopometry Measurement of Human Skin in vivo by a new Digital Optical Projection System", Preprints 5th Congress of the International Society for Skin Imaging, Wien, 1997), чтобы показать уменьшение глубины морщин на 25% - 38% через 4 недели ежедневного применения.