применение стромальных стволовых клеток жировой ткани для лечения свищей

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для лечения свищей у индивида, включающая стромальные стволовые клетки жировой ткани, где по меньшей мере примерно 50% стромальных стволовых клеток жировой ткани, составляющих композицию, экспрессируют маркеры CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 и CD105, и где содержание стромальных стволовых клеток жировой ткани в композиции составляет, по меньшей мере, примерно 3·10 ⁶ клеток/мл.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанные стромальные стволовые клетки жировой ткани являются стромальными стволовыми клетками индивида, которому проводят лечение.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая, по меньшей мере, примерно 10·10⁶ клеток/мл стромальных стволовых клеток жировой ткани.

4. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой менее примерно 5% стромальных стволовых клеток жировой ткани, составляющих композицию, содержащую стромальные стволовые клетки жировой ткани, экспрессируют маркеры CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 и/или CD133.

5. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая, по меньшей мере, примерно 10·10⁶ клеток/мл стромальных стволовых клеток жировой ткани.

6. Фармацевтическая композиция по п.1, где композиция, содержащая стромальные стволовые клетки жировой ткани, дополнительно содержит адгезивное вещество.

7. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанные стромальные стволовые клетки жировой ткани экспрессируют маркеры c-Kit, виментин и CD90 и не экспрессируют маркеры CD34, фактор VIII, альфа-актин, десмин, S-100 и кератин.

8. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанные стромальные стволовые клетки жировой ткани экспрессируют маркеры CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 и CD105 и не экспрессируют маркеры CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 и/или CD133.

Описание изобретения к патенту

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США № 11/065461, поданной 25 февраля 2005, и частичным продолжением заявки на патент США № 11/056241, поданной 14 февраля 2005, содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Уровень техники

Как правило, свищ является патологическим соединением или каналом между органами или сосудами, которые обычно не соединены. Свищи могут образоваться в различных частях организма. Например, к типам свищей, названным по части тела, в которой они образуются, относят аноректальный свищ, или свищ заднего прохода, или каловый свищ (между прямой кишкой или другой аноректальной областью и поверхностью кожи), артериовенозная фистула или АВ фистула (между артерией и веной), желчный свищ (между желчными протоками и поверхностью кожи, часто вызываемый операциями на желчном пузыре), шеечный свищ (патологическое отверстие шейки матки), краниопазушная фистула (между внутричерепным пространством и околоносовыми пазухами), межкишечный свищ (между двумя частями кишечника), кишечно-кожный свищ (между кишечником и поверхностью кожи, а именно между двенадцатиперстной кишкой, тощей кишкой или подвздошной кишкой), тонкокишечно-влагалищный свищ (между кишечником и влагалищем), желудочный свищ (между желудком и поверхностью кожи), маточно-перитонеальный (между маткой и внутрибрюшинной полостью), перилимфатическая фистула (разрыв перегородок между средним и внутренним ухом), артериовенозная фистула легкого (между артерией и веной легкого, приводящая в результате к шунтированию крови), прямокишечно-влагалищный свищ (между примой кишкой и влагалищем), пупочный свищ (между пупком и кишечником), трахеопищеводный свищ (между дыхательной и пищеварительной трубками) и мочепузырно-влагалищный свищ (между мочевым пузырем и влагалищем). К причинам образования свищей относятся травма, осложнения после медицинского лечения и заболевание.

Лечение свищей различается в зависимости от причины и выраженности свища и обычно включает хирургическое вмешательство. Используются различные хирургические операции, наиболее часто - фистулотомия, наложение лигатуры (тяжа, который проводится через свищевой канал и оставляет к нему доступ для дренирования) или операция по наложению эндоректального лоскута (при которой здоровая ткань накладывается на внутреннее отверстие свища для предотвращения повторного инфицирования канала калом или другим материалом). Оперативное вмешательство при аноректальных свищах имеет побочные эффекты, включая рецидивирование, повторное инфицирование и недержание.

Воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона и язвенный колит, являются главными причинами аноректальных, межкишечных и кишечно-кожных свищей. Зарегистрированная частота свищей при болезни Крона варьирует от 17% до 50%. Лечение свищей у пациентов с болезнью Крона до настоящего времени вызывает трудности, поскольку для многих таких свищей доступное лечение не эффективно. Подобные свищи и их рецидивы являются крайне неприятными осложнениями, которые значительно снижают уровень жизни пациентов с данной патологией. Последние усовершенствования медицинского лечения (например, лечение посредством Infliximab®) и грамотное оперативное лечение снизили необходимость в сложных оперативных вмешательствах. Однако у многих пациентов излечение не происходит. Неспособность излечения свищей вероятно вызвана неоптимальным качеством ткани, которая поражена болезнью Крона. Действительно, свищи при болезни Крона являются модельной системой заживления раны в самых неблагоприятных из возможных условий.

Другой главной причиной свищей является травма, например, в результате изнасилования или в результате постоянных травм в детстве, тканей влагалища и мочевого пузыря и/или прямой кишки, приводящая к образованию прямокишечно-влагалищного свища и мочепузырно-влагалищного свища. Ежегодно порядка 100000 женщин в развивающихся странах страдают такими свищами (также известными как акушерскими свищами) в результате родов при наличии механического препятствия прохождению плода. В течение родов при наличии механического препятствия прохождению плода давление головки плода на таз матери останавливает кровоснабжение чувствительных тканей в данной области. Омертвевшая ткань отделяется, и у женщины развивается мочепузырно-влагалищный свищ, а иногда прямокишечно-влагалищный свищ. Также канал свища может образовываться в результате постоянного недержания мочи и/или кала. United Nations Population Fund (UNFPA) оценивает пораженность мирового население акушерскими свищами в более чем два миллиона. Этот расчет может быть существенно занижен. Доля успешных попыток первичного хирургического вмешательства варьирует от 88 до 93 процентов, но снижается с числом успешных попыток. Таким образом, значительный процент женщин с акушерскими свищами не могут быть излечены оперативным путем.

Необходимы новые подходы к лечению свищей.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится, кроме прочего, к новым композициям, которые содержат стромальные стволовые клетки жировой ткани. Описанные композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, имеют отчетливый фенотип и проявляют большую фенотипическую однородность, чем ранее описанные композиции стромальных стволовых клеток жировой ткани, таким образом, делая их более подходящими для применения в лечении свищей и ран, чем ранее описанные композиции. Композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, могут содержать растворы или другие вещества, служащие в качестве лекарственных средств или медицинского оборудования, например в качестве шовного материала или адгезивных веществ. Кроме того, представлены новые способы лечения свищей и ран с применением стромальных стволовых клеток жировой ткани, а также наборы их содержащие.

Эти варианты осуществления настоящего изобретения, другие варианты осуществления и их признаки и особенности будут очевидны из описания, чертежей и формулы, которые следуют далее.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 отображены результаты характеристики клеток, выделенные способами примера 1 посредством иммунофлуоресцентного окрашивания. Частота иммуноположительных клеток обозначена как: -, менее 5%; +/-, 6-15%; +, 16-50%; ++, 51-85%; and +++, 86-100%. P - количество пересевов.

На фиг.2 отображено непрямое иммунофлуоресцентное описание характеристик стромальных стволовых клеток жировой ткани. Клетки пациента #001 пересевали 6 раз после Синим цветом отмечены DAPI-окрашенные ядра. (A) CD90; (B) c-Kit и (C) виментин.

На фиг.3 суммированы клинические результаты, полученные при использовании определенных способов и композиций настоящего изобретения. F - женщины; М - мужчины; NI - без имплантата; NA - не проанализированные.

На фиг.4 отображены кривые роста клеток из аспирата жировой ткани при разных концентрациях FBS (0,5, 2,5 и 10%, как указано). Синовиальные фибробласты человека культивировали в присутствии либо 5%, либо 10% FBS. Количества клеток ± SD выражены в единицах поглощения при 595 нм. Данные представлены из репрезентативного эксперимента с трех лунок.

На фиг.5 отображено вздутие слизистой оболочки прямой кишки после инъекции клеток вблизи зашитого внутреннего отверстия.

На фиг.6 отображены фотографии свища до (А) и спустя восемь недель (В) после инъекции клеток.

На фиг.7А отображены гистограммы флуоресцентной иммуноцитометрии, соответствующей профилю поверхностных маркеров (CD3, CD9, CD10, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD28, CD29, CD31, CD34, CD36, CD38, CD44, CD45, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e и CD49f), полученной на клетках, выделенных из липосакционного материала пациентов, участвовавших в исследовании, на шестом пересеве.

На фиг.7В отображены гистограммы флуоресцентной иммуноцитометрии, соответствующей профилю поверхностных маркеров (CD50, CD51, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD90, CD95, CD102, CD104, CD105, CD106, CD133, CD166, glicoforina, 2-microglobuline, HLA I, HLA II и NGFR), полученных на клетках, выделенных из липосакционных материалов пациентов, участвовавших в исследовании, на шестом пересеве.

Подробное описание изобретения

1. Определения

Как использовано в описании заявки, следующие термины и фразы имеют следующие определения. Если не указано иного, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют те же значения, которые известны среднему специалисту в данной области, к которой относится изобретение.

Под «жировой тканью» понимается любая жировая ткань. Жировая ткань может быть бурой или белой жировой тканью, подкожной, сальниковой/висцеральной, грудной, семенниковой или жировой тканью других областей. Предпочтительно, жировая ткань является подкожной белой жировой тканью. Клетки могут содержать первичные клеточные культуры или иммортализованные клеточные линии. Жировая ткань может быть жировой тканью любого организма, имеющего жировую ткань. Предпочтительно, жировая ткань является жировой тканью млекопитающего, наиболее предпочтительно, жировая ткань является жировой тканью человека. Общедоступным источником жировой ткани является операция липосакции, однако, источник жировой ткани или способ получения жировой ткани не важен для целей настоящего изобретения. Если желательна трансплантация аутологичных стромальных клеток индивиду, то жировую ткань выделяют у этого пациента.

«Стромальные стволовые клетки жировой ткани» относятся к мезенхимальным стволовым клеткам, которые происходят из жировой ткани.

Термин «адгезивный» относится к любому веществу, которое соединяет или связывает поверхности вместе, например клей.

Термин «клеточная композиция» относится к препарату клеток, где препарат может включать, кроме клеток, неклеточные компоненты, такие как среда для культивирования клеток, например белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, коферменты, антиоксиданты, металлы и тому подобное. Более того, клеточная композиция может содержать компоненты, которые не влияют на рост или жизнеспособность клеточного компонента, но которые применяются для представления клеток в определенном формате, например в виде полимерного матрикса для инкапсуляции или фармацевтического препарата.

Термин «культура» относится к любым растущим клеткам, организмам, многоклеточным образованиям или тканям в среде. Термин «культивирование» относится к любому из способов достижения такого роста и может включать несколько стадий. Термин «дополнительное культивирование» относится к культивированию клетки, организма, многоклеточного образования или ткани до определенной стадии роста, затем используя другой способ культивирования для перевода указанной клетки, организма, многоклеточного образования или ткани на другой уровень роста. «Клеточная культура» относится к росту клеток in vitro. В такой культуре клетки пролиферируют, но они не организуются в ткань per se. «Культивирование ткани» относится к поддержанию роста ткани, например, эксплантаты зародышевых органов или органов взрослых людей in vitro таким образом с сохранением его архитектуры и функции. «Монослойная культура» относится к культуре, в которой клетки размножаются в подходящей среде, при этом в основном прикреплены друг к другу и к подложке. Более того, «суспензионная культура» относится к культуре, в которой клетки размножаются, при этом остаются суспендированы в подходящей среде. Таким же образом, «поточная культура» относится к культивированию клеток или эксплантатов в потоке свежей среды для поддержания роста клеток, например жизнеспособности. Термин «кондиционная среда» относится к супернатанту, не содержащему культуры клеток/тканей, получаемому после отрезка времени в контакте с культивированными клетками таким образом, что среда изменяется и содержит определенные паракринные и/или аутокринные факторы, продуцируемые клетками и секретируемые в среду. «Конфлюэнтной культурой» является клеточная культура, в которой все клетки находятся в контакте и поэтому вся поверхность сосуда для культивирования покрыта, и подразумевается, что клетки достигли своей максимальной плотности, однако конфлюэнтность не обязательно означает, что деления приостановятся или популяция не увеличится в размере.

Термин «культуральная среда» или «среда» известен в данной области техники и относится в общем смысле к любому веществу или препарату, используемому для культивирования живых клеток. Термин «среда», который используется в отношении культуры клеток, включает компоненты окружения клеток. Среды могут быть твердыми, жидкими, газообразными или смесью фаз и материалов. Среды включают как жидкие ростовые среды, так и жидкие среды, которые не поддерживают рост клеток. Среды также включают студенистые среды, такие как агар, агарозу, желатиновый и коллагенный матриксы. К примерам газообразных сред относят газовую фазу, с которой контактируют клетки, растущие на чашке Петри или другом твердом или полутвердом носителе. Термин «среда» также относится к материалу, который предназначен для применения в культуре клеток, даже если он еще не контактировал с клетками. Другими словами, обогащенная питательными веществами жидкость, приготовленная для культивирования бактерий, является средой. Подобным образом, порошкообразная смесь, которая при смешивании с водой или другой жидкостью становится пригодной для культуры клеток, может быть названа «порошкообразной средой». «Среда определенного состава» относится к среде, которая приготовлена из определенных химических (обычно очищенных) компонентов. «Среда определенного состава» не содержит плохо охарактеризованные биологические экстракты, такие как дрожжевые экстракты и мясной бульон. «Обогащенная среда» включает среды, которые разработаны для поддержания роста большинства или всех жизнеспособных форм определенных видов. Обогащенные среды часто включают сложные биологические экстракты. «Средой, подходящей для выращивания культур высокой плотности» является любая среда, в которой культура клеток может достигнуть 3 или более при OD600, если условия (такие как температура и скорость переноса кислорода) позволят такой рост. Термин «минимальная среда» относится к среде, которая поддерживает рост многих типов микроорганизмов, которые не нуждаются ни в каких специальных питательных добавках. Большинство минимальных сред обычно состоят из четырех основных химических групп: аминокислот, углеводов, неорганических солей и витаминов. Минимальная среда обычно выступает в качестве основы для более сложных сред, в которые добавляют такие добавки как сыворотка, буфера, факторы роста, липиды и подобные им. Примеры минимальных сред включают, но не ограничены, Eagles Basal Medium, Minimum Essential Medium, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Medium 199, Nutrient Mixtures Ham's F-I0 and Ham's F-12, Mc Coy's 5A, Dulbecco's MEM/F-I 2, RPMI 1640, и Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM).

Термин «включает» и «включающий» используется как открытая структура, означая, что могут быть включены дополнительные элементы.

Термин «дифференцировка» относится к образованию клеток, экспрессирующих маркеры, про которые известно, что они связаны с клетками, которые более специализированы и близки к тому, чтобы стать терминально-дифференцированными клетками, неспособными к дальнейшему делению или дифференцировке. Например, в контексте поджелудочной железы дифференцировка может быть оценена по образованию кластеров клеток, подобных островковым, содержащим повышенную пропорцию бета-эпителиальных клеток, которые продуцируют повышенные количества инсулина. Термин «дальнейшая» или «большая» дифференцировка относится к клеткам, которые более специализированы и близки к тому, чтобы стать окончательно дифференцированными клетками, неспособными к дальнейшему делению или дифференцировке, чем клетки, из которых они культивированы. Термин «конечная дифференцировка» относится к клеткам, которые стали терминально-дифференцированными клетками, неспособными к дальнейшему делению или дифференцировке.

Термин «свищ» относится к любому патологическому проходу, или каналу, или связи обычно между двумя внутренними органами или проходу из внутреннего органа на поверхность тела. К примерам свищей относятся, но не ограничиваются ими, аноректальный свищ, или свищ заднего прохода, или каловый свищ, артериовенозная фистула или АВ фистула, желчный свищ, шеечный свищ, краниопазушная фистула, межкишечный свищ, кишечно-кожный свищ, тонкокишечно-влагалищный свищ, желудочный свищ, маточно-перитонеальный свищ, перилимфатический свищ, артериовенозная фистула легкого, прямокишечно-влагалищный свищ, пупочный свищ, трахеопищеводный свищ и мочепузырно-влагалищный свищ.

Термин «включая» применяется здесь для обозначения «включая, но не ограничиваясь». Термины «включая» и «включая, но не ограничиваясь» взаимозаменяемые.

«Маркер» относится к биологической молекуле, присутствие которой, концентрация, активность или состояние фосфорилирования могут быть определены и использованы для фенотипирования клетки.

«Пластырем» является перевязочный материал или материал для закрытия, используемый для закрытия или защиты раны или другого поражения.

«Пациент», «индивид» или «хозяин», лечение которого проводят способом по изобретению, может означать либо человека, либо животного, не являющегося человеком.

Фраза «фармацевтически приемлемый» используется в данном случае для ссылки на такие соединения, материалы, композиции и/или лекарственные формы, которые при медицинском показании могут использоваться для контакта с тканями человека и животных, не вызывая чрезмерную токсикацию, аллергическую реакцию, раздражение или другие эффекты или осложнения, соответствующие оправданному соотношению риск/польза.

Фраза «фармацевтически приемлемый носитель», как используется в описании, означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное средство или упаковочный материал растворителя, принимающий участие в доставке или транспортировке данного соединения из одного органа или части тела в другой орган или часть тела. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не опасным для пациента. Термин «фенотип» относится к наблюдаемым характеристикам всех клеток, таким как размер, морфология, экспрессия белка и т.д.

Термин «клетка-предшественник» относится к клетке, которая имеет способность произвести потомство, более дифференцированное, чем она сама. Например, термин может относиться к недифференцированной клетке или клетке, дифференцировавшейся не до последнего уровня дифференцировки и способной к пролиферации и порождению других клеток-предшественников, способных производить материнские клетки в большом количестве, которые, в свою очередь, могут служить источником дифференцированных или способных к дифференцировке дочерних клеток. В предпочтительном варианте осуществления, термин клетка-предшественник относится к обобщенной материнской клетке, чьи потомки (потомство) подвергаются биологической специализации, зачастую в разных направлениях, путем дифференцировки, например путем приобретения совершенно самостоятельных свойств, как происходит при прогрессирующем разнообразии эмбриональных клеток и тканей. Клеточная дифференцировка является сложным процессом, обычно происходящим путем многих клеточных делений. Дифференцированная клетка может происходить из мультипотентной клетки, которая, в свою очередь, произошла из мультипотентной клетки, и т.д. Несмотря на то, что каждую из этих мультипотентных клеток можно рассматривать как стволовую клетку, перечень типов клеток, источником которых она может служить, может значительно варьировать. Некоторые дифференцированные клетки также способны давать клетки с большим потенциалом развития. Такая способность может быть природной или может быть индуцирована искусственно посредством обработки различными факторами. Согласно данному определению, стволовые клетки также могут быть как клетками-предшественниками, так и многими непосредственными предшественниками терминально-дифференцированных клеток.

«Пролиферация» относится к увеличению числа клеток. «Пролиферирующий» и «пролиферация» относится к клеткам, находящимся в митозе.

Как используется в данном случае, термин «раствор» включает фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, в котором клетки данного изобретения остаются живыми.

Термин «по существу очищенная» в отношении популяции стволовых клеток жировой ткани относится к популяции стволовых клеток жировой ткани, которая не менее чем примерно на 75%, предпочтительно не менее чем примерно на 85%, более предпочтительно не менее чем примерно на 90% и наиболее предпочтительно не менее чем примерно на 95% очищена относительно доли стромальных клеток жировой ткани от общего числа клеток. По-другому, термин «по существу очищенная» относится к популяции стромальных стволовых клеток жировой ткани по настоящему изобретению, которая содержит менее чем примерно 20%, более предпочтительно менее чем примерно 10%, наиболее предпочтительно менее чем примерно 5% коммитированных по определенной линии клеток в исходной неамплифицированной и выделенной популяции до последующего культивирования и амплификации.

«Подложка», как используется в данном случае, относится к любому устройству или материалу, который может служить фундаментом или матриксом для роста стромальных стволовых клеток жировой ткани.

Термин «шовный материал» относится к нити, или волокну, или другому связывающему материалу, который может быть использован для сшивания ран.

Термин «лечение», как используется в данном случае, относится как к закрытию свища или раны, так и к предотвращению прогрессирования или рецидивирования свища или раны.

«Терапевтическое» или «лечебное средство» относится к средству, способному проявлять требуемый биологический эффект у хозяина. Химиотерапевтические и генотоксические средства, которые общепризнанно имеют химическое происхождение, противопоставлены биологическим или вызывающим лечебный эффект посредством определенных механизмов действия, соответственно. Примеры терапевтических средств биологического происхождения включают факторы роста, гормоны и цитокины. Разнообразные лечебные средства общеизвестны в данной области техники и могут быть идентифицированы посредством своих эффектов. Конкретные лечебные средства обладают способностью к регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. Примеры включают химиотерапевтические нуклеотиды, препараты, гормоны, неспецифические (не из класса антител) белки, олигонуклеотиды (например, антисмысловые олигонуклеотиды, которые связываются с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, с последовательностью мРНК)), пептиды и пептидомиметики.

«Рана» является ранением или повреждением ткани, вызванным физическими факторами, приводящими к разрушению нормальной целостности ткани.

2. Новые композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани

В одном из аспектов изобретение относится к композициям, содержащим стромальные стволовые клетки жировой ткани, с определенными характеристиками, такими как определенный фенотип. Например, стромальные стволовые клетки жировой ткани в клеточной композиции изобретения могут быть охарактеризованы по экспрессии поверхностных клеточных маркеров, размеру, потреблению глюкозы, продукции лактата и клеточному выходу/жизнеспособности. Еще один аспект настоящего изобретения касается композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, которые включают в качестве клеточного компонента по существу очищенные препараты стромальных стволовых клеток жировой ткани определенного фенотипа или их потомство. Композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, по настоящему изобретению включают не только по существу очищенные популяции клеток-предшественников, но также могут включать компоненты клеточной культуры, например культуральную среду, содержащую аминокислоты, металлы, факторы коферментов, а также небольшие популяции других стромальных клеток, например, некоторые из которых могут быть последовательными этапами дифференцировки клеток по настоящему изобретению. Более того, другие внеклеточные компоненты могут включать компоненты, которые переводят клеточный компонент в удобный для поддержания в определенных условиях, например имплантации, непрерывного культивирования, или подходящий для использования в качестве биологически совместимого материала или фармацевтической композиции.

В некоторых вариантах осуществления композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, получают способами культивирования, описанными в разделе 4 и в примерах.

В одном из вариантов осуществления предоставлена композиция, содержащая стромальные стволовые клетки жировой ткани, в которой не менее примерно 50%, не менее примерно 60%, не менее примерно 70%, не менее примерно 80%, не менее примерно 85%, не менее примерно 90%, не менее примерно 95% или, предпочтительно, не менее примерно 96%, 97%, 98% или 99% стволовых клеток экспрессируют маркеры CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49a, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 и/или CD105. В некоторых вариантах осуществления композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, менее чем примерно 15%, примерно 10%, примерно 5% и, предпочтительно, примерно 4%, 3%, 2% или 1% стволовых клеток экспрессируют маркеры CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 и/или CD133.

В другом варианте осуществления предоставлена композиция, содержащая стромальные стволовые клетки жировой ткани, в которой не менее примерно 50%, не менее примерно 60%, не менее примерно 70%, не менее примерно 80%, не менее примерно 85%, не менее примерно 90%, не менее примерно 95% или, предпочтительно, не менее примерно 96%, 97%, 98% или 99% стволовых клеток экспрессируют маркеры c-Kit, виментин и/или CD90. В некоторых вариантах осуществления в композициях, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани менее чем примерно 15%, примерно 10%, примерно 5% и, предпочтительно, примерно 4%, 3%, 2% или 1% стволовых клеток экспрессируют маркеры CD34, фактор VIII, альфа-актин, десмин, S-100 и/или кератин. Также предоставленное является популяцией стромальных стволовых клеток, которые экспрессируют маркеры c-Kit, виментин и CD90 и не экспрессируют маркеры CD34, фактор VIII, альфа-актин, десмин, S-100 и кератин.

Определение фенотипа клеточной популяции по поверхностным маркерам может быть осуществлено либо посредством индивидуального окрашивания клеток (поточная цитометрия), или посредством приготовления гистологических срезов популяции in situ, выполняемого в соответствии с обычными методиками. Определение профиля экспрессии поверхностных маркеров посредством антител, иммунофенотипическое описание, может быть прямым, при использовании меченых антител, или непрямым, при использовании вторичных меченых антител на первичные специфические антитела к клеточным маркерам, достигая таким образом усиления сигнала. С другой стороны, наличие или отсутствие связывания антитела может быть определено разными методиками, которые включают, но ими не ограничиваются, иммунофлюоресцентную микроскопию и радиографию. Подобным образом можно провести мониторинг уровней связывания антитела при поточной цитометрии, технологии, которая позволяет находить корреляцию между уровнем флюорохрома и количеством антигена, присутствующего на поверхности клетки и специфически связанного с мечеными антителами. Дифференциальная экспрессия группы поверхностных маркеров на популяции клеток предоставляет способ для идентификации и выделения указанной популяции.

В определенных вариантах осуществления композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, являются суспензиями стромальных стволовых клеток жировой ткани в различных растворах или материалах, например, для использования в качестве фармацевтических препаратов или биоматериалов, как описано более подробно ниже. В одном из вариантов осуществления клеточная композиция включает суспензию этих стромальных стволовых клеток жировой ткани в растворе Рингера и HSA. В другом варианте осуществления клеточная композиция включает суспензию этих стромальных стволовых клеток жировой ткани в материале, таком как полимер, клей, гель и так далее. Подобные суспензии могут быть получены, например, посредством осаждения этих стромальных стволовых клеток жировой ткани в культуральной среде и ресуспендирования их в необходимом растворе или материале. Клетки можно осадить и/или сменить им культуральную среду, например, посредством центрифугирования, фильтрации, ультрафильтрации и т.д.

Концентрация этих стромальных стволовых клеток жировой ткани в этих клеточных композициях, содержащих эти стромальные стволовые клетки жировой ткани, может быть не менее примерно 5×10⁶, не менее примерно 10×10⁶ клеток/мл, не менее примерно 2×10⁶ клеток/мл, не менее примерно 30×10 ⁶ клеток/мл, не менее примерно 40×10⁶ клеток/мл.

Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к потомству стромальных стволовых клеток жировой ткани, например к клеткам, которые произошли от стромальных стволовых клеток жировой ткани. Такое потомство может включать как последующие поколения стромальных стволовых клеток жировой ткани, так и коммитированные по определенной линии клетки, полученные посредством стимуляции дифференцировки стромальных стволовых клеток жировой ткани после их выделения из эксплантата, например, стимулированные in vitro. В определенных вариантах осуществления клетки-потомки получаются после примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9 или примерно 10 пересевов родительской популяции. Однако клетки-потомки могут быть получены после любого числа пересевов родительской популяции.

В определенных вариантах осуществления композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, по изобретению предоставлены как в виде части фармацевтического препарата, например, стерильного, не содержащего нежелательные вирусы, бактерии и другие патогены, так и не содержащего пирогены препарата. То есть для введения человеку композиции по изобретению должны соответствовать как стандартам стерильности, пирогенности, так и обычным стандартам безопасности и чистоты, которые требует отдел по биологическим стандартам FDA.

В определенных вариантах осуществления такие композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, могут быть использованы для трансплантации животным, предпочтительно млекопитающим, и, еще более предпочтительно, людям. Предпочтительно клетки могут быть аутологичными, но также и аллогенными или ксеногенными относительно хозяина, которому производится трансплантация. Из-за трудностей получения достаточного количества аутологичных стволовых клеток стромальные стволовые клетки жировой ткани ценным альтернативным источником стволовых клеток для терапевтического применения могут служить стромальные стволовые клетки жировой ткани от аллогенного донора. В данной области известно, что стромальные стволовые клетки костного мозга и стромальные клетки жировой ткани не вызывают реакцию аллогенных лимфоцитов in vitro и, следовательно, аллогенные стромальные стволовые клетки жировой ткани, полученные от донора, теоретически могут быть использованы для любого пациента вне зависимости от несовместимости по МНС.

Способы введения композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, индивидам, в частности человеку, которые подробно описаны в данном документе, включают инъекции или имплантации клеток в зоны-мишени индивида, клетки можно поместить в устройство для доставки, которое поможет введению клеток индивиду посредством инъекции или имплантации. Подобные устройства для доставки включают трубки, например катетеры, для инъекции клеток и жидкостей в организм индивида-реципиента. В предпочтительном варианте осуществления, у трубок дополнительно есть игла, например шприц, через которую композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, могут быть введены индивиду в необходимую область. Композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, могут быть введены в такие устройства для доставки, например в шприц, в разных формах. Например, композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, включают композиции стромальных стволовых клеток жировой ткани, которые, находясь в таком устройстве для доставки, суспендированы в растворе или погружены в поддерживающий матрикс.

Фармацевтически приемлемые носители и разбавители включают солевые, водные буферные растворы, растворители и/или диспергирующие среды. Использование таких носителей широко известно в данной области техники. Раствор предпочтительно стерильный и жидкий в такой степени, чтобы не возникало трудностей с наполнением шприца. Предпочтительно, раствор стабилен при условиях производства и хранения и сохранен от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибки, посредством применения, к примеру, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и подобных им. Растворы, которые используются для приготовления композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, посредством внедрения стромальных стволовых клеток жировой ткани, как описано здесь, в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и, при необходимости, другие ингредиенты, перечисленные выше, должны быть в последствии стерилизованы фильтрацией.

Некоторые примеры материалов и растворов, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сукроза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетатцеллюлоза; (4) порошковый трагант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) вспомогательные вещества, такие как масло какао и воск для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоли; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбитол, маннитол и полиэтиленгликоль; (12) эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную водуа; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) рН буферные вещества; (21) полиэфиры; поликарбонаты и/или полиангидриды и (22) другие нетоксичные вещества, используемые в фармацевтических составах.

В некоторых вариантах осуществления композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, также включают адгезивные вещества. В определенных вариантах осуществления адгезивным веществом является адгезивное вещество на основе фибрина, такое как фибриновый гель, или фибриновый клей, или полимер на основе фибрина, или адгезивное вещество, или другой тканевой клей или хирургический клей, такой как, например, цианоакрилат, коллаген, тромбин или полиэтиленгликоль. Другие материалы, которые могут быть использованы, включают, но ими не ограничиваются, альгинат кальция, агарозу, I, II, IV типы или другие изоформы коллагена, полимолочную/полигликолиевую кислоту, производные гиалуроната или другие материалы (Perka C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49: 305-311; Sechriest V.F. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49: 534-541; Chu CR et al. (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29: 1147-1154; Hendrickson D.A. et al. (1994) Orthop. Res. 12: 485-497). В других вариантах осуществления, адгезивным веществом является жидкая повязка, где композиции данного способа, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, смешаны с жидким перевязочным материалом. «Жидкая повязка» является раствором, содержащим соединение, например полимерный материал, которым обрабатывают рану посредством спрея или щеточки с последующим удалением растворителя посредством испарения для образования защитной пленки на месте раны.

Настоящее изобретение относится к способам получения композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, включающих соединения или материалы для применения для закрытия свищей или ран. В одном из вариантов осуществления способ получения таких материалов включает суспендирование стромальных стволовых клеток жировой ткани клеточной композиции с данным материалом. В одном из вариантов осуществления стромальные стволовые клетки жировой ткани осаждают из культуральной среды и ресуспендируют в фибриновом клее или геле. Фибриновые клеи и гели и другие полимеры на основе фибрина и адгезивные вещества широко известны в данной области техники и коммерчески доступны. Например, коммерчески доступным набором фибринового клея является Tissucol® Duo 2.0, и другие коммерчески доступные фибриновые клеящие герметики включают Crosseal®, TISSEEL VH Fibrin Sealant® и подобные им.

Композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, по изобретению также могут быть использованы для покрытия носителя, например медицинского оборудования. Например, носителем может быть шовный материал, нить, аппарат для восстановления менисков, заклепки, крепление, скобка, винт, металлическая пластинка для скрепления отломков кости, система для установки металлической пластины для скрепления отломков кости, хирургическая сетка, лоскут, например лоскут для лечения, сердечно-сосудистый лоскут или перикардиальный лоскут, поддерживающая повязка, ортопедический стержень, противоспаечный барьер, стент, направляемое устройство для излечивания/восстановления тканей, наполняющее вещество, венозный клапан, костномозговой каркас, трансплантат связки или сухожилия, имплантат клеток глаза, остов для артродеза позвонков, кожный лоскут, лоскут из твердой мозговой оболочки, лоскут костного трансплантата, костный штифт, раневая повязка, клей, полимер или гемостатическое вещество.

Носители, в которые можно ввести или поместить композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, или которые можно покрыть композициями, содержащими стромальные стволовые клетки жировой ткани, включают матриксы, которые совместимы с реципиентом и которые деградируют до продуктов, которые оказывают вредное воздействие на реципиента. Натуральные и/или синтетические биодеградирующие матриксы являются примерами таких матриксов. Натуральные биодеградирующие матриксы включают собранную плазму, например, полученную от млекопитающего, и коллагеновые матриксы. Синтетические биодеградирующие матриксы включают синтетические полимеры, такие как полиангидриды, полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Другие примеры синтетических полимеров и способов введения и помещения клеток на данный матрикс известны в данной области техники (см., например, патент США № 4298002 и патент США № 5308701). Данные матриксы обеспечивают данным хрупким клеткам поддержку и защиту in vivo.

Носитель может быть покрыт клетками любым способом, который известен специалисту в данной области техники, например посредством пропитывания, разбрызгивания, покрытия, закрепления и т.д.

В одном из вариантов осуществления, носителем является шовный материал, скрепка, рассасывающаяся нить, нерассасывающаяся нить, натуральная нить, синтетическая нить, однофиламентная нить или полифиламентная нить (также называемая крученая). Предпочтительные способы получения шовного материала и других носителей, применяемых для закрытия ран, покрытых стромальными стволовыми клетками жировой ткани, раскрыты в заявке США № 11/056241 «Biomaterial for Suturing», поданной 14 февраля 2005, заявка приведена в описании в качестве ссылки в полном объеме. Композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, раскрытые здесь, представляют собой новые композиции, которые могут быть использованы вместе со способами, раскрытыми в заявке США № 11/056241.

Кроме того, в любых композициях, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани, по меньшей мере, одно терапевтическое вещество может быть включено в композицию. Например, композиция может включать анальгезирующее вещество в качестве вспомогательного для лечения воспаления или боли на месте свища или раны или противоинфекционное средство для профилактики инфекции в месте, обрабатываемом композицией.

В частности, неограничивающие примеры терапевтических средств, которые могут использоваться, включают следующие терапевтические категории: анальгетики, такие как нестероидные противовоспалительные препараты, опиоидные агонисты и салицилаты; противоинфекционные средства, такие как антигельминтики, средства против анаэробной флоры, антибиотики, аминогликозидные антибиотики, противогрибковые антибиотики, цефалоспориновые антибиотики, макролидные антибиотики, разнообразные бета-лактамные антибиотики, антибиотики пенициллинового ряда, хинолоновые антибиотики, сульфонамидные антибиотики, тетрациклиновые антибиотики, антимикобактериальные препараты, антимикобактериальные противотуберкулезные препараты, противопротозойные противомалярийные средства, противовирусные средства, противоретровирусные средства, противочасоточные средства, противовоспалительные средства, кортикостероидные противовоспалительные средства, противозудные средства/местные анестетики, локальные противоинфекционные средства, локальные противоинфекционные противогрибковые средства, локальные противоинфекционные противовирусные средства; электролиты и нефротические средства, такие как подкисляющие средства, подщелачивающие средства, диуретики, диуретики, ингибирующие карбангидразу, петлевые диуретики, осмотические диуретики, калийсберегающие диуретики, тиазидные диуретики, заменители электролитов и средства, способствующие выведению мочевой кислоты; ферменты, такие как ферменты поджелудочной железы и тромболитические ферменты; гастроинтестинальные средства, такие как противодиарейные средства, противорвотные, гастроинтестинальные противовоспалительные средства, антацидные противоязвенные средства, противоязвенные средства ингибиторы протонной помпы, противоязвенные средства, воздействующие на слизистую желудка, противоязвенные средства Н2-блокаторы, средства, способствующие растворению желчных камней, средства, стимулирующие пищеварение, рвотные средств, слабительные средства и средства, смягчающие стул, прокинетические средства; общие анестетики, такие как ингаляционные анестетики, галогенсодержащие ингаляционные анестетики, внутривенные анестетики, барбитуратные внутривенные анестетики, бензодиазепиновые внутривенные анестетики и внутривенные анестетики из ряда опиоидных агонистов; гормоны и модификаторы гормонов, такие как средства, вызывающие аборт, адренальные средства, кортикостероидные адренальные средства, андрогены, антиандрогены, иммунобиологические средства, такие как иммуноглобулины, иммуносупрессанты, анатоксины и вакцины; местные анестетики, такие как амидные местные анестетики и эфирные местные анестетики; средства, воздействующие на скелетную мускулатуру, такие как противоподагрические противовоспалительные средства, кортикостероидные противовоспалительные средства, золотосодержащие противовоспалительные средства, иммуносупрессивные противовоспалительные средства, нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), противовоспалительные средства из группы салицилатов, минералы; и витамины, такие как витамин А, витамин В, витамин С, витамин D, витамин Е и витамин K.

Предпочтительные классы употребительных терапевтических средств из вышеперечисленных категорий включают: (1) анальгетики в целом, такие как лидокаин или его производные, и нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), включая диклофенак, ибупрофен, кетопрофен и напрофен; (2) опиоидные агонисты, такие как кодеин, фентанил, гидроморфин и морфин; (3) анальгетики из группы салицилатов, такие как аспирин (ASA) (ASA, покрытый кишечнорастворимой оболочкой); (4) антигистаминовые средства Н1-блокаторы, такие как клемастин и терфенадин; (5) противоинфекционные средства, такие как мупироцин; (6) средства против анаэробной флоры, такие как хлорамфеникол и клиндамицин; (7) противоинфекционные противогрибковые антибиотики, такие как амфотерицин b, клотримазол, флюконазол и кетоконазол; (8) противоинфекционные макролидные антибиотики, такие как азитромицин и эритромицин; (9) разнообразные противоинфекционные бета-лактамные антибиотики, такие как азтреонам и имипенем; (10) противоинфекционные антибиотики пенициллинового ряда, такие как нафциллин, оксациллин, пенициллин G и пенициллин V; (11) противоинфекционные хинолоновые антибиотики, такие как ципрофлоксацин и норфлоксацин; (12) противоинфекционные тетрациклиновые антибиотики, такие как доксациклин, миноциклин и тетрациклин; (13) противоинфекционные противотуберкулезные антимикобактериальные препараты, такие как изониазид (INH) и рифампин; (14) противоинфекционные противопротозойные средства, такие как атоваквон и дапсон; (15) противоинфекционные противомалярийные противопротозойные средства, такие как хлорохин и пириметамин; (16) противоинфекционные противоретровирусные средства, такие как ритонавир и зидовудин; (17) противоинфекционные противовирусные средства, такие как ацикловир, ганцикловир, альфа-интерферон и римантадин; (18) противоинфекционные местные противогрибковые средства, такие как амфотерицин В, клотримазол, миконазол и нистатин; (19) противоинфекционные местные противовирусные средства, такие как ацикловир; (20) электролиты и нефротические средства, такие как лактулоза; (21) петлевые диуретики, такие как фуросемид; (22) калийсберегающие диуретики, такие как триатерен; (23) тиазидные диуретики, такие как гидрохлоротиазид (HCTZ); (24) средства, способствующие выведению мочевой кислоты, такие как пробенецид; (25) ферменты, такие как РНКаза и ДНКаза; (26) противорвотные средства, такие как прохлорперазин; (27) гастроинтестинальные противовоспалительные средства из ряда салицилатов, такие как сульфасалазин; (28) противоязвенные средства ингибиторы протонной помпы, такие как омепразол; (29) противоязвенные средства Н ₂-блокаторы, такие как циметидин, фамотидин, низатидин и ранитидин; (30) средства, способствующие пищеварению, такие как панкреолипаза; (31) прокинетические средства, такие как эритромицин; (32) эфирные местные анестетики, такие как бензокаин и прокаин; (33) скелетно-мышечные кортикостероидные противовоспалительные средства, такие как беклометазон, бетаметазон, кортизон, дексаметазон, гидрокортизон и преднизон; (34) скелетно-мышечные противовоспалительные иммуносупрессивные средства, такие как азатиоприн, циклофосфамид и метотрексат; (35) скелетно-мышечные нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), такие как диклофенак, ибупрофен, кетопрофен, кеторолак и напроксен; (36) минералы, такие как железо, кальций и магний; (37) соединения витаминов, такие как цианокобаламин (витамин В₁₂) и ниацин (витамин В₃); (38) соединения витамина С, такие как аскорбиновая кислота; и (39) соединения витамина D, такие как кальцитриол.

В определенных вариантах осуществления терапевтическим средством может быть фактор роста или другая молекула, которая влияет на клеточную дифференцировку и/или пролиферацию. В данной области техники широко известны факторы роста, вызывающие терминальную дифференцировку, и может быть выбран любой из таких факторов, для которого показано, что он вызывает состояние терминальной дифференцировки. Факторами роста для применения в способах, описанных здесь, могут, в определенных вариантах осуществления, быть варианты или фрагменты факторов роста, встречающихся в природе. Например, вариант может быть сделан посредством консервативных замен аминокислот и испытания получившегося варианта в одном или нескольких тестах, описанных выше, или в другом функциональном тесте, известном в данной области техники. Консервативные аминокислотные замены относятся к взаимозаменяемости остатков, имеющих схожие боковые цепи. Например, в группу аминокислот с алифатической боковой цепью входят глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; в группу аминокислот с гидроксиалифатической боковой цепью входят серин и треонин; в группу аминокислот с амидсодержащей боковой цепью входят аспарагин и глутамин; в группу аминокислот с ароматической боковой цепью входят фенилаланин, тирозин и триптофан; в группу аминокислот с основной боковой цепью входят лизин, аргинин и гистидин; и в группу аминокислот с серосодержащей боковой цепью входят цистеин и метионин. Предпочтительными консервативными аминокислотными замещаемыми группами являются валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин.

Если специалисты в данной области техники примут во внимание, варианты или фрагменты полипептидных факторов роста могут быть получены, используя традиционные способы, такие как мутагенез, включая создание заданной точечной мутации(-й) или посредством усечения. Например, мутация может привести к вариантам в сущности с такой же, или просто подклассу, биологической активностью, как и у полипептидного фактора роста, от которого он произошел.

3. Способы получения новых композиций, содержащих стромальные стволовые клетки жировой ткани

Также предоставлены способы получения стромальных стволовых клеток жировой ткани, включающие вышеописанные композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани. В одном из вариантов осуществления, способ включает: (a) забор жировой ткани у индивида; (b) получение суспензии клеток посредством ферментативного расщепления; (с) осаждение суспензии клеток и ресуспендирование клеток в культуральной среде; (d) культивирование клеток по меньшей мере около 10 дней и (g) увеличение числа клеток по меньшей мере в течение двух пересевов культуры.

Стромальные стволовые клетки жировой ткани предпочтительно являются стромальными стволовыми клетками жировой ткани индивида, которому должны быть введены композиции, содержащие конечные стромальные стволовые клетки жировой ткани. Однако стромальные стволовые клетки также могут быть выделены от любого организма того же или другого вида, чем индивид. Любой организм, имеющий жировую ткань, может быть возможным кандидатом. Предпочтительно, организм является организмом млекопитающего, наиболее предпочтительно, организм является организмом человеком.

В определенных вариантах осуществления, клетки культивируют в течение по меньшей мере примерно 15, по меньшей мере примерно 20 дней, по меньшей мере примерно 25 дней или по меньшей мере примерно 30 дней. Предпочтительно, клетки дольше размножаются в культуре для улучшения гомогенности фенотипа клеток в клеточной популяции.

В определенных вариантах осуществления, количество клеток увеличивают в культуре по меньшей мере в течение трех пересевов культуры или «пересеваются по меньшей мере три раза». В других вариантах осуществления, клетки пересеваются по меньшей мере четыре раза, по меньшей мере пять раз, по меньшей мере шесть раз, по меньшей мере семь раз, по меньшей мере восемь раз, по меньшей мере девять раз, по меньшей мере десять раз. Предпочтительно, если клетки дольше размножаются в культуре для улучшения гомогенности фенотипа клеток в клеточной популяции. На самом деле, клетки можно преумножать в культуре так долго, пока можно улучшить гомогенность клеточного фенотипа и сохранить способность дифференцироваться.

Клетки можно культивировать по любой методике культивирования стволовых клеток, известной в области техники. Описание различных методик культивирования, так же как и их крупномасштабные варианты, можно найти в Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, Wiley-Liss 2000. В определенных вариантах осуществления клетки культивируют в монослойной культуре. В одном из вариантов осуществления клетки культивируют и пассируют так, как это описано ниже в примере 1.

Может быть использована любая среда, способная к поддержанию стромальных клеток в тканевой культуре. Составы сред, которые поддерживают рост фибробластов, включают, но не ограничены, среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM) альфа-модифицированную минимальную среду (.alpha.MEM) и среду 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI Media 1640) и тому подобное. Обычно для поддержания роста стромальных клеток и/или хондроцитов в вышеперечисленные среды добавляют от 0 до 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) или 1-20% лошадиной сыворотки. Однако можно использовать среду с определенным составом, если необходимые факторы роста, цитокины и гормоны в FBS для стромальных клеток и хондроцитов идентифицированы и предоставлены в должных концентрациях в ростовой среде. Среды, которые можно использовать в способах по изобретению, могут содержать один или более интересующих компонентов, включая, но ими не ограничиваясь, антибиотики митогенные или соединения, вызывающие дифференцировку стромальных клеток. Клетки должны расти при температуре от 31°С до 37°С в увлажненном инкубаторе. Содержание оксида углерода должно поддерживаться между 2% и 10%, а содержание кислорода между 1% и 22%. Клетки могут находиться в такой окружающей среде в течение 4 недель.

Антибиотики, которые могут быть добавлены в среду, включают, но ими не ограничиваются, пенициллин и стрептомицин. Концентрация пенициллина в культуральной среде определенного химического состава составляет от примерно 10 до примерно 200 единиц в мл. Концентрация стрептомицина в культуральной среде определенного химического состава составляет от примерно 10 до примерно 200 мг/мл.

Стромальные стволовые клетки жировой ткани могут быть временно или стабильно трансфицированы или трансдуцированы интересующей нуклеиновой кислотой, используя плазмиду, вирусный вектор или альтернативную стратегию. Интересующие нуклеиновые кислоты включают, но ими не ограничены, нуклеиновые кислоты, которые кодируют продукты генов, усиливающих продукцию компонентов внеклеточного матрикса, находящихся в том типе ткани, который предстоит восстанавливать, например стенка кишечника или стенка влагалища.

Трансдукция вирусными векторами, доставляющими регуляторные гены в стромальные стволовые клетки, может быть проведена с вирусными векторами (аденовирусными, ретровирусными, аденоассоциированными вирусными или другими векторами), очищенными в слое хлорида цезия или другим способом в множественности заражения (вирусные единицы:клетки) в промежутке от 10:1 до 2000:1. Клетки должны быть обработаны вирусом в среде с сывороткой или без сыворотки в отсутствие или в присутствии катионного детергента, как, например, полиэтиленамина или Lipofectamine.TM. в течение от 1 часа до 24 часов (Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9: 2493-2502; Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int. 64: 45-49).

Другие подходящие способы переноса векторов или плазмид в стволовые клетки включают липид/ДНКовые комплексы, как, например, те, что описаны в патентах США № 5578475; 5627175; 5705308; 5744335; 5976567; 6020202 и 6051429. Подходящие реагенты включают липофектамин, 3:1 (w/w) липосомный состав поликатионного липида 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминтрифторацетат (DOSPA) (Chemical Abstracts Registry name: N-[2-(2,5-бис[(3-аминопропил)амино]-1-окспентил}амино)этил]-N,N-диметил-2,3-бис(9-октадеценилокси)-1-пропанаминтрифторацетат) и нейтральный липид диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE) в фильтрованной через мембрану воде. Примером является состав Lipofectamine 2000TM (доступным от Gibco/Life Technologies # 11668019). Другие реагенты включают FuGENETM 6 трансфицирующий реагент (смесь липидов в нелипосомальной форме и другие соединения в 80% этаноле, который можно получить от Roche Diagnostics Corp. # 1814443) и LipoTAXITM трансфицирующий реагент (липидный состав от Invitrogen Corp., #204110). Трансфекция стволовых клеток может быть проведена посредством электропорации, например, как описано в M.L.Roach and J.D.McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185:1. Подходящие вирусные векторные системы для получения стволовых клеток со стабильными генетическими изменениями могут основываться на аденовирусах и ретровирусах и могут быть приготовлены, используя коммерчески доступные вирусные компоненты.

Трансфекции плазмидных векторов, доставляющих регуляторные гены в стромальные стволовые клетки, могут быть введены в клетки монослойных культур, используя преципитацию ДНК фосфатом кальция или способами с катионными детергентами (Lipofectamine.TM., DOTAP), или в трехмерные культуры посредством внедрения плазмидных ДНК векторов напрямую в биосовместимый полимер (Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5: 753-759).

Для отслеживания и обнаружения функциональных белков, закодированных этими генами, вирусные или плазмидные ДНК векторы должны содержать легко детектируемый маркерный ген, такой как зеленый флуоресцирующий белок, или фермент бета-галактозидазу, каждый из которых может быть отслежен гистохимическими методами.

4. Способы лечения свищей и ран

Другой аспект изобретения составляет новейший метод для применения стромальных стволовых клеток жировой ткани для лечения свищей и ран. В предпочтительных вариантах осуществления стромальные стволовые клетки жировой ткани получают от жировой ткани индивида, которому проводят лечение. В других предпочтительных вариантах осуществления стромальные стволовые клетки жировой ткани содержат композиции, включающие стромальные стволовые клетки жировой ткани, описанные в описании настоящей заявки. Однако другие препараты стромальных стволовых клеток жировой ткани могут быть использованы в способах, описанных в данном документе, например, такие как препараты, описанные в патентах США № 6777231 и 6555374 и заявке на патент США № 11/065461 "Identification and Isolation of Multipotent Cell From Non-Osteochondral Mesenchymal Tissue , поданной 25 февраля 2005.

В одном из вариантов осуществления способ лечения свищей у индивида включает: (а) закрытие внутреннего отверстия шовным материалом и (b) доставку по меньшей мере примерно 10×10⁶, по меньшей мере примерно 20×10⁶, по меньшей мере примерно 30×10 ⁶ или по меньшей мере примерно 40×10⁶ стромальных стволовых клеток жировой ткани, например, в композиции, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани, настоящего изобретения, в закрытое швом внутреннее отверстие. В определенных вариантах осуществления, например, когда первая доставка клеток является недостаточной, способ может дополнительно включать: (с) доставку второй дозы по меньшей мере примерно 20×10⁶ клеток, по меньшей мере примерно 30×10⁶ или по меньшей мере примерно 40×10⁶ стромальных стволовых клеток жировой ткани, например, в композиции, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани, настоящего изобретения, в закрытое швом внутреннее отверстие.

В другом варианте осуществления композиция, содержащая стромальные стволовые клетки жировой ткани, используемая по способу, является такой, что в ней по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или, предпочтительно, по меньшей мере примерно 96%, 97%, 98% или 99% стволовых клеток экспрессируют маркеры CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49a, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 и/или CD105.

В другом варианте осуществления композиция, содержащая стромальные стволовые клетки жировой ткани, используемая по способу, является такой, что в ней по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или, предпочтительно, по меньшей мере примерно 96%, 97%, 98% или 99% стволовых клеток экспрессируют маркеры c-Kit, виментин и/или CD90.

Общие способы введения клеток индивидам, в частности людям, в настоящем изобретении, некоторые из которых подробно описаны, включают инъекции или имплантации клеток в зоны-мишени индивида, клетки можно поместить в устройство для доставки, которое поможет введению клеток индивиду посредством инъекции или имплантации. Подобные устройства для доставки включают трубки, например катетеры, для инъекции клеток и жидкостей в тело реципиента. В предпочтительном варианте осуществления, у трубок дополнительно есть игла, например шприц, через которую клетки по изобретению могут быть введены индивиду в требуемой области. Клетки по изобретению могут быть введены в такие устройства для доставки, например в шприц, в разных формах. Например, клетки, находясь в таком устройстве для доставки, могут быть суспендированы в растворе или внедрены в поддерживающий матрикс. Фармацевтически приемлемые носители и разбавители включают солевые, водные буферные растворы, растворители и/или диспергирующие среды. Использование таких носителей широко известно в данной области техники. Раствор предпочтительно стерильный и жидкий в такой степени, чтобы не возникало трудностей с наполнением шприца. Предпочтительно, раствор стабилен при условиях производства и хранения и сохранен от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы, посредством применения, к примеру, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и подобных им. Растворы в данном изобретении могут быть приготовлены посредством внедрения клеток-предшественниц, как описано здесь, в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и, при необходимости, другие ингредиенты, перечисленные выше, подвергаются последующей стерилизации фильтрацией.

В других вариантах осуществления способ лечения свищей у индивидов включает: (а) закрытие внутреннего отверстия шовным материалом, который содержит стромальные стволовые клетки жировой ткани, например, в форме подлежащей композиции, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани. Такой шовный материал, покрытый подлежащими композициями, содержащими стромальные стволовые клетки жировой ткани, описан подробно в заявке на патент США № 11/056241, поданной 14 февраля 2005, которая приведена в описании в качестве ссылки.

Способы в некоторых вариантах осуществления могут дополнительно включать: (d) глубокое выскабливание свищевого канала и (е) заполнение указанного свищевого канала материалом. В определенных вариантах осуществления способы могут дополнительно включать доставку по меньшей мере примерно 10×10⁶ стромальных стволовых клеток жировой ткани, например, из подлежащей клеточной композиции в материал. Предпочтительно, если материалом является полимер или адгезивное вещество на основе фибрина, такое как фибриновый клей или гель. В определенных вариантах осуществления дозировка составляет по меньшей мере примерно 10×10 ⁶ стромальных стволовых клеток жировой ткани, уже находящихся внутри материала, например, таким образом, что материал включает композицию, содержащую стромальные стволовые клетки жировой ткани.

В другом варианте осуществления способ лечения свищей у индивида включает:

(i) глубокое выскабливание по меньшей мере одного свищевого канала;

(ii) закрытие внутреннего отверстия выскобленного канала шовным материалом;

(iii) доставку по меньшей мере примерно 10×10 ⁶, по меньшей мере примерно 20×10⁶, по меньшей мере примерно 30×10⁶ или по меньшей мере примерно 40×10⁶ стромальных стволовых клеток жировой ткани в закрытое шовным материалом внутреннее отверстие, например, в композиции по изобретению, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани.

В определенных вариантах осуществления, например, когда первой доставки клеток недостаточно, способ может далее включать:

(iv) доставку второй дозы по меньшей мере примерно 20×10 ⁶ клеток, по меньшей мере примерно 30×10⁶ клеток или по меньшей мере примерно 40×10⁶ стромальных стволовых клеток жировой ткани в закрытое шовным материалом внутреннее отверстие в композиции данного изобретения, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани.

Стадию (i) предпочтительно проводят посредством глубокого выскабливания всех свищевых каналов, которое производится, например, путем введения кюретажной иглы в свищевой канал, и образующееся в результате выскабливания свищевых стенок кровотечение служит источником естественного фибрина, который заполнит свищевой канал. Недавние клинические исследования заявителей свидетельствуют о том, что естественный фибрин, получаемый данным способом выскабливания, является предпочтительным выбором в сравнении с использованием искусственных фибриновых герметиков, таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способа изобретения свищевые каналы, которые подлежат лечению, не наполняются подобными материалами.

Стадию (iv) предпочтительно проводят посредством местной доставки клеток, например, композиции, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани, посредством инъекции внутрь стенок свища по ходу свищевого канала. Например, две инъекции по 10 миллионов клеток в трехсантиметровый канал свища.

Способы по изобретению могут быть применимы для лечения любого свища, включая, но не ограничиваясь, аноректальный свищ, или свищ заднего прохода, или каловый свищ, артериовенозную фистулу или АВ фистулу (между артерией и веной), желчный свищ, шеечный свищ, краниопазушную фистулу, межкишечный свищ, кишечно-кожный свищ, тонкокишечно-влагалищный свищ, желудочный свищ, маточно-перитонеальный свищ, перилимфатический свищ, аретриовенозную фистулу легкого, прямокишечно-влагалищный свищ, пупочный свищ, трахеопищеводный свищ и мочепузырно-влагалищный свищ. Предпочтительно, способы могут быть применены для лечения свищей кишечника, например тех, которые соединяют кишечник с самим собой или другим органом, таких как прямокишечно-влагалищный свищ, межкишечный свищ, кишечно-кожный свищ и тонкокишечно-влагалищный свищ. В другом предпочтительном варианте осуществления, способы могут быть применены для лечения влагалищных и маточных свищей, например тех, которые соединяют влагалище или матку с ними самими или с другими органами, таких как шеечный свищ, прямокишечно-влагалищный свищ, тонкокишечно-влагалищный свищ и мочепузырно-влагалищный свищ.

При оперативном лечении доступы к свищам могут осуществляться любыми из способов, известных в данной области техники, например через надрез, катетер и т.д.

В другом из вариантов осуществления способ лечения раны у индивида включает: (а) закрытие раны шовным материалом и (b) доставку по меньшей мере примерно 10×10⁶ , по меньшей мере примерно 20×10⁶, по меньшей мере примерно 30×10⁶ или по меньшей мере примерно 40×10⁶ стромальных стволовых клеток жировой ткани, например, в композиции, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани, в закрытую швом рану. В определенных вариантах осуществления, например, когда первой доставки клеток недостаточно, способ может далее включать: (с) доставку второй дозы по меньшей мере примерно 20×10⁶ клеток, по меньшей мере примерно 30×10⁶ клеток или по меньшей мере примерно 40×10⁶ стромальных стволовых клеток жировой ткани, например, в композиции, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани, в закрытую шовным материалом рану. В других вариантах осуществления рана может быть заполнена композицией данного изобретения, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани, например, в дозе по меньшей мере примерно 10×10⁶ стромальных стволовых клеток жировой ткани, заключенные в материал, например, таким образом, что материал включает клеточную композицию, где материалом является, например, адгезивное вещество или клей. В других вариантах осуществления способ лечения раны у индивида включает: (а) закрытие раны шовным материалом, который содержит стромальные стволовые клетки жировой ткани, например, из подлежащей композиции, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани. Такой шовный материал, покрытый клетками из подлежащей композиции, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани, подробно описан выше и в заявке патента США № 11/056251, поданной 14 февраля 2005, которая приведена в описании в качестве ссылки.

Способы, описанные выше, могут дополнительно включать введение терапевтических средств индивиду, подлежащему лечению, например, системно или местно в место шва. В определенных вариантах осуществления стромальные стволовые клетки жировой ткани входят в состав композиции, содержащей стромальные стволовые клетки жировой ткани, которая включает терапевтическое средство, как описано выше. В других вариантах осуществления, терапевтическое средство вводится отдельно, например, одновременно со способом, перед проведением способа или после проведения способа. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство вводится индивиду перед, во время и после того, как способ осуществляется на индивиде. Примеры терапевтических средств описаны выше. В предпочтительных вариантах осуществления, терапевтические средства для лечения болезни Крона вводятся индивиду. Примерами терапевтических средств, вводимых при болезни Крона, являются противовоспалительные средства, такие как средства, включающие месаламин, иммуносупрессивные средства, такие как 6-меркаптопурин и азатиоприн; биологические средства, такие как инфликсимаб (Remicade®), антибиотики и противодиарейные средства, такие как дифеноксилат, лоперамид и кодеин.

В вариантах осуществления, в которых используются аллогенные стволовые клетки, может быть необходимо поддерживающее лечение. Например, в соответствии со способами, известными в данной области техники, для предотвращения GVHD перед, в течение и/или после лечения могут быть введены иммуносупрессанты. Перед введением в соответствии со способами, известными в данной области техники, для подавления иммунной реакции от индивида на клетки или наоборот клетки также могут быть модифицированы.

Дозировка любого терапевтического средства будет зависеть от симптомов, возраста и массы тела пациента, от природы и тяжести заболевания, на которое направлено лечение, или от пути введения и формы средства. Любой из подлежащих составов может быть введен одной дозой или несколькими разбитыми дозировками. Дозировки лекарственных средств могут быть легко определены способами, известными квалифицированным специалистам в данной области техники, или как предложено здесь. Также могут быть назначены смеси из нескольких терапевтических средств или несколько терапевтических средств можно ввести в отдельных составах.

Терапевтические средства могут вводиться перорально, парентерально, посредством ингаляции спреем, локально, ректально, через нос, через щеку, вагинально или через имплантируемый резервуар. Термин «парентерально», как использовано здесь, включает методику подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, внутрисиновиальной, внутристернальной, интратекальной, внутрираневой и внутричерепной инъекции или инфузии.

Точное время введения и количество каждого конкретного средства, которое результируется в наиболее эффективном лечении для каждого конкретного пациента, будет зависеть от активности, фармакокинетики и биодоступности конкретного соединения, физиологического состояния пациента (включая возраст, пол, тип заболевания и стадию, общее физическое состояние, отвечаемость на конкретные дозировки и тип лекарств), пути введения и им подобных. Рекомендации, представленные здесь, могут быть использованы для оптимизации лечения, например определения оптимального времени и/или количества для введения, которое потребует не более чем рутинного экспериментирования, состоящего из наблюдения за индивидом и титрования дозировок и/или режима.

Во время прохождения индивидом лечения состояние пациента можно контролировать посредством измерения одного или более актуальных показателей в заранее определенные моменты в течение 24-часового периода. Лечение, включая добавки, количества, режим введения и описание состава, может быть оптимизировано в соответствие с результатами такого мониторинга. Пациента можно периодически подвергать переоценке для определения степени улучшения посредством измерения одних и тех же параметров, первая такая переоценка обычно осуществляется по истечении четырех недель от начала терапии, а последующие переоценки осуществляются через каждые от четырех до восьми недель в течение лечения и в последующем раз в три месяца. Лечение может продолжаться в течение нескольких месяцев или даже лет со стандартно минимальной длительностью в один месяц при лечении людей. Окончательное определение количества вводимого средства и, возможно, изменения в режиме введения могут основываться на этих повторных оценках.

Лечение можно начать с меньших доз, которые ниже оптимальных дозировок для данного соединения. Затем дозу можно увеличить на некоторую часть так, чтобы достигалось оптимальное терапевтическое воздействие.

Комбинированное применение нескольких терапевтических средств может снизить требуемые дозировки для каждого индивидуального компонента в силу того, что появление и длительность эффекта различных компонентов могут быть комплементарны. При такой комбинированной терапии различные действующие вещества могут приниматься вместе или раздельно, одновременно или в разное время суток.

Токсичность и терапевтическую эффективность подлежащих соединений можно определить стандартными фармацевтическими методиками на культурах клеток или экспериментальных животных, например, для определения LD₅₀ и ED₅₀. Предпочтительны составы, проявляющие большие терапевтические индексы. Хотя могут быть применены соединения, имеющие токсические побочные эффекты, нужно уделить внимание разработке системы доставки, которая устремляет средство в требуемое место для снижения побочных эффектов.

Для определения диапазона дозировок для использования на людях можно использовать данные, полученные на тестах на культурах клеток и в исследованиях на животных. Дозировка каждого терапевтического средства или по выбору для любого из компонентов здесь находится предпочтительно в промежутке циркулирующих концентраций, которые включают ED₅₀ с маленькой токсичностью или без нее. Дозировка может варьировать в данном интервале в зависимости от применяемой дозировки и используемого пути введения. Для средств по изобретению терапевтически эффективная дозировка может быть предварительно оценена в тестах на культуре клеток. Дозировку можно определить на животных моделях для достижения концентраций в плазме интервала, который включает IC₅₀ (то есть концентрация тестируемого соединения, при которой достигается полумаксимальное ингибирование симптомов), как определено на культуре клеток. Такая информация может быть использована для более точного определения полезных дозировок для людей. Уровни в плазме можно измерить, например, посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии.

5. Наборы

В других вариантах осуществления в изобретении рассматриваются наборы, включая композиции, содержащие стромальные стволовые клетки жировой ткани, и выбор инструкции по их использованию. Наборы, содержащие фармацевтические композиции и биоматериалы по настоящему изобретению, также находятся в рамках данного изобретения. Компоненты набора могут быть упакованы с целью ручного или частично или полностью автоматического употребления вышеуказанными способами. Такие наборы могут иметь разнообразные применения, включая, например, лечение, восстановление, получение биоматериалов и другие применения.

ПРИМЕРЫ

После общего описания изобретения его будет легче понять, обращаясь к следующим примерам, которые включены только лишь с целью иллюстрации определенных аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения и не имеют намерения ограничить данное изобретение.

Пример 1

Приготовление стволовых клеток из липоаспиратов с улучшенной гомогенностью

Жировую ткань получали посредством липосакции под местной анестезией и общей седацией. Полую тупоконечную канюлю вводили в подкожное пространство через маленький надрез (менее 0,5 см в диаметре). Проводя аккуратную аспирацию, канюлю продвигали сквозь жировую ткань абдоминальной стенки для механического разрушения жировой ткани. Для сокращения до минимума потери крови в жировую ткань путем инъекции ввели солевой раствор и вазоконстриктор эпинефрин. Таким способом от каждого пациента, которого предстоит лечить, получали от 80 до 100 мл необработанного липоаспирата.

Необработанный липоаспират тщательно промывали стерильным раствором фосфатного буфера (PBS; Gibco BRL, Paisley, Scotland, UK) для удаления клеток крови и местного анестетика. Внеклеточный матрикс перерабатывали в растворе коллагеназы II типа (0,075%; Gibco BRL) в сбалансированном солевом растворе (5 мг/мл; Sigma, St. Louis, USA) в течение 30 минут при 37°С для выделения клеточной фракции. Далее коллагеназу инактивировали посредством добавления равного объема среды иглой, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM; Gibco BRL), которая содержала 10% фетальную бычью сыворотку (FBS; Gibco BRL). Суспензию клеток центрифугировали при 250×g в течение 10 минут. Клетки ресуспендировали в 0,16 M NH₄ Cl и давали постоять в течение 10 минут при комнатной температуре для лизиса эритроцитов. Смесь центрифугировали при 250×g и клетки ресуспендировали в DMEM плюс 10% FBS и 1% смеси пенициллина/стрептомицина (Gibco BRL), потом их рассевали на культуральные чашки в концентрации 10-30×10³ клеток/см².

Клетки культивировали в течение 24 часов при 37°С в атмосфере 5% CO₂ в воздухе. Затем чашки промывали PBS для удаления неприлипших клеток и клеточных фрагментов. Клетки поддерживались в культуре в той же среде и в тех же условиях до того, как достигали примерно 80% конфлюэнтности с заменой культуральной среды каждые 3-4 дня. Клетки потом пересевались посредством трипсин-ЭДТА (Gibco BRL) в разведении 1:3, которое соответствует клеточной плотности приблизительно 5-6×10³ клеток/см². Для трансплантации мы использовали клетки между пересевами 1 и 3; клетки, которые пересевались более чем дважды, были предпочтительны для задачи по изолированию популяции клеток с большей гомогенностью. Описание характеристик клеток проводилось с использованием клеток между пересевами от 1 до 9.

Пример 2

Описание характеристик стволовых клеток их липоаспирата с улучшенной гомогенностью

Для описания клеток посредством иммунофлуоресцентного окрашивания клетки рассевались до низкой плотности в DMEM плюс 10% FBS на покровном стекле в 24-луночной плашке. Для иммуногистохимического усечения клетки промывали PBS и фиксировали в ацетоне в течение 10 минут при -20°С. Для окрашивания на а-актин клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10 минут при комнатной температуре. После блокирования PBS, который содержал 4% козлиную сыворотку и 0,1% Triton X-100, клетки инкубировали при 4°С в течение ночи с первичными антителами к следующим клеточным маркерам в указанных разведениях [(i) альфа-актин; Dako, Glostrup, Denmark; 1/50; (ii) виментин; Sigma, St. Louis, USA; 1/200; (iii) CD 90; CYMBUS, Biotechnology LTD, Chandlers Ford, Hants, UK; 1/50; (iv) фактор VIII; Dako; 1/100; (v) CD 34; Chemicon, CA, USA; 1/100; (vi) c-Kit; Chemicon; 1/100; (vii) десмин; Dako; 1/100; (viii) цитокератин; Dako; 1/100 and (ix) S-100; Dako; 1/50]. Далее клетки инкубировали с соответствующими флуоресцентными изотиоционат(FITC)-конъюгированными или тетраметилродаминизотиоционатхлорид(TRITC)-конъюгированными вторичными антителами (Sigma; 1/50) в течение 45 минут при комнатной температуре. Для отрицательного контроля мы опустили стадию с первичными антителами. Ядра были окрашены 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Далее клетки запускали в Mobiglow (MoBiTec, Gottingen, Germany) и наблюдали за ними через эпифлуоресцентный микроскоп TE300 (Nikon, Tokyo, Japan). В каждом случае мы определяли количество иммунопозитивных клеток в разных полях и сравнивали их с числом прокрашенных ядер. Произвольно выбранные поля экспортировались на компьютер (Macintosh G3; Apple Computer Ink., Cupertino, Ca, USA) через Spot1 камеру (Diagnostic Instruments Inc., Tampa, FL, USA). Человеческие клетки гладкой мускулатуры аорты, человеческие клетки пупочного венозного эндотелия (HUVEC) и человеческие синовиальные фибробласты использовались как положительные контроли для иммуноокрашивания различными антителами.

При пересеве 1 большой процент (90-95%) стромальных стволовых клеток жировой ткани экспрессировали виментин, маркер мезенхимальных скелетных клеток (фиг.1). Экспрессия виментина поддерживалась на одинаковом уровне вплоть до и включая пересев 9. Однако уровни других маркеров со временем снижались. Например, а-актин, который был у 17% клеток, полученных от LPA во время пересева 1, не определялся во время пересева 7. Маркер эндотелиальных клеток, фактор фон Виллебранда (фактор VIII), CD34, который также определяется на поверхности эндотелиальных клеток, был обнаружен только при пересевах с 1 до 3 (7% и 12% иммуноположительных клеток, соответственно). В противоположность, экспрессия c-Kit (CD117), маркера клеточной пролиферации, увеличивалась со временем, составляя с 4 пересева 99% иммуноположительных клеток (фиг.2). Маркер фибробластов CD90, исходно экспрессированный на 80% клеток, полученных из LPA, обнаруживался на 99% клеток, начиная с пересева 6 (фиг.3). Не было найдено никакой экспрессии нейроэктодермального маркера S100 или эктодермального маркера кератина ни на одной из клеток, полученных из LPA, ни на какой стадии. Изменения уровней наблюдаемых маркеров с увеличением числа пересевов указывает на гомогенность полученной клеточной популяции.

Для обсчета роста клеток клетки высевали в 24-луночные плашки в концентрации 5×10³ клеток/см ². После того, как клетки прикреплялись к субстрату (3 ч), культуральная среда заменялась на DMEM, дополненный 1% антибиотиками и 0,5%, 2%, 5% или 10% FBS. В качестве положительного контроля на проверку каждой порции сыворотки культивировали человеческие синовиальные фибробласты и определяли их рост. Среду заменяли каждые двое суток. В 24-часовые интервалы клетки фиксировали в 1% глутаральдегиде и после окрашивания ядер кристаллвиолетом определяли число клеток в каждой лунке по уровню поглощения при 595 нм. Для установления взаимосвязи между числом клеток в лунке и поглощением при 595 нм строили стандартную кривую (r² =0,99).

Жизнеспособные стромальные клетки жировой ткани были успешно выделены и культивировались из всех семи липоаспиратов (LPAs). Эти клетки росли в культуре и пересевались через интервалы от 7 до 10 дней. В некоторых случаях клетки замораживались и размораживались перед имплантацией. Скорость роста стромальных стволовых клеток жировой ткани (ADSC) зависела от концентрации сыворотки с максимальной пролиферацией в FBS между 5% и 10% (фиг.4). Среднее время удвоения популяции при данных концентрациях сыворотки составило 37,6±0,6 ч и не отличалось существенно от времени удвоения популяции для человеческих синовиальных фибробластов, культивировавшихся в таких же условиях (35,6±1,4 ч; р>0,05; t-test; результаты трех независимых экспериментов).

С целью проанализировать клетки более стандартизованным и менее субъективным образом, клетки подвергли анализу на клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (FACS). В общем, анализ на проточном цитометре позволяет обнаруживать поверхностные антигены посредством антител, которые напрямую (ковалентно) или ненапрямую (вторичные флуоресцентно меченые антитела) связаны с флуоресцентной меткой. С другой стороны, для вышеописанного иммуногистохимического анализа требовалось проникновение в клетку и последующее окрашивание антителами. Таким образом, для последнего требуется индивидуальный оптимизированный протокол в зависимости от белка-мишени и антитела. Более того, в силу проникновения через клеточную мембрану становится невозможным различить между внутренним (не связанным с мембраной) и внеклеточным белком-маркером. Следовательно, с помощью иммуногистохимического анализа можно узнать, экспрессируется ли белковый маркер, но невозможно определить, экспрессируется ли он на поверхности клетки или внутриклеточно.

Протокол, использованный для иммуногистохимии, для определения поверхностных антигенов является стандартным и требует только подходящие отрицательные контроли. Далее, на FACS анализе можно оценить процент позитивных клеток (клеток, экспрессирующих поверхностный маркерный антиген) и уровень экспрессии (мало или много поверхностного антигена на каждой клетке). Данные оценки являются субъективными по своей природе, используя иммуногистохимию, и могут варьировать от одного эксперимента к другому, что не происходит при FACS анализе.

Такая иммунофенотипическая характеристика клеток может быть проведена на свежевыделенных клетках и после периодов культивирования, например на 7 день, после 4 недель и после 3 месяцев в культуре. Анализ поверхностных маркеров в разных временных точках позволяет оценить гомогенность фенотипа в процессе культивирования. Примеры такого анализа и данных, демонстрирующих фенотип, полученные от препаратов, полученных от 3 здоровых доноров от нуля до трех месяцев культивирования, подробно описаны в заявке патента США № 11/065461, поданной 25 февраля 2005, которая приведена в описании в качестве ссылки.

После выделения по вышеописанному способу стромальные стволовые клетки жировой ткани от одного из пациентов были охарактеризованы по признаку присутствия/отсутствия серии поверхностных маркеров. Для этого наблюдали за экспрессией следующих поверхностных маркеров на проточной цитометрии.

Интергин: CD11b, CD18, CD29, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD61, CDl04.

Гематопоэтические маркеры: CD3, CD9, CD10, CD13, CD16, CD14, CD19, CD28, CD34, CD38, CD45, CD90, CD133, гликофорин.

Рецепторы ростовых факторов: CD105, NGFR.

Рецепторы внеклеточного матрикса: CD15, CD31, CD44, CD50, CD54, CD62e, CD62l, CD62p, CD102, CD106, CD146, CD166.

Другие: CD36, CD55, CD56, CD58, CD59, CD95, HLA-I, HLA-II, 2- микроглобулин.

Для охарактеризования клетки собирались с помощью мягкого переваривания трипсином, промывки с PBS и инкубировались в течение 30 минут при 4°С с флуоресцеин(FITS)- или фикоэритрин(PE) - мечеными маркерными антителами к каждому из поверхностных маркеров для анализа. Клеточные маркеры промывались и немедленно анализировались, используя Epics-XL цитометр (Coulter). В качестве контролей клетки окрашивали неспецифическими антителами к соответствующим изотопам, помеченными FITS или РЕ.

Из анализа профиля экспрессии поверхностных маркеров (фиг.7А, 7В) использовались следующие критерии для установления, какие маркеры определяют клеточную популяцию и позволяют ей быть идентифицированной и дифференцированной от других типов клеток.

1. Отбрасывать те маркеры, которые отличаются от одной пробы к другой через промежутки времени в процессе культивирования в условиях эксперимента, проведенного со стромальными стволовыми клетками от здоровых доноров, в заявке патента США № 11/065461, поданной 25 февраля 2005, которая приведена в описании в качестве ссылки.

2. Отбирать маркеры по принципу их биологической причастности, отбрасывая маркеры, характерные для специфичных типов клеток (например, CD3 является маркером, эксклюзивным для лимфоцитов).

Применяя данные критерии, популяция мультипотентных стволовых клеток характеризуется как положительная по CD9+, CD10+, CD13+, CD29+, CD44+, CD49a+, CD51+, CD54+, CD55+, CD58+, CD59+, CD90+ и CD105+ и не экспрессирующая CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 и CD133.

Пример 3

Приготовление стволовых клеток, содержащих фибриновый гель, для использования при лечении свищей

Для клинического применения клетки, приготовленные, как изложено ранее, могут быть использованы после трех или менее пересевов (фиг.3), но предпочтительно использованы после двух или более пересевов, как описано выше, с целью получения клеточного препарата с большей гомогенностью. Клеточные культуры для клинического применения трипсинизировали в течение 3 минут при 37°С. Трипсинизация прекращалась посредством добавления DMEM с FBS, и суспензию центрифугировали при 110×g в течение 5 минут. Клетки промывали в PBS и суспензию опять центрифугировали при 110×g в течение 5 минут. Клетки ресуспендировали примерно между 3 и 30×10⁶ клеток/мл в 1 или 2 мл лактатного раствора Рингера и помещали в подходящий шприц. К лактатному раствору Рингера по выбору можно добавлять человеческий сывороточный альбумин (HSA).

В определенных случаях половину клеток ресуспендировали в тробиновом компоненте набора фибринового клея (Tissucol® Duo 2.0; Baxter, Madrid, Spain) перед комбинированием двух компонентов набора, в качестве попытки улучшить обтурацию свищевых каналов. Применение фибринового клея для заполнения свищевых отверстий известно в данной области техники; однако, оно не эффективно в качестве самостоятельного лечения свищей. Добавление фибринового клея к композициям, содержащим стромальные стволовые клетки жировой ткани, описанным здесь, служит для поддержания локального местонахождения клеток, и нами замечено, что клетки растут хорошо внутри фибриновых клеев и гелей.

Пример 4

Улучшенное оперативное вмешательство для исправления свищей, используя препараты стволовых клеток из липоаспиратов

Мы провели I фазу клинического испытания, разработанного определить возможность осуществления и сохранность при трансплантации аутологичных стволовых клеток, используя вышеописанные композиции стромальных стволовых клеток жировой ткани для лечения свищей Крона. Протокол был одобрен комитетом по клиническим испытаниям и этике госпиталя La Paz 12 апреля 2002, и была выпущена подробная форма об информированном согласии для пациентов. Комитет по этике информировали о прогрессе исследования на протяжении клинического испытания.

Методы

Пациенты выбирались в соответствии со следующими включающими критериями: старше 18 лет; постановка диагноза болезни Крона по меньшей мере за 5 лет до начала исследования; наличие одного или более сочетанных свищей Крона (кишечно-кожный свищ, надсфинктерный свищ и/или прямокишечно-влагалищный свищ), который не поддавался медицинскому лечению и безуспешно лечился классическим вмешательством по меньшей мере дважды; согласие пациента с подписью формы об информированном согласии. Исключающими критериями были следующие: отсутствие удовлетворения критериям включения; умственная отсталость; чрезмерная худоба; аллергия на местные анестетики; диагноз рака в прошлом; и СПИД.

Пять пациентов (номера 001-005) были включены в исследование. Это были трое мужчин и две женщины, и средний возраст составлял 35,1±2,4 года (разброс от 31,2 до 37,5 лет). Было приготовлено девять клеточных имплантатов: три в прямокишечно-влагалищные свищи; пять в кишечно-кожные свищи (четыре различных свища у одного пациента) и один в надсфинктерный перианальный свищ. Все кишечно-кожные свищи были малопродуктивными - менее 50 сс в день и находились в брюшной стенке (таблица 1). Ни один пациент не получал исключительно парентеральное питание, Remicaid или Octreotride одновременно с данным вмешательством. Пациентам 001 и 002 потребовалось две процедуры липосакции, потому что после первой липосакции стволовые клетки не выжили после криоконсервации.

Один пациент был исключен из-за бактериальной контаминации культивируемых клеток. Мы внесли препараты стромальных стволовых клеток жировой ткани (ADSC) в девять свищей на пересевах от третьего и ранее четырем пациентам. В восемь обработанных свищей еженедельно продолжали инъекции по меньшей мере в течение 8 недель. У шести свищей наружное отверстие было покрыто эпителием к концу 8 недели, таким образом, эти свищи рассматривались как излеченные (75%). В случае оставшихся двух свищей было неполное закрытие наружного отверстия со снижением продуктивности (невылеченные; 25%). Ни у одного пациента не обнаружены никакие побочные эффекты по истечении периода последующего наблюдения (по меньшей мере шесть месяцев и не более чем два года).

В случае кишечно-кожных свищей все каналы были глубоко очищены. В случае прямокишечно-влагалищных свищей мы использовали влагалищный доступ с отслоением задней стенки влагалища. Щель была полностью отгорожена и ректальное отверстие было ушито рассасывающимся шовным материалом 3/0. Слизистая прямой кишки была повреждена болезнью Крона и была чрезвычайно хрупкая. В случае перианального свища основной канал был выскоблен и ректальное отверстие было ушито рассасывающимся шовным материалом 3/0 за склерозированную слизистую.

Используя иглу, в случаях кишечно-кожных свищей мы инъецировали клетки в стенку канала. В случаях прямокишечно-влагалищных и перианального свищей мы инъецировали клетки в слизистую прямой кишки вблизи ушитого внутреннего отверстия. Во всех случаях мы обнаруживали заполоненное жидкостью вздутие в месте инъекции (фиг.5). Число инъецированных клеток варьировало от 3 до 30×10 ⁶ клеток в зависимости от роста культивируемых клеток (фиг.3).

Во всех случаях время от начала приготовления инъецируемого препарата до конца его инъецирования было менее 90 минут. В случаях кишечно-кожных свищей каналы сначала заполнялись фибриновым клеем, и затем зашивали кожу. В случаях прямокишечно-влагалищных свищей формировали перемещаемый вагинальный лоскут. После нахождения доступных каналов они также были заполнены фибриновым клеем.

Никакие перевязки не наносились после операции. Потребление жидкости начиналось спустя двенадцать часов после операции, и твердая пища разрешалась еще спустя шесть часов. После от одного до трех дней после операции пациента выписывали и назначали расписание амбулаторных приемов.

Два патогистологических препарата забрали. Один препарат (пациент 002) был получен из зоны кишечно-кожного свища (7 месяцев после имплантата #2 и 10 дней после имплантата #3). Другой препарат (пациент номер 001) был получен из прямокишечно-влагалищной стенки спустя один год после первого имплантата (имплантат #1), в момент хирургического вмешательства, связанного с имплантатом #6. Препараты были помещены в парафин, порезаны, окрашены гематоксилином и эозином и оценены.

Еженедельные наблюдения были расписаны на восьминедельный срок после операции. Пациенты считались вылеченными, если была очевидна полная эпителизация наружного отверстия вне зависимости от предшествующих наблюдений. После восьми недель был назначен двухмесячный период наблюдения по меньшей мере в течение шести месяцев и не более чем двух лет.

Результаты

Пять пациентов были включены в исследование и были проведены семь липосакций (фиг.3). Пациент номер 003 был выведен из исследования на стадии приготовления имплантата в результате обнаружения контаминации грампозитивными бактериями культуры клеток липоаспирата. Бактерии идентифицированы как Oerkovai xanthineolytica. Кишечно-кожный свищ у пациента 002 был исключен из исследования в результате неотложной абдоминальной операции по поводу нового кишечно-везикулярного свища, который привел к острому сепсису. На лапаротомии потребовалось иссечь зону имплантата. Таким образом, мы не могли проследить до минимального восьминедельного срока наблюдения в данном случае.

Девять свищей у четырех пациентов были обработаны ADSC после трех или менее пересевов (фиг.3). Восемь свищей были расценены как подходящие для оставления в исследовании, и продолжили наблюдение в течение по меньшей мере восьми недель (фиг.3). У шести свищей наружное отверстие эпителизировалось к 8 неделе, и эти фистулы были расценены как вылеченные (75%) (фиг.6). Остальные две имели только неполное закрытие наружного отверстия вместе со снижением продуктивности, как отмечено пациентами (25%; не вылечены; фиг.3). Не отмечено прямой связи между количеством инъецированных клеток или временем культивирования и результативностью вмешательства. Не отмечено прямой взаимосвязи между полом пациентов или возрастом и излечением. Последующие исследования, которые мы провели, указывают на то, что начальная дозировка 20×10 ⁶ клеток является подходящей. Мы определили, что вторая дозировка 40×10⁶ клеток может быть введена, если первая дозировка не эффективна. Предпочтительны более высокие дозировки клеток, потому что мы наблюдали, что большие количества клеток имеют лучший терапевтический эффект на заживление тканей.

Хирургические и имплантационные вмешательства проводили без дополнительных технических сложностей в случае всех девяти свищей. Ни в одном из исследованных случаев не было обнаружено никаких немедленных побочных реакций (например, анафилаксия, аллергические реакции).

Два патогистологических препарата были получены спустя семь месяцев (кишечно-кожный свищ) и один год (прямокишечно-влагалищный свищ) после операции. На полной серии патогистологических срезов не было обнаружено никакой цитологической трансформации.

Обсуждение

В предшествующем докладе мы описали успешное лечение терапией на основе клеток молодой женщины с рецидивирующим прямокишечно-влагалищным свищом, который не поддавался медицинскому лечению. Таким образом, мы разработали настоящую I фазу клинического испытания для определения возможности осуществления и сохранности при трансплантации аутологичных стромальных стволовых клеток (с улучшениями в исходном протоколе) для лечения неподдающихся лечению свищей Крона, а также проверить применение стромальных стволовых клеток жировой ткани в сочетании с фибриновым клеем.

В качестве источника стволовых клеток мы выбрали жировую ткань из-за ее способности вступать в миогенную дифференцировку и того факта, что свищи хорошо отвечают на мышечные трансплантаты. Более того, липосакционный жир доступен в большом количестве и может быть извлечен с минимальными побочными эффектами для пациента. Другие группы использовали стромальные стволовые клетки из костного мозга, но в подобных случаях требуется процедура иммобилизации клеток, которая может быть опасна для некоторых пациентов, например пациентов с инфарктом миокарда. В нашем исследовании все процедуры липосакции завершались клинически значимыми количествами клеток с характеристиками стволовых клеток.

Мы наблюдали наших пациентов в соответствие с запланированным расписанием, и мы наблюдали полное заживление у 6 из 8 вмешательств. Важно отметить, что болезнь Крона представляет наихудшие условия для оперативного вмешательства по поводу свищей в силу хрупкости ткани и множества проблем, связанных с заживлением у данных пациентов. Наши пациенты были отобраны в результате отсутствия реакции на медицинское лечение и по меньшей мере двух предшествующих оперативных вмешательств, но наше лечение выглядит вполне эффективным. Более того, новые обострения болезни Крона все еще могут привести к новым свищам у любого пациента, которому потребуется очередное лечение, используя криоконсервированные аутологичные клетки от данного пациента.

Биологический механизм, которые лежит в основе терапевтического успеха трансплантации ADSC, еще неизвестен. Может быть стволовые клетки дифференцируются в соединительную, мышечную или рубцовую ткани. В качестве альтернативы, секреция факторов роста этими самыми клетками может способствовать заживлению раны. Мы видели обычную рубцовую ткань при патогистологическом исследовании одного свища, но мы не обладаем способами определения трансплантированных клеток соединительной ткани от местных. Мы наблюдали полное заживление в 75% случаев, используя наше лечение.

Ссылки

Практическое исполнение настоящего изобретения задействует, если не указано другое, общепринятые методики клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, биологии трансгенов, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые принадлежат компетенции квалифицированных сотрудников в данной области (см., например, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2^nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N.Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent № 4683195; Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells (R.I.Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al eds.), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IY (D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)).

Все публикации и патенты, упоминаемые здесь, включая статьи, перечисленные ниже, приведены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме как если бы каждая индивидуальная публикация или патент были бы индивидуально отмечены тем, что приведены в качестве ссылки. В случае конфликта, настоящая заявка, включая любые определения внутри, будет осуществлять контроль.

1. American Gastroenterological Association Medical Position Statement: Perianal Crohn's Disease. Gastroenterology (2003) 125:1503-1507.

2. Levy С., Tremaine W.J. Inflamm. Bowel. Dis. (2002) 8(2): 106-11.

3. Pennincke F., D'Hoore A., Filez L. Acta Gastroenterol. Belg (2001) 64(2):223-226.

4. Rius J., Nessim A., Nogueras J.J., Wexner S.D. Eur J Surg. (2000) 166(3):218-222.

5. Mizuno H., Zuk P.A., Zhu M., Lorenz H.P., Benhaim P., Hedrick M.H. Plastic Reconstr Surg (2002) 109(1): 199-209.

6. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Tissue Eng (2001) 7(2): 211-228.

7. Garcia-Olmo D., Garcia-Arranz M., Gomez-Garcia L. et al. Int J Colorectal Dis (2003)18: 451-454.

8. Abkowitz J.L. New Engl J Med (2002) 346(10): 770-772.

9. Matsubara H. Lancet (2004) 363: 746-747.

10. Cowan C.M., Shi Y.Y., Aalami O.O. et al. Nat Biotechnol. (2004) 22(5): 560-7.

11. Garcia-Olmo D., Garcia-Olmo M.A. New Eng J Med (2003) 349: 1480-1481.

12. Osawa M., Hanada K., Hanada H. and Nakauchi H. (1996) Science 273, 242-245.

13. Morrison S.J., Uchida N. and Weissman I.L. (1995) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 35-71.

14. Ivanova N.B., Dimos J.T., Schaniel C., Hackney J.A., Moore K.A., Lemischka* I.R. (2002) Science 298, 601-604.

15. Phillips R.L. (2000) Curr Top Microbiol Immunol. 251, 13-19.

16. Ramalho-Santos M., Yoon S., Matsuzaki Y., Mulligan R.C., Melton D.A. (2002) Science 298, 597-600.

17. De Ugarte D.A., Morizono K., Elbarbary, AAlfonso Z., Zuk P.A., Zhu M., Dragoo J.L., Ashjian P., Thomas B., Benhaim P., Chen I., Fraser J., Hedrick M.H. (2003) Cells Tissues Organs 174(3), 101-109.

18. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Exp Hematol. (1976) Sep; 4(5): 267-74.

19. Caplan A.I. J Orthop Res. (1991) Sep; 9(5): 641-50.

20. Pittenger M.F. et al. (1999) Science 284: 143-147.

21. Beresford J.N., Bennett J.H., Devlin C., Leboy P.S., Owen M.E. J Cell Sci. (1992) Jun; 102(Pt2): 341-51.

22. Yoo J.U., Johnstone B. Clin Orthop. (1998) Oct; (355 Suppl): S73-81.

23. Wakitani S. et al. (1995) Muscle Nerve 18: 1417-1426.

24. Haynesworth S.E., Goshima J., Goldberg V.M., Caplan A.I. Bone. 1992; 13(1): 81-8.

25. Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F., Hazzi C., Stedeford T., Willing A., Freeman Т.В., Saporta S., Janssen W., Patel N., Cooper D.R., Sanberg P.R. Exp. Neurol. (2000) Aug; 164(2): 247-56.

26. Rogers J.J., Young H.E., Adkison L.R., Lucas P.A., Black A.C. Jr, Am Surg. (1995) Mar; 61(3): 231-6.

27. Jiang Y., Vaessen B., Lenvik T., Blackstad M., Reyes M., Verfaillie C.M. Exp Hematol. (2002) Aug; 30(8): 896-904.

28. Caplan A.L., Bruder S.P. Trends Mol Med. (2001) Jun; 7(6): 259-64.

29. Stanford C.M. et al. (1995) J Biol Chem 270: 9420-9428.

Эквиваленты

Настоящее изобретение представляет, среди прочих вещей, способы и композиции для лечения и предотвращения свищей. В то время как конкретные варианты осуществления цели изобретения были обсуждены, вышеперечисленные спецификации имеют иллюстративную, но не ограничивающую задачу. Многие вариации изобретения станут очевидны тем, кто квалифицирован в данной области техники, после обзора данных спецификаций. Прилагаемая формула изобретения не намерена заявлять обо всех таких вариантах воплощения и вариациях, и полный масштаб изобретения должен быть определен в качестве ссылки на формулу изобретения, параллельно с полным масштабом их эквивалентов, и спецификации вместе с такими вариациями.