способ определения содержания этилового спирта и других метаболитов в крови человека

Формула изобретения

Способ определения содержания этилового спирта и других метаболитов в крови человека методом газожидкостной хроматографии, включающий получение дистиллятов крови методом прямой перегонки с водяным паром и исследование компонентов крови, отличающийся тем, что проводят количественное определение этилового спирта, диэтилового эфира, ацетальдегида, ацетона, метилацетата, этилацетата, пропилового спирта, изобутилового спирта, бутилового спирта, изоамилового спирта в ходе одного исследования с использованием капиллярной хроматографической колонки, расчет концентрации определяемых компонентов крови производят по формуле:



где а - результат хроматографического исследования, мг/дм³;

V - объем дистиллята, см³ ;

m - масса навески цельной крови, г.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике при изучении метаболических нарушений у человека, вызванных отравлением алкоголем, и в судебной медицинской деятельности для диагностирования степени опьянения живых лиц.

Общепринятым способом определения этилового спирта в крови человека является метод цветных реакций. Наибольшее распространение в 60-е годы получил так называемый «нитритный» метод и способ Видмарка. «Нитритный» метод очень трудоемок, требует быстрой обработки исследуемого материала двойной перегонкой с водяным паром, большого количества исследуемого материала (около 200-300 г). Кроме того, метод недостаточно специфичен. Способ Видмарка применяется с целью определения степени опьянения живых лиц. Метод также достаточно трудоемок, необходимо исследование 3-4 навесок исследуемого материала и параллельное проведение 3-4 холостых опытов, что указывает на плохую воспроизводимость метода.

Известен способ количественного определения содержания этилового алкоголя в крови и моче человека методом газожидкостной хроматографии [Методическое письмо от 22 апреля 1968 г. № 10-95/14-32]. Сущность метода заключается в превращении спиртов в алкилнитриты, которые затем подвергаются хроматографическому разделению. В основе детектирования лежит измерение различий в теплопроводности чистого газа-носителя, поступающего в сравнительную камеру детектора по теплопроводности - катарометра, и смеси анализируемого вещества с газом-носителем, выходящей из хроматографической колонки в измерительную камеру детектора. Для проведения исследования применяется хроматограф лабораторный ХЛ-4.

Концентрацию этилового спирта определяют путем вычисления отношения высот пиков этилнитрита и изопропилнитрита (пропилнитрита) с последующей интерполяцией из калибровочного графика. Калибровочные графики строят, используя стандартные растворы этилового спирта в крови и моче.

Существенным недостатком способа является отсутствие возможности количественного определения этилового спирта при одновременном присутствии в исследуемом материале этилового, пропилового и изопропилового алкоголя. Кроме того, описанный выше способ не позволяет одновременно определять в крови этиловый спирт, диэтиловый эфир, ацетальдегид, ацетон, метилацетат, этилацетат, пропиловый спирт, изобутиловый спирт, бутиловый спирт, изоамиловый спирт и другие метаболиты.

Задачей изобретения является разработка способа одновременного количественного определения в крови человека этилового спирта, диэтилового эфира, ацетальдегида, ацетона, метилацетата, этилацетата, пропилового спирта, изобутилового спирта, бутилового спирта, изоамилового спирта и других метаболитов методом газожидкостной хроматографии.

Поставленная задача решается тем, что в способе определения содержания этилового спирта и других метаболитов в крови человека методом газожидкостной хроматографии, включающем исследование компонентов крови, одновременно проводят количественное определение этилового спирта, диэтилового эфира, ацетальдегида, ацетона, метилацетата, этилацетата, пропилового спирта, изобутилового спирта, бутилового спирта, изоамилового спирта и других метаболитов в дистиллятах крови с использованием капиллярной хроматографической колонки, рассчитываем концентрацию компонентов крови по формуле:

где а - результат хроматографического исследования, мг/дм³;

V - объем дистиллята, см ³;

m - масса навески цельной крови, г.

На фиг.1 представлена хроматограмма дистиллята цельной крови человека, на фиг.2 - хроматограмма модельной смеси.

Сущность метода заключается в получении дистиллятов крови методом прямой перегонки с водяным паром, которые затем подвергаются хроматографическому разделению. Разделенные на хроматографической колонке компоненты смеси поочередно поступают в пламенно-ионизационный детектор, сигналы которого регистрируются в виде ряда хроматографических пиков. В основе детектирования лежит измерение различий электропроводности пламени чистого газа-носителя, поступающего в сравнительную камеру детектора, и смеси анализируемого вещества с газом-носителем, поступающей из хроматографической колонки в измерительную камеру детектора. Для проведения исследования применяют газовый хроматограф фирмы «Хьюлетт Паккард» (США), модель 5890, серия 2, с пламенно-ионизационным детектором и системой электронного регулирования потока газа-носителя, колонку хроматографическую капиллярную «HP-FFAP» (США) 50 м × 0,32 мм × 0,52 мкм, внутренний стандарт - 1,2-пропиленгликоль, газ-носитель - азот, температурная программа термостата колонки: начальная температура - 50 градусов Цельсия, 10 мин в изотерме, далее программирование температуры со скоростью 15 градусов в минуту до 220 градусов Цельсия, 10 мин в изотерме, температура инжектора - 150 градусов Цельсия, температура детектора - 230 градусов Цельсия, деление потока - 1:40.

Количественное определение этилового спирта и других метаболитов проводят следующим образом. Взвешивают от 10 до 50 г цельной крови в перегонную колбу вместимостью 500 см³, затем добавляют 50 см³ дистиллированной воды. Смесь перемешивают. Колбу со смесью присоединяют к дефлегматору с каплеуловителем и холодильником с прямой трубкой. При осторожном нагревании (бурное вспенивание) смесь подвергают прямой дистилляции и собирают точно 25 см³ дистиллята в мерную колбу вместимостью 25 см³. Приемную колбу необходимо дополнительно охлаждать. В 25 см³ полученного дистиллята вносят 2 мм³ внутреннего стандарта. Смесь тщательно перемешивают и подвергают хроматографическому исследованию. Капиллярная хроматографическая колонка позволяет надежно разделить компоненты дистиллята крови и одновременно определить этиловый спирт, диэтиловый эфир, ацетальдегид, ацетон, метилацетат, этилацетат, пропиловый спирт, изобутиловый спирт, бутиловый спирт, изоамиловый спирт и другие метаболиты.

Хроматограф предварительно калибруют по этиловому спирту и другим метаболитам, а также пропиленгликолю, используя не менее трех калибровочных смесей. Значения времени удерживания, калибровочных коэффициентов и концентрации внутреннего стандарта заносят в память компьютера. Расчетная концентрация внутреннего стандарта 83,2 мг/дм³.

Исследования выполнялись на цельной крови человека (девять здоровых мужчин в возрасте от 25 до 39 лет).

Результаты исследований представлены в таблице.

Таблица
Содержание эндогенных этилового спирта и ацетальдегида в крови человека
№ п/п	Содержание этилового спирта, 10-3%	Содержание ацетальдегида, 10-3%
1	0,11	0,02
2	0,19	0,04
3	0,25	0,05
4	0,16	0,02
5	0,95	0,10
6	0,20	0,05
7	0,32	0,07
8	0,25	0,04
9	107,85	0,17

Полученные данные о содержании эндогенного этилового спирта в крови человека соответствуют литературным, согласно которым в норме, без введения извне, в крови человека может содержаться до 0,004% алкоголя. Кроме того, предлагаемый способ позволяет надежно диагностировать степень опьянения живых лиц (таблица, результат № 9). Согласно литературным данным концентрация алкоголя от 0,02 до 0,20% вызывает в зависимости от индивидуальной чувствительности, состояния и типа нервной деятельности опьянение различной степени.

Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что предлагаемый способ определения содержания этилового спирта и других метаболитов в крови человека позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты.