улучшенные способы получения птичьих яиц и птицы, свободных от специфических микроорганизмов

Формула изобретения

1. Способ увеличения выводимости и жизнеспособности яиц, свободных от микроорганизмов, полученных от птицы-родителя, который осуществляют в стерильной среде перед удалением незрелого яйца в скорлупе из птицы-родителя, и который включает следующие этапы:

a) содержание птицы как птицы-родителя;

b) определение времени извлечения незрелого яйца из птицы-родителя путем:

i. определения положения незрелого яйца в репродуктивных органах птицы-родителя до перехода незрелого яйца в клоаку птицы-родителя; и

ii.установление необходимого уровня формирования и кальцификации скорлупы яйца определением этапа развития незрелого яйца, исходя из показателей формирования и кальцификации скорлупы.

2. Способ по п.1, где этап (b) осуществляют с использованием комбинации наблюдения и/или физических методов, таких как пальпация брюшной и тазовой области, ультразвук, сканирование рентгеном и/или ЯМР-интроскопия.

3. Способ по п.1, где способ включает определение месторасположения незрелого яйца перед нижним отверстием таза птицы-родителя перед удалением незрелого яйца из птицы-родителя.

4. Способ по п.1, включающий определение, находится ли незрелое яйцо, по существу, на полпути между каудальной частью грудины и седалищным бугром птицы-родителя.

5. Способ по п.1, дополнительно включающий следующие этапы: удаление незрелого яйца в скорлупе из птицы-родителя при достижении необходимого уровня формирования и кальцификации скорлупы яйца перед переходом незрелого яйца в клоаку птицы-родителя; и инкубацию незрелого яйца в скорлупе и выведение цыпленка из незрелого яйца с получением птицы-несушки со статусом свободной от микроорганизмов.

6. Способ по п.1, дополнительно включающий этап удаления микроорганизмов, инфицирующих незрелое яйцо во время его нахождения в репродуктивных органах, включая трансовариальный путь.

7. Способ по п.1, включающий следующие этапы:

i. определение конкретных микроорганизмов, инфицирующих незрелое яйцо во время его нахождения в репродуктивных органах;

ii. выбор подходящего антимикробного препарата для борьбы с конкретными микроорганизмами, такого как флюороквиналон, цефалоспорин и макролид; и

iii. введение антимикробного препарата птице-родителю и/или в незрелое яйцо in ova.

8. Способ по п.5, где птицу-родителя умерщвляют, подвергают эвтаназии или анестезии и извлекают незрелое яйцо менее чем через около 30 мин с момента умерщвления, эвтаназии или анестезии птицы-родителя.

9. Способ по п.1, где птицу-родителя выбирают из стаи аналогичных птиц, разводимых в одинаковых условиях, или птица-родитель выведена естественным способом в стерильной среде из стаи птиц, аналогичным образом существующих в незараженной среде, или птица-родитель представляет собой одну из птиц стаи, которые имеют статус незараженной другими инфекциями, полученных подходящей селекцией и размноженных естественным путем в контролируемых условиях, и способ применяют для получения птиц, имеющих статус незараженных различными инфекциями.

10. Способ по п.1, где птица-несушка является частью стаи, и после выведения птиц-несушек берут образец из птиц-несушек и проводят тестирование на специфическое заражение для того, чтобы обеспечить стае статус незараженной.

11. Способ по п.5, где при отсутствии достижения птицей-несушкой статуса свободной от заражения специфическими инфекциями птицу-несушку используют в способе в качестве птицы-родителя.

12. Способ по п.1, где птица, выведенная от птицы-несушки, незараженной специфическими инфекциями, не является птицей-несушкой, и полученная таким образом птица выводится в стерильной среде для последующего оплодотворения птиц-несушек с аналогичным или более низким статусом незараженности.

13. Способ получения яйца со статусом свободного от микроорганизмов в стерильной среде, включающий:

i. содержание птицы-несушки с аналогичным или лучшим статусом свободной от микроорганизмов, полученной способом по п.1;

ii. использование птицы-несушки для откладки яиц; и

iii. перемещение яйца в другую стерильную среду немедленно после того, как откладываемое яйцо при необходимости стерилизуют.

14. Применение яиц, полученных способом по п.13, для получения терапевтических и профилактических биологических субстанций, таких как вакцины, антитела, моноклональные антитела, фибробласты, белки и/или антигены для серологического тестирования.

15. Применение по п.14, где яйцо продуцирует экзогенный белок.

16. Биологические продукты, включая вакцину, предпочтительно вакцину против вируса гриппа, антитело, моноклональное антитело, фибробласт, белок и/или антиген для серологического тестирования, для использования в терапевтических и профилактических способах, полученные с использованием яиц, которые получены способами по п.5.

17. Способ получения полустерильных яиц для восстановления стай птиц способом по п.5, где птицу-родителя получают из восстановленной стаи, полученную от нее птицу-несушку тестируют для получения показателя свободной от микроорганизмов, и при подтверждении отсутствия заражения птицу-несушку используют для получения потомства для создания стаи незараженных птиц соответствующего статуса свободных от микроорганизмов.

Описание изобретения к патенту

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к улучшенному способу разведения птицы со статусом свободной от специфических микроорганизмов. В частности, настоящее изобретение относится к способу увеличения выводимости и жизнеспособности яиц, извлеченных стерильным способом из брюшной полости птицы-родителя, и яйцо является свободным от микроорганизмов, настоящее изобретение дополнительно относится к получению птичьих яиц со статусом свободных от специфических микроорганизмов.

Используемые в настоящем описании термины «незараженный инфекциями» и «свободный от микроорганизмов» взаимозаменяемы. Эти термины используются здесь в очень широком значении и относятся к большинству патогенов и инфекций, которые могут переноситься птицами, в частности домашней птицей, такой как куры, индейки и другие виды птиц, широко используемых для получения стай птиц для размножения с получением оплодотворенных яиц для коммерческого производства и получения яиц и мяса для потребления человеком. Кроме того, такие яйца и птицы используются при получении широкого ряда биологических субстанций, включая вакцины, антитела, моноклональные антитела, фибробласты и белки, как для терапевтического, так и для профилактического применения у людей и животных. Кроме того, они интенсивно используются для диагностических тестов и получения трансгенных яиц и птиц. Для многих из таких применений требуются яйца и/или птицы, полученные из них, незараженные всеми или определенными контаминантами, такими как инфекции, включая различные виды паразитов, бактерий, микоплазм, вирусов, ретровирусов, прионов, фрагментов ДНК и РНК. Иногда вирусы могут представлять собой малые вирусы, включая пикорнавирусы и парвовирусы. Некоторые бактерии, которыми часто заражены яйца, включают Clostridia and Enterobacteria. Существует множество непатогенных организмов, которые необходимо контролировать. Аналогично, многие из микроорганизмов, включающие паразитов, аэробные и анаэробные бактерии, виды симбионтов и виды, связанные с кишечником и клоакой, являются нежелательными. Аналогично, также нежелательными являются микоплазмы, вирусы, включая ретровирусы, прионы, грибки, дрожжи и плесени.

Следовательно, термин «незараженный специфическими инфекциями» или «свободный от микроорганизмов» может включать некоторые из них или их все и используется здесь в значительно более широком смысле, чем только незараженный специфическими патогенами. Например, незараженный традиционными специфическими патогенами (SPF) не означает незараженный некоторыми вирусами, и на самом деле может быть заражен бактериями и вирусами. Для определенного применения это может быть достаточным. Цель последующего применения яиц и птицы будет определять, от каких патогенов они должны быть свободны. Яйца, незараженные обычными микроорганизмами, и яйца, незараженные некоторыми специфическими патогенами, получают обработкой химикатами свежих отложенных естественным путем яиц, включая дезинфицирующие средства и антибиотики, и помещением яиц в изоляторы. Такие отложенные естественным путем яйца получают от подобранной стаи птиц-родителей. В то время как эти способы относительно успешны при получении яиц, незараженных специфическими патогенами, в отношении получения незараженных яиц они, по существу, не успешны. Однако химикаты не способны бороться с заражением, например, бактериями, проникающими через поры скорлупы яйца непосредственно перед и/или сразу же после откладывания яйца и перед дезинфекцией. Заражение яиц, незараженных специфическими патогенами, незараженных обычными микроорганизмами или стерильных ведет в результате к несоответствию требованиям и во многих случаях к потере коммерческой ценности и пригодности.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В европейском патенте № 0295964 описывается технология культивирования in vitro птичьего эмбриона, довольно подробно описывается развитие эмбриона из яйца. Описывается инкубация эмбриона в закрытом контейнере после извлечения эмбриона из скорлупы. На самом деле в этом описании используемым контейнером является предпочтительно часть скорлупы яйца, выбранного от того же вида, что и культивируемый, или в рамках данного изобретения от аналогичных кур. Это изобретение относится к генной инженерии птиц, но также исследует фундаментальный механизм развития птиц. Аналогично в европейском патенте № 0511431 описывается способ культивирования in vitro оплодотворенной яйцеклетки курицы, где эмбрион, который был только что оплодотворен, изымают из верхней расширенной части яйцевода курицы в течение часа или около того после откладки яйца и затем проводят последующее культивирование. Однако оба этих изобретения связаны с искусственным культивированием яиц и не решают задач настоящего изобретения.

В европейском патенте № 01650109 описывается способ разведения птицы со статусом незараженной специфическими инфекциями. Основной описанный способ включает содержание птицы, такой как несушка, стерильное извлечение яйца из несушки до перехода яйца в клоаку птицы, инкубацию яйца и выведение птенца с получением курицы-несушки. Изобретение также относится к получению птичьих яиц со статусом незараженных специфическими инфекциями.

Однако продолжает существовать необходимость в улучшении такого способа. Желательно увеличить показатели выводимости и снизить смертность цыплят. С коммерческой точки зрения очень желательно получить оба надежных результата и результаты, включающие высокую выводимость (идеально подходящие коммерческие показатели>85%, но достаточно стабильно>50%). По существу, это очень важно при работе с малыми, редкими и особо ценными популяциями, такими как, например, трансгенные птицы.

В противоположность предшествующему уровню техники настоящее изобретение относится к улучшенным способам получения яиц, незараженных микроорганизмами с высокой выводимостью. Следовательно, настоящее изобретение относится к усовершенствованному и улучшенному способу по сравнению с заявленным в европейской патентной заявке № 01650109.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к улучшенному способу выведения птицы со статусом свободной от специфических микроорганизмов. В частности, настоящее изобретение относится к применению специальных технологий, гарантирующих, что незрелые яйца, извлекаемые в скорлупе перед входом в клоаку, остаются стерильными по настоящему изобретению.

Согласно основному варианту воплощения настоящее изобретение относится к способу определения момента извлечения незрелого яйца в скорлупе из птицы-несушки.

Первый аспект настоящего изобретения относится к способу увеличения выводимости и жизнеспособности яиц, свободных от микроорганизмов, полученных от птицы-родителя, который осуществляют в стерильной среде перед удалением незрелого яйца в скорлупе из птицы-родителя и который включает следующие этапы:

a) содержание птицы как птицы-родителя;

b) определение времени извлечения незрелого яйца из птицы-родителя путем:

i. определения положения незрелого яйца в репродуктивных органах птицы-родителя до перехода незрелого яйца в клоаку птицы-родителя; и

ii. установление необходимого уровня формирования и кальцификации скорлупы яйца определением этапа развития незрелого яйца, исходя из показателей формирования и кальцификации скорлупы.

Причем этап (b) способа осуществляют с использованием комбинации наблюдения и/или физических методов, таких как пальпация брюшной и тазовой области, ультразвук, сканирование рентгеном и/или ЯМР-интроскопия. Кроме того, способ включает определение месторасположения незрелого яйца перед нижним отверстием таза птицы-родителя перед удалением незрелого яйца из птицы-родителя, и определение, находится ли незрелое яйцо, по существу, на полпути между каудальной частью грудины и седалищным бугром птицы-родителя.

Способ согласно изобретению может дополнительно включать следующие этапы:

удаление незрелого яйца в скорлупе из птицы-родителя при достижении необходимого уровня формирования и кальцификации скорлупы яйца перед переходом незрелого яйца в клоаку птицы-родителя; и

инкубацию незрелого яйца в скорлупе и выведение цыпленка из незрелого яйца с получением птицы-несушки со статусом свободной от микроорганизмов.

Дополнительно способ включает этап удаления микроорганизмов, инфицирующих незрелое яйцо во время его нахождения в репродуктивных органах, включая трансовариальный путь.

Согласно другому варианту способ также включает следующие этапы:

i. определение конкретных микроорганизмов, инфицирующих незрелое яйцо во время его нахождения в репродуктивных органах;

ii. выбор подходящего антимикробного препарата для борьбы с конкретными микроорганизмами, такого как флюороквиналон, цефалоспорин и макролид; и

iii. введение антимикробного препарата птице-родителю и/или в незрелое яйцо in ova.

При этом птицу-родителя умерщвляют, подвергают эвтаназии или анестезии и извлекают незрелое яйцо менее чем через около 30 минут с момента умерщвления, эвтаназии или анестезии птицы-родителя. Причем птицу-родителя выбирают из стаи аналогичных птиц, разводимых в одинаковых условиях, или птица-родитель выведена естественным способом в стерильной среде из стаи птиц, аналогичным образом существующих в незараженной среде, или птица-родитель представляет собой одну из птиц стаи, которые имеют статус незараженной другими инфекциями, полученных подходящей селекцией и размноженных естественным путем в контролируемых условиях, и способ применяют для получения птиц, имеющих статус незараженных различными инфекциями.

В способе согласно изобретению птица-несушка является частью стаи, и после выведения птиц-несушек берут образец из птиц-несушек и проводят тестирование на специфическое заражение, для того чтобы обеспечить стае статус незараженной. При отсутствии достижения птицей-несушкой статуса свободной от заражения специфическими инфекциями, птицу-несушку используют в способе в качестве птицы-родителя. Предпочтительно птица, выведенная от птицы-несушки, незараженной специфическими инфекциями, не является птицей-несушкой, и полученная таким образом птица выводится в стерильной среде для последующего оплодотворения птиц-несушек с аналогичным или более низким статусом незараженности.

В еще одном варианте способ получения яйца со статусом свободного от микроорганизмов в стерильной среде включает:

i. содержание птицы-несушки с аналогичным или лучшим статусом свободной от микроорганизмов, полученной способом по п.1;

ii. использование птицы-несушки для откладки яиц; и

iii. перемещение яйца в другую стерильную среду, немедленно после того, как откладываемое яйцо, при необходимости, стерилизуют.

Полученные вышеуказанным способом яйца применяют для получения терапевтических и профилактических биологических субстанций, таких как вакцины, антитела, моноклональные антитела, фибробласты, белки и/или антигены для серологического тестирования. Причем яйцо продуцирует экзогенный белок.

Биологические продукты, включая вакцину, предпочтительно вакцину против вируса гриппа, антитело, моноклональное антитело, фибробласт, белок и/или антиген для серологического тестирования, используют в терапевтических и профилактических способах, полученные с использованием яиц, которые получены вышеописанными способами.

Кроме того, предложен способ получения полустерильных яиц для восстановления стай птиц указанным выше способом, где птицу-родителя получают из восстановленной стаи, полученную от нее птицу-несушку тестируют для получения показателя свободной от микроорганизмов, и при подтверждении отсутствия заражения птицу-несушку используют для получения потомства для создания стаи незараженных птиц соответствующего статуса свободных от микроорганизмов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Клоака является главным местом заражения птицы. Клоака представляет собой камеру, связанную и с пищеварительной и с репродуктивной системами птицы, следовательно, яйцо и фекалии могут присутствовать в клоаке одновременно. Как правило, яйцо перед выходом в клоаку свободно от заражения инфекцией. Однако, поскольку скорлупа яйца пористая, то в течение короткого периода времени, когда яйцо входит в клоаку, основной проблемой становится внешнее заражение. Следовательно, настоящее изобретение направлено на извлечение незрелого яйца из птицы-родителя, требующее специального способа, поддерживающего его стерильность и статус незараженного микроорганизмами.

В частности, настоящее изобретение направлено на улучшение и повышение качества способа определения момента извлечения незрелого яйца в скорлупе из птицы-родителя. Следовательно, настоящее изобретение относится к способу увеличения выводимости и жизнеспособности яиц, незараженных микроорганизмами, при получении из птицы-родителя. Любое увеличение выводимости и/или жизнеспособности яиц со статусом незараженных микроорганизмами имеет большое коммерческое значение, даже если процент увеличения относительно скромный.

Также настоящее изобретение направлено на удаление микроорганизмов, бактерий, микоплазм, вирусов, ретровирусов, прионов, паразитов, способных инфицировать яйцо, в то время, когда оно находится в репродуктивных органах и перед выходом яйца в клоаку, что является очень важным при получении яйца, незараженного микроорганизмами.

В частности, настоящее изобретение направлено на точное определение положения и этапа развития незрелого яйца в репродуктивных органах перед завершением развития в птице-родителе и перед извлечением из птицы-родителя. Это гарантирует, что незрелое яйцо, извлеченное из птицы-родителя в правильное время, гарантирует жизнеспособность яйца и получение птицы-несушки. Если незрелое яйцо извлечено слишком рано, оно может иметь мягкую, некальцифицированную скорлупу, требующую специальных условий культивирования и также в результате может привести к нежизнеспособности яйца. Извлечение незрелого яйца из репродуктивных органов до входа в клоаку предотвращает заражение яйца и птицы, полученной из него. Настоящее изобретение относится к специальным способам установления момента извлечения яйца из птицы-родителя и гарантирует, что незрелое яйцо извлечено из птицы-родителя в правильное время в соответствии с формированием и кальцифицированием скорлупы, что в результате ведет к жизнеспособности яйца и птицы-несушки.

Как правило, перед извлечением яйца записывают модель откладки яйца птицей-родителем по времени для получения расчетного времени перехода яйца в дистальную часть репродуктивных органов и клоаку. На этом этапе яйцо и его скорлупа предпочтительно полностью сформировались. Это обеспечивает стерильное удаление яйца из брюшной полости, которое может быть осуществлено максимально близко, как только возможно, к расчетному времени перехода.

В идеале скорлупа яйца должна кальцифицироваться до поздней стадии, которая может быть определена с использованием диагностических методов, таких как радиография, или даже путем мягкого надавливания пальцами - пальпации и наблюдения формоизменения скорлупы. Частично кальцифицированная скорлупа и, в частности, скорлупа с низким уровнем кальцификации, как правило, мягкая и хрупкая, следовательно, уровень выводимости из таких яиц - низкий. Настоящее изобретение направлено на извлечение незрелых яиц на этом этапе с получением оптимальной выводимости и жизнеспособности полученных в результате яиц и птиц.

В одном варианте воплощения настоящее изобретение относится к способу определения этапа развития, в частности расположения и состояния скорлупы в репродуктивных органах до извлечения яйца из птицы-родителя, включающему непрерывное наблюдение или цейтраферную видеосъемку с собственной частотой (например, ежедневно) и определение времени откладки как при нормальном, так и при модифицированном цикле откладки применительно к видам и отдельным птицам. Наблюдение за тем, когда и как долго каждое яйцо остается в различных частях репродуктивных органов, включая матку, относительно времени овуляции и откладки яйца. Корреляция этих серий наблюдений способна прогнозировать не только, например, когда следующее яйцо появится в матке, но и также этап развития, например степень формирования и кальцификации яичной скорлупы.

Настоящий способ может быть любым образом доработан для определенных широко распространенных видов (например, кур) определением физического расположения яйца в брюшной полости. Этот подход в частности применим при обычном использовании после установления необходимой корреляции между наблюдениями при пальпации, этапом развития яйца и положением в репродуктивных органах.

Подтверждение расположения яйца в репродуктивных органах и наличия скорлупы физическими способами включает пальпацию брюшной полости и пальпацию тазовой области, технологии визуализации, такие как ультразвук, рентген или ЯМР-интроскопию и/или непосредственное наблюдение под общей анестезией, и также может быть использовано хирургическое или паталого-анатомическое исследование как таковые или в комбинации с технологиями наблюдения.

Технологии визуализации, как правило, требуют общей анестезии обследуемой птицы с использованием, например, галотана или кислорода. Ветеринарное устройство, используемое для визуализации кошек и собак, часто подходит для птиц после системных регулировок для установки экспозиции. Применение ультразвука возможно только у птиц с небольшим количеством или с отсутствием оперения в брюшной области.

Пальпация, как правило, может быть применена при удержании птицы в положении близком к нормальному положению стоя. Пальпацию брюшной полости проводят между большим пальцем и другими пальцами оператора. Ее следует проводить осторожно во избежание нанесения повреждений как птице, так и яйцам, находящимся в брюшной полости.

Не следует удалять яйца из птицы до кальцифицирования скорлупы при последующей инкубации и выведении в традиционных условиях. Яйца с более высокой степенью незрелости, такие как яйца с мягкой некальцифицированной скорлупой или на еще более раннем периоде требуют специальных условий культивирования и/или являются реципиентами яичной скорлупы. Если присутствует фактор неопределенности в отношении конкретной птицы и яйца, то извлечение яйца следует отложить до тех пор, пока наблюдаемое яйцо будет отложено. Следующее за ним яйцо может быть извлечено.

Эти технологии включают субъективную оценку специалиста, проводящего процедуру. Пальпацией определяют, является ли яйцо мягким и не кальцифицированным или нет. Эти технологии могут быть скомбинированы с технологиями определения положения яйца в брюшной полости. Яйцо должно быть расположено перед нижним отверстием таза. Предпочтительно яйцо, по существу, должно находиться на полпути между каудальной частью грудины и седалищным бугром. У разных птиц это расстояние варьирует. Предпочтительно пальпацию применяют в комбинации с рентгеном, ЯМР-интроскопией или технологией ультразвуковой визуализации.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения способ включает комбинирование наблюдений и/или физических методов. В идеале указанные физические методы включают пальпацию брюшной и тазовой областей, ультразвук, сканирование рентгеном и/или ЯМР-интроскопию. В идеале, методы наблюдения включают этапы мониторинга и записи типового варианта откладки яйца птицей-родителем с получением расчетного времени перехода. Выбор наиболее подходящего способа зависит от навыка в пальпации специалиста, а также других факторов, таких как размер птицы. Дополнительная точность может быть достигнута точным наблюдением за отдельной птицей для определения времени в течение дня, когда птица, как правило, откладывает яйцо; целью является извлечение яйца максимально близко к моменту его откладки.

В другом варианте воплощения настоящее изобретение относится к способу профилактики инфицирования незрелого яйца микроорганизмами, инфицирующими яйцо во время его нахождения в репродуктивных органах (включая яичники), но перед выходом яйца в клоаку. Это инфицирование может происходить через яичники. Может быть проведена как профилактика проникновения микроорганизмов в развивающееся яйцо, так и удаление микроорганизмов из неотложенного яйца введением как птице-родителю, так и/или в яйцо антимикробных препаратов против конкретных микроорганизмов. Такой вариант воплощения настоящего изобретения относится к способу удаления заражения из неотложенного незрелого яйца выбором антимикробных препаратов, обладающих активностью против конкретных микроорганизмов in ova или иным введением птице-родителю или в неотложенное яйцо.

Выбор правильного антимикробного препарата и его дозы, режима и пути введения основывается на in ova концентрациях и времени получения in ova специфичности к конкретному этапу развития яйца. Эти схемы приема и пути введения могут сильно отличаться от применяемого рутинного лечения общих заболеваний.

Способ, как правило, включает идентификацию целевого микроорганизма с использованием стандартного лабораторного метода идентификации микроорганизмов и последующий выбор подходящих антимикробных препаратов для уничтожения микроорганизмов.

Выбор антимикробного препарата, схемы приема и пути введения могут быть определены по результатам стандартной in vitro чувствительности, что часто используется в обычных клинических микробиологических лабораториях, работающих по национальным и международным стандартам, таким как, CLS. Для достижения оптимальных результатов используют определение in ova концентраций антимикробных препаратов и времени по отношению ко времени дозирования и конкретному этапу развития яйца. In ova концентрации конкретных антимикробных препаратов требуют фармакокинетических данных по концентрациям для яиц, определяемых в серийных образцах яиц на различных этапах развития. Это может быть определено введением известных доз антимикробного препарата курам-несушкам, которых затем подвергают эвтаназии в подходящие последовательные моменты времени (в зависимости от введения антимикробного препарата, например, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 20 и 24 часа после введения), и собирают соответствующие образцы яиц после смерти. Концентрации антимикробного препарата в яйцах могут быть определены с использованием традиционных методов, адаптированных и специально утвержденных для использования с материалами яйца.

Для уменьшения числа или уничтожения бактерий и микоплазм могут быть применены флюороквиналон, цефалоспорин и макролид в зависимости от антимокробной чувствительности и безопасности для птицы. Флюороквиналоновые антимикробные препараты, такие как энрофлоксацин, могут вводиться в зависимости от концентрации уничтожаемых бактерий или микоплазм, и при этом применяют схемы введения, по меньшей мере, рекомендуемые при рутинной терапии. Например, энрофлоксацин вводят с водой в концентрации 10-30 мг/кг/день в течение 2-5 часов. Цефалоспориновые и макролидиновые антимикробные препараты вводят, применяя схему введения, гарантирующую максимальное воздействие, основанное на времязависимом уничтожении бактерий. Также могут быть применены другие классы антимикробных препаратов.

Может быть проведена как профилактика проникновения таких микроорганизмов в развивающееся яйцо, так и удаление таких микроорганизмов из неотложенного яйца введением как птице-родителю, так и/или в яйцо антимикробных препаратов против конкретных микроорганизмов. Антимикробные препараты, как правило, вводят или перорально (принудительно или с кормом, или с водой), или парентерально: подкожно, внутримышечно или внутривенно. Также возможно введение, направляемое ультразвуком, или прямое введение при лапароскопии в развивающееся яйцо в курице.

В идеале яйцо удаляют стерильно хирургическим путем из брюшной полости птицы-родителя.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу, где стерильное хирургическое удаление включает:

нанесение лапаротомного рассечения и перерезание яйцевода птицы с обоих концов с наложением швов;

нанесение поперечного разреза на дистальные части яйцевода у каждого шва;

удаление яйца, заключенного в яйцевод;

стерилизацию яйцевода;

удаление яйца; и

стерилизацию яйца.

В качестве альтернативы, способ стерильного хирургического удаления может включать:

нанесение разреза на коже птицы;

обработку поверхности матки; и

нанесение разреза на матке и извлечение яйца и матки или зажим матки и удаление яйца.

В случае, когда матку зажимают и удаляют яйцо, матка может быть зашита таким образом, чтобы птица была способна в дальнейшем откладывать яйца. Этот аспект является важным в таких ситуациях, когда птица-родитель относится к ценным и не может быть умерщвлена. В таком случае птице делают анестезию. В качестве альтернативы, птица может быть подвергнута эвтаназии перед стерильным извлечением яйца.

Стерильное извлечение яйца следует проводить быстро в течение менее чем около 30 минут после проведения эвтаназии или анестезии во избежание негативного воздействия на выживаемость эмбриона. Длительное воздействие анестезии или чрезмерная задержка между эвтаназией птицы-родителя и удалением яйца окажет негативное воздействие на выживаемость эмбриона.

Сразу же после удаления яйца из птицы-родителя его инкубируют в стерильной среде и выводят из него птицу-несушку.

По существу, настоящее изобретение относится к способу получения яиц искусственным путем от птиц-родителей для получения яиц и птиц-несушек с контролем микроорганизмов. Указанные яйца и птица в соответствии с их назначением в дальнейшем могут выводиться, выращиваться, содержаться и размножаться как традиционным способом, так и с использованием изолятора или стерильной среды.

В идеале, одну птицу воспитывают в стерильной среде как птицу-родителя, вскармливая птицу стерильным кормом. Затем яйцо извлекают из птицы-родителя искусственно перед переходом яйца в зону потенциального заражения у птицы-родителя и затем яйцо инкубируют и выводят птицу-несушку, содержащуюся в стерильной среде.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения птицу-родителя выбирают из стаи аналогичных птиц, разводимых в одинаковых условиях. В другом варианте воплощения настоящего изобретения птицу-родителя выводят естественным способом в стерильной среде из стаи птиц, аналогичным образом существующих в незараженной среде.

В дополнительном варианте воплощения настоящего изобретения птица-родитель представляет собой одну из птиц стаи, которая имеет статус незараженной другими инфекциями, полученных подходящей селекцией и размноженных естественным путем в контролируемых условиях, и способ применяют для получения птиц, имеющих статус незараженных различными инфекциями.

Предпочтительно после выведения птица-несушка является частью стаи, берут образец птицы-несушки и проводят тестирование на специфическое заражение, для того чтобы обеспечить стае статус незараженной. В идеале, когда птица-несушка не имеет статус незараженной специфическими инфекциями, птицу-несушку используют в качестве птицы-родителя в способе по настоящему изобретению. Используя повторяющийся процесс, можно, в конечном счете, получить стаю птиц, по существу, стерильных и имеющих статус незараженных бактериями.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения птицу-несушку удаляют из стерильной среды для откладки яиц, которые, в свою очередь, выводят с получением далее птиц-несушек.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения птицу-несушку удаляют из стерильной среды и кормят кормом, содержащим не патогенную нормальную кишечную флору. Птица, полученная этим способом, имеет нормальную кишечную флору и может содержаться с низкими затратами и подходит для потребления или применения в пищевой промышленности.

В дополнительном варианте воплощения настоящего изобретения цыплята или взрослые птицы, выведенные из яиц, незараженных микроорганизмами, могут быть инфицированы выбранными не патогенными организмами (включая потенциально пробиотические бактерии и паразитов) или выбранными из патогенных организмов, или выбранными из комбинации не патогенов с патогенами. Яйца или птицы, полученные таким образом, могут быть использованы, например, в научных исследованиях взаимодействия хозяин-патоген, взаимодействия хозяин-симбионт и в открытии и исследовании новых способов лечения заболеваний и способов профилактики и продуктов, применяющихся как для птиц, так и для млекопитающих.

Как правило, птица представляет собой курицу. Хотя этот способ применим ко всем птицам. Несмотря на то что вышеописанное относится полностью к домашней птице и, в частности, к курам, следует понимать, что настоящее изобретение может быть осуществлено на других птицах.

Предпочтительно в случае, когда птица выведена от птицы-несушки, незараженной специфическими инфекциями, и не является птицей-несушкой, полученная таким образом птица выводится в стерильной среде для последующего оплодотворения птиц-несушек с аналогичным или более низким статусом незараженности.

Настоящее изобретение также относится к яйцу и птице, полученным любым способом по настоящему изобретению.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения яйца со статусом незараженного специфическими инфекциями, включающему в стерильной среде:

содержание птицы-несушки с аналогичным или лучшим статусом незараженности, полученной способом по настоящему изобретению;

использование птицы-несушки для откладки яиц; и

перемещение яйца в другую стерильную среду.

В идеале откладываемое яйцо немедленно извлекают и скорлупу яйца стерилизуют.

Затем птица-несушка может быть использована для откладки яиц, которые могут представлять собой конечный продукт или из которых может быть выведена птица, которая может входить в стаю птиц со статусом незараженных бактериями или не быть несушкой и использоваться для оплодотворения птиц-несушек.

Предпочтительно птицу подвергают анестезии или эвтаназии или забивают перед удалением яйца в скорлупе. Женская особь птицы-родителя может быть как живой, так и недавно забитой. Живая птица может быть в соответствии с этическими, юридическими и общепринятыми нормами обращения с животными полностью в сознании, находиться под воздействием седативных средств или под анестезией. Яйца и яйцеклетки могут быть оплодотворенными и не оплодотворенными.

Возбудители инфекции, которые могут контролироваться настоящим изобретением, включают организмы, являющиеся патогенами или не патогенами для соответствующих видов. Они включают виды птичьих (как правило, куры, дикие птицы и индейки), людей и других млекопитающих (как правило, собаки, кошки, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, овцы, козы, крысы и мыши). Для целей настоящего изобретения, микроорганизмы включают паразитов, бактерии (включая анаэробные и аэробные виды, виды симбионты и виды, связанные с кишечником), микоплазм, вирусы (включая ретровирусы), прионы, грибки, дрожжи, плесени и фрагменты ДНК и РНК.

В случае, когда для получения потомства или птиц, получаемых искусственным путем, используют оплодотворенные яйца, они затем могут быть выведены, выращены, содержаться и размножаться в традиционных системах сельского хозяйства, SPF системах, или в изоляторах для контроля проникновения микроорганизмов.

В соответствии с настоящим изобретением для максимальной степени свободы от микроорганизмов, яйца предпочтительно получают асептически от женских особей (кроме того, они также не заражены бактериями или стерильны), и жизненный цикл должен полностью проходить в изоляторах. Жизненный цикл может полностью проходить вне изоляторов, когда получены SPF яйца и птицы.

В соответствии с настоящим изобретением асептически полученные яйца, если они предназначены для выведения, выращивания, содержания и размножения птиц, могут быть использованы в комбинации с другими способом контроля микробиологического загрязнения. Такие способы включают дезинфицирующие средства, антимикробные препараты, антибиотики, антивирусные агенты, антипаразитарные средства, иммуномодуляторы и вакцины.

Следует понимать, что при определенных обстоятельствах, когда берутся отобранные птицы в качестве птиц-родителей, полученные птицы-несушки фактически могут не быть в достаточной степени незараженными для получения птиц-несушек высокого качества. Возможно затем необходимо провести те же самые этапы снова с использованием яиц, полученных от таких птиц-несушек, и искусственно извлекаемые яйца от этих птиц-несушек обеспечивают получение других птиц-несушек, которые, надо надеяться, будут незараженными.

Следует понимать, что когда выведенные птицы не являются птицами-несушками, их затем сохраняют для последующего оплодотворения птиц-несушек. В таком случае вся стая должна быть стерильной.

Возможно по настоящему изобретению получить обычные яйца для последующего использования. В случае, когда требуются яйца со статусом незараженных микроорганизмами, первое, что необходимо сделать - это инкубировать яйца, полученные хирургическим путем от птиц-родителей.

Выращивание и размножение птиц в здоровом и продуктивном состоянии при содержании их в незараженной специфическими инфекциями или стерильной среде требует специальных рационов для компенсации отсутствия определенных питательных веществ, в норме продуцируемых, например контаминантами, обнаруженными в обычной среде в кишечнике или на коже птиц.

В другом дополнительном варианте воплощения настоящее изобретение относится к способу получения терапевтических и профилактических биологических продуктов, полученных по настоящему изобретению из стерильных яиц. Такие продукты включают вакцины (живые и инактивированные), антибиотики, моноклональные антитела, такие как интерферон, терапевтические и профилактические белки и другие аналогичные биологические продукты, каждый из которых получают по известным технологиям. Также могут быть получены антигены для серологического тестирования или других диагностических тестов. Яйца могут быть использованы для получения культур тканей/клеток, сред и для исследований. Применение яиц для получения, например, моноклональных антител, имеет преимущество, состоящее в том, что полученные антитела или другие белки обладают высокой активностью, они находятся в той же самой форме, что и человеческие антитела по показателям, например гликозилирование. Кроме того, затраты на очистку полученного в результате белкового продукта/моноклонального антитела могут быть уменьшены, поскольку удалены живые микроорганизмы и токсины или загрязняющие продукты, требующие дополнительной и очень дорогой обработки, которая также часто является причиной более низкого выхода продукта и/или активности целевого белка.

Необязательно птица-родитель может представлять собой трансгенную птицу (то есть птица трансгенно изменена для несения экзогенной ДНК), которая во взрослом состоянии отложит яйца, продуцирующие экзогенный белок или другие вещества. Существует риск загрязнения вакцин патогенами, которые передаются через яйца с эмбрионами. В прошлом для успешного получения вакцины использовали эмбрионы, незараженные специфическими патогенами (SPF) от стаи с минимизированным риском и в качестве альтернативы или дополнительно стаи содержали в очень чистой среде. Новый способ получения яиц со статусом незараженных бактериями гарантирует, что яйца, использованные для получения вакцины, стерильны и не подверглись заражению и не имеют проблем со стерильностью, которые могут привести в результате к тому, что вакцины могут считаться небезопасными для применения у людей и животных. Новый способ, по существу, обеспечивает альтернативный источник стерильных яиц, не зараженных микроорганизмами. Он имеет преимущество в том, что преодолевает проблемы, связанные с заражением, с которыми сталкивались ранее.

Яйца, полученные по настоящему изобретению, могут быть использованы для выделения патогенных микроорганизмов, получения вакцины, антител, моноклонального антитела и других терапевтических и профилактических молекул, таких как пептиды и белки, и получения антигенов для применения в серологических реакциях.

Получение из яиц вакцины против микроорганизмов, таких как вирус, как правило, осуществляется следующим способом. Выбирают штамм подходящего вируса и затем его адаптируют для роста в яйце. Эти адаптированные штаммы вирусов вводят в оплодотворенные яйца, которые затем инкубируют для роста вируса. До достижения яйцом этапа выведения могут быть получены большие количества вируса. Затем собранный вирус может быть перемешан и обработан в несколько этапов с получением в результате полностью готовой вакцины как для вакцинации людей, так и для вакцинации животных в соответствующих случаях. Большие партии вплоть до нескольких миллионов яиц собирают, обрабатывают, смешивают для получения вакцины. Подходящее количество яиц используют для получения исходных вирусов для инфицирования яиц целевым вирусом и также для оценки безопасности вакцины, например, для подтверждения отсутствия случайных агентов или соответствия требованиям обработки целевого вируса в вакцину.

Следует понимать, что вакцина может быть составлена из инактивированных патогенных микроорганизмов, живых штаммов микроорганизмов, рекомбинантных штаммов, субъединиц и/или выделенных специфических антигенов. В другом дополнительном варианте воплощения настоящее изобретение относится к способу получения микробиологически полустерильных птиц или птиц, незараженных специфическими патогенами, для пополнения стаи птиц. Это особенно ценно, когда традиционные стаи для размножении и/или SPF стаи утрачены и инфицированы специфическими патогенами. В таких случаях одним из наиболее быстрых и эффективных способов восстановления SPF стаи является получение новой стаи из существующих инфицированных стай, используя их для получения стерильным способом незараженных яиц из отобранных птиц из инфицированной стаи. Такой подход, по существу, ценен, когда инфицированные птицы имеют генетическую или трансгенную ценность. В частности, это применимо для стай птиц, инфицированных, например, птичьим гриппом или некоторыми видами бактерий, такими как сальмонелла.

Птичий грипп представляет собой заразное заболевание домашней птицы. Несмотря на то что все виды птиц подвержены этому заболеванию, стаи домашней птицы, по существу, предрасположены к инфекциям, которые быстро переходят в эпидемию. Важнейшие меры контроля включают быстрый забой заболевшей птицы, своевременное избавление от тушек и установление карантина, и тщательную дезинфекцию оставшихся стай птиц. Способ получения незараженных микроорганизмами птиц по настоящему изобретению применим в ситуации, когда происходит вспышка такого вируса, и стаи птиц нуждаются в пополнении. Этот способ обеспечивает безопасный и надежный способ восстановления стай птиц, являющихся стерильными или, по меньшей мере, наполовину стерильными или незараженными специфическими бактериями, включая специфические микроорганизмы, в том числе вирус птичьего гриппа.

Способ получения яиц незараженных, полустерильных или незараженных специфическими патогенами для восстановления стай птиц включает способ по любому из предшествующих притязаний, где птица-родитель получена из восстановленной стаи или в качестве альтернативы из восстановленной стаи получена птица-несушка, и согласно способу по настоящему изобретению протестирована на отсутствие заражения, и при подтверждении отсутствия заражения птицу-несушку используют для получения потомства для создания стаи незараженных птиц, применяя заявленный способ. В качестве альтернативы, птица и яйца могут быть получены для употребления в пищу человеком или животным в определенных ситуациях, в частности, для пациентов с ослабленным иммунитетом, с более высокой по сравнению с обычной подверженностью инфекциям или для животного, или человека во избежание инфицирования.

Следует понимать, что настоящее изобретение применимо ко всем видам птичьих и рептилиям, включая, но без ограничения, кур, индеек, перепелок, уток, гусей, цесарок, фазанов, куропаток, попугаев и ирландских тетеревов.

Настоящее изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1

Способ

Одну стаю из пяти взрослых самок и пяти взрослых самцов кур со статусом SPF содержали на выбранном рационе и размножали естественным способом. Для определения времени откладки яиц (яйцекладки) проводили наблюдение отдельно за каждой самкой, регистрируя данные в течение двухнедельного периода. Для каждой самки высчитывали среднее время в днях (время, L), когда было отложено яйцо. Время в днях для L-3 ч высчитывали и период от L-3 до L получил название период извлечения. Этот период был временем, в которое проводили удаление наиболее сформированных яиц из каждой птицы с применением асептической хирургической лапаротомии.

Для проведения этой процедуры птиц подвергли эвтаназии смещением шейных позвонков и вскоре после этого проводили процедуру. Птиц погружали в дезинфицирующий раствор на 5 минут. С передней части и брюшной части удаляли перья и проводили стерилизацию кожи 50% спиртовым раствором йода, нагретым до температуры 37°С. Затем каждую птицу помещают в специально адаптированный хирургический изолятор, стерилизованный 5% раствором перуксусной кислоты и содержащий стерильные инструменты и 500 мл пробирки, содержащие йод и спирт. Птицу покрывают стерильной хирургической салфеткой и затем стерильное входное отверстие изолятора закрывают стерильной салфеткой. Наносят лапаротомное рассечение и яйцевод (как правило, матка) перерезают с обоих концов от яйца, используя абсорбирующий шовный материал. Затем на яйцеводе делают поперечный дистальный разрез к каждому шву от яйца, и яйцевод, содержащий яйцо, удаляют из брюшной полости самки. Затем матку, содержащую яйцо, помещают в спиртовой раствор йода на пять минут, после чего яйцевод, содержащий яйцо, извлекают через входное отверстие хирургического изолятора в принимающий изолятор. В принимающем изоляторе яйцевод рассекают, яйцо удаляют, удаленное яйцо протирают тампоном с дезинфицирующим раствором и перемещают в изолятор, адаптированный, как инкубатор для выведения.

После одного дня выведения живых цыплят удаляют из изолятора для выведения и перемещают в два больших изолятора для выращивания, подходящих для выращиваемых групп молодых цыплят. Цыплят выращивали на коммерческом рационе, простерилизованном ионизирующим излучением.

В возрасте 18 дней из каждого изолятора для выведения удалили по пять цыплят, подвергли их эвтаназии и взяли образцы для бактериологического исследования на аэробные и анаэробные культуры. Образцы включают печень, легкие, сердечную кровь, влагалище/клоаку, содержимое слепой кишки и тонкого кишечника и фекалии.

Результаты

Из искусственно удаленных яиц успешно были выведены жизнеспособные цыплята (выводимость>50%, гораздо чаще>90%). В образцах, взятых у цыплят, не было обнаружено ни анаэробных, ни аэробных бактерий.

Заключение

Безопасный способ искусственного получения оплодотворенных незараженных яиц от кур был подтвержден. Яйца были жизнеспособны, и полученные из них цыплята также были жизнеспособны и успешно содержались в изоляторах. Вышеуказанный способ описан в европейской патентной заявке № 01650109, что очевидно дает возможность получения незараженных кур. Однако при повторном осуществлении способа было обнаружено, что результаты имеют более высокую вариабельность и часто дают относительно более низкую выводимость (например,<30%), которая, как правило, не приемлема с коммерческой точки зрения.

Пример 2

Серию дополнительных исследований проводили в течение 2 лет, исследования проводили по протоколу примера 1 с целью улучшения и доработки способа по примеру 1.

В серии малых исследований использовали всего 106 птиц в шести стаях в разном возрасте и с разным генотипом (в каждом исследовании использовали от 9 до 20 птиц) с получением незараженных бактериями яиц. Полученные во время исследований результаты по выводимости и определению микробиологического статуса кур очень сильно варьировали, по выводимости в пределах от нуля до 40%. Это было значительно ниже, чем установленное ранее. Другой обескураживающий фактор заключался в неуспехе некоторых исследовании по получению яиц со статусом не имеющих микробиологического загрязнения. В результате этого время, потраченное на получение яйца после проведения эвтаназии или анестезии, увеличивало усилия для гарантии стерильности.

Были проведены серии исследований (пример 2A-D) для оценки воздействия различных вариантов процедуры удаления на выводимость и микробиологический статус кур из полученных яиц. Эти варианты включают определение времени от проведения эвтаназии или анестезии до удаления яйца из брюшной полости птицы-родителя и определение времени удаления яйца относительно предшествующего времени откладки яиц, и этапа зрелости яиц в репродуктивных органах. Оценки включают степень незрелости яйца (например, мягкая скорлупа или яйцо слишком незрелое для интактного удаления), выводимость, стерильность и легкость манипулирования с тканями (что позднее являлось причиной последующего увеличения времени от проведения эвтаназии/анестезии до удаления яйца). Вариабельные факторы оценивались отдельно.

Вариабельные факторы, оказывающие воздействие на стерильность и жизнеспособность оплодотворенных яиц, полученных стерильной лапаротомией, оценены в этом примере. Оценки проведены в исследованиях, и полученные результаты приведены ниже.

Пример 2А

Влияние временных различий между ожидаемой откладкой яйца и стерильным хирургическим удалением яйца из птицы-родителя на жизнеспособность, стерильность и простоту хирургических манипуляций.

Результаты

Выводимость:

контроль: (яйца, отложенные естественным путем) выводимость - 85-100%, стерильность - 80-100%;

яйца, удаленные из матки через 30 минут после анестезии или эвтаназии: выводимость - 13-40%, стерильность - 80-100%;

яйца, удаленные из матки через 60 минут после эвтаназии:

выводимость - 14%, стерильность - 80-92%.

Эти результаты показывают: жизнеспособность незрелых яиц у кур снизилась с течением времени после эвтаназии.

Простота хирургических манипуляций:

контроль не проводили;

по прошествии 30 минут, как указано выше, хорошая, ткани легко удаляются;

по прошествии 60 минут, как указано выше, трудная, ткани трудно удаляются/ легкая степень трупного окоченения.

Эти результаты показали, что стерильное хирургическое удаление яиц в незараженный бактериями хирургический изолятор проводится легче при хирургической операции через 30 минут.

Пример 2В

Воздействие определения времени откладки яйца в сравнении с пальпацией и комбинацией этих техник на соотношение яиц, с полностью сформировавшейся скорлупой, по сравнению с яйцами с мягкой скорлупой, жизнеспособность (как правило, живые куры к моменту выведения) и на легкость хирургических манипуляций.

Результаты

Только определение времени: мягкая скорлупа и неподходящие для удаления яйца 8-71%, жизнеспособность 13-50%, стерильность 75-100%, легкость хирургических манипуляций варьирует;

только пальпация: мягкая скорлупа и неподходящие для удаления яйца 13-71%, жизнеспособность 13-54%, стерильность 89-100%, легкость хирургических манипуляций хорошая;

комбинация пальпации и определения времени: мягкая скорлупа и неподходящие для удаления яйца 10-23%, жизнеспособность 14-57%, стерильность 92-100%, легкость хирургических манипуляций хорошая.

Эти результаты предполагают, что пальпация или пальпация в комбинации с определением времени откладки имеют некоторые преимущества по сравнению со способом только определения времени, в частности, по показателям легкости хирургических манипуляций при удалении яйца из брюшной полости. Дополнительный анализ данных показывает, что определение времени плюс пальпация позволяют сократить период времени для удаления яйца и что только определение времени увеличивает период времени, это возможно отражает, что в группе, где использовалась комбинация определения времени плюс пальпация, меньшее количество яиц имело мягкую скорлупу. Менее мягкая скорлупа должна облегчить и ускорить манипуляции во время удаления яйца.

Пример 2С

Воздействие антибиотиков (например, пероральное введение флюороквиналона) на уничтожение трансовариальной бактериальной и микоплазматической инфекций и жизнеспособность и стерильность эмбрионов и последующих цыплят.

Результаты

Без антибиотиков: жизнеспособность 22-60%, и стерильность 66-92%;

с антибиотиками: жизнеспособность 13-57%, и стерильность 89-100%.

Эти результаты показывают полезность применения антибиотиков для удаления трансовариальной инфекции (например. Salmonella) и отсутствие побочных эффектов на жизнеспособность полученных незараженных яиц.

Пример 2D

Воздействие времени (от нуля до 180 минут) между эвтаназией и удалением яйца на жизнеспособность и легкость манипуляций, выводимость и стерильность.

Результаты

Стерильность 100%;

трудность манипуляций возрастает по прошествии 30 минут;

выводимость составила 20, 40 и 80% для яиц, удаленных через 60, 40 и 20 минут после эвтаназии (n=10 за раз). Эти результаты показывают, что стерильное удаление яиц из брюшной полости птиц в незараженный хирургический изолятор легче при проведении хирургической операции через около 30 минут.

Пример 3

Оценка результатов исследований в примерах с 2А по 2D показывает, что наилучшая выводимость и микробиологическая стерильность полученных яиц была наиболее подходящей при эвтаназии птиц (проведение манипуляций с птицами, находящимися под анестезией гораздо более трудное), в которых яйцо удаляют максимально быстро после эвтаназии (через 15-30 минут) и в которых скорлупа яйца твердая и хорошо сформированная (зрелость яичной скорлупы находится на высоком уровне, скорлупа не мягкая), базируется на комбинации определения времени откладки яиц и пальпации. Основываясь на других данных, используемых для определения оптимальных условий инкубации для полученных незрелых яиц, первые 18 дней инкубацию проводят при низкой (около 25%) относительной влажности. Этот приведенный ниже способ является подтверждающим исследованием, в котором все варианты, определенные в примере 2, были собраны вместе для определения оптимального взаимодействия между вариантами.

Способ и материал.

Исследование проводили на 180 взрослых разводимых самках со статусом SPF в 7 следующих группах (в различном возрасте и с различным генотипом) содержали на выбранном рационе и проводили размножение естественным способом. Для определения оптимального времени удаления яиц из брюшной полости птиц использовали комбинацию пальпации и определения наблюдением времени откладки.

Для проведения этой процедуры птиц подвергли эвтаназии смещением шейных позвонков и вскоре после этого проводили процедуру. С передней части и брюшной части удаляли перья и проводили стерилизацию кожи 50% спиртовым раствором йода. Затем каждую птицу помещали в специально адаптированный хирургический изолятор, стерилизованный 5% раствором перуксусной кислоты и содержащий стерильные инструменты. Птицу покрывали стерильной хирургической салфеткой и затем закрывали стерильное входное отверстие изолятора стерильной хирургической салфеткой. Наносили лапаротомное рассечение и далее делали аккуратное рассечение и удаляли яйцо из матки/дистальной части репродуктивных органов и проксимально к клоаке. Затем яйцо перемещали в условиях отсутствия заражения бактериями в изолятор, адаптированный, как инкубатор для выведения. Всего было удачно извлечено 153 яйца с хорошей скорлупой через 13-22 минуты после проведения эвтаназии, которые были признаны подходящими для инкубации.

После хранения в течение около 6-24 часов при температуре 18-20°С без вибрации в вентилируемых пластиковых поддонах для яиц, яйца взвешивали и затем помещали в маленькие инкубаторы-качалки. Инкубаторы содержали при 25% относительной влажности и температуре 37,6°С. Яйца держали воздушной полостью вверх, взвешивали по отдельности на 0, 7 и 18 день инкубации. На 18 день на всех инкубаторах устанавливали показатель относительной влажности около 65%. Записывали количество проклюнувшихся яиц и живых цыплят.

В возрасте 7 дней выведения живых цыплят удаляют из изолятора для выведения и перемещают в два больших изолятора для выращивания, подходящие для выращиваемых групп молодых цыплят. Цыплят выращивали на коммерческом рационе, простерилизованном ионизирующим излучением. В возрасте 14-21 дней были взяты образцы фекалий и мазок от каждой из выращиваемой в изоляторе птицы и проводили бактериологические исследования на аэробные и анаэробные культуры.

Результаты

Из искусственно удаленных незрелых яиц успешно были выведены жизнеспособные цыплята. В образцах, взятых у цыплят, не было обнаружено ни анаэробных, ни аэробных бактерий. (Яйца, отложенные естественным путем птицами-родителями за 9 дней перед эвтаназией, имели выводимость цыплят 86%. Это подтверждает нормальный или высокий уровень естественной оплодотворенности яиц, полученных от самок.)

Выводимость 7 групп незараженных бактериями яиц составила в пределах от 60% (9 из 15) до 77% (17 из 22) со средним показателем 74%.

Заключение

Был подтвержден безопасный высокоэффективный способ искусственного получения оплодотворенных незараженных бактериями яиц от кур. Яйца были оплодотворенными, и полученные из них цыплята были жизнеспособны и успешно содержались в изоляторах. Это исследование подтверждено использованием широкомасштабного исследования на 7 следующих стаях кур, по сравнению с описанными ранее способами получения оплодотворенных незараженных бактериями яиц, могут быть получены отсутствие вариабельности в показателях выводимости полученных яиц и 100% микробиологический статус отсутствия инфекции при выведении птиц из полностью созревших яиц (близко ко времени естественной откладки, выбор основывается на комбинации определения времени откладки яйца и пальпации), быстром удалении яйца из птицы-родителя (через 15-30 минут после проведения эвтаназии или анестезии) и последующей инкубации при относительной влажности 25% (гораздо более низкой по сравнению с той, при которой находятся яйца, отложенные естественным путем).

Применение технологий, описанных в настоящей патентной заявке, позволило авторам настоящего изобретения достичь гораздо более высоких подходящих показателей выводимости, означающих, что показатели выводимости постоянно выше 60%. Ранее невозможно было достичь таких показателей на постоянной основе.