изотиазолиноновые биоциды, улучшенные ионами цинка

Формула изобретения

1. Противомикробная композиция, содержащая (а), по меньшей мере, один изотиазолин-3-он, выбранный из группы, состоящей из 1,2-бензизотиазолин-3-она, N-(н-бутил)-1,2-бензизотиазолин-3-она и их сочетания, и (b), по меньшей мере, одно соединение цинка, выбранное из группы, состоящей из хлорида цинка, сульфида цинка, карбоната цинка, основного карбоната цинка, оксидов цинка, гидроксидов цинка и их сочетания, где указанный изотиазолин-3-он присутствует в количестве от 1 до 500 млн^-1, соединение цинка присутствует в количестве от 5 до 200000 млн^-1, и массовое соотношение изотиазолин-3-она и соединения цинка составляет от 1:2000 до 100:1.

2. Композиция по п.1, где компонент (а) присутствует в количестве от 1 до 500 млн^-1, компонент (b) присутствует в количестве от 5 до 200000 млн^-1, и массовое соотношение составляет от 1:100 до 100:1.

3. Композиция по п.1, где компонент (а) присутствует в количестве от 5 до 500 млн^-1 , и компонент (b) присутствует в количестве от 5 до 500 млн ^-1.

4. Противомикробная композиция по п.1, где указанным соединением цинка является хлорид цинка.

5. Противомикробная композиция по п.1, которая также содержит со-биоцид, выбранный из группы, включающей соли пиритиона, пиритионовые кислоты и их сочетание, где указанный со-биоцид присутствует в указанной композиции в количестве от около 0,001 до около 1% по отношению к общей массе указанной композиции.

6. Концентрат противомикробной композиции, который при разведении водой дает количество соединений (а) и (b), которое указано в п.1, где указанный концентрат содержит изотиазолин-3-он в количестве от 1 до 95% мас./мас.

7. Концентрат противомикробной композиции по п.6, который также содержит со-биоцид, выбранный из группы, включающей соли пиритиона, пиритионовые кислоты и их сочетание, где указанный со-биоцид присутствует в указанной композиции в количестве от около 1 до около 50% по отношению к общей массе указанной композиции.

8. Композиция, содержащая полимерную эмульсию, где указанная композиция дополнительно содержит влажный консервант, содержащий сочетание (а), по меньшей мере, одного изотиазолин-3-она, выбранного из группы, состоящей из 1,2-бензизотиазолин-3-она, N-(н-бутил)-1,2-бензизотиазолин-3-она и их сочетания, и (b), по меньшей мере, одного соединения цинка, выбранного из группы, состоящей из хлорида цинка, сульфида цинка, карбоната цинка, основного карбоната цинка, оксидов цинка, гидроксидов цинка и их сочетания, оксидов цинка, гидроксидов цинка и их сочетания, где указанное сочетание присутствует в композиции в общем количестве от около 10 до около 400 млн^-1, и где молярное соотношение компонента (а) и компонента (b) составляет от около 4:1 до около 1:2.

9. Композиция по п.8, где указанная полимерная эмульсия содержит полимер, выбранный из группы, включающей соединения акрила и замещенные (мет)акрилаты, стирол/бутадиен, этиленвинилацетат, поливинилацетат, стирол/бутадиен/N-метилолакриламид, нитрил и его сополимеры.

10. Противомикробная композиция по п.8, где указанной солью цинка является хлорид цинка.

11. Композиция по п.8, которая, кроме того, содержит со-биоцид, выбранный из группы, включающей соли пиритиона, пиритионовые кислоты и их сочетание, где указанный со-биоцид присутствует в указанной композиции в количестве от около 0,001 до около 1,0% по отношению к общей массе указанной композиции.

12. Композиция по п.11, где указанные соли пиритиона выбирают из группы, включающей пиритионмедь, пиритионцинк, пиритионнатрий и их сочетания.

13. Композиция по п.8, где композиция выбрана из группы, включающей краски, клеи, герметики, мастики, минеральные и пигментные суспензии, типографские краски, сельскохозяйственные пестицидные составы, чернила для печати, бытовую химию для покрытия, продукты личной гигиены, жидкости для обработки металлов и их комбинации.

14. Композиция по п.1, где соединением цинка является оксид цинка.

15. Композиция по п.8, где соединением цинка является оксид цинка.

Описание изобретения к патенту

Изотиазолиноны, такие как 1,2-бензизотиазолин-3-он (также называемые "BIT"), известны как эффективные противомикробные агенты. BIT, как описано, например, в композициях, представленных в европейском патенте EP 0 703 726, широко применяют в качестве бактерицидов во множестве областей. Иллюстративно в публикации патента Великобритании GB2230190A описана композиция консерванта, содержащая BIT и продукт присоединения хлорида цинка ("ZC"), вместе с 2,2'-дитиопиридин-1,1'-диоксидом ("DTP"). В примере 3 публикации 190A сравниваются композиции, содержащие BIT плюс ZC плюс DTP с контрольным примером, содержащим только BIT плюс ZC. Результаты, представленные в примере 3 и таблице 3 данной публикации, показывают, что добавление DTP позволяет снизить количество BIT в композиции. Тем не менее, авторы данного изобретения обнаружили, что количество BIT (2,5 ч/млн), применяемое в контрольном примере, является недостаточным для противомикробного действия при применении в реальных условиях.

Хотя доказано, что BIT является полезным во множестве областей применения, полезные количества BIT, которые могут быть добавлены к коммерческому продукту, ограничены эффективностью и экономическими соображениями и, в меньшей степени, проблемами охраны окружающей среды и токсикологическими проблемами. Следовательно, необходимы альтернативные противомикробные композиции для применения во влажном состоянии, которые являются экономичными и минимизируют вероятность возникновения неблагоприятного токсикологического действия и воздействия на окружающую среду. В данном изобретении представлена такая альтернатива.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте, данное изобретение относится к противомикробным композициям, содержащим (a), по меньшей мере, один изотиазолин-3-он и (b), по меньшей мере, одно соединение цинка, выбранное из группы, включающей соли цинка оксиды цинка, гидроксиды цинка и их сочетания. Иллюстративные соли цинка включают хлорид цинка, сульфид цинка, карбонат цинка, основный карбонат цинка и их сочетания. Соединение цинка является источником иона металла в противомикробной композиции. В композиции изотиазолин-3-он присутствует в количестве от 1 до 500 ч./млн (предпочтительно, от 5 до 500 ч./млн), соединение цинка присутствует в количестве от 5 до 200000 ч./млн (предпочтительно, от 5 до 500 ч./млн), и массовое соотношение изотиазолин-3-она к соединению цинка составляет от 1:2000 до 100:1 (предпочтительно, от 1:100 до 100:1). Необязательно, противомикробная композиция дополнительно содержит соль пиритиона или пиритионовую кислоту. Полезные соли пиритиона включают пиритионмедь, пиритионцинк, пиритионнатрий, пиритиондисульфид и их сочетания.

В другом аспекте, данное изобретение относится к концентрату противомикробной композиции, который, при разбавлении водой, обеспечивает противомикробное действие в функциональной жидкости. Концентрат содержит (a), по меньшей мере, один изотиазолин-3-он и (b), по меньшей мере, одно соединение цинка, выбранное из группы, включающей соли цинка, оксиды цинка, гидроксиды цинка и их сочетания. В концентрате компонент (a) присутствует в количестве от 1 до 95% масс./масс., и компонент (b) присутствует в количестве от 1 до 50% масс./масс. по отношению к общей массе концентрата при условии, что массовый процент (a) плюс (b) не превышает 100% массовых.

В еще одном аспекте, данное изобретение относится к функциональной жидкости, которая содержит щелочную среду плюс (a), по меньшей мере, один изотиазолин-3-он и (b), по меньшей мере, одно соединение цинка, выбранное из группы, включающей соли цинка, оксиды цинка, гидроксиды цинка и их сочетания. Иллюстративные соли цинка включают хлорид цинка, сульфид цинка, карбонат цинка, основной карбонат цинка и их сочетания. В композиции изотиазолин-3-он присутствует в количестве от 1 до 500 ч./млн (предпочтительно, от 5 до 500 ч./млн), соединение металла присутствует в количестве от 5 до 20000 ч./млн (предпочтительно, от 5 до 500 ч./млн), и массовое соотношение изотиазолин-3-она к иону цинка составляет от 1:2000 до 100:1 (предпочтительно, от 100:1 до 1:100). Необязательно, противомикробная композиция дополнительно содержит соль пиритиона или пиритионовую кислоту. Полезные соли пиритиона включают пиритионмедь, пиритионцинк, пиритионнатрий и пиритиондисульфид. Основной средой для функциональной жидкости может быть, например, полимер, применяемый в полимерных эмульсиях. Примеры полимерных систем включают решетки, такие как акриловые и замещенные (мет)акрилаты, стирол/бутадиен, этиленвинилацетат, поливинилацетат, стирол/бутадиен/N-метилолакриламид, нитрил и сополимеры указанных выше соединений. Типовые функциональные жидкости включают композиции для нанесения покрытий, такие как краски, клеи, герметики, мастики, минеральные и пигментные суспензии, типографские краски, сельскохозяйственные пестицидные композиции, чернила для печати, бытовая химия, продукты личной гигиены, жидкости для обработки металлов и другие системы на водной основе.

Эти и другие аспекты будут очевидны при прочтении представленного ниже подробного описания данного изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 представлена графическая изоболограмма, показывающая противомикробное действие смесей 1,2-бензизотиазолин-3-она ("BIT") и хлорида цинка на Ps. aeruginosa, на основании значений частичной ингибирующей концентрации.

На фигуре 2 представлена графическая изоболограмма, показывающая противомикробное действие смесей Kathon^® (смеси 5-хлор-2-метил-4-изотиазолин-3-она ("ClMIT") и 2-метил-4-изотиазолин-3-она ("MIT")) и хлорида цинка на Ps. aeruginosa на основании значений частичной ингибирующей концентрации.

На фигуре 3 представлена графическая изоболограмма, показывающая противомикробное действие смесей MIT и хлорида цинка на Ps. aeruginosa на основании значений частичной ингибирующей концентрации.

На фигуре 4 представлена графическая изоболограмма, показывающая противомикробное действие смесей N-(н-бутил)-1,2-бензизотиазолин-3-она ("BBIT") и хлорида цинка на Ps. aeruginosa на основании значений частичной ингибирующей концентрации.

На фигуре 5 представлена графическая изоболограмма, показывающая противомикробное действие смесей BIT и хлорида натрия на Ps. aeruginosa на основании значений частичной ингибирующей концентрации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с данным изобретением, неожиданно было обнаружено, что противомикробная композиция, содержащая изотиазолин-3-он плюс соединение цинка, выбранное из группы, состоящей из солей цинка, оксидов цинка, гидроксидов цинка и их сочетаний, демонстрирует улучшенное противомикробное действие по сравнению с содержащими изотиазолин композициями, которые не содержат соединение металла. Улучшенная эффективность достигается в противомикробных композициях при широком спектре pH от 3 до 12.

Противомикробную композицию в соответствии с данным изобретением подходящим образом вводят в функциональную жидкость. Функциональная жидкость подходящим образом содержит щелочную среду плюс (a), по меньшей мере, один изотиазолин-3-он и (b), по меньшей мере, одно соединение цинка, выбранное из группы, включающей соли цинка с органическими кислотами, соли цинка с неорганическими кислотами, оксиды цинка, гидроксиды цинка и их сочетания. Иллюстративные соли цинка включают хлорид цинка, сульфид цинка, карбонат цинка, основный карбонат цинка (также известный как «гидроксисодержащий карбонат цинка», также известный как «гидроксикарбонат цинка», который далее идентифицирован эмпирической формулой Zn₅(OH) ₆(CO₃)₂), и их сочетания.

Изотиазолинон, применяемый в соответствии с данным изобретением, предпочтительно является изотиазолин-3-оном, который выбирают из: 1,2-бензизотиазолин-3-она ("BIT"), N-(н-бутил)-1,2-бензизотиазолин-3-она ("BBIT"), 4,5-дихлор-2-н-октил-4-изотиазолин-3-она ("DCOIT"), 2-метил-4-изотиазолин-3-она ("MIT"), смесей 5-хлор-2-метил-4-изотиазолин-3-она ("ClMIT") плюс MIT (доступны от Rohm and Haas Company, Philadelphia, PA под торговым наименованием Kathon^®) дитио-2,2'-бис(бензметиламид), и их сочетаний. Особенно предпочтительными изотиазолинами являются BIT, MIT и BBIT и их сочетания.

В композиции изотиазолин-3-он присутствует в количестве от 1 до 500 ч./млн (предпочтительно, от 5 до 500 ч./млн), соединение цинка присутствует в количестве от 5 до 200000 ч./млн (предпочтительно, от 5 до 500 ч./млн), и массовое соотношение изотиазолин-3-она к соединению цинка составляет от 1:2000 до 100:1 (предпочтительно, от 100:1 до 1:100).

Необязательно, противомикробная композиция дополнительно содержит соль пиритиона или пиритионовую кислоту. Полезные соли пиритиона включают пиритионмедь, пиритионцинк, пиритионнатрий. Если она применяется, соль пиритиона или пиритионовая кислота присутствует в композиции в количестве от около 0,001% масс./масс. до около 1,0% масс./масс.

В одном варианте, сочетание противомикробных компонентов для противомикробной композиции может быть представлено в виде концентрата противомикробной композиции, который, при разбавлении водой, обеспечивает противомикробное действие в функциональной жидкости. Концентрат содержит (a), по меньшей мере, один изотиазолин-3-он и (b), по меньшей мере, одно соединение цинка, выбранное из группы, включающей соли цинка, оксиды цинка, гидроксиды цинка и их сочетания. В концентрате компонент (a) присутствует в количестве от 1 до 95% масс./масс., и компонент (b) присутствует в количестве от 1 до 50% масс./масс.

Противомикробные композиции в соответствии с данным изобретением применяют в функциональных жидкостях, таких как полимерные эмульсии, или других композициях для нанесения покрытий, для обеспечения сохранности во влажном состоянии и в виде сухой пленки. Щелочной средой может быть, например, полимер, используемый в полимерных эмульсиях, где полимер выбирают из группы, включающей соединения акрила и замещенные (мет)акрилаты, стирол/бутадиен, этиленвинилацетат, поливинилацетат, стирол/бутадиен/N-метилолакриламид, нитрил и сополимеры указанных выше соединений. Типовые функциональные жидкости включают композиции для нанесения покрытий, такие как краски, клеи, герметики, мастики, минеральные и пигментные суспензии, типографские краски, сельскохозяйственные пестицидные композиции, чернила для печати, бытовая химия, продукты личной гигиены, жидкости для обработки металлов и другие системы на водной основе.

Данное изобретение далее описано в представленных ниже примерах. Все указанные здесь проценты являются массовыми процентами по отношению к общей массе композиции, если не указано иначе.

Пример 1

В этом примере, в образцы коммерческого акрилового латекса на водной основе, торговое наименование REVACRYL 1A, поставляемого Harlow Chemical Company, pH 8,1, содержащего противомикробные добавки в количествах, указанных в таблице 1 ниже, вводят бактериальную суспензию, состоящую из

Pseudomonas aeruginosa, NCIMB 8295

Providencia rettgeri, NCIMB 10842

Serratia marcescens, NCIMB 9523

Aeromonas hydrophila, NCIMB 9233

Alcaligenes spp. (Wet State Preservation изолят)

Burkholderia cepacia, ATCC 25416

Pseudomonas putida, NCIMB 9494

Все тестируемые виды культивируют в питательном агаре и инкубируют в течение 24 часов при температуре 30°С. По прошествии этого периода отдельные суспензии каждого тестируемого организма готовят в концентрации 10⁶ колониеобразующих единиц на мл в физиологическом растворе с применением счетной камеры Thoma, полученной смешиванием равных объемов отдельных суспензий. Концентрация бактерий в каждой аликвоте после каждого введения составляет 2 × 10⁶ на мл.

Содержащие противомикробную добавку образцы краски хранят при температуре 40°С в течение 7 дней перед началом тестирования. В образцы краски вводят 1% об./об. бактериальной суспензии, описанной выше. Все тестируемые образцы инкубируют при температуре 30°С в течение всего времени тестирования и исследуют на присутствие жизнеспособных бактерий через 1, 3 и 7 дней после каждого введения. Жизнеспособные бактерии определяют штриховой разводкой аликвот в питательном агаре с последующим инкубированием при температуре 30°С в течение 2 дней.

В таблице 1 представлены результаты, полученные после третьей инокуляции в дни 1, 3 и 7.

Таблица 1
Образец	3-е инокулирование
	BIT/ч./млн	День 1	День 3	День 7
BIT/ZnO	50	С	С	С
	100	1+(92)	1+(27)	-
	150	1+(95)	S(7)	-
	200	S(10)	T(4)	-
	250	1+(89)	1+(22)	-
	300	1+(77)	1+(12)	-
BIT/ZnCl2	50	C	C	C
	100	++	1+(30)	-
	150	1+(34)	1+(21)	-
	200	1+(51)	1+(14)	-
	250	++(185)	1+(25)	-
	300	1+(58)	1+(17)	-
PROXEL BD20	50	C	C	C
	100	C	C	C
	150	C	C	C
	200	C	C	C
	250	1+(75)	-	-
	300	1+(54)	-	-
	400	1+(47)	-	-
Градация оценок следующая:
-	рост не определен
T	присутствуют 0-5 колоний
S	5-10 колоний
1+	20-100 колоний
+	незначительный рост - нет определенного количества колоний
++	умеренный рост - колонии видимы, некоторое сращивание
+++	сильный рост - сросшиеся колонии видны повсюду
C	сильный рост сливания

Результаты демонстрируют усиливающее действие BIT в сочетании с цинксодержащей солью по сравнению с коммерческим продуктом, а именно PROXEL BD20, продуктом Arch Chemicals, Inc., содержащим только BIT, при сохранении коммерческого латекса, выражающееся в том, что только 100 ч./млн BIT необходимо в присутствии цинксодержащей соли, по сравнению с 250 ч./млн BIT в образце, содержащем только BIT.

Пример 2

Исследование потенцирования между 1,2-бензизотиазолин-3-оном (BIT) и хлоридом цинка (ZnCl₂) против Pseudomonas aeruginosa .

Бактерии

Pseudomonas aeruginosa (NCIB 10421) сохраняют в питательном агаре при применении для изучения синергии между BIT и ZnCl₂ .

Расчет минимальных ингибирующих концентраций против монокультур

Бактерии выращивают до стационарной фазы (приблизительно 24 часа) в питательном бульоне (приблизительно 10⁹ организмов на мл). 0,1% (об./об.) инокулума применяют для посева свежей среды, и 100 мкл инокулума затем добавляют в каждую ячейку титровального микропланшета, за исключением первой ячейки, которая содержит 200 мкл.

С применением удвоенных разведений концентрации исследуемых соединений варьируют в каждой ячейке вдоль оси ординат. Присутствие или отсутствие роста записывают с применением визуальной проверки через 24 часа инкубирования при 37°C.

Расчет противомикробного действия на монокультуры

Титровальные микропланшеты применяют для этого анализа. Создают матрицу образца с различными концентрациями двух соединений от 2 × MIC (минимальная ингибирующая концентрация) до нулевой концентрации в 10 × 10 матрице. Так как титровальный микропланшет имеет только 96 ячеек, сочетания двух соединений, образующие крайние концентрации (самую высокую и самую низкую), были пропущены. Растворы получают в бульоне в двойной концентрации от конечных концентраций после предварительного растворения соединений в дистиллированной воде.

Смесь (100 мкл) добавляют в планшет таким образом, чтобы общий объем в каждой ячейке составлял 200 мкл. Питательный бульон применяют для Ps. aeruginosa. Планшеты инкубируют в течение 16-24 часов при 37°. Присутствие или отсутствие роста определяют визуально.

Результаты примера 2

Таблица 2 Противомикробное действие исследуемых соединений
Соединение	MIC (ч./млн) для Ps.aeruginosa
1	2	3	4
BIT	30	42	42	30
ZnCl2	300	450	375	450

BIT - 1,2-бензизотиазолин-3-он от Arch Limited PROXEL® GXL.

Расчет действия на монокультуры

Минимальной ингибирующей концентрацией (MIC) является самая низкая концентрация биоцида, которая демонстрирует ингибирование роста при применении в чистом виде. Для целей расчета фракционной ингибирующей концентрации (FIC), если чистый биоцид не контролирует рост, MIC берут как наибольшую применяемую концентрацию. Фракционной ингибирующей концентрацией является концентрация биоцида, при которой контролируется рост в смеси, деленная на MIC этого биоцида. Рассчитывают значения FIC для обоих соединений в смеси, результаты показаны в таблице 3. Сумма этих двух цифр является показателем действия двух биоцидов. Значение менее единицы указывает на улучшенный эффект, если общее значение равно единице или больше, действие является дополняющим, и если значение больше двух, биоциды являются антагонистами.

Таблица 3 Фракционные ингибирующие концентрации для 1,2-бензизотиазолин-3-она (BIT) и хлорида цинка (ZnCl2) для Ps. aeruginosa
Соединение	Значения FIC
	1	2	3	4
BIT	1	0,20	0,20	0,40	0,14	0,14	0,29	0,29	0,43	0,14	0,20	0,40	0
ZnCl2	0	0,25	0,50	0,25	0,33	0,50	0,17	0,33	0,17	0,60	0,33	0,17	1
Всего	1	0,45	0,70	0,65	0,47	0,64	0,46	0,62	0,60	0,74	0,53	0,57	1

При построении графика с осями, обозначающими фракционную ингибирующую концентрацию биоцида для двух биоцидов в линейном масштабе, если комбинация является аддитивной, тогда изобола (т.е. линия, соединяющая точки, которые представляют все сочетания с одинаковым действием, включая равноэффективные концентрации чистых биоцидов) является прямой, улучшенные сочетания дают вогнутые изоболы, и антагонистические сочетания дают выпуклые изоболы. Как показано на Фиг.1, сочетание BIT и ZnCl₂ оказывают улучшенное действие на Ps.aeruginosa , что подтверждено вогнутой изоболой на графике на Фиг.1.

Пример 3

Исследование потенцирования между Kathon^® (ClMIT/MIT) и хлоридом цинка (ZnCl₂) против Pseudomonas aeruginosa .

Бактерии

Pseudomonas aeruginosa (NCIB 10421) сохраняют в питательном агаре при применении для изучения синергии между Kathon^® и ZnCl₂.

Расчет минимальных ингибирующих концентраций против монокультур

Бактерии выращивают до стационарной фазы (приблизительно 24 часа) в питательном бульоне (приблизительно 10⁹ организмов на мл). 0,1% (об./об.) инокулума применяют для посева свежей среды, и 100 мкл инокулума затем добавляют в каждую ячейку титровального микропланшета, за исключением первой ячейки, которая содержит 200 мкл.

С применением удвоенных разведений, концентрации исследуемых соединений варьируют в каждой ячейке вдоль оси ординат. Присутствие или отсутствие роста записывают с применением визуальной проверки через 24 часа инкубирования при 37°C.

Расчет противомикробного действия на монокультуры

Титровальные микропланшеты применяют для этого анализа. Создают матрицу образца с различными концентрациями двух соединений от 2 × MIC (минимальная ингибирующая концентрация) до нулевой концентрации в 10 × 10 матрице. Так как титровальный микропланшет имеет только 96 ячеек, сочетания двух соединений, образующие крайние концентрации (самую высокую и самую низкую), были пропущены. Растворы получают в бульоне в двойной концентрации от конечных концентраций после предварительного растворения соединений в дистиллированной воде.

Смесь (100 мкл) добавляют в планшет таким образом, чтобы общий объем в каждой ячейке составлял 200 мкл. Питательный бульон применяют для Ps. aeruginosa . Планшеты инкубируют в течение 16-24 часов при 37°. Присутствие или отсутствие роста определяют визуально.

Результаты примера 3

Таблица 4 Противомикробное действие исследуемых соединений
Соединение	MIC (ч./млн) для Ps.aeruginosa
1	2	3	4
Kathon	0,9	0,9	0,9	0,53
ZnCl2	294	294	210	600

Смесь ClMIT и MIT доступна от Rohm and Haas Company, Philadelphia, PA под торговым наименованием Kathon^®.

Расчет действия на монокультуры

Минимальной ингибирующей концентрацией (MIC) является самая низкая концентрация биоцида, которая демонстрирует ингибирование роста при применении в чистом виде. Для целей расчета фракционной ингибирующей концентрации (FIC), если чистый биоцид не контролирует рост, MIC берут как наибольшую применяемую концентрацию. Фракционной ингибирующей концентрацией является концентрация биоцида, при которой контролируется рост в смеси, деленная на MIC этого биоцида. Рассчитывают значения FIC для обоих соединений в смеси, результаты показаны в таблице 5. Сумма этих двух цифр является показателем действия двух биоцидов. Значение менее единицы указывает на улучшенный эффект, если общее значение равно единице или больше, действие является дополняющим, и если значение больше двух, биоциды являются антагонистами.

Таблица 5 Фракционные ингибирующие концентрации для Kathon ® (ClMIT/MIT) и хлорида цинка (ZnCl2) для Ps. aeruginosa
Соединение	Значения FIC
	1	2	3	4
Kathon	1	0,17	0,17	0,33	0,33	0,17	0,33	0,33	0,14	0,28	0,28	0
ZnCl 2	0	0,14	0,29	0,14	0,29	0,29	0,14	0,29	0,50	0,38	0,50	1
Всего	1	0,31	0,46	0,47	0,62	0,46	0,47	0,62	0,64	0,66	0,78	1

При построении графика с осями, обозначающими фракционную ингибирующую концентрацию биоцида для двух биоцидов в линейном масштабе, если комбинация является аддитивной, тогда изобола (т.е. линия, соединяющая точки, которые представляют все сочетания с одинаковым действием, включая равноэффективные концентрации чистых биоцидов) является прямой, улучшенные сочетания дают вогнутые изоболы, и антагонистические сочетания дают выпуклые изоболы. Как показано на Фиг.2, сочетание Kathon^® и ZnCl₂ оказывают улучшенное действие на Ps.aeruginosa, что подтверждено вогнутой изоболой на Фиг.2.

Пример 4

Исследование потенцирования между MIT и хлоридом цинка (ZnCl₂ ) против Pseudomonas aeruginosa.

Бактерии

Pseudomonas aeruginosa (NCIB 10421) сохраняют в питательном агаре при применении для изучения синергии между MIT и ZnCl₂.

Расчет минимальных ингибирующих концентраций против монокультур

Бактерии выращивают до стационарной фазы (приблизительно 24 часа) в питательном бульоне (приблизительно 10⁹ организмов на мл). 0,1% (об./об.) инокулума применяют для посева свежей среды, и 100 мкл инокулума затем добавляют в каждую ячейку титровального микропланшета, за исключением первой ячейки, которая содержит 200 мкл.

С применением удвоенных разведений, концентрации исследуемых соединений варьируют в каждой ячейке вдоль оси ординат. Присутствие или отсутствие роста записывают с применением визуальной проверки через 24 часа инкубирования при 37°C.

Расчет противомикробного действия на монокультуры

Титровальные микропланшеты применяют для этого анализа. Создают матрицу образца с различными концентрациями двух соединений от 2 × MIC (минимальная ингибирующая концентрация) до нулевой концентрации в 10 × 10 матрице. Так как титровальный микропланшет имеет только 96 ячеек, сочетания двух соединений, образующие крайние концентрации (самую высокую и самую низкую) были пропущены. Растворы получают в бульоне в двойной концентрации от конечных концентраций после предварительного растворения соединений в дистиллированной воде.

Смесь (100 мкл) добавляют в планшет таким образом, чтобы общий объем в каждой ячейке составлял 200 мкл. Питательный бульон применяют для Ps. aeruginosa. Планшеты инкубируют в течение 16-24 часов при 37°. Присутствие или отсутствие роста определяют визуально.

Результаты примера 4

Таблица 6 Противомикробное действие исследуемых соединений
Соединение	MIC (ч./млн) для Ps.aeruginosa
1	2	3	4
MIT	9	6	10,5	8
ZnCl2	210	210	450	450

Расчет действия на монокультуры

Минимальной ингибирующей концентрацией (MIC) является самая низкая концентрация биоцида, которая демонстрирует ингибирование роста при применении в чистом виде. Для целей расчета фракционной ингибирующей концентрации (FIC), если чистый биоцид не контролирует рост, MIC берут как наибольшую применяемую концентрацию. Фракционной ингибирующей концентрацией является концентрация биоцида, при которой контролируется рост в смеси, деленная на MIC этого биоцида. Рассчитывают значения FIC для обоих соединений в смеси, результаты показаны в таблице 7. Сумма этих двух цифр является показателем действия двух биоцидов. Значение менее единицы указывает на улучшенный эффект, если общее значение равно единице или больше, действие является дополняющим, и если значение больше двух, биоциды являются антагонистами.

Таблица 7 Фракционные ингибирующие концентрации для (MIT) и хлорида цинка (ZnCl2) для Ps. aeruginosa
Соединение	Значения FIC
		1	2	3	4
MIT	1	0,17	0,33	0,33	0,50	0,25	0,50	0,75	0,14	0,29	0,17	0
ZnCl 2	0	0,57	0,29	0,43	0,14	0,43	0,29	0,14	0,33	0,17	0,50	1
Всего	1	0,74	0,62	0,76	0,64	0,68	0,79	0,89	0,48	0,46	0,67	1

При построении графика с осями, обозначающими фракционную ингибирующую концентрацию биоцида для двух биоцидов в линейном масштабе, если комбинация является аддитивной, тогда изобола (т.е. линия, соединяющая точки, которые представляют все сочетания с одинаковым действием, включая равноэффективные концентрации чистых биоцидов) является прямой, улучшенные сочетания дают вогнутые изоболы, и антагонистические сочетания дают выпуклые изоболы. Как показано на Фиг.3, сочетание MIT и ZnCl₂ оказывают улучшенное действие на Ps.aeruginosa , что подтверждено вогнутой изоболой на графике на Фиг.3.

Пример 5

Исследование потенцирования между BBIT и хлоридом цинка (ZnCl₂) против Pseudomonas aeruginosa.

Бактерии

Pseudomonas aeruginosa (NCIB 10421) сохраняют в питательном агаре при применении для изучения синергии между BBIT и ZnCl₂.

Расчет минимальных ингибирующих концентраций против монокультур

Бактерии выращивают до стационарной фазы (приблизительно 24 часа) в питательном бульоне (приблизительно 10⁹ организмов на мл). 0,1% (об./об.) инокулума применяют для посева свежей среды, и 100 мкл инокулума затем добавляют в каждую ячейку титровального микропланшета, за исключением первой ячейки, которая содержит 200 мкл.

С применением удвоенных разведений, концентрации исследуемых соединений варьируют в каждой ячейке вдоль оси ординат. Присутствие или отсутствие роста записывают с применением визуальной проверки через 24 часа инкубирования при 37°C.

Расчет противомикробного действия на монокультуры

Титровальные микропланшеты применяют для этого анализа. Создают матрицу образца с различными концентрациями двух соединений от 2 × MIC (минимальная ингибирующая концентрация) до нулевой концентрации в 10 × 10 матрице. Так как титровальный микропланшет имеет только 96 ячеек, сочетания двух соединений, образующие крайние концентрации (самую высокую и самую низкую), были пропущены. Растворы получают в бульоне в двойной концентрации от конечных концентраций после предварительного растворения соединений в дистиллированной воде.

Смесь (100 мкл) добавляют в планшет таким образом, чтобы общий объем в каждой ячейке составлял 200 мкл. Питательный бульон применяют для Ps. aeruginosa . Планшеты инкубируют в течение 16-24 часов при 37°. Присутствие или отсутствие роста определяют визуально.

Результаты примера 5

Таблица 8 Противомикробное действие исследуемых соединений
Соединение	MIC (ч./млн) для Ps.aeruginosa
1	2	3	4
BBIT	315	360	42	180
ZnCl2	525	525	600	600

BBIT - N-(н-бутил)-1,2-бензизотиазолин-3-он.

Расчет действия на монокультуры

Минимальной ингибирующей концентрацией (MIC) является самая низкая концентрация биоцида, которая демонстрирует ингибирование роста при применении в чистом виде. Для целей расчета фракционной ингибирующей концентрации (FIC), если чистый биоцид не контролирует рост, MIC берут как наибольшую применяемую концентрацию. Фракционной ингибирующей концентрацией является концентрация биоцида, при которой контролируется рост в смеси, деленная на MIC этого биоцида. Рассчитывают значения FIC для обоих соединений в смеси, результаты показаны в таблице 9. Сумма этих двух цифр является показателем действия двух биоцидов. Значение менее единицы указывает на улучшенный эффект, если общее значение равно единице или больше, действие является дополняющим, и если значение больше двух, биоциды являются антагонистами.

Таблица 9 Фракционные ингибирующие концентрации для BBIT и хлорида цинка (ZnCl2) для Ps. aerueinosa
Соединение	Значения FIC
	1	2	3	4
BBIT	1	0,29	0,25	0,14	0,71	0,25	0
ZnCl2	0	0,43	0,43	0,50	0,38	0,38	1
Всего	1	0,71	0,68	0,64	1,09	0,63	1

При построении графика с осями, обозначающими фракционную ингибирующую концентрацию биоцида для двух биоцидов в линейном масштабе, если комбинация является аддитивной, тогда изобола (т.е. линия, соединяющая точки, которые представляют все сочетания с одинаковым действием, включая равноэффективные концентрации чистых биоцидов) является прямой, улучшенные сочетания дают вогнутые изоболы, и антагонистические сочетания дают выпуклые изоболы. Как показано на Фиг.4, сочетание BBIT и ZnCl₂ оказывают улучшенное действие на Ps.aeruginosa , что подтверждено вогнутой изоболой, показанной на Фиг.4.

Сравнительный пример А

Исследование потенцирования между 1,2-бензизотиазолин-3-оном (BIT) и хлоридом натрия (NaCl₂) против Pseudomonas aeruginosa по сравнению с синергией между 1,2-бензизотиазолин-3-оном (BIT) и хлоридом цинка (ZnCl₂) против Pseudomonas aeruginosa (пример 2).

Бактерии

Pseudomonas aeruginosa (NCIB 10421) сохраняют в питательном агаре при применении для изучения синергии между BIT и хлоридом натрия.

Расчет минимальных ингибирующих концентраций против монокультур

Бактерии выращивают до стационарной фазы (приблизительно 24 часа) в питательном бульоне (приблизительно 10⁹ организмов на мл). 0,1% (об./об.) инокулума применяют для посева свежей среды, и 100 мкл инокулума затем добавляют в каждую ячейку титровального микропланшета, за исключением первой ячейки, которая содержит 200 мкл.

С применением удвоенных разведений, концентрации исследуемых соединений варьируют в каждой ячейке вдоль оси ординат. Присутствие или отсутствие роста записывают с применением визуальной проверки через 24 часа инкубирования при 37°C.

Расчет противомикробного действия на монокультуры

Титровальные микропланшеты применяют для этого анализа. Создают матрицу образца с различными концентрациями двух соединений от 2 × MIC (минимальная ингибирующая концентрация) до нулевой концентрации в 10 × 10 матрице. Так как титровальный микропланшет имеет только 96 ячеек, сочетания двух соединений, образующие крайние концентрации (самую высокую и самую низкую), были пропущены. Растворы получают в бульоне в двойной концентрации от конечных концентраций после предварительного растворения соединений в дистиллированной воде.

Смесь (100 мкл) добавляют в планшет таким образом, чтобы общий объем в каждой ячейке составлял 200 мкл. Питательный бульон применяют для Ps. aeruginosa. Планшеты инкубируют в течение 16-24 часов при 37°. Присутствие или отсутствие роста определяют визуально.

Результаты сравнительного примера А

Таблица 10 Противомикробное действие исследуемых соединений
Соединение	MIC (ч./млн) для Ps.aeruginosa
BIT	30
NaCl 2	Не определено (более 675)

BIT - 1,2-бензизотиазолин-3-он от Arch Limited PROXEL® GXL.

Расчет действия на монокультуры

Минимальной ингибирующей концентрацией (MIC) является самая низкая концентрация биоцида, которая демонстрирует ингибирование роста при применении в чистом виде. Для целей расчета фракционной ингибирующей концентрации (FIC), если чистый биоцид не контролирует рост, MIC берут как наибольшую применяемую концентрацию. Фракционной ингибирующей концентрацией является концентрация биоцида, при которой контролируется рост в смеси, деленная на MIC этого биоцида. Рассчитывают значения FIC для обоих соединений в смеси, результаты показаны в таблице 11. Сумма этих двух цифр является показателем действия двух биоцидов. Значение менее единицы указывает на улучшенный эффект, если общее значение равно единице или больше, действие является дополняющим, и если значение больше двух, биоциды являются антагонистами.

Таблица 11 Фракционные ингибирующие концентрации для 1,2-бензизотиазолин-3-она (BIT) и хлорида натрия (NaCl2 ) для Ps. aeruginosa
Соединение	Значения FIC
BIT	1	1,00	0
NaCl2	0	0,33	1
Всего	1	1,33	1

При построении графика с осями, обозначающими фракционную ингибирующую концентрацию биоцида для двух биоцидов в линейном масштабе, если комбинация является аддитивной, тогда изобола (т.е. линия, соединяющая точки, которые представляют все сочетания с одинаковым действием, включая равноэффективные концентрации чистых биоцидов) является прямой, улучшенные сочетания дают вогнутые изоболы, и антагонистические сочетания дают выпуклые изоболы. Как показано на Фиг.5, сочетание BIT и NaCl₂ являются аддитивными по воздействию на Ps.aeruginosa, что подтверждено прямой изоболой на графике на Фиг.5. Кроме того, результаты этого примера также показывают, что сочетание изотиазолин-3-она, такого как BIT, и соединения цинка, такого как ZnCl₂, как показано в примере 2, демонстрирует неожиданные результаты потенцирования против Ps. aeruginosa.