способ усиления эффектов окрашивающих веществ и кондиционеров

Формула изобретения

1. Способ нанесения на волосы окрашивающего вещества для волос, включающий стадии:

a) получения окрашивающего вещества для волос;

b) получения композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид, причем указанный пептид содержит от приблизительно 7 до приблизительно 50 аминокислот; и

c) нанесения окрашивающего вещества для волос и композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид, на волосы на время, достаточное для связывания с волосами окрашивающего вещества для волос и связывающегося с волосами пептида;

причем сохранение цвета после обработки шампунем является более хорошим, чем при использовании только окрашивающего вещества для волос.

2. Способ по п.1, где окрашивающее вещество для волос выбрано из группы, состоящей из красителей, пигментов и наночастиц.

3. Способ по п.2, где краситель выбран из группы, состоящей из 4-гидроксипропиламино-3-нитрофенола, 4-амино-3-нитрофенола, 2-амино-6-хлор-4-нитрофенола, 2-нитропарафенилендиамина, N,N-гидроксиэтил-2-нитрофенилендиамина, 4-нитроиндола, 2-нитро-5-глицерилметиланилина, 3-метиламино-4-нитрофеноксиэтанола, 3-нитро-р-гидроксиэтиламинофенола, гидроксиантрахинонаминопропилметилморфолинметосульфата, хны, НС Blue 1, НС Blue 2, НС Yellow 4, НС Red 3, НС Red 5, НС Red 7, НС Violet 1, НС Violet 2, НС Blue 7, НС Blue 10, НС Blue 12, НС Yellow 2, НС Yellow 6, НС Yellow 8, НС Yellow 12, НС Orange 2, НС Orange 3, НС Brown 2, D&C Yellow 1, D&C Yellow 3, D&C Blue 1, Disperse Blue 3, Disperse Violet 1, Disperse Orange, Disperse Violet 4, Disperse Black 9, Basic Orange 31, Basic Yellow 57, Basic Yellow 87, HC Yellow No. 9, Basic Blue 26, Basic Blue 7, Basic Blue 99, Basic Violet 14, Basic Violet 2, Basic Brown 16, Basic Brown 17, Basic Red 2, Basic Red 51, Acid Red 33, Brilliant Black 1, производных эозина и производных галогенированного флуоресцеина.

4. Способ по п.2, где пигмент выбран из группы, состоящей из D&C Red No. 36, D&C Red No. 30, D&C Orange No. 17, лака Green 3, лака Ext. Yellow 7, лака Orange 4, лака Red 28, кальциевых лаков D&C Red No 7, 11, 31 и 34, бариевого лака D&C Red No. 12, стронциевого лака D&C Red No. 13, алюминиевых лаков FD&C Yellow No. 5 и No. 6, алюминиевых лаков FD&C No. 40, алюминиевых лаков D&C Red No. 21, 22, 27 и 28, алюминиевых лаков FD&C Blue No. 1, алюминиевых лаков D&C Orange No. 5, алюминиевых лаков D&C Yellow No. 10; циркониевого лака D&C Red No. 33, Cromophthal® Yellow, Sunfast® Magenta, Sunfast® Blue, оксидов железа, карбоната кальция, гидроксида алюминия, сульфата кальция, каолина, ферроцианида железа и аммония, карбоната магния, кармина, сульфата бария, слюды, оксихлорида висмута, стеарата цинка, марганцево-фиолетового, оксида хрома, диоксида титана, наночастиц диоксида титана, оксида цинка, оксида бария, ультрамаринового синего, цитрата висмута, гидроксиапатита, силиката циркония и частиц углеродной сажи.

5. Способ по п.2, где наночастицы представляют собой наночастицы полимера, содержащие материалы, выбранные из группы, состоящей из полистирола, полиметилметакрилата, поливинилтолуола, сополимера стирола/бутадиена и латекса.

6. Способ по п.1, где окрашивающее вещество для волос и композицию, содержащую связывающийся с волосами пептид, наносят на волосы одновременно.

7. Способ по п.1, где окрашивающее вещество для волос наносят на волосы перед нанесением композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид.

8. Способ по п.1, где композицию, содержащую связывающийся с волосами пептид, наносят на волосы перед нанесением окрашивающего вещества для волос.

9. Способ по п.1, где композиция, содержащая связывающийся с волосами пептид, содержит конъюгат, содержащий связывающийся с волосами пептид, присоединенный к окрашивающему веществу для волос.

10. Способ по п.9, где связывающийся с волосами пептид из конъюгата ковалентно связан с окрашивающим веществом для волос.

11. Способ по п.1, где окрашивающее вещество для волос со стадии (а), необязательно, присоединено к связывающемуся с волосами пептиду.

12. Способ по п.1, где связывающийся с волосами пептид получен комбинаторно способом, выбранным из группы, состоящей из фагового дисплея, дрожжевого дисплея, бактериального дисплея и комбинаторного твердофазного синтеза пептидов.

13. Способ по п.1, где связывающийся с волосами пептид получен эмпирически.

14. Способ по п.13, где полученный эмпирически пептид содержит положительно заряженные аминокислоты, обладающие аффинностью для волос.

15. Способ по п.1 или 11, где связывающийся с волосами пептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20, 21 и 52.

16. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию:

d) повторного нанесения композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид, на волосы на время, достаточное для связывания с волосами связывающегося с волосами пептида.

17. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию:

d) нанесения на волосы композиции, содержащей полимерный закрепитель.

18. Способ по п.17, где полимерный закрепитель выбран из группы, состоящей из поли(аллиламина), полиакрилатов, сополимеров акрилата, полиуретанов, карбомеров, метиконов, амодиметиконов, полиэтиленгликоля, пчелиного воска и силоксанов.

19. Композиция окрашивающего вещества для волос, содержащая окрашивающее вещество для волос и связывающийся с волосами пептид, причем указанный пептид содержит от приблизительно 7 до приблизительно 50 аминокислот, где окрашивающее вещество и пептид не присоединены друг к другу.

20. Кондиционирующая композиция для волос, содержащая кондиционер для волос и связывающийся с волосами пептид, причем указанный пептид содержит от приблизительно 7 до приблизительно 50 аминокислот, где кондиционер и пептид не присоединены друг к другу.

Описание изобретения к патенту

По настоящей патентной заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки Соединенных штатов No. 60/721329, поданной 28 сентября 2005 г.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области личной гигиены и, в частности, ухода за волосами и кожей. Более конкретно, изобретение относится к способу усиления эффектов традиционных и нетрадиционных окрашивающих веществ, кондиционеров и других средств с благоприятным действием с помощью применения закрепителя на основе пептидов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Кондиционеры и окрашивающие вещества для волос и кожи являются хорошо известными и общеупотребительными продуктами личной гигиены. Основной проблемой с существующими в настоящее время кондиционерами и неокислительными окрашивающими веществами является отсутствие у них требуемой стабильности для длительных эффектов. Окислительные красители для волос обеспечивают устойчивую окраску, однако окислительные средства, которые они содержат, могут вызывать повреждение волос. Для улучшения стойкости композиций для ухода за волосами и кожей разработаны кондиционеры для волос, окрашивающие вещества для волос и другие средства с благоприятным действием на основе пептидов (Huang et al., публикация находящейся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентной заявки США No.2005/0050656 и публикация патентной заявки США No. 2005/0226839). Описаны также солнцезащитные средства на основе пептидов (Buseman-Williams et al., публикация находящейся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентной заявки США No. 2005/0249682; и Lowe et al., публикация находящейся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентной заявки США No. 60/737042). Средства с благоприятным действием на основе пептидов получают присоединением специфической пептидной последовательности, обладающей высокой аффинностью связывания с волосами или кожей, к средству с благоприятным действием, такому как кондиционирующее или окрашивающее средство. Пептидная часть связывается с волосами или кожей, таким образом крепко присоединяя средство с благоприятным действием. Эти средства с благоприятным действием на основе пептидов обеспечивают улучшенную стойкость, но требуют присоединения связывающего пептида к средству с благоприятным действием.

Пептиды с высокой аффинностью связывания для волос идентифицировали с использованием способов скрининга фагового дисплея (Huang et al., выше; Estell et al. WO 0179479; Murray et al., публикация патентной заявки США No. 2002/0098524; Janssen et al., публикация патентной заявки США No. 2003/0152976; и Janssen et al., WO 04048399). Кроме того, опубликованы полученные эмпирически пептиды, связывающиеся с волосами и кожей, основанные на положительно заряженных аминокислотах (Rothe et., WO 2004/000257).

Comwell et al. (патент США No. 6551361) описывают способ уменьшения потери окраски для волос, обработанных окислительным красителем для волос, включающий в себя контактирование волос либо до, либо после обработки волос окислительным красителем для волос с органическим аминосоединением, таким как основные аминокислоты, мочевина, гуанидин и их соли или смеси. Однако в данном описании не описано применение конкретных связывающихся с волосами или кожей пептидов или конъюгатов, содержащих связывающиеся с волосами или связывающиеся с кожей пептиды, присоединенные к средству с благоприятным действием, в качестве закрепителей для окрашивающих веществ и кондиционеров.

Проблемой, подлежащей разрешению, таким образом, является предоставление альтернативных способов увеличения стойкости кондиционеров и окрашивающих веществ для волос и кожи, являющихся простыми и легкими для выполнения.

Заявители обратились к указанной проблеме посредством открытия, что эффекты традиционных и нетрадиционных окрашивающих веществ, кондиционеров и других средств с благоприятным действием усиливают применением закрепителя на основе пептидов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к новым закрепителям на основе пептидов, применимых для улучшения стойкости традиционных и нетрадиционных окрашивающих веществ, кондиционеров, и других средств с благоприятным действием для волос и кожи. Закрепители по изобретению представляют собой короткие пептиды, выбранные по их способности специфически связываться с волосами или кожей. Эти связывающиеся с волосами пептиды (HBP) или связывающиеся с кожей пептиды (SBP) применяют вместе с окрашивающим веществом, кондиционером или каким-либо другим средством с благоприятным действием для волос или кожи.

Соответственно изобретение относится к способу применения средства с благоприятным действием для волос, включающему в себя стадии:

a) получения средства с благоприятным действием для волос, обладающего аффинностью для волос;

b) получения композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид;

c) нанесения средства с благоприятным действием и композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид, на волосы на время, достаточное для связывания с волосами средства с благоприятным действием для волос и связывающегося с волосами пептида.

Необязательно, композицию, содержащую связывающийся с волосами пептид, можно наносить повторно по необходимости. В альтернативном варианте осуществления способы по изобретению могут включать в себя также полимерный закрепитель для дополнительного усиления связывания средства с благоприятным действием с волосами.

Подобным образом, изобретение относится к способу применения средства с благоприятным действием для кожи, включающему в себя стадии:

a) получения средства с благоприятным действием для кожи, обладающего аффинностью для кожи;

b) получения композиции, содержащей связывающийся с кожей пептид;

c) нанесения средства с благоприятным действием и композиции, содержащей связывающийся с кожей пептид, на кожу на время, достаточное для связывания с кожей средства с благоприятным действием для кожи и связывающегося с кожей пептида.

Кроме того, изобретение относится к композиции окрашивающего вещества для волос, содержащей окрашивающее вещество для волос и связывающийся с волосами пептид, а также к кондиционирующей композиции для волос, содержащей кондиционер для волос и связывающийся с волосами пептид. Подобным образом, изобретение относится к кондиционирующей композиции для кожи, содержащей кондиционер для кожи и связывающийся с кожей пептид, а также к композиции окрашивающего вещества для кожи, содержащей окрашивающее вещество для кожи и связывающийся с кожей пептид.

В частном варианте осуществления изобретение относится к связывающемуся с волосами пептиду, выбранному из группы, состоящей из SEQ ID NO:16, 17, 18, 19, 20, и 21.

ОПИСАНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Различные варианты осуществления по изобретению можно более полно понять из следующего подробного описания и сопутствующих описаний последовательностей, составляющих часть этого описания.

Следующие последовательности согласуются с 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") и соответствуют стандарту ST.25 (1998) Всемирной организации интеллектуальной собственности (WIPO) и требованиям к спискам последовательностей EPO и PCT (Правила 5.2 и 49.5(a-bis), раздел 208 и дополнение C административной инструкции). Символы и формат, применяемые для данных по нуклеотидной и аминокислотной последовательности, удовлетворяют требованиям правил, изложенных в 37 C.F.R. §1.822.

SEQ ID NO:1-6 и 53-62 представляют собой аминокислотные последовательности связывающихся с волосами пептидов.

SEQ ID NO:7 и 63-74 представляют собой аминокислотные последовательности связывающихся с кожей пептидов.

SEQ ID NO:8-12 представляют собой аминокислотные последовательности полученных эмпирически связывающихся с волосами и кожей пептидов.

SEQ ID NO:13-15 представляют собой аминокислотные последовательности пептидных спейсеров.

SEQ ID NO:16-21 представляют собой аминокислотные последовательности мультикопийных связывающихся с волосами пептидов.

SEQ ID NO:22 представляет собой аминокислотную последовательность случайным образом синтезированного пептида.

SEQ ID NO:23 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты кодирующей области для мультикопийного связывающегося с волосами пептида HC77607.

SEQ ID NO: 24 представляет собой аминокислотную последовательность пептида TBP1.

SEQ ID NO:25-29 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты для олигонуклеотидов, используемых для получения гена TBP1, как описано в примере 5.

SEQ ID NO:30 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты синтетического фрагмента ДНК TBP1.

SEQ ID NO:31-36 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты для олигонуклеотидных праймеров, используемых для получения экспрессирующей плазмиды pINK1, как описано в примере 5.

SEQ ID NO:37 представляет собой аминокислотную последовательность пептида TBP101, описанного в примере 5.

SEQ ID NO:38 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательности для INK101.

SEQ ID NO:39 представляет собой аминокислотную последовательность пептида TBP101-DP, как описано в примере 5.

SEQ ID NO:40 и 41 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты для олигомеров, используемых для сайт-направленного мутагенеза плазмиды pINK101, как описано в примере 5.

SEQ ID NO:42 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты плазмиды pINK101-DP.

SEQ ID NO: 43 представляет собой аминокислотную последовательность пептида IBT3.

SEQ ID NO:44, 45 и 48-51 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты олигонуклеотидов, используемых для сайт-направленного мутагенеза, как описано в примере 5.

SEQ ID NO:46 и 47 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты праймеров, используемых для амплификации фрагмента фермента кетостероид-изомеразы, как описано в примере 5.

SEQ ID NO:52 представляет собой аминокислотную последовательность связывающегося с волосами пептида с добавленным к C-концу остатком цистеина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способу усиления эффектов окрашивающих веществ, кондиционеров и других средств с благоприятным действием с использованием связывающихся с волосами или кожей пептидов в качестве закрепителя. Изобретение является применимым, поскольку способ можно использовать для окрашивания или кондиционирования волос и кожи, обеспечивая увеличенную стойкость по сравнению с общепринятыми способами.

Здесь используют следующие определения, к которым следует обращаться для интерпретации формулы и описания изобретения.

Термин «изобретение» или «настоящее изобретение» в рамках изобретения является неограничивающим термином и не предназначен для обозначения какого-либо отдельного варианта осуществления конкретного изобретения, но охватывает все возможные варианты осуществления, как описано в описании и формуле изобретения.

«HBP» обозначает связывающийся с волосами пептид.

«SBP» обозначает связывающийся с кожей пептид.

«HCA» обозначает кондиционер для волос.

«SCA» обозначает кондиционер для кожи.

«BA» обозначает средство с благоприятным действием.

Термин «пептид» относится к двум или более аминокислотам, соединенным друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями.

Термин «связывающийся с волосами пептид» относится к пептидным последовательностям, связывающимся с волосами с высокой аффинностью. Связывающиеся с волосами пептиды по изобретению обладают длиной от приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 50 аминокислот, более предпочтительно от приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 25 аминокислот, наиболее предпочтительно от приблизительно 7 до приблизительно 20 аминокислот.

Термин «связывающийся с кожей пептид» относится к пептидным последовательностям, связывающимся с кожей с высокой аффинностью. Связывающиеся с кожей пептиды по изобретению обладают длиной от приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 50 аминокислот, более предпочтительно от приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 25 аминокислот, наиболее предпочтительно от приблизительно 7 до приблизительно 20 аминокислот.

Термин «средство с благоприятным действием» представляет собой общий термин, который относится к средству, обеспечивающему косметический или профилактический эффект при нанесении на кожу или волосы. Средства с благоприятным действием, как правило, включают в себя кондиционеры, окрашивающие вещества, отдушки, отбеливатели, солнцезащитные средства и т.п. вместе с другими веществами, общепринятыми в индустрии личной гигиены.

Термин «волосы» в рамках изобретения относится к волосам, бровям и ресницам человека.

Термин «кожа» в рамках изобретения относится к коже человека или заменителям кожи человека, таким как кожа свиньи, Vitro-Skin® и EpiDerm . Кожа в рамках изобретения как поверхность тела, будет, как правило, содержать слой эпителиальных клеток и может, кроме того, содержать слой эндотелиальных клеток.

Термины «присоединение» и «присоединенный» в рамках изобретения относятся к любой химической связи и включают в себя как ковалентные, так и нековалентные взаимодействия.

Термин «строгость» применительно к отбору связывающихся с волосами и связывающихся с кожей пептидов по настоящему изобретению относится к концентрации элюирующего средства (как правило, детергента), используемого для элюирования пептидов из волос или кожи. Более высокие концентрации элюирующего средства обеспечивают более строгие условия.

Термин «комплекс пептид-волосы» обозначает структуру, содержащую пептид, связанный со стержнем волоса посредством участка связывания на пептиде.

Термин «комплекс пептид-кожа» обозначает структуру, содержащую пептид, связанный с кожей посредством участка связывания на пептиде.

Термин «комплекс пептид-субстрат» относится либо к комплексу пептид-волосы, либо к комплексу пептид-кожа.

Термин «наночастицы» определяют здесь как частицы со средним диаметром частиц между 1 и 500 нм. Предпочтительно средний диаметр частиц составляет между 1 и 200 нм. В рамках изобретения «размер частиц» и «диаметр частиц» обладают одинаковым значением. Наночастицы включают в себя в качестве неограничивающих примеров металлические, полупроводниковые, полимерные или другими органические или неорганические частицы.

Термин «аминокислота» относится к основной химической структурной единице белка или полипептида. Следующие аббревиатуры используют для обозначения конкретных аминокислот:

Аминокислота	Трехбуквенная аббревиатура	Однобуквенная аббревиатура
Аланин	Ala	A
Аргинин	Arg	R
Аспарагин	Asn	N
Аспарагиновая кислота	Asp	D
Цистеин	Cys	C
Глутамин	Gln	Q
Глутаминовая кислота	Glu	E
Глицин	Gly	G
Гистидин	His	H
Изолейцин	Ile	I
Лейцин	Leu	L
Лизин	Lys	K
Метионин	Met	M
Фенилаланин	Phe	F
Пролин	Pro	P
Серин	Ser	S
Треонин	Thr	T
Триптофан	Trp	W
Тирозин	Tyr	Y
Валин	Val	V

«Ген» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, экспрессирующему конкретный белок, включающему регуляторные последовательности, предшествующие кодирующей последовательности (5'-некодирующие последовательности) и следующие за ней (3'-некодирующие последовательности). «Нативный ген» относится к гену, как он обнаружен в природе, с его собственными регуляторными последовательностями. «Химерный ген» относится к любому гену, который не является нативным геном, содержащему регуляторные и кодирующие последовательности, вместе не обнаруженные в природе. Соответственно, химерный ген может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, полученные из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, полученные из одного и того же источника, но расположенные иначе, чем это встречается в природе. «Чужеродный» ген относится к гену, в норме не обнаруживаемому в организме-хозяине, но введенному в организм-хозяин посредством переноса генов. Чужеродные гены могут включать в себя нативные гены, введенные в неприродный организм, или химерные гены.

«Синтетические гены» можно собирать из олигонуклеотидных структурных элементов, химически синтезированных с использованием способов, известных специалистам в данной области. Эти структурные элементы лигируют и гибридизуют для получения фрагментов гена, которые затем собирают химически для конструирования целого гена. «Химически синтезированный» по отношению к последовательности ДНК означает, что составляющие нуклеотиды собирают in vitro. Можно выполнять ручной химический синтез ДНК с использованием общепринятых способов или можно выполнять автоматический химический синтез с использованием одного из ряда коммерчески доступных аппаратов. Соответственно, гены можно адаптировать для оптимальной экспрессии гена на основании оптимизации нуклеотидной последовательности, чтобы отражать предпочтение кодонов клетки-хозяина. Специалисты в данной области принимают во внимание вероятность успешной экспрессии гена, если использование кодонов смещено в сторону кодонов, предпочтительных для хозяина. Определение предпочтительных кодонов можно основывать на исследовании генов, полученных из клетки-хозяина, для которых доступна информация о последовательности.

Термин «фаг» или «бактериофаг» относится к вирусу, инфицирующему бактерии. Измененные формы можно использовать для целей настоящего изобретения. Предпочтительный бактериофаг получен из фага «дикого типа», называемого M13. Система M13 может расти внутри бактерии, так что она не разрушает инфицированную ею клетку, но заставляет ее постоянно производить новые фаги. Он является одноцепочечным ДНК-фагом.

Термин «фаговый дисплей» относится к экспонированию функциональных чужеродных пептидов или малых белков на поверхности частиц бактериофага или фагмиды. Полученный способами генетической инженерии фаг можно использовать для представления пептидов в качестве фрагментов его природных поверхностных белков. Посредством популяций фагов с различными последовательностями генов можно получить пептидные библиотеки.

«ПЦР», или «полимеразная цепная реакция», представляет собой способ, используемый для амплификации специфических фрагментов ДНК (патенты США No. 4683195 и 4800159).

Стандартные способы рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, используемые в рамках изобретения, хорошо известны в данной области и описаны в Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (далее в этом документе «Maniatis»); и в Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); и в Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc, and Wiley-Interscience (1987).

Изобретение относится к способу усиления эффектов окрашивающих веществ, кондиционеров и других средств с благоприятным действием с использованием связывающихся с волосами или кожей пептидов в качестве закрепителя. Связывающиеся с волосами и кожей пептиды обладают аффинностью связывания для волос или кожи соответственно, и их можно идентифицировать с использованием комбинаторных способов, таких как фаговый дисплей, или можно получить эмпирически. Кроме того, в качестве закрепителя можно использовать конъюгаты, содержащие связывающийся с волосами или кожей пептид, присоединенный к средству с благоприятным действием. В способе по изобретению закрепитель на основе пептидов можно использовать либо одновременно с применением средства с благоприятным действием, либо после применения средства с благоприятным действием, либо перед применением средства с благоприятным действием, чтобы закрепить средство с благоприятным действием на волосах или коже.

Идентификация связывающихся с волосами и связывающихся с кожей пептидов

Связывающиеся с волосами пептиды (HBP) и связывающиеся с кожей пептиды (SBP), как определено здесь, представляют собой пептидные последовательности, которые специфически связываются с высокой аффинностью с волосами или кожей соответственно. Связывающиеся с волосами или кожей пептиды не обладают специфической аффинностью для средства с благоприятным действием, однако они могут неспецифически взаимодействовать с некоторыми средствами с благоприятным действием, в частности со средствами, являющимися полярными. Связывающиеся с волосами и связывающиеся с кожей пептиды по изобретению имеют длину от приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 50 аминокислот, более предпочтительно от приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 25 аминокислот, наиболее предпочтительно от приблизительно 7 до приблизительно 20 аминокислот. Подходящие связывающиеся с волосами или кожей пептиды можно отбирать с использованием способов, хорошо известных в данной области, или можно получать эмпирически.

Связывающиеся с волосами или связывающиеся с кожей пептиды можно получать случайным образом и затем отбирать с помощью специфического образца волос или кожи на основании их аффинности связывания с интересующим субстратом, как описано Huang et al. в публикации, находящейся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентной заявки США No.2005/0050656, содержание которой приведено здесь в качестве ссылки. Получение библиотек случайных пептидов хорошо известно, и его можно осуществлять множеством способов, включая бактериальный дисплей (Kemp, D. J.; Proc. Natl. Acad. Sc/. USA 78(7):4520-4524 (1981), и Helfman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1):31-35, (1983)), дрожжевой дисплей (Chien et al., Proc Natl Acad Sci USA 88(21):9578-82 (1991)), комбинаторный твердофазный синтез пептидов (патент США No. 5449754, патент США No. 5480971, патент США No. 5585275, патент США No.5639603), и способ фагового дисплея (патент США No. 5223409, патент США No. 5403484, патент США No. 5571698, патент США No. 5837500). Способы получения таких библиотек биологических пептидов хорошо известны в данной области. Примерные способы описаны в Dani, M., J. of Receptor & Signal Transduction Res., 21 (4):447-468 (2001), Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000), Kay et al., Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, Vol. 8:545-551 (2005), и Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, Brian K. Kay, Jill Winter, and John McCafferty, eds.; Academic Press, NY, 1996. Кроме того, библиотеки для фагового дисплея коммерчески доступны в таких компаниях, как New England Biolabs (Beverly, MA).

Предпочтительным способом получения пептидов случайным образом является получение посредством фагового дисплея. Фаговый дисплей представляет собой способ отбора in vitro, в котором пептид или белок генетически сливают с белком оболочки бактериофага, получая в результате экспонирование слитого пептида на поверхности фагового вириона, в то время как ДНК, кодирующая слитый белок, находится внутри вириона. Эта физическая связь между экспонированным пептидом и ДНК, кодирующей его, позволяет скрининг большого числа вариантов пептидов, каждый из которых связан с соответствующей последовательностью ДНК посредством простого способа отбора in vitro, названного «биопэннинг». В его наиболее простой форме биопэннинг проводят посредством инкубации пула экспонированных на фагах вариантов с интересующей мишенью, иммобилизованной на планшете или бусине, отмывки несвязавшегося фага и элюции специфически связавшегося фага посредством разрушения связывающих взаимодействий между фагом и мишенью. Затем элюированный фаг амплифицируют in vivo и процесс повторяют, получая в результате пошаговое обогащение фагового пула в пользу последовательностей с наиболее прочным связыванием. После 3 или более циклов отбора/амплификации, отдельные клоны характеризуют секвенированием ДНК.

Конкретно, связывающиеся с волосами или кожей пептиды можно отбирать с использованием следующего способа. Подходящую библиотеку пептидов получают с использованием описанных выше способов или библиотеку закупают у коммерческого поставщика. После получения библиотеки пептидов библиотеку приводят в контакт с соответствующим количеством тестового субстрата, конкретно образца волос или кожи. Библиотеку пептидов растворяют в подходящем растворе для контакта с образцом. Тестовый образец можно суспендировать в растворе или можно иммобилизовать на планшете или бусине. Предпочтительным раствором является забуференный водный солевой раствор, содержащий поверхностно-активное вещество. Подходящим раствором является Трис-солевой буфер (TBS) с 0,5% Tween® 20. Раствор дополнительно можно перемешивать любым способом, чтобы увеличивать скорость переноса массы пептидов к тестовому субстрату, таким образом уменьшая время, требуемое для достижения максимального связывания.

При контакте ряд полученных случайным образом пептидов будет связываться с тестовым субстратом с формированием комплекса пептид-субстрат (т.е. комплекса пептид-волосы или пептид-кожа). Несвязавшийся пептид можно удалить отмывкой. После удаления всего несвязавшегося материала пептиды, обладающие различной степенью аффинности связывания для тестового субстрата, можно фракционировать избирательными отмывками в буферах, обладающих различной строгостью. Увеличение строгости используемого буфера увеличивает требуемую силу связи между пептидом и тестовым субстратом в комплексе пептид-субстрат.

Множество веществ можно использовать, чтобы менять строгость буферного раствора для отбора пептидов, включая в качестве неограничивающих примеров кислый pH (1,5-3,0); основной pH (10-12,5); высокие концентрации соли, такой как MgCl₂ (3-5 M) и LiCl (5-10 M); воду; этиленгликоль (25-50%); диоксан (5-20%); тиоцианат (1-5 M); гуанидин (2-5 M); мочевину (2-8 M); и различные концентрации различных поверхностно-активных веществ, таких как SDS (додецилсульфат натрия), DOC (дезоксихолат натрия), Nonidet P-40, Triton X-100, Tween® 20, где Tween®20 является предпочтительным. Эти вещества можно получить в буферных растворах, включая в качестве неограничивающих примеров Трис-HCl, Трис-солевой буфер, Трис-борат, Трис-уксусную кислоту, триэтиламин, фосфатный буфер и глицин-HCl, где Трис-солевой буфер является предпочтительным.

Следует учитывать, что пептиды, обладающие увеличенной аффинностью для тестового субстрата, можно элюировать посредством повторения процесса отбора с использованием буферов с увеличивающейся строгостью. Элюированные пептиды можно идентифицировать и секвенировать любыми способами, известными в данной области.

В одном варианте осуществления можно использовать следующий способ для получения связывающихся с волосами или связывающихся с кожей пептидов по настоящему изобретению. Библиотеку полученных комбинаторно фагов-пептидов приводят в контакт с интересующим тестовым субстратом для получения комплексов фаг-пептид-субстрат. Комплекс фаг-пептид-субстрат отделяют от не входящих в комплекс пептидов и несвязанного субстрата и связанные фаги-пептиды из комплексов фаг-пептид-субстрат элюируют из комплекса, предпочтительно посредством обработки кислотой. Затем элюированные фаги-пептиды идентифицируют и секвенируют. Для идентификации последовательностей пептидов, которые связываются с одним субстратом, но не с другим, например пептидов, которые связываются с волосами, но не с кожей, или пептидов которые связываются с кожей, но не с волосами, можно добавить стадию вычитательного пэннинга. Конкретно, библиотеку полученных комбинаторно фагов-пептидов сначала приводят в контакт с не являющимся мишенью субстратом, чтобы удалить фаги-пептиды, которые с ним связываются. Затем несвязавшиеся фаги-пептиды приводят в контакт с желаемым субстратом и продолжают вышеуказанный способ. Альтернативно, библиотеку полученных комбинаторно фагов-пептидов можно приводить в контакт с не являющимся мишенью и желаемым субстратом одновременно. Затем комплексы фаг-пептид-субстрат отделяют от комплексов фаг-пептид-не являющийся мишенью субстрат и продолжают способ, описанный выше, для желаемых комплексов фаг-пептид-волосы или фаг-пептид-кожа.

Альтернативно, для выделения пептидов с более высокой аффинностью для волос или кожи можно использовать модифицированный способ скрининга фагового дисплея. При модифицированном способе комплексы фаг-пептид-субстрат формируют, как описано выше. Затем эти комплексы обрабатывают буфером для элюции. Можно использовать любой из буферов для элюции, описанных выше. Предпочтительно буфер для элюции представляет собой кислый раствор. Затем оставшиеся устойчивые к элюции комплексы фаг-пептид-субстрат используют для прямой инфекции бактериальной клетки-хозяина, такой как E. coli ER2738. Инфицированные клетки-хозяева выращивают в подходящей культуральной среде, такой как среда LB (Лурия-Бертани), и эту культуру распределяют по агару, содержащему подходящую культуральную среду, такую как среда LB с IPTG (изопропил -D-тиогалактопиранозид) и S-Gal . После роста отбирают бляшки для выделения ДНК и секвенирования для идентификации пептидных последовательностей с высокой аффинностью связывания для интересующего субстрата. Альтернативно, можно использовать ПЦР для идентификации устойчивых к элюции фагов-пептидов по модифицированному способу скрининга фагового дисплея, описанному выше, посредством проведения ПЦР непосредственно на комплексах фаг-пептид-субстрат с использованием соответствующих праймеров, как описано Janssen et al. в публикации патентной заявки США No. 2003/0152976, приведенной здесь в качестве ссылки.

Устойчивые к шампуню связывающиеся с волосами пептиды можно отбирать с использованием модифицированного способа биопэннинга, как описано O'Brien et al. в публикации, находящейся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентной заявки США No. 2006/0073111, приведенной здесь в качестве ссылки. Сходным образом, устойчивые к кондиционеру для волос связывающиеся с волосами пептиды и устойчивые к композиции для ухода за кожей связывающиеся с кожей пептиды можно идентифицировать с использованием способов, описанных Wang et al. (находящаяся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентная заявка США No. 11/359163) и Wang et al. (находящаяся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентная заявка США No. 11/359162) соответственно. В этих способах либо исходную библиотеку фаговых пептидов растворяют в интересующей среде (т.е. в среде шампуня, в среде кондиционера для волос или в среде композиции для ухода за кожей) - для контактирования с субстратом, либо комплекс фаг-пептид-субстрат после его формирования после контакта субстрата с библиотекой фаговых пептидов, как описано выше, приводят в контакт с интересующей средой. Затем проводят способ биопэннинга, как описано выше. Среда шампуня, среда кондиционера для волос или среда композиции для ухода за кожей может представлять собой концентрированный коммерческий продукт или его разведение.

Подходящие связывающиеся с волосами пептиды и связывающиеся с кожей пептиды можно получить с использованием способов, описанных здесь. Кроме того, можно использовать любой известный связывающийся с волосами или связывающийся с кожей пептид, такой как пептиды, описанные Huang et al., (публикация находящейся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентной заявки США No.2005/0050656 и публикация патентной заявки США No. 2005/0226839), Estell et al. (WO 0179479); Murray et al., (публикация патентной заявки США No. 2002/0098524); Janssen et al., (публикация патентной заявки США No. 2003/0152976); Janssen et al., (WO 04048399), O'Brien et al. (публикация находящейся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентной заявки США No. 2006/0073111), Wang et al. (находящаяся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентная заявка США No. 11/359163) и Wang et al. (находящаяся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентная заявка США No. 11/359162), все из которых приведены здесь в качестве ссылки. Неограничивающие примеры подходящих связывающихся с волосами и связывающихся с кожей пептидов приведены в таблице 1.

Альтернативно, пептидные последовательности, связывающиеся с волосами и кожей, можно получать эмпирически посредством конструирования пептидов, содержащих положительно заряженные аминокислоты, которые могут связываться с волосами и кожей посредством электростатического взаимодействия, как описано Rothe et al. (WO 2004/000257). Эмпирически полученные связывающиеся с волосами и кожей пептиды содержат от приблизительно 7 аминокислот до приблизительно 50 аминокислот и содержат по меньшей мере приблизительно 40 молярных % положительно заряженных аминокислот, таких как лизин, аргинин и гистидин. Наиболее предпочтительными являются пептидные последовательности, содержащие трипептидные мотивы, такие как HRK, RHK, HKR, RKH, KRH, KHR, HKX, KRX, RKX, HRX, KHX и RHX, где X может представлять собой любую природную аминокислоту, но наиболее предпочтительно выбранную из аминокислот с нейтральными боковыми цепями, таких как глицин, аланин, пролин, лейцин, изолейцин, валин и фенилаланин. Кроме того, следует понимать, что пептидные последовательности должны отвечать другим функциональным требованиям для окончательного использования, включая растворимость, вязкость и совместимость с другими компонентами в составляемом продукте, и таким образом, будут меняться согласно необходимому применению. В некоторых случаях пептид может содержать вплоть до 60 молярных % аминокислот, не включающих в себя гистидин, лизин или аргинин. Подходящие эмпирически полученные связывающиеся с волосами и связывающиеся с кожей пептиды включают в себя в качестве неограничивающих примеров, SEQ ID NO: 8-12 (см. таблицу 1).

Может также являться благоприятным использовать смесь различных связывающихся с волосами или связывающихся с кожей пептидов. Пептиды в смеси необходимо выбирать так, чтобы не существовало взаимодействий между пептидами, уменьшающих благоприятный эффект. Специалист в данной области может определить подходящие смеси связывающихся с волосами или связывающихся с кожей пептидов с использованием общепринятых экспериментов. Кроме того, может являться желательным соединить два или более связывающихся с волосами пептидов или связывающихся с кожей пептидов вместе либо непосредственно, либо через спейсер, чтобы усилить взаимодействие пептида с субстратом. Способы получения композиций из множества пептидов и подходящих спейсеров описаны ниже. Неограничивающие примеры даны в таблице 1.

Получение связывающихся с волосами и кожей пептидов

Связывающиеся с волосами и кожей пептиды по настоящему изобретению можно получать с использованием общепринятых способов синтеза пептидов, хорошо известных в данной области (см., например, Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, 1984; и Pennington et al., Peptide Synthesis Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, 1994). Кроме того, многие компании предлагают услуги синтеза пептидов по заказу.

Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению можно получать с использованием способов рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования. Гены, кодирующие связывающиеся с волосами или связывающиеся с кожей пептиды, можно получать в гетерологичных клетках-хозяевах, в частности в клетках хозяев-микроорганизмов, как описано Huang et al. (публикация патентной заявки США No. 2005/0050656), и как проиллюстрировано в примере 5 здесь. Пептиды, полученные посредством рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, могут дополнительно содержать остаток пролина (P) на N-конце и, необязательно, остаток аспарагиновой кислоты (D) на C-конце. Эти дополнительные остатки происходят от использования участков расщепления DP для отделения желаемой пептидной последовательности от пептидных меток, используемых для стимулирования формирования телец включения, и между тандемными повторами пептидных последовательностей.

Средства с благоприятным действием для волос

Любое подходящее средство с благоприятным действием для волос, известное в данной области, можно использовать в способе по изобретению. Средство с благоприятным действием для волос обладает аффинностью для волос. В рамках изобретения «обладает аффинностью для волос» означает, что средство с благоприятным действием адсорбируется на поверхности волос или адсорбируется в волосах. Подходящие средства с благоприятным действием для волос включают в себя в качестве неограничивающих примеров, окрашивающие вещества для волос и кондиционеры для волос.

Окрашивающие вещества для волос, как определяют здесь, представляют собой любой краситель, пигмент, наночастицу и т.п., которые можно использовать для изменения цвета волос. Окрашивающие волосы средства хорошо известны в данной области (см., например, Green et al., WO 0107009, приведенный здесь в качестве ссылки, CFTA International Color Handbook, 2^nd ed., Micelle Press, England (1992) и Cosmetic Handbook, US Food and Drug Administration, FDA/IAS Booklet (1992)) и коммерчески доступны из различных источников (например, Bayer, Pittsburgh, PA; Ciba-Geigy, Tarrytown, NY; ICI, Bridgewater, NJ; Sandoz, Vienna, Austria; BASF, Mount Olive, NJ; и Hoechst, Frankfurt, Germany). Подходящие средства для окрашивания волос включают в себя в качестве неограничивающих примеров такие красители, как 4-гидроксипропиламино-3-нитрофенол, 4-амино-3-нитрофенол, 2-амино-6-хлор-4-нитрофенол, 2-нитропарафенилендиамин, N,N-гидроксиэтил-2-нитрофенилендиамин, 4-нитроиндол, 2-нитро-5-глицерилметиланилин, 3-метиламино-4-нитрофеноксиэтанол, 3-нитро-p-гидроксиэтиламинофенол, гидроксиантрахинонаминопропилметилморфолинметосульфат, хну, HC Blue 1, HC Blue 2, HC Yellow 4, HC Red 3, HC Red 5, HC Red 7, HC Violet 1, HC Violet 2, HC Blue 7, HC Blue 10, HC Blue 12, HC Yellow 2, HC Yellow 6, HC Yellow 8, HC Yellow 12, HC Orange 2, HC Orange 3, HC Brown 2, D&C Yellow 1, D&C Yellow 3, D&C Blue 1, Disperse Blue 3, Disperse Violet 1, Disperse Orange, Disperse Violet 4, Disperse Black 9, Basic Orange 31, Basic Yellow 57, Basic Yellow 87, HC Yellow No. 9, Basic Blue 26, Basic Blue 7, Basic Blue 99, Basic Violet 14, Basic Violet 2, Basic Brown 16, Basic Brown 17, Basic Red 2, Basic Red 51, Acid Red 33, Brilliant Black 1, производные эозина, такие как D&C Red No. и производные галогенированного флуоресцеина, такие как D&C Red No. 27, D&C Red Orange No. 5 в сочетании с D&C Red No. 21 и D&C Orange No. 10; и пигменты, D&C Red No. 36, D&C Red No. 30, D&C Orange No. 17, лак Green 3, лак Ext. Yellow 7, лак Orange 4 и лак Red 28; кальциевые лаки D&C Red No. 7, 11, 31 и 34, бариевый лак D&C Red No. 12, стронциевый лак D&C Red No. 13, алюминиевые лаки FD&C Yellow No. 5, FD&C Yellow No. 6, FD&C No. 40, D&C Red No. 21, 22, 27 и 28, FD&C Blue No. 1, D&C Orange No. 5, D&C Yellow No. 10, циркониевый лак D&C Red No. 33; Cromophthal® Yellow 131AK (Ciba Specialty Chemicals), Sunfast® Magenta 122 (Sun Chemical) и Sunfast® Blue 15:3 (Sun Chemical), оксиды железа, карбонат кальция, гидроксид алюминия, сульфат кальция, каолин, ферроцианид железа и аммония, карбонат магния, кармин, сульфат бария, слюда, оксихлорид висмута, стеарат цинка, марганцево-фиолетовый, оксид хрома, диоксид титана, наночастицы диоксида титана, оксид цинка, оксид бария, ультрамариновый синий, цитрат висмута и белые минералы, такие как гидроксиапатит, и циркон (силикат циркония), и частицы углеродной сажи.

Металлические и полупроводниковые наночастицы также можно использовать в качестве окрашивающих средств для волос из-за их сильного излучения света (Vic et al., публикация патентной заявки США No. 2004/0010864). Металлические наночастицы включают в себя в качестве неограничивающих примеров частицы золота, серебра, платины, палладия, иридия, родия, осмия, железа, меди, кобальта и сплавов, составленных из этих металлов. «Сплав» определяют здесь как гомогенную смесь двух или более металлов. «Полупроводниковые наночастицы» включают в себя в качестве неограничивающих примеров частицы селенида кадмия, сульфида кадмия, сульфида серебра, оксида цинка, сульфида цинка, селенида цинка, сульфида свинца, арсенида галлия, силикона, оксида олова, оксида железа и фосфида индия. Наночастицы стабилизируют и делают водорастворимыми посредством использования подходящего органического покрытия или монослоя. В рамках изобретения защищенные монослоем наночастицы являются одним из типов стабилизированных наночастиц. Способы получения стабилизированных водорастворимых металлических и полупроводниковых наночастиц известны в данной области, и подходящие примеры описаны Huang et al. в публикации находящейся одновременно на рассмотрении и в совместном владении патентной заявки США No. 2004/0115345, приведенной здесь в качестве ссылки. Цвет наночастиц зависит от размера частиц. Таким образом, контролируя размер наночастиц, можно получить различные цвета.

Кроме того, органические и неорганические наночастицы с присоединенным адсорбированным или абсорбированным красителем можно использовать в качестве окрашивающего волосы средства. Например, окрашивающее волосы средство может представлять собой полимерные наночастицы. Полимерные наночастицы включают в себя в качестве неограничивающих примеров микросферы, состоящие из таких материалов, как полистирол, полиметилметакрилат, поливинилтолуол, сополимер стирол/бутадиен и латекс. Для использования по изобретению окрашенные микросферы обладают диаметром от приблизительно 10 нанометров до приблизительно 2 микрон. Микросферы можно окрашивать посредством присоединения любого подходящего красителя, такого как краситель, описанный выше, к микросферам. Красители можно присоединять к поверхности микросферы или адсорбировать внутри пористой структуры пористой микросферы. Подходящие микросферы, включая неокрашенные и окрашенные микросферы, функционализированные для обеспечения ковалентного присоединения, доступны из таких компаний, как Bang Laboratories (Fishers, IN).

Кондиционеры для волос, как определяют здесь, представляют собой средства, улучшающие вид, текстуру и блеск, так же как увеличивающие объем или мягкость волос. Кондиционеры для волос включают в себя в качестве неограничивающих примеров средства для укладки волос, средства для выпрямления волос, средства для укрепления волос и придающие объем средства, такие как наночастицы. Кондиционеры для волос хорошо известны в данной области, см., например, Green et al., выше, и коммерчески доступны из различных источников. Подходящие кондиционеры для волос включают в себя в качестве неограничивающих примеров катионные полимеры, такие как катионизированная гуаровая камедь, сополимеры диаллиловой четвертичной соли аммония/акриламида, кватернизированный поливинилпирролидон и его производные и различные поликватернионные соединения; алкильные группы с длинной цепью (т.е. C₈ - C₂₄); катионные поверхностно-активные вещества, такие как хлорид стеарилалкония и гидрохлорид сапамина; жирные спирты, такие как бегениловый спирт; жирные амины, такие как стеариламин; воски; сложные эфиры; неионные полимеры, такие как поливинилпирролидон, поливиниловый спирт и полиэтиленгликоль; силиконы; силоксаны, такие как декаметилциклопентасилоксан; эмульсии полимеров, таких как амодиметикон; и наночастицы, такие как наночастицы кремния и полимерные наночастицы. Предпочтительные кондиционеры для волос по настоящему изобретению содержат амино- или гидроксильные функциональные группы для облегчения присоединения к связывающимся с волосами пептидам, как описано ниже. Примерами предпочтительных кондиционеров являются октиламин (CAS No. 111-86-4), стеариламин (CAS No. 124-30-1), бегениловый спирт (CAS No. 661-19-8, Cognis Corp., Cincinnati, OH), силоксаны с концевой виниловой группой, силикон с концевой виниловой группой (CAS No. 68083-19-2), метилвинилсилоксаны с концевой виниловой группой, метилвинилсиликон с концевой виниловой группой (CAS No. 68951-99-5), силоксаны с концевым гидроксилом, силикон с концевым гидроксилом (CAS No. 80801-30-5), модифицированные амином производные силикона, [(аминоэтил)амино]пропилгидроксилдиметилсилоксаны, [(аминоэтил)амино]пропилгидроксилдиметилсиликоны и альфа-тридецил-омега-гидроксиполи(окси-1,2-этандиил) (CAS No. 24938-91-8).

Средства с благоприятным действием для кожи

Любое подходящее средство с благоприятным действием для кожи, известное в данной области, можно использовать в способе по изобретению. Средство с благоприятным действием для кожи обладает аффинностью для кожи. В рамках изобретения факт обладания «аффинностью для кожи» означает, что средство с благоприятным действием адсорбируется на поверхности кожи. Подходящие средства с благоприятным действием для кожи включают в себя в качестве неограничивающих примеров окрашивающие вещества для кожи, кондиционеры для кожи и солнцезащитные средства.

Окрашивающие вещества для кожи, как определено здесь, представляют собой любой краситель, пигмент, наночастицу и т.п., которые можно использовать для изменения цвета кожи. Любой из красителей, пигментов или наночастиц, описанных выше, можно использовать в качестве окрашивающего вещества для кожи. Окрашивающее средство может также представлять собой средство для искусственного загара, такое как дигидроксиацетон, придающее загорелый вид коже без воздействия солнца.

Кондиционеры для кожи, как определено здесь, включают в себя в качестве неограничивающих примеров вяжущие средства, подтягивающие кожу; отшелушивающие средства, удаляющие мертвые клетки кожи; смягчающие средства, помогающие поддерживать гладкий, мягкий, эластичный вид; увлажняющие средства, увеличивающие содержание влаги в верхнем слое кожи; окклюзионные средства, замедляющие испарение воды с поверхности кожи; и различные соединения, улучшающие вид сухой или поврежденной кожи или уменьшающие шелушение и сохраняющие эластичность. Любой подходящий известный кондиционер для кожи можно использовать в способе по изобретению. Кондиционеры для кожи хорошо известны в данной области, см., например, Green et al., выше, и коммерчески доступны из различных источников. Подходящие примеры кондиционеров для кожи включают в себя в качестве неограничивающих примеров, альфа-гидроксикислоты, бета-гидроксикислоты, полиолы, гиалуроновую кислоту, D,L-пантенол, полисалицилаты, витамин A-пальмитат, витамин E-ацетат, глицерин, сорбит, силиконы, производные силикона, ланолин, природные масла и сложные эфиры триглицеридов. Предпочтительными кондиционерами для кожи по настоящему изобретению являются полисалицилаты, пропиленгликоль (CAS No. 57-55-6, Dow Chemical, Midland, МI), глицерин (CAS No. 56-81-5, Proctor & Gamble Co., Cincinnati, OH), гликолевая кислота (CAS No. 79-14-1, DuPont Co., Wilmington, DE), молочная кислота (CAS No. 50-21-5, Alfa Aesar, Ward Hill, MA), яблочная кислота (CAS No. 617-48-1, Alfa Aesar), лимонная кислота (CAS No. 77-92-9, Alfa Aesar), виннокаменная кислота (CAS NO. 133-37-9, Alfa Aesar), глукаровая кислота (CAS No. 87-73-0), галактаровая кислота (CAS No. 526-99-8), 3-гидроксивалериановая кислота (CAS No. 10237-77-1), салициловая кислота (CAS No. 69-72-7, Alfa Aesar), и 1,3-пропандиол (CAS No. 504-63-2, DuPont Co., Wilmington, DE). Полисалицилаты можно получать способом, описанным White et al. в патенте США No. 4855483, приведенном здесь в качестве ссылки. Глукаровую кислоту можно синтезировать с использованием способа, описанного Merbouh et al. (Carbohydr. Res. 336:75-78 (2001). 3-гидроксивалериановую кислоту можно получать, как описано Bramucci et al. в WO 02012530.

Солнцезащитные средства представляют собой вещества, которые поглощают, отражают или рассеивают ультрафиолетовый свет при длине волны от 290 до 400 нанометров. Солнцезащитные средства, используемые по изобретению, могут представлять собой либо органические солнцезащитные средства, либо неорганические солнцезащитные средства. Органические солнцезащитные средства определяют здесь как органические химические вещества, поглощающие ультрафиолетовый свет с длиной волны между 290 и 400 нм. Органические солнцезащитные средства хорошо известны в данной области (см., например,, Woddin et al., патент США No. 5219558, приведенный здесь в качестве ссылки, в частности от колонки 3, линии 35, до колонки 4, линии 23). Подходящие неограничивающие примеры включают в себя парааминобензойную кислоту (PABA), этилпарааминобензоат, амилпарааминобензоат, октилпарааминобензоат, этилгексилдиметилпарааминобензоат (падимат O), этиленгликольсалицилат, фенилсалицилат, октилсалицилат, бензилсалицилат, бутилфенилсалицилат, гомоментилсалицилат (гомосалат), этилгексилсалицилат (октисалат), TEA-салицилат (троламинсалицилат), бензилциннамат, 2-этоксиэтилпараметоксициннамат (такой как Parsol®, доступный из Givaudan-Roure Co.), этилгексилметоксициннамат (октиноксат), октилпараметоксициннамат, глицерилмоно(2-этилгексаноат)дипараметоксициннамат, изопропилпараметоксициннамат, урокановую кислоту, этилуроканат, гидроксиметоксибензофенон (бензофенон-3), гидроксиметоксибензофенонсульфоновую кислоту (бензофенон-4) и ее соли, дигидроксиметоксибензофенон (бензофенон-8), дигидроксиметоксибензофенондисульфонат натрия, дигидроксибензофенон, тетрагидроксибензофенон, 4-третбутил-4'-метоксидибензоилметан (авобензон), фенилбензимидазолсульфоновую кислоту (энсулизол), 2,4,6-трианилино-p-(карбо-2'-этилгексил-1'-окси)-1,3,5-триазин, октокрилен, ментилантранилат (мерадимат) и 2-(2-гидрокси-5-метилфенил)бензотриазол.

Неорганические солнцезащитные вещества против УФ, как правило, представляют собой неорганические пигменты и оксиды металлов, включая в качестве неограничивающих примеров диоксид титана (такой как SunSmart, доступный из Cognis Co.), оксид цинка и оксид железа. Предпочтительным солнцезащитным средством являются наночастицы диоксида титана. Подходящие наночастицы диоксида титана описаны в патентах США No: 5451390; 5672330; и 5762914. Диоксид титана P25 является примером подходящего коммерческого продукта, доступного из Degussa (Parsippany, NJ). Другие коммерческие поставщики наночастиц диоксида титана включают в себя Kemira (Helsinki, Finland), Sachtleben (Duisburg, Germany) и Tayca (Osaka, Japan).

Наночастицы диоксида титана, как правило, обладают средним размером диаметра частиц менее чем 100 нанометров (нм), как определяют по динамическому рассеянию света, измеряющему распределение размера частиц в жидкой суспензии. Частицы, как правило, представляют собой агломераты, которые могут лежать в диапазоне от приблизительно 3 нм до приблизительно 6000 нм. Любые способы, известные в данной области, можно использовать для получения таких частиц. Способ может включать в себя окисление в паровой фазе галогенидов титана или преципитацию раствора из растворимых комплексов титана при условии получения наночастиц диоксида титана.

Предпочтительным способом получения наночастиц диоксида титана является впрыскивание кислорода и галогенида титана, предпочтительно тетрахлорида титана, в высокотемпературную реакционную зону, как правило, в диапазоне от 400 до 2000 градусов Цельсия. В условиях высоких температур, присутствующих в реакционной зоне, получают наночастицы диоксида титана, обладающие большой площадью поверхности и ограниченным распределением по размеру. Источником энергии в реакторе может являться любой источник тепла, такой как плазменная горелка.

Конъюгаты, содержащие связывающийся с волосами или кожей пептид, присоединенный к средству с благоприятным действием

В другом варианте осуществления конъюгат, содержащий связывающийся с волосами или кожей пептид, присоединенный к средству с благоприятным действием, используют в качестве закрепителя на основе пептидов по изобретению. Связывающее взаимодействие может представлять собой ковалентное связывание или нековалентное взаимодействие, такое как водородное связывание, электростатическое взаимодействие, гидрофобное взаимодействие или взаимодействие Ван-дер-Ваальса. В случае нековалентного взаимодействия конъюгат на основе пептидов можно получить смешиванием пептида со средством с благоприятным действием и необязательным спейсером и предоставлением достаточного времени, чтобы произошло взаимодействие. Несвязавшиеся вещества можно отделить от полученного конъюгата на основе пептидов с использованием способов, известных в данной области, например хроматографических способов.

Конъюгаты на основе пептидов можно также получать ковалентным присоединением специфического связывающегося с волосами пептида или связывающегося с кожей пептида к средству с благоприятным действием либо непосредственно, либо через спейсер, как описано Huang et al. в публикации патентной заявки США No.2005/0050656. Ковалентное присоединение неорганических солнцезащитных средств и органических солнцезащитных средств к связывающемуся с кожей пептиду описано Buseman-Williams, выше, и Lowe et al., выше соответственно.

Любые известные химические реакции конъюгации пептида или белка можно использовать для получения конъюгатов на основе пептидов, используемых по изобретению. Химические реакции конъюгации хорошо известны в данной области (см., например, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York (1996)). Подходящие присоединяющие средства включают в себя в качестве неограничивающих примеров карбодиимидные присоединяющие средства, кислые хлориды, изоцианаты, эпоксиды, малеинимиды и другие функциональные присоединяющие реагенты, реакционноспособные по отношению к концевым аминогруппам и/или группам карбоновой кислоты и сульфгидрильным группам на пептидах. Кроме того, может являться необходимым защищать реакционноспособные аминогруппы или группы карбоновой кислоты на пептиде для получения желаемой структуры закрепителя на основе пептидов. Использование защитных групп для аминокислот, таких как t-бутилоксикарбонил (t-Boc), хорошо известно в данной области (см., например, Stewart et al., выше; Bodanszky, выше; и Pennington et al., выше). В некоторых случаях может являться необходимым вводить реакционноспособные группы, такие как группы карбоновой кислоты, спирта, аминогруппы, группы изоцианата, или альдегидные группы, в средство с благоприятным действием для присоединения к связывающемуся с волосами или связывающемуся с кожей пептиду. Эти модификации можно выполнять с использованием общепринятых химических реакций, таких как окисление, восстановление, фосгенирование и т.п., которые хорошо известны в данной области.

Может также являться желательным присоединять связывающийся с волосами пептид или связывающийся с кожей пептид к средству с благоприятным действием через спейсер. Спейсер служит для отделения средства с благоприятным действием от пептида, чтобы убедиться, что средство не мешает связыванию пептида с волосами или кожей. Спейсер может представлять собой любую из множества молекул, таких как алкильные цепи, фенильные соединения, этиленгликоль, амиды, сложные эфиры и т.п. Спейсер можно ковалентно присоединять к пептиду и средству с благоприятным действием с использованием любых из химических реакций присоединения, описанных выше. Чтобы облегчить введение спейсера, можно использовать бифункциональное перекрестносшивающее средство, содержащее спейсер и реакционноспособные группы на обоих концах для присоединения пептида и средства с благоприятным действием.

Кроме того, спейсер может представлять собой пептид, содержащий любые аминокислоты и их смеси. Предпочтительные пептидные спейсеры состоят из аминокислот пролина, лизина, глицина, аланина, серина и их смесей. Кроме того, пептидный спейсер может содержать участок расщепления специфическим ферментом, такой как участок для протеазы каспазы 3, участок, позволяющий ферментативное удаление средства с благоприятным действием с волос. Пептидные спейсеры могут обладать длиной от 1 до приблизительно 50 аминокислот, предпочтительно от 1 до приблизительно 20 аминокислот. Пептидные спейсеры включают в себя в качестве неограничивающих примеров SEQ ID NO: 13-15. Эти пептидные спейсеры можно присоединять к связывающейся пептидной последовательности любым способом, известным в данной области. Например, полный двойной блок связывающий пептид-пептидный спейсер можно получать с использованием общепринятых способов синтеза пептидов, описанных выше. Кроме того, блоки связывающего пептида и пептидного спейсера можно объединять с использованием карбодиимидных соединяющих средств (см., например, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York (1996)), вторичных хлоридов кислот, диизоцианатов и других бифункциональных соединяющих средств, которые являются реакционноспособными по отношению к концевым аминогруппам и/или группам карбоновой кислоты на пептидах. Альтернативно, полный двойной блок связывающий пептид-пептидный спейсер можно получать с использованием общепринятых способов рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, описанных выше. Спейсер также может представлять собой сочетание пептидного спейсера и органической молекулы-спейсера, которое можно получать с использованием способов, описанных выше.

Может также являться желательным обладать множеством связывающихся с волосами или связывающихся с кожей пептидов, присоединенных к средству с благоприятным действием, для усиления взаимодействия средства на основе пептидов с благоприятным действием и волос или кожи, как описано Huang et al. (публикация патентной заявки США No.2005/0050656). Можно использовать либо множественные копии одного и того же связывающегося с волосами или связывающегося с кожей пептида либо сочетание различных связывающихся с волосами или связывающихся с кожей пептидов. Мультикопийный связывающийся с волосами и кожей пептид может содержать различные спейсеры, как описано выше. Мультикопийные связывающиеся с волосами пептиды включают в себя в качестве неограничивающих примеров SEQ ID NO:16-21.

Композиции, содержащие связывающийся с волосами пептид

Связывающийся с волосами пептид можно наносить на волосы из различных композиций. Например, связывающийся с волосами пептид можно наносить на волосы из водного раствора, содержащего связывающийся с волосами пептид. Альтернативно, связывающийся с волосами пептид можно наносить на волосы из композиции для ухода за волосами. Композиции для ухода за волосами определяют здесь как композиции для обработки волос, включая в качестве неограничивающих примеров шампуни, кондиционеры, ополаскиватели, лосьоны, аэрозоли, гели, муссы и красители для волос. Связывающийся с волосами пептид используют в композиции в концентрации от приблизительно 0,01 % до приблизительно 10%, предпочтительно от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% по массе относительно общей массы композиции. Эта пропорция может меняться как функция от типа композиции для ухода за волосами. Кроме того, композиция, содержащая связывающийся с волосами пептид, может дополнительно содержать средство с благоприятным действием для волос. Если композиция содержит средство с благоприятным действием для волос, средство с благоприятным действием можно присоединять к связывающемуся с волосами пептиду, как описано выше. Может являться необходимым оптимизировать концентрацию пептида по отношению к концентрации средства с благоприятным действием для наилучших результатов. Подходящие связывающиеся с волосами пептиды, включая мультикопийные связывающиеся с волосами пептиды, описаны выше. Кроме того, в композиции можно использовать смесь различных связывающихся с волосами пептидов. Связывающиеся с волосами пептиды в смеси необходимо выбирать так, чтобы не существовало взаимодействия между пептидами, ослабляющего благоприятный эффект. Специалист в данной области может определить подходящие смеси связывающихся с волосами пептидов с использованием общепринятых экспериментов. Если в композиции используют смесь связывающихся с волосами пептидов, общая концентрация пептидов составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 10% по массе относительно общей массы композиции.

В другом варианте осуществления связывающийся с волосами пептид может присутствовать в композиции в форме конъюгата, содержащего связывающийся с волосами пептид, присоединенный к средству с благоприятным действием для волос, как описано выше. Например, средство с благоприятным действием может представлять собой краситель для волос, и конъюгат может содержать связывающийся с волосами пептид, присоединенный к кондиционеру для волос. Кроме того, средство с благоприятным действием может представлять собой краситель для волос, и конъюгат может содержать связывающийся с волосами пептид, присоединенный либо к тому же самому красителю для волос, либо к другому окрашивающему веществу для волос. Все эти и другие возможные комбинации входят в объем изобретения.

Композиция, содержащая связывающийся с волосами пептид, может дополнительно содержать косметически приемлемую среду для композиций для ухода за волосами, примеры которой описаны, например, Philippe et al. в патенте США No. 6280747, Omura et al. в патенте США No. 6139851 и Cannell et al. в патенте США No. 6013250, которые приведены здесь в качестве ссылок. Например, эти композиции для ухода за волосами могут представлять собой водные, спиртовые или водно-спиртовые растворы, где спирт предпочтительно представляет собой этанол или изопропанол в пропорции от приблизительно 1 до приблизительно 75% по массе относительно общей массы для водно-спиртовых растворов. Кроме того, композиции для ухода за волосами могут содержат одну или несколько общепринятых косметических или дерматологических добавок или адъювантов, включая, в качестве неограничивающих примеров, антиоксиданты, консерванты, фильтры, поверхностно-активные вещества, солнцезащитные средства против УФA и/или УФB, отдушки, загустители, увлажняющие вещества и анионные, неионные или амфотерные полимеры и красители или пигменты.

Композиции, содержащие связывающийся с кожей пептид

Связывающийся с кожей пептид можно наносить на кожу из различных композиций. Например, связывающийся с кожей пептид можно наносить на кожу из водного раствора, содержащего связывающийся с кожей пептид. Альтернативно, связывающийся с кожей пептид наносят на кожу из композиции для ухода за кожей. Композиции для ухода за кожей определяют здесь как композиции для обработки кожи, включая, в качестве неограничивающих примеров, продукты для ухода за кожей, очищения кожи, макияжа, и продукты против морщин. Связывающийся с кожей пептид используют в композиции в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 10%, предпочтительно от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% по массе относительно общей массы композиции. Эта пропорция может меняться как функция от типа композиции для ухода за кожей. Кроме того, композиция, содержащая связывающийся с кожей пептид, может дополнительно содержать средство с благоприятным действием для кожи. Если композиция содержит средство с благоприятным действием для кожи, средство с благоприятным действием можно присоединять к связывающемуся с кожей пептиду, как описано выше. Может быть необходимым оптимизировать концентрацию связывающегося с кожей пептида относительно концентрации средства с благоприятным действием для наилучших результатов. Подходящие связывающийся с кожей пептиды, включая мультикопийные связывающийся с кожей пептиды, описаны выше. Кроме того, в композиции можно использовать смесь различных связывающихся с кожей пептидов. Связывающиеся с кожей пептиды в смеси необходимо выбирать так, чтобы не существовало взаимодействия между пептидами, ослабляющего благоприятный эффект. Специалист в данной области может определить смеси связывающихся с кожей пептидов с использованием общепринятых экспериментов. Если в композиции используют смесь связывающихся с кожей пептидов, общая концентрация пептидов составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 10% по массе относительно общей массы композиции.

В другом варианте осуществления связывающийся с кожей пептид может присутствовать в композиции в форме конъюгата, содержащего связывающийся с кожей пептид, присоединенный к средству с благоприятным действием для кожи, как описано выше. Например, средство с благоприятным действием может представлять собой кондиционер для кожи, и конъюгат может содержать связывающийся с кожей пептид, присоединенный либо к тому же самому либо к другому кондиционеру для кожи. Средство с благоприятным действием может представлять собой краситель для кожи, и конъюгат может содержать связывающийся с кожей пептид, присоединенный к кондиционеру для кожи. Кроме того, средство с благоприятным действием может представлять собой кондиционер для кожи, и конъюгат может содержать связывающийся с кожей пептид, присоединенный к солнцезащитному средству. Все эти и другие возможные комбинации входят в объем изобретения.

Композиция, содержащая связывающийся с кожей пептид, может дополнительно содержать косметически приемлемую среду для композиций для ухода за кожей, примеры которой описаны, например, Philippe et al. выше. Например, косметически приемлемая среда может представлять собой безводную композицию, содержащую жировое вещество в пропорции, как правило, от приблизительно 10 до приблизительно 90% по массе относительно общей массы композиции, где жирная фаза содержит по меньшей мере одно жидкое, твердое или полутвердое жировое вещество. Жировые вещества включают в себя в качестве неограничивающих примеров масла, воски, смолы и так называемые пастообразные жировые вещества. Альтернативно, композиции могут существовать в форме стабильной дисперсии, такой как эмульсия вода-в-масле или масло-в-воде. Кроме того, композиции могут содержать одну или несколько общепринятых косметических или дерматологических добавок или адъювантов, включая в качестве неограничивающих примеров антиоксиданты, консерванты, фильтры, поверхностно-активные вещества, солнцезащитные средства против УФA и/или УФB, отдушки, загустители, увлажняющие вещества и анионные, неионные или амфотерные полимеры, и красители или пигменты.

Способы нанесения средства с благоприятным действием на волосы

Закрепители на основе пептидов по изобретению используют для усиления устойчивости общепринятых средств с благоприятным действием для волос, например, окрашивающих веществ или кондиционеров. Средство с благоприятным действием для волос можно наносить на волосы из любой подходящей композиции. Средство с благоприятным действием для волос может присутствовать в композиции в форме конъюгата со связывающимся с волосами пептидом, как описано выше. В одном варианте осуществления средство с благоприятным действием для волос наносят на волосы из общепринятой композиции для ухода за волосами, например, временного красителя для волос или кондиционера для волос. Эти композиции для ухода за волосами хорошо известны в данной области, и подходящие композиции описаны выше.

В одном варианте осуществления средство с благоприятным действием для волос наносят на волосы на время, достаточное для того, чтобы средство с благоприятным действием для волос связалось с волосами, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Необязательно, волосы можно ополаскивать для удаления средства с благоприятным действием, не связавшегося с волосами. Затем композицию, содержащую связывающийся с волосами пептид, наносят на волосы на время, достаточное для того, чтобы связывающийся с волосами пептид связался с волосами, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Композицию, содержащую связывающийся с волосами пептид, можно смыть с волос или оставить на волосах.

В другом варианте осуществления композицию, содержащую связывающийся с волосами пептид, наносят на волосы на время, достаточное для того, чтобы связывающийся с волосами пептид связался с волосами, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Необязательно, волосы можно ополаскивать для удаления композиции связывающегося с волосами пептида, не связавшейся с волосами. Затем средство с благоприятным действием для волос наносят на волосы на время, достаточное для того, чтобы средство с благоприятным действием связалось с волосами, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Несвязавшееся средство с благоприятным действием для волос можно смыть с волос или оставить на волосах.

В другом варианте осуществления средство с благоприятным действием для волос и композицию, содержащую связывающийся с волосами пептид, наносят на волосы одновременно на время, достаточное для того, чтобы средство с благоприятным действием и связывающийся с волосами пептид связались с волосами, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Необязательно, волосы можно ополаскивать для удаления с волос несвязавшихся средства с благоприятным действием и композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид.

В другом варианте осуществления средство с благоприятным действием для волос предоставляют как часть композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид. В этом варианте осуществления композицию, содержащую средство с благоприятным действием для волос и связывающийся с волосами пептид, наносят на волосы на время, достаточное для того, чтобы средство с благоприятным действием и связывающийся с волосами пептид связались с волосами, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Композицию, содержащую средство с благоприятным действием для волос и связывающийся с волосами пептид, можно смыть с волос или оставить на волосах.

В любом из описанных выше способов композицию, содержащую связывающийся с волосами пептид, можно, необязательно, повторно наносить на волосы после нанесения средства с благоприятным действием для волос и композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид, для дальнейшего улучшения стойкости средства с благоприятным действием.

Кроме того, в любом из способов, описанных выше, композицию, содержащую полимерный закрепитель, можно, необязательно, наносить на волосы после нанесения средства с благоприятным действием для волос и композиции, содержащей связывающийся с волосами пептид, для дальнейшего усиления стойкости средства с благоприятным действием. Композиция, содержащая полимерный закрепитель, может присутствовать в водном растворе или в композиции для ухода за волосами, содержащей полимерный закрепитель. Как правило, полимерный закрепитель присутствует в композиции в концентрации от приблизительно 0,25% до приблизительно 10% по массе на основании общей массы композиции. Полимерные закрепители хорошо известны в области продуктов личной гигиены и включают в себя в качестве неограничивающих примеров, поли(аллиламин), акрилаты, сополимеры акрилата, полиуретаны, карбомеры, метиконы, амодиметиконы, полиэтиленгликоль, пчелиный воск, силоксаны и т.п. Выбор полимерного закрепителя зависит от конкретного применяемого средства с благоприятным действием и связывающегося с волосами пептида. Специалист в данной области может легко определить оптимальный полимерный закрепитель с использованием общепринятых экспериментов.

Способ нанесения средства с благоприятным действием на кожу

Закрепители на основе пептидов по изобретению используют для усиления стойкости общеупотребительных средств с благоприятным действием для кожи, например окрашивающих веществ, кондиционеров, солнцезащитных средств, отдушек и т.п. Средство с благоприятным действием для кожи можно наносить на кожу из любой подходящей композиции. Средство с благоприятным действием для кожи может присутствовать в композиции в форме конъюгата со связывающимся с кожей пептидом, как описано выше. В одном варианте осуществления средство с благоприятным действием можно наносить на кожу из общепринятой композиции для ухода за кожей, например, окрашивающего вещества для кожи, кондиционера для кожи, солнцезащитного средства и т.п., которые хорошо известны в данной области.

В одном варианте осуществления средство с благоприятным действием для кожи наносят на кожу на время, достаточное для того, чтобы средство с благоприятным действием для кожи связалось с кожей, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Необязательно, кожу можно ополаскивать для удаления средства с благоприятным действием, не связавшегося с кожей. Затем композицию, содержащую связывающийся с кожей пептид, наносят на кожу на время, достаточное для того, чтобы связывающееся с кожей пептидное средство связалось с кожей, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Композицию, содержащую связывающийся с кожей пептид, можно смыть с кожи или оставить на коже.

В другом варианте осуществления композицию, содержащую связывающийся с кожей пептид, наносят на кожу на время, достаточное для того, чтобы связывающийся с кожей пептид связался с кожей, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Необязательно, кожу можно ополаскивать для удаления композиции связывающегося с кожей пептида, не связавшейся с кожей. Затем средство с благоприятным действием для кожи наносят на кожу на время, достаточное для того, чтобы средство с благоприятным действием для кожи связалось с кожей, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Несвязавшееся средство с благоприятным действием для кожи можно смыть с кожи или оставить на коже.

В другом варианте осуществления средство с благоприятным действием для кожи и композицию, содержащую связывающийся с кожей пептид, наносят на кожу одновременно на время, достаточное для того, чтобы средство с благоприятным действием и связывающийся с кожей пептид связались с кожей, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Необязательно, кожу можно ополаскивать для удаления с кожи несвязавшихся средства с благоприятным действием и композиции, содержащей связывающийся с кожей пептид.

В другом варианте осуществления средство с благоприятным действием для кожи предоставляют как часть композиции, содержащей связывающийся с кожей пептид. В этом варианте осуществления композицию, содержащую средство с благоприятным действием для кожи и связывающийся с кожей пептид, наносят на кожу на время, достаточное для того, чтобы средство с благоприятным действием для кожи и связывающийся с кожей пептид связались с кожей, как правило, между приблизительно 5 секундами и приблизительно 60 минутами. Композицию, содержащую средство с благоприятным действием для кожи и связывающийся с кожей пептид, можно смыть с кожи или оставить на коже.

В любом из способов, описанных выше, композицию, содержащую связывающийся с кожей пептид, можно, необязательно, повторно наносить на кожу после нанесения средства с благоприятным действием для кожи и композиции, содержащей связывающийся с кожей пептид, для дальнейшего усиления стойкости средства с благоприятным действием.

Кроме того, в любом из способов, описанных выше, композицию, содержащую полимерный закрепитель, можно, необязательно, наносить на кожу после нанесения средства с благоприятным действием для кожи и композиции, содержащей связывающийся с кожей пептид, для дальнейшего усиления стойкости средства с благоприятным действием. Композиция, содержащая полимерный закрепитель, может представлять собой водный раствор или композицию для ухода за кожей, содержащую полимерный закрепитель. Как правило, полимерный закрепитель присутствует в композиции в концентрации от приблизительно 0,25% до приблизительно 10% по массе на основании общей массы композиции. Полимерные закрепители хорошо известны в области продуктов личной гигиены и включают в себя в качестве неограничивающих примеров поли(аллиламин), акрилаты, сополимеры акрилата, полиуретаны, карбомеры, метиконы, амодиметиконы, полиэтиленгликоль, пчелиный воск, силоксаны, и т.п. Выбор полимерного закрепителя зависит от конкретного используемого средства с благоприятным действием и связывающегося с кожей пептида. Специалист в данной области может легко определить оптимальный полимерный закрепитель с использованием общепринятых экспериментов.

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение дополнительно охарактеризовано в следующих примерах. Следует понимать, что в то время как в этих примерах показаны предпочтительные варианты осуществления изобретения, они приведены только с целью иллюстрации. Из вышеописанного обсуждения и этих примеров специалист в данной области может определить существенные характеристики этого изобретения и, без отклонения от его сущности и объема, может выполнить различные изменения и модификации по изобретению, чтобы адаптировать его для различных применений и условий.

Значение использованных сокращений является следующим: «мин» обозначает минуту(минуты), «час» обозначает час(ы), «сек» обозначает секунду(секунды), «мкл» обозначает микролитр(ы), «мл» обозначает миллилитр(ы), «л» обозначает литр(ы), «нм» обозначает нанометр(ы), «мм» обозначает миллиметр(ы), «см» обозначает сантиметр(ы), «мкм» обозначает микрометр(ы), «мМ» обозначает миллимолярный, «M» обозначает молярный, «моль» обозначает моль(моли), «ммоль» обозначает миллимоль(миллимоли), «мкмоль» обозначает микромоль(микромоли), «пмоль» обозначает пикомоль(пикомоли), «г» обозначает грамм(ы), «мкг» обозначает микрограмм(ы), «мг» обозначает миллиграмм(ы), «% масс.» обозначает массовый процент, «% об.» обозначает объемный процент, «MALDI» обозначает ионизацию лазерной десорбцией с использованием матрицы, «OD₆₀₀» обозначает оптическую плотность, измеренную при длине волны 600 нм, «об/мин» обозначает оборотов в минуту, «атм» обозначает атмосферу(атмосферы), «кПа» обозначает килопаскали, «SLPM» обозначает стандартных литров в минуту, «psi» обозначает фунт на квадратный дюйм, «RCF» обозначает относительную силу центрифугирования.

ПРИМЕР 1

Окрашивание волос с использованием полученного комбинаторно связывающегося с волосами пептида в качестве закрепителя

Целью данного примера являлось продемонстрировать окрашивание волос с использованием красителя для волос в комбинации со связывающимся с волосами пептидом в качестве закрепителя. Связывающийся с волосами пептид, используемый в этом примере, идентифицирован с использованием скрининга фагового дисплея Huang et al. (публикация патентной заявки США No.2005/0050656).

Связывающийся с волосами пептид IB5 с остатком цистеина, добавленным к C-концу, приведенный как SEQ ID NO:52, получен из SynPep (Dublin, CA). Этот пептид (25 мг) добавляли к 10 г 1 % масс. исходного раствора Basic Violet #2 (Aldrich, Milwaukee, WI; CAS 3248-91-7) в воде и обеспечивали перемешивание раствора в течение ночи. Образец натуральных белых волос (International Hair Importers & Products Inc., Bellerose, NY) вставляли в пробирку 13 мм × 100 мм и впрыскивали в пробирку 8 мл смеси пептид/краситель. Образец волос перемешивали в контакте с раствором окрашивающего вещества в течение 30 мин с использованием магнитной мешалки; затем вынимали и высушивали на воздухе в течение 30 мин.

Затем образец волос подвергали промывке водой с использованием больших количеств деионизованной воды с последующими пятью обработками шампунем в течение нескольких дней. Обработка шампунем включала в себя нанесение коммерчески доступного шампуня, Pantene Pro-V Sheer Volume (Proctor & Gamble, Cincinnati, OH), на волосы следующим образом. Каплю шампуня размером с двадцатипятицентовую монету равномерно распределяли по образцу волос и затем энергично втирали в волосы в течение 30 сек, после чего образец волос ополаскивали водой для удаления шампуня. Затем образец волос высушивали при комнатной температуре.

Описанный выше способ повторяли без добавления связывающегося с волосами пептидного закрепителя, что служило контролем. Стойкость цвета оценивали качественно с использованием визуального наблюдения сохранения цвета по сравнению с контролем с использованием следующей шкалы:

«Без изменений»: обозначает такое же значение потери цвета, как и в контроле;

«Средне»: обозначает небольшое улучшение сохранения цвета по сравнению с контролем;

«Хорошо»: обозначает большое улучшение сохранения цвета по сравнению с контролем; и

«Очень хорошо»: обозначает минимальную потерю цвета.

После обработки шампунем цвет образца волос, обработанного красителем и связывающимся с волосами пептидным закрепителем, оценивали как «очень хорошо», что указывает на минимальную потерю цвета после обработки шампунем. Для контроля без связывающегося с волосами пептида показали значительную потерю цвета после обработки шампунем. Эти результаты показали эффективность связывающегося с волосами пептида в качестве закрепителя для красителей для волос.

Этот эксперимент повторили с использованием исходного раствора Basic Violet #2 с концентрацией 0,75 % масс. или 0,50 % масс. вместо концентрации 1,0 % масс., описанной выше. При концентрации красителя 0,75 % масс. цвет образца волос, обработанного красителем и связывающимся с волосами пептидным закрепителем оценивали как «средне», что указывает на небольшое улучшение сохранения цвета по сравнению с контролем. При использовании концентрации красителя 0,50 % масс. цвет образца волос, обработанного красителем и связывающимся с волосами пептидным закрепителем, оценивали как «без изменений», что указывает на такую же потерю цвета, как в контроле. Эти результаты показывают, что концентрацию красителя и соотношение красителя и связывающегося с волосами пептида необходимо оптимизировать для наилучших результатов.

ПРИМЕР 2

Окрашивание волос с использованием полученного эмпирически связывающегося с волосами пептида в качестве закрепителя

Целью данного примера являлось продемонстрировать окрашивание волос с использованием красителя для волос в комбинации со связывающимся с волосами пептидом в качестве закрепителя. Связывающийся с волосами пептид, используемый в этом примере, получен эмпирически.

Эмпирически полученный связывающийся с волосами пептид, приведенный как SEQ ID NO:8, получен из SynPep (Dublin, CA). Этот пептид (27 мг) добавляли к 10 г 0,5 % масс. исходного раствора Basic Violet #2 (Aldrich, Milwaukee, WI; CAS 3248-91-7) в воде и обеспечивали перемешивание раствора в течение ночи. Образец натуральных белых волос (International Hair Importers & Products Inc., Bellerose, NY) вставляли в пробирку 13 мм × 100 мм и впрыскивали в пробирку 8 мл смеси пептид/краситель. Образец волос перемешивали в контакте с раствором окрашивающего вещества в течение 30 мин с использованием магнитной мешалки; затем вынимали и высушивали на воздухе в течение 30 мин.

Затем образец волос подвергали промывке водой с использованием больших количеств деионизованной воды с последующими восемью обработками шампунем в течение нескольких дней. Обработка шампунем включала в себя нанесение коммерчески доступного шампуня, Pantene Pro-V Sheer Volume (Proctor & Gamble, Cincinnati, OH), на волосы следующим образом. Каплю шампуня размером с двадцатипятицентовую монету равномерно распределяли по образцу волос и затем энергично втирали в волосы в течение 30 сек, после чего образец волос ополаскивали водой для удаления шампуня. Затем образец волос высушивали при комнатной температуре.

Описанный выше способ повторяли без добавления связывающегося с волосами пептидного закрепителя, что служило контролем. Стойкость цвета оценивали качественно с использованием визуального наблюдения сохранения цвета по сравнению с контролем с использованием шкалы, описанной в примере 1.

После обработки шампунем цвет образца волос, обработанного красителем и связывающимся с волосами пептидным закрепителем, оценивали как «средне», что указывает на небольшое улучшение сохранения цвета по сравнению с контролем.

Пример 3

Окрашивание волос с использованием конъюгата, содержащего связывающийся с волосами пептид, присоединенный к кондиционеру для волос, в качестве закрепителя

Целью данного примера являлось продемонстрировать окрашивание волос с использованием красителя для волос в сочетании с конъюгатом, содержащим связывающийся с волосами пептид, ковалентно присоединенный к кондиционеру для волос, в качестве закрепителя.

Получение конъюгата октадецил-связывающийся с волосами пептид:

Октадецилизоцианат (70 мг, Aldrich, CAS No.112-96-9) растворяли в 5 мл N,N'-диметилформамида (DMF) и добавляли к раствору пептида IB5 со снятой защитой, обладающего остатком цистеина, добавленным к C-концу, приведенному как SEQ ID NO:52, (150 мг), растворенному в 10 мл DMF. Триэтиламин (30 мг) добавляли, чтобы катализировать реакцию. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 120 час. Растворитель выпаривали, получая 191 мг грязно-белого кристаллического порошка. Продукт анализировали посредством газовой хроматографии-MALDI масс-спектрометрии и обнаружили, что он содержит два компонента, обладающие молекулярными массами 1717 и 2013 г/моль, что соответствует 1 и 2 единицам октадецила соответственно, ковалентно присоединенным к пептиду.

Окрашивание волос:

Конъюгат октадецил-связывающийся с волосами пептид (28 мг) добавляли к 10 г 0,5 % масс. исходного раствора Basic Violet #2 (Aldrich, Milwaukee, WI; CAS 3248-91-7) в воде и обеспечивали перемешивание раствора в течение ночи. Образец натуральных белых волос (International Hair Importers & Products Inc., Bellerose, NY) вставляли в пробирку 13 мм × 100 мм и впрыскивали в пробирку 8 мл смеси конъюгат/краситель. Образец волос перемешивали в контакте с раствором окрашивающего вещества в течение 30 мин с использованием магнитной мешалки; затем вынимали и высушивали на воздухе в течение 30 мин.

Затем образец волос подвергали промывке водой с использованием больших количеств деионизованной воды с последующими восемью обработками шампунем в течение нескольких дней. Обработка шампунем включала в себя нанесение коммерчески доступного шампуня, Pantene Pro-V Sheer Volume (Proctor & Gamble, Cincinnati, OH), на волосы следующим образом. Каплю шампуня размером с двадцатипятицентовую монету равномерно распределяли по образцу волос и затем энергично втирали в волосы в течение 30 сек, после чего образец волос ополаскивали водой для удаления шампуня. Затем образец волос высушивали при комнатной температуре.

Описанный выше способ повторяли без добавления конъюгированного закрепителя, что служило контролем. Стойкость цвета оценивали качественно с использованием визуального наблюдения сохранения цвета по сравнению с контролем с использованием шкалы, описанной в примере 1.

После обработки шампунем цвет образца волос, обработанного красителем и закрепителем октадецил-связывающийся с волосами пептид, оценивали как «хорошо», что указывает на большое улучшение сохранения цвета по сравнению с контролем.

ПРИМЕР 4

Окрашивание волос с использованием смеси различных связывающихся с волосами пептидов в качестве закрепителя

Целью данного примера являлось продемонстрировать окрашивание волос с использованием красителя для волос в комбинации со смесью двух различных связывающихся с волосами пептидов в качестве закрепителя. Использовали смесь двух различных однокопийных связывающихся с волосами пептидов.

Связывающиеся с волосами пептиды, используемые в этом примере, представляли собой IB5 с остатком цистеина, добавленным к C-концу, приведенный как SEQ ID NO:52, и KF11, приведенный как SEQ ID NO:2, оба полученные из SynPep. Каждый из пептидов использовали в концентрации 0,125 % масс. Использовали способ, описанный в примере 1, с концентрацией Basic Violet #2 0,50 % масс. за исключением того, что проводили восемь промывок шампунем вместо пяти промывок шампунем, используемых в примере 1.

После обработки шампунем цвет образца волос, обработанного красителем и смесью связывающихся с волосами пептидов, оценивали как «очень хорошо», что указывает на минимальную потерю окрашивающего вещества после обработки шампунем. Для контроля без связывающегося с волосами пептида показали значительную потерю цвета после обработки шампунем. Эти результаты показали, что сохранение цвета волос можно улучшить посредством использования смеси различных связывающихся с волосами пептидов.

Этот эксперимент повторяли с использованием смеси связывающегося с волосами пептида KF11 (SEQ ID NO:2) и эмпирически полученного пептида, применяемого в примере 2 (SEQ ID NO:8). Для этих дух пептидов не было улучшения сохранения цвета после обработки шампунем по сравнению с контролем. Эти результаты позволяют предполагать, что при использовании смеси двух различных связывающихся с волосами пептидов следует уделять внимание тому, чтобы не существовало взаимодействия между пептидами, уменьшающего благоприятный эффект. Считают, что высокополярный эмпирически полученный пептид взаимодействовал с пептидом KF11, таким образом прекращая эффект закрепителя.

ПРИМЕР 5

Биологическое получение мультикопийного связывающегося с волосами пептида

Целю данного примера являлось получение мультикопийного связывающегося с волосами пептида HC77607, приведенного как SEQ ID NO: 16, с использованием способов рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования. Мультикопийный связывающийся с волосами пептид являлся составленным из шести связывающихся с волосами пептидных последовательностей, разделенных пептидными спейсерами, по 3 копии каждого из KF11 (SEQ ID NO:2) и D21' (SEQ ID NO:3). Пептид экспрессировали в E. coli в виде телец включения. Дополнительные аминокислотные последовательности (т.е., пептидные метки) сливали с мультикопийной связывающейся с волосами пептидной последовательностью, чтобы стимулировать формирование телец включения.

Конструирование гена HC77607:

Последовательность ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность пептида HC77607, приведенную как SEQ ID NO: 16, сконструирована GenScript Corp. (Scotch Plains, NJ) с использованием запатентованных алгоритмов обратной трансляции, оптимизирующих использование кодонов для высокого уровня транскрипции в E. coli и исключающих повторяющиеся последовательности и вторичную структуру РНК. Кодирующая последовательность ДНК приведена как SEQ ID NO:23. В этой кодирующей последовательности участок узнавания для эндонуклеазы BamHI включали на N-конце и два терминирующих кодона плюс участки узнавания для эндонуклеаз AscI и HindIII присоединяли на C-конце. Эту кодирующую последовательность ДНК собирали из синтетических олигонуклеотидов и клонировали в плазмидный вектор pUC57 между участками BamHI и HindIII в GenScript Corp для получения плазмиды pUC57/HC77607. Последовательность ДНК верифицировали в GenScript Corp.

Конструирование экспрессирующего вектора pLX121:

Клонирование гена пептида TBP101:

Сконструировали синтетический пептид из 68 аминокислот, названный TBP1 и приведенный как SEQ ID NO:24. Ген для пептида TBP1, обозначенный TBP1, собирали из синтетических олигонуклеотидов (полученных из Sigma-Genosys, Woodlands, TX), которые приведены в таблице 2.

Каждый олигонуклеотид фосфорилировали ATP с использованием T4-полинуклеотидкиназы. Полученные олигонуклеотиды смешивали, кипятили в течение 5 мин и затем медленно охлаждали до комнатной температуры. Наконец, отожженные олигонуклеотиды лигировали T4 ДНК-лигазой для получения синтетического фрагмента ДНК TBP1, приведенного как SEQ ID NO:30, который кодирует пептид TBP101.

Конструирование экспрессирующей плазмиды pINK1:

TBP1 вводили в систему Gateway Technology для сверхэкспрессии белка (Invitrogen, Carlsbad, CA) согласно инструкциям производителя. На первой стадии реакционную смесь для лигирования TBP1 использовали для реакции ПЦР, катализируемой pfu ДНК-полимеразой (Stratagene, La Jolla, CA) согласно общепринятому способу ПЦР. Праймер 5'TBP1 (5'-CAC CGG ATC CAT CGA AGG TCG T-3'), приведенный как SEQ ID NO:31, и праймер 3'TBP1 (5'-TCA TTA TGC AGC CAG CAG CGC-3'), приведенный как SEQ ID NO:32, использовали для амплификации фрагмента TBP1. Благодаря дизайну этих праймеров дополнительную последовательность CACC и другой стоп-кодон TGA добавляли к 5'- и 3'-концам амплифицированных фрагментов.

Амплифицированный TBP1 напрямую клонировали в вектор pENTR/D-TOPO с использованием набора для направленного клонирования Invitrogen pENTR directional TOPO®, получая исходную плазмиду Gateway pENTR-TBP1. Эту исходную плазмиду размножали в штамме E. coli One Shot TOP10 (Invitrogen). Точность амплификации ПЦР и клонирования определяли секвенированием ДНК в DuPont Sequencing Facility.

Плазмиду pENTR-TBP1 дополнительно модифицировали сайт-направленным мутагенезом с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза Stratagene QuickChange® II (Stratagene La Jolla, CA; каталожный no. 200523), согласно инструкциям производителя для получения участков узнавания для эндонуклеаз NgoMI (GCCGGC) и KasI (GGCGCC). Для получения участков узнавания для эндонуклеазы NgoMI для мутагенеза использовали праймер AGG-1-F, приведенный как SEQ ID NO:33, и праймер AGG-1-R, приведенный как SEQ ID NO:34. Для получения участка KasI для мутагенеза использовали праймер GGA-1-F, приведенный как SEQ ID NO:35, и праймер GGS-1-R, приведенный как SEQ ID NO:36. В результате мутагенеза получили плазмиду pENTR-TBP101, кодирующую синтетический пептид из 68 аминокислот, названный TBP101, приведенный как SEQ ID NO:37.

Наконец, исходную плазмиду смешивали с pDEST17. Реакции рекомбинации LR катализировали LR Clonase (Invitrogen). Заданную плазмиду, pINK101, конструировали и размножали в штамме DH5 альфа E. coli. Точность реакции рекомбинации определяли секвенированием ДНК. Все реагенты для реакций рекомбинации LR предоставлены в экспрессирующей системе E. coli Invitrogen с набором Gateway Technology.

Полученная плазмида содержала кодирующую область 6H-TBP1 для рекомбинантного белка INK101, который представляет собой белок 11,6 кДа. Эта белковая последовательность содержит метку 6xHis и пептидный линкер, содержащий участок узнавания фактора Xa перед последовательностью пептида TBP101. Кодирующая область для INK101, между участками узнавания NdeI и AscI, приведена как SEQ ID NO:38.

Область, кодирующую метку 6xHis и последующий линкер (28-ак), можно вырезать из pINK101 посредством расщепления ферментами рестрикции NdeI и BamHI.

Для тестирования экспрессии кодирующей последовательности 6H-TBP1 экспрессирующей плазмидой pINK101 трансформировали штамм E. coli BL21-AI (Invitrogen каталожный no. C6070-03). Для получения рекомбинантного белка 50 мл среды LB-ампициллин (10 г/л бакто-триптона, 5 г/л бакто-дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 100 мг/л ампициллина, pH 7,0) инокулировали одной колонией трансформированных бактерий и культуру встряхивали при 37°C до достижения OD₆₀₀ 0,6. Экспрессию индуцировали добавлением к культуре 0,5 мл 20% L-арабинозы и продолжали встряхивание в течение следующих 4 час. Анализом белка клетки посредством электрофореза в полиакриламидном геле показали продукцию пептида TBP101.

Введение участка расщепления DP в аминокислотную последовательность TBP101:

Пептидную связь DP, которая, в частности, является лабильной при низком pH (M. Landon, Methods Enzymol. 47:145-9 (1977)), использовали в качестве участка расщепления кислотой для отделения подлежащего продукции пептида от стабилизирующей метки. Таким образом, аминокислотную последовательность TBP101, приведенную как SEQ ID NO:37, изменяли для включения кислотно-лабильной последовательности DP между вышележащей кодирующей линкер областью и последовательностью TBP101 для получения TBP101-DP, приведенного как SEQ ID NO:39.

Последовательность плазмиды pINK101 модифицировали сайт-направленным мутагенезом для изменения двух кодонов, кодирующих дипептидную последовательность EG, на кодоны, кодирующие дипептид DP, в начале гена 6H-TBP1. Участок расщепления кислотой DP добавляли с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза Stratagen QuickChange II® Kit (Stratagene La Jolla, CA; каталожный no. 200523) согласно инструкциям производителя. Олигонуклеотиды, применяемые для выполнения сайт-направленного мутагенеза, приведены как SEQ ID NO:40 (верхняя цепь) и SEQ ID NO:41 (нижняя цепь).

Полученной плазмидой трансформировали химически компетентные клетки TOP 10 (Invitrogen; каталожный no. C4040-06). Плазмидную ДНК получали с использованием набора QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, Valencia, CA) и сайт-направленные мутации подтверждали секвенированием. Аминокислоты в положениях 32 и 33 TBP101, глутаминовую кислоту (E) и глицин (G) заменяли на аспарагиновую кислоту (D) и пролин (P) соответственно посредством изменения четырех нуклеотидных остатков (GAA на GAT и GGT на CCA). Полученная плазмида, обозначенная pINK101-DP, приведена как SEQ ID NO:42.

Продукцию пептида с плазмиды pINK101-DP оценивали, как описано выше. Для pINK101-DP, как и для исходной плазмиды pINK101, получали продукцию нерастворимого пептида в форме телец включения.

Конструирование Tag IBT3:

Последовательность ДНК, кодирующую пептид, обладающий последовательностью, приведенной как SEQ ID NO:43 и обозначенной как IBT3, собирали из двух синтетических олигонуклеотидов (Sigma Genosys), приведенных как SEQ IN NO:44 и 45, с комплементарной последовательностью. В каждый олигонуклеотид включали выступающие концы для получения липких концов, совместимых с участками рестрикции NdeI и BamHI. Два олигонуклеотида отжигали посредством нагревания смеси олигонуклеотидов (100 пмоль каждого в деионизованной воде) при 99°C в течение 10 мин и затем позволяли смеси медленно охлаждаться до комнатной температуры.

Плазмиду pINK101-DP расщепляли в буфере 2 (New England Biolabs, Beverly, MA) ферментами рестрикции NdeI и BamHI (New England Biolabs Beverly, MA) для высвобождения фрагмента 90 п.н., соответствующего метке 6xHis и линкеру из исходной плазмиды pDEST17, содержащему участок att из системы для клонирования Gateway. Фрагменты NdeI-BamHI из расщепленной плазмиды разделяли электрофорезом в агарозном геле и вектор очищали с использованием набора Qiagen QIAquick® Gel Extraction (QIAGEN; каталожный no. 28704). Разведенные отожженные олигонуклеотиды (приблизительно 0,2 пмоль) лигировали T4 ДНК-лигазой (New England Biolabs; каталожный no. M0202) с расщепленной NdeI-BamHI, очищенной в геле плазмидой (приблизительно 50 нг) при 12°C в течение 18 час. Анализировали плазмидную ДНК, выделенную из трансформантов E. coli TOP 10, и последовательность ожидаемой плазмиды подтверждали секвенированием. Эта плазмида, обозначенная pLX121, кодирует пептид, названный IBT3-TBP101. Полную конструкцию с подтвержденной последовательностью тестировали по экспрессии, как описано выше.

Конструирование партнера для слияния KSI (EP,S):

В коммерчески доступном плазмидном векторе pET-31b(+) (Novagen/EMD Biosciences, Madison, WI) представлены последовательности, кодирующие фрагмент фермента кетостероид-изомеразы (KSI). Этот фрагмент KSI проявляет тенденцию к формированию нерастворимых телец включения в E. coli при слиянии с интересующими пептидами. Чтобы использовать последовательность этого партнера для слияния, фрагмент KSI амплифицировали ПЦР с использованием плазмиды pET-31b(+) в качестве матрицы и олигонуклеотидных праймеров, приведенных как SEQ ID NO:46 и 47.

Полученный продукт ПЦР расщепляли эндонуклеазами NdeI и BamHI и клонировали в плазмиду pLX121, также расщепленную NdeI и BamHI, в E. coli DH10B. Конечную конструкцию обозначили KSI-101DP, а содержащую ее плазмиду обозначили pINK101_DP_KSI.

Затем плазмиду pINK101_DP_KSI модифицировали сайт-направленным мутагенезом (QuickChange; Stratagene) для удаления кислотно-лабильной последовательности DP из белкового продукта KSI, замены ее на EP и удаления единственного остатка C в последовательности KSI с заменой его на S в то же самое время. Для данной цели одновременно использовали две пары олигонуклеотидов, приведенные как SEQ ID NO:48 и 49, и SEQ ID NO: 50 и 51. Полученную плазмиду обозначили pINK101_DP_KSI(EP,S).

Конструирование слитых генов KSI-HC77607 и KSI(EPS)-HC77607:

ДНК плазмид pINK101_DP_KSI и pINK101_DP_KSI(EP,S) расщепляли эндонуклеазами BamHI и AscI и фрагмент, кодирующий TBP101, заменяли фрагментом BamHI-AscI, кодирующим HC77607, полученным из плазмиды pUC57/HC77607 (описанной выше). Полученные плазмиды кодируют слитые белки KSI-HC77607 и KSI(EP,S), функционально связанные с промотором гена 10 T7. Эти плазмиды сначала клонировали в неэкспрессирующем штамме E. coli TOP10, затем переносили в экспрессирующий штамм, E. coli BL21-AI.

Ферментация:

Рекомбинантный штамм E. coli, описанный выше, выращивали в 6-л ферментации, которую сначала проводили в периодическом режиме, и затем в периодическом режиме с подпиткой. Состав среды для ферментации приведен в таблице 3. pH среды для ферментации составлял 6,7. Среду для ферментации стерилизовали автоклавированием, после чего добавляли следующие простерилизованные компоненты: гидрохлорид тиамина (4,5 мг/л), глюкозу (22,1 г/л), микроэлементы, см. таблицу 4 (10 мл/л), ампициллин (100 мг/л) и инокулят (посев) (125 мл). pH регулировали, как необходимо, с использованием гидроксида аммония (20 % об.) или фосфорной кислоты (20 % об.). Добавляемые компоненты стерилизовали либо автоклавированием, либо фильтрацией.

Таблица 3 Состав среды для ферментации
Компонент	Концентрация
KH2 PO4	9 г/л
(NH 4)2HPO4	4 г/л
MgSO 4 · 7H2O	1,2 г/л
Лимонная кислота	1,7 г/л
Дрожжевой экстракт	5,0 г/л
Противовспенивающее средство Mazu DF 204	0,1 г/л

Таблица 4 Микроэлементы
Компонент	Концентрация, мг/л
EDTA	840
CoCl2 · H2O	250
MnCl 2 · 4H2O	1500
CuCl 2 · 2H2O	150
H 3BO3	300
Na 2MoO4 · 2H2O	250
Zn(CH 3COO)2 · H2O	1300
Цитрат железа	10000

Условия проведения ферментации обобщены в таблице 5. Начальная концентрация глюкозы составляла 22,1 г/л. После истощения остаточной начальной глюкозы начинали запланированную экспоненциальную подпитку глюкозой, начиная периодическую фазу с подпитки проведения ферментации. Подпитка глюкозой (см. таблицы 6 и 7) содержала 500 г/л глюкозы и являлась дополненной 5 г/л дрожжевого экстракта. Компоненты среды для подпитки стерилизовали либо автоклавированием, либо фильтрацией. Целью являлось сохранение удельной скорости роста 0,13 час^-1 при условии коэффициента выхода (биомассы к глюкозе) 0,25 г/г и поддержание очень низких значений уровня уксусной кислоты в ферментационном чане (т.е. менее чем 0,2 г/л). Подпитку глюкозой продолжали до конца прогона. Индукцию запускали болюсом из 2 г/л L-арабинозы в выбранное время (т.е., по истечении 15 час времени ферментации). Болюс для доставки 5 г дрожжевого экстракта на литр среды для ферментации добавляли в ферментационный чан в следующее время: за 1 час перед индукцией, во время индукции, и через 1 час после времени индукции. Проведение ферментации останавливали по истечении 19,97 час времени ферментации и через 4,97 час после времени индукции.

Таблица 5 Условия проведения ферментации
Условие	Начальное	Минимум	Максимум
Перемешивание	220 об/мин	220 об/мин	1200 об/мин
Поток воздуха	3 SLPM	3 SLPM	30 SLPM
Температура	37ºC	37ºC	37ºC
pH	6,7	6,7	6,7
Давление	0,500 атм (50,7 кПа)	0,500 атм (50,7 кПа)	0,500 атм (50,7 кПа)
Растворенный O2*	20%	20%	20%
* Каскадная мешалка, затем поток воздуха

Таблица 6 Состав среды для подпитки
Компонент	Концентрация
MgSO4 · 7H2O	2,0 г/л
Глюкоза	500 г/л
Ампициллин	150 г/л
(NH4) 2HPO4	4 г/л
KH 2PO4	9 г/л
Дрожжевой экстракт	5,0 г/л
Микроэлементы - Подпитка (таблица 7)	10 мл/л

Таблица 7 Микроэлементы - Подпитка
Компонент	Концентрация, мг/л
EDTA	1300
CoCl2 · H2O	400
MnCl 2 · 4H2O	2350
CuCl 2 · 2H2O	250
H 3BO3	500
Na 2MoO4 · 2H2O	400
Zn(CH 3COO)2 · H2O	1600
Цитрат железа	4000

Выделение и очистка пептида HC77607:

После завершения прогона ферментации всю культуру после ферментации три раза пропускали через гомогенизатор APV модель 2000 типа Gaulin при 12000 psi (82700 кПа). Культуру охлаждали ниже 5°C перед каждой гомогенизацией. Гомогенизированную культуру немедленно пропускали через центрифугу с многослойными дисковыми фильтрами Westfalia WhisperFuge (Westfalia Separator Inc., Northvale, NJ) при 600 мл/мин и 12000 RCF для отделения телец включения от суспендированного клеточного дебриса и растворенных примесей. Разведенную массу ресуспендировали до 15 г/л (на сухое вещество) в воде и доводили pH до 10,0 с использованием NaOH. Суспензию пропускали через гомогенизатор 2000 типа Gaulin при 12000 psi (82700 кПа) с одним пропусканием для обеспечения тщательного перемешивания. Гомогенизированную суспензию с pH 10 немедленно пропускали через центрифугу с многослойными дисковыми фильтрами Westfalia WhisperFuge при 600 мл/мин и 12000 RCF для отделения промытых телец включения от суспендированного клеточного дебриса и растворенных примесей. Разведенную массу ресуспендировали до 15 г/л (на сухое вещество) в чистой воде. Суспензию пропускали через гомогенизатор APV 2000 типа Gaulin при 12000 psi (82700 кПа) с одним пропусканием для обеспечения тщательной промывки. Гомогенизированную суспензию немедленно пропускали через центрифугу с многослойными дисковыми фильтрами Westfalia WhisperFuge при 600 мл/мин и 12000 RCF для отделения промытых телец включения от остаточного суспендированного клеточного дебриса и NaOH.

Разведенную массу ресуспендировали в чистой воде до 25 г/л (на сухое вещество) и pH смеси доводили до 2,2 с использованием HCl. Дитиотреитол (DTT, 10 мМ) добавляли для разрушения дисульфидных связей. Подкисленную суспензию нагревали до 70°C в течение 14 час для завершения расщепления участка DP, отделяя слитый пептид от продуцированного пептида. Продукт охлаждали до 5°C и выдерживали в течение 12 час. Смесь центрифугировали при 9000 RCF в течение 30 мин и супернатант сливали. Затем супернатант фильтровали через 0,2 мкм мембрану.

Фильтрованный продукт наносили на колонку 22 × 250 мм для обращеннофазовой хроматографии, содержащую 10 мкм наполнителя C18, предварительно обработанного 10% ацетонитрилом, 90% водой с 0,1% об. трифторуксусной кислоты (TFA). Продукт возвращали в очищенном состоянии посредством элюции с колонки градиентом воды и ацетонитрила, линейно изменяющимся от 10% до 25% ацетонитрила в воде с TFA 0,1% об. Элюент, содержащий пептидный продукт, собирали и концентрировали выпариванием в вакууме до показателя 2:1 перед лиофилизацией. Спектрофотометрическую детекцию при 220 нм использовали для мониторирования и прослеживания элюции пептидного продукта.

Пример 6

Окрашивание волос с использованием мультикопийного связывающегося с волосами пептида в качестве закрепителя

Целью данного примера являлось продемонстрировать окрашивание волос с использованием красителя для волос в комбинации с мультикопийным связывающимся с волосами пептидом в качестве закрепителя. Мультикопийный связывающийся с волосами пептид, используемый в этом примере, получен, как описано в примере 5.

Окрашивание волос:

Этот мультикопийный связывающийся с волосами пептид, приведенный как SEQ ID NO:16, (28 мг) добавляли к 10 г 0,5 % масс. исходного раствора Basic Violet #2 (Aldrich, Milwaukee, Wl; CAS 3248-91-7) в воде и обеспечивали перемешивание раствора в течение ночи. Образец натуральных белых волос (International Hair Importers & Products Inc., Bellerose, NY) вставляли в пробирку 13 мм × 100 мм, и впрыскивали в пробирку 8 мл смеси пептид/краситель. Образец волос перемешивали в контакте с раствором окрашивающего вещества в течение 30 мин с использованием магнитной мешалки; затем вынимали и высушивали на воздухе в течение 30 мин.

Затем образец волос подвергали промывке водой с использованием больших количеств деионизованной воды с последующими восемью обработками шампунем в течение периода нескольких дней. Обработка шампунем включала в себя нанесение коммерчески доступного шампуня, Pantene Pro-V Sheer Volume (Proctor & Gamble, Cincinnati, OH), на волосы следующим образом. Каплю шампуня размером с двадцатипятицентовую монету равномерно распределяли по образцу волос и затем энергично втирали в волосы в течение 30 сек, после чего образец волос ополаскивали водой для удаления шампуня. Затем образец волос высушивали при комнатной температуре.

Описанный выше способ повторяли без добавления связывающегося с волосами пептидного закрепителя, что служило контролем. Стойкость цвета оценивали качественно с использованием визуального наблюдения сохранения цвета по сравнению с контролем с использованием шкалы, описанной в примере 1.

После обработки шампунем цвет образца волос, обработанного красителем и мультикопийным связывающимся с волосами пептидом, оценивали как «очень хорошо», что указывает на минимальную потерю цвета.

ПРИМЕРЫ 7-12

Окрашивание волос с использованием связывающихся с волосами пептидов в качестве закрепителя

Целью данных примеров являлось продемонстрировать окрашивание волос с использованием красителя для волос в сочетании с различными связывающимися с волосами пептидами в качестве закрепителя. Сохранение цвета оценивали количественно с использованием способа спектрофотометрического измерения.

Окрашивание волос выполняли, как описано в примере 1, с использованием Red Dye No. 33 (CAS No. 3567-66-6, полученного из Abbey Color, Philadelphia, PA), в концентрации 0,07 % масс. Использовали различные связывающиеся с волосами пептиды, как перечислено в таблице 8. После окрашивания волос их однократно ополаскивали деионизованной водой и затем однократно обрабатывали шампунем, как описано в примере 1.

Интенсивность окраски после шампуня измеряли с использованием спектрофотометра X-Rite® SP78 Sphere (X-Rite, Inc., Grandville, MI) посредством помещения окрашенного образца волос в фотосенсор и вычисления параметров L*, a* и b*, представляющих ответ фотометра. Начальное фоновое значение L* измеряли для неокрашенных волос, и все измерения представляли собой среднее из трех отдельных определений. Значения дельта E рассчитывали с использованием уравнения 1 ниже:

Дельта E = ((L*₁-L*₂)² + (a ₁-a₂)² +(b₁-b₂ )²)^1/2 (1)

где L* = меняющаяся яркость, и a* и b* представляют собой координаты цветности цветового пространства CIELAB, как определено International Commission of Illumination (CIE) (Minolta, Precise Color Communication - Color Control From Feeling to Instrumentation, Minolta Camera Co., 1996). Большее значение дельта E указывает на лучшее сохранение цвета. Результаты обобщены в таблице 8.

Таблица 8 Результаты сохранения цвета после обработки шампунем
Пример	Пептид	SEQ ID NO:	Конц. пептида % масс.	Дельта E
7	A09	5	0,95%	34,8
8	A09	5	0,25%	25,6
9	HC77607	16	0,25%	19,8
10	IB5-Cys	52	0,25%	20,4
11 Сравнительный	Случайный	22	0,25%	10,8
12 Сравнительный	Нет	-	-	8,09

Как можно видеть по результатам в таблице 8, использование связывающегося с волосами пептида в качестве закрепителя для красителя обеспечивает существенно более хорошее сохранение цвета волос, как измеряли по значениям дельта E, чем при использовании одного красителя (пример 12) или при использовании случайного пептида в качестве закрепителя (пример 11).

ПРИМЕР 13

Окрашивание волос с использованием смеси различных связывающихся с волосами пептидов в качестве закрепителя

Целью данного примера являлось продемонстрировать окрашивание волос с использованием красителя для волос в сочетании со смесью двух различных связывающихся с волосами пептидов в качестве закрепителя. Использовали смесь однокопийного связывающегося с волосами пептида и мультикопийного связывающегося с волосами пептида.

Связывающиеся с волосами пептиды, используемые в этом примере, представляли собой IB5 с остатком цистеина, добавленным к C-концу, приведенный как SEQ ID NO:52, полученный из SynPep, и мультикопийный связывающийся с волосами пептид HC77607, приведенный как SEQ ID NO:16, полученный, как описано в примере 5. Каждый из пептидов использовали в концентрации 0,125 % масс. Использовали способ, описанный в примере 4, с Basic Violet #2 в концентрации 0,50 % масс.

После обработки шампунем, состоящей из 8 промывок шампунем, цвет образца волос, обработанного красителем и смесью связывающихся с волосами пептидов, оценивали как «очень хорошо», что указывает на минимальную потерю окрашивающего вещества после обработки шампунем. Для контроля без связывающегося с волосами пептида показали существенную потерю цвета после обработки шампунем. Эти результаты показали, что сохранение цвета волос можно улучшить использованием смеси различных связывающихся с волосами пептидов.